Wykrywanie rzadkich zdarzeń za pomocą sekwencjonowania DNA i RNA z korekcją błędów

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kilka kluczowych pytań w różnych dziedzinach badań, takich jak wykrywanie przedrakowych klonów, ocena prognostyczna pacjentów z białaczką po leczeniu oraz identyfikacja potencjalnie patogennych mutacji u dawców szpiku kostnego. Tę procedurę zademonstruje mi Spencer, który jest technikiem w laboratorium. Ten film opisuje, jak połączyć protokół sekwencjonowania z korekcją błędów z chemią Illumina i dostępnymi na rynku panelami genów w celu wykrywania klonalnych wariantów pojedynczych nukleotydów i małych indeli z czułością 1 na 10 000.

Aby wprowadzić wymagane unikalne identyfikatory molekularne, niestandardowe adaptery 16N i5 i i7 wykorzystują PCR. Najpierw przygotuj Q5 Master Mix, który wykorzystuje polimerazę o wyższej wierności niż dostępna na rynku alternatywa. Następnie, dla każdej reakcji, połącz 37,5 mikrolitrów Q5 Master Mix, sześć mikrolitrów pięciu mikromolowych adapterów 16N i5, które są unikalnymi identyfikatorami molekularnymi, oraz sześć mikrolitrów adapterów i7.

Jeśli celem jest multipleksowanie, użyj różnych adapterów i7 w oddzielnych próbkach. Teraz uruchom PCR, używając następujących parametrów: trzydzieści sekund w 98 stopniach Celsjusza, a następnie cztery do sześciu cykli po dziesięć sekund w 98 stopniach Celsjusza, trzydzieści sekund w 66 stopniach Celsjusza i trzydzieści sekund w 72 stopniach Celsjusza. Zakończ reakcję dwuminutowym przedłużeniem w temperaturze 72 stopni Celsjusza i przytrzymaj w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnie oba cykle PCR, które musisz na nich wykonać, najprawdopodobniej zależą od wielkości panelu genów, którego używasz, z naszego doświadczenia wynika, że czterocyklowy PCR jest wystarczający, jeśli panel genów ma około 1500 różnych ścieżek oligonukleotydów specyficznych dla genu, podczas gdy panel z około pięcioma do 600 parami oligonukleotydów wymaga około sześciu cykli PCR. Następnie oczyść reakcje PCR za pomocą kulek magnetycznych, dodaj 56,25 mikrolitra roztworu kulek magnetycznych do każdego produktu PCR o pojemności 75 mikrolitrów, a następnie przenieś każdą reakcję do oddzielnej 1,5 mililitrowej probówki o niskiej wiązalności, zmieszanej przez pipetowanie w górę iw dół co najmniej dziesięć razy i odczekaj pięć minut. Następnie przenieś mieszaniny do uchwytu magnetycznego i pozwól supernatantom oczyścić się przez dwie minuty.

Następnie usunąć i wyrzucić supernatanty. Następnie dodaj 200 mikrolitrów 70% etanolu, odczekaj trzydzieści sekund, a następnie usuń etanol. Powtórz ten etap mycia etanolem raz, a następnie pozostaw kulki do wyschnięcia na powietrzu przez pięć minut.

Na koniec wymyj zmodyfikowane biblioteki z kulek w dwudziestu mikrolitrach podwójnie destylowanej wody. Następnie umieść probówki na stojaku magnetycznym, aby oddzielić kulki magnetyczne od eluentu. Po pierwsze, należy dokonać dziesięciokrotnego seryjnego rozcieńczenia bibliotek ECS w porównaniu z poprzednim krokiem, aż do jednej części na 1000 w paskach PCR.

Następnie przygotuj Master Mix w 1,5 mililitrowej tubce. Do każdej reakcji połącz 10 mikrolitrów ddPCR EvaGreen Mix, 0,2 mikrolitra startera P5, 0,2 mikrolitra startera P7 i 4,6 mikrolitra podwójnie destylowanej wody. Następnie odpipetuj 15 mikrolitrów EvaGreen Master Mix do nowego zestawu probówek, a na koniec dodaj pięć mikrolitrów od jednego do 1 000 oczyszczonego produktu ECS do Master Mix.

Następnie wykonaj kropelki PCR za pomocą generatora kropel. Najpierw załaduj kasetę, odpipetuj 70 mikrolitrów oleju wytwarzającego kropelki do studzienki kasety, oznaczonego oleju i odpipetuj 20 mikrolitrów mieszaniny reakcyjnej ddPCR do dobrze oznakowanej próbki. Następnie przykryj kasetę gumową uszczelką i załaduj ją do generatora kropel, a następnie całe wytwarzanie kropel, aby kontynuować.

Teraz, używając pipety wielokanałowej, powoli, przez pięć sekund, załaduj 45 mikrolitrów kropelek pobranych z każdej studzienki kasety na nową płytkę PCR. Następnie uszczelnij płytkę PCR folią aluminiową. Teraz wzmocnij sygnał w kropelkach, używając następujących warunków: pięć minut w 95 stopniach Celsjusza, a następnie 40 cykli po trzydzieści sekund w 95 stopniach Celsjusza i jedna minuta w 63 stopniach Celsjusza, a następnie schłodzić reakcję do czterech stopni Celsjusza przez pięć minut, a następnie podnieść ją do 90 stopni Celsjusza na pięć minut, a następnie trzymanie w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnie przygotuj maszynę do czytnika kropelek szablonu ddPCR. Wybierz parametry bezwzględnej kwantyfikacji i użycia QX200 ddPCR EvaGreen Supermix. Następnie przepuść reakcje przez czytnik kropel.

Po zakończeniu analizy ddPCR należy zastosować te same progi dzielące do każdej próbki. Następnie znormalizuj każdą bibliotekę do żądanej liczby cząsteczek. Zacznij od wykonania 50 mikrolitrowych reakcji, składających się z 25 mikrolitrów Q5 Master Mix, dwóch mikrolitrów jednego mikromolowego startera P5, dwóch mikrolitrów jednego mikromolowego startera P7 i 21 mikrolitrów znormalizowanej biblioteki DNA.

Następnie uruchom PCR przy użyciu następujących parametrów: 30 sekund w 98 stopniach Celsjusza, a następnie 16 cykli po 10 sekund w 98 stopniach Celsjusza, trzydzieści sekund w 66 stopniach Celsjusza i trzydzieści sekund w 72 stopniach Celsjusza, następnie dwie minuty w 72 stopniach Celsjusza i przytrzymaj w czterech stopniach Celsjusza. Następnie określ ilościowo stężenie DNA w bibliotekach i połącz biblioteki w równych ilościach molowych do sekwencjonowania, celując w około cztery nanomolowe. Teraz zsekwencjonuj pulę biblioteki ECS za pomocą platformy sekwencjonowania Illumina, z następującymi ustawieniami sekwencjonowania: dwa razy 144 odczyty sparowanych końców, osiem cykli indeksu pierwszego i 16 cykli indeksu drugiego.

DNA pacjenta z mutacją w GATA1 rozcieńczono w komercyjnym genomowym DNA przy pierwotnym VAF wynoszącym 0,19. Korzystając z opisanego protokołu, ECS okazał się ilościowy na poziomie od 1 do 10 000 dla wariantu pojedynczego nukleotydu. Następnie próbki sierści buffy od dwudziestu zdrowych osób zostały przeanalizowane przy użyciu komercyjnego panelu sekwencjonowania, który składa się z 568 amplikonów.

Podsumowując, 109 klonalnych mutacji somatycznych było obecnych w obu powtórzeniach co najmniej jednego punktu czasowego zbierania, przy czym wybrano warianty alleli o frakcjach w zakresie od 0,0003 do 0,1451,21 mutacji o znanych kosmicznych reprezentacjach, a każda z nich została zwalidowana za pomocą cyfrowego PCR kropelkowego. Aby zademonstrować skorygowany o błędy poziom ekspresji w protokole, wykorzystano dostosowany panel genów składający się z 415 genów, o których wiadomo, że są związane z różnymi nowotworami, do stworzenia biblioteki zbudowanej z najczęściej eksonu ekspresji każdego genu. Poziom ekspresji transkryptu o niskiej liczebności był wysoce powtarzalny między powtórzeniami.

Następnie wykorzystano cyfrowy test PCR kropelkowy do walidacji sześciu wybranych genów o różnej ekspresji. Porównanie pokazuje, że poziom ekspresji genów został prawidłowo uchwycony przez protokół ECS, bez konieczności normalizacji. Kiedy już opanujesz technikę, możesz ją wygodnie wykonać w półtora dnia.

Większość czasu będzie poświęcona na inkubację, a ręczna obsługa zajmie około 30-40% całkowitego wymaganego czasu, w zależności od tego, ile próbek naukowcy przetwarzają w tym samym czasie. Podczas próby wykonania tej procedury bardzo ważne jest, aby mieć replikowaną bibliotekę sekwencjonowania dla tej samej próbki. Da ci to większą pewność, że mutacje o niskiej częstotliwości są naprawdę pozytywne, jeśli sama mutacja jest niezależnie rdzeniem w obu powtórzeniach.

Zgodnie z tą procedurą, można wykonać inne czynności, takie jak RNA ECS, aby odpowiedzieć na pytania, takie jak wykrywanie transkryptu o niskiej liczebności lub transkryptu fuzyjnego. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom głównie w dziedzinie nowotworów hematologicznych, a my używamy tej techniki do badania klonów przedbiałaczkowych u zdrowych osób, a także do wykrywania choroby o minimalnej ilości resztkowej u pacjentów z białaczką, którzy są w remisji.