Name: Wykrywanie rzadkich zdarzeń za pomocą sekwencjonowania DNA i RNA z korekcją błędów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Poznaj metodę sekwencjonowania z korekcją błędów wykorzystującą chemię Illumina i panele genowe do wykrywania rzadkich mutacji somatycznych z czułością 1:10 000. Technika umożliwia identyfikację klonów przedrakowych i ocenę minimalnej choroby resztkowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy uczestnikom badania Children's Oncology Group AAML1531 oraz Nurses' Health Study za ich wkład w postaci próbek pacjentów. Praca ta została sfinansowana przez National Institutes of Health (UM1 CA186107, RO1 CA49449 i RO1 CA149445), Children's Discovery Institute of Washington University i St. Louis Children's Hospital (MC-II-2015-461) oraz Eli Seth Matthews Leukemia Foundation.

<ol><li>Hoang, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+quantification+of+rare+somatic+mutations+in+normal+tissues+using+massively+parallel+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Genome-wide quantification of rare somatic mutations in normal tissues using massively parallel sequencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 113, 9846-9851 (2016).</li>
<li>O'Roak, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sporadic+autism+exomes+reveal+a+highly+interconnected+protein+network+of+de+novo+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sporadic autism exomes reveal a highly interconnected protein network of de novo mutations.</a> Nature. 485, 246-250 (2012).</li>
<li>Young, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+ultra-rare+pre-leukemic+clones+via+targeted+error-corrected+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Quantifying ultra-rare pre-leukemic clones via targeted error-corrected sequencing.</a> Leukemia. 29 (7), 1608-1611 (2015).</li>
<li>Young, A. L., Challen, G. A., Birmann, B. M., Druley, T. E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27546487">Clonal hematopoiesis harbouring AML-associated mutations is ubiquitous in healthy adults.</a> NatureCommunications. 7, 12484(2016).</li>
<li>Patel, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+relevance+of+integrated+genetic+profiling+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Prognostic relevance of integrated genetic profiling in acute myeloid leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 366, 1079-1089 (2012).</li>
<li>Shendure, J., Ji, H. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/nbt1486">Next-generation DNA sequencing.</a> Nature Biotechnology. 26 (10), 1135-1145 (2008).</li>
<li>Kohlmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+residual+disease+by+next-generation+deep-sequencing+of+RUNX1+mutations+can+identify+acute+myeloid+leukemia+patients+with+resistant+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Monitoring of residual disease by next-generation deep-sequencing of RUNX1 mutations can identify acute myeloid leukemia patients with resistant disease.</a> Leukemia. 28, 129-137 (2014).</li>
<li>Luthra, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+sequencing-based+multigene+mutational+screening+for+acute+myeloid+leukemia+using+MiSeq%3A+applicability+for+diagnostics+and+disease+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Next-generation sequencing-based multigene mutational screening for acute myeloid leukemia using MiSeq: applicability for diagnostics and disease monitoring.</a> Haematologica. 99, 465-473 (2014).</li>
<li>Kinde, I., Wu, J., Papadopoulos, N., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+quantification+of+rare+mutations+with+massively+parallel+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Detection and quantification of rare mutations with massively parallel sequencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (23), 9530-9535 (2011).</li>
<li>Schmitt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+ultra-rare+mutations+by+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Detection of ultra-rare mutations by next-generation sequencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 109 (36), 14508-14513 (2012).</li>
<li>Vander Heiden, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pRESTO%3A+a+toolkit+for+processing+high-throughput+sequencing+raw+reads+of+lymphocyte+receptor+repertoires%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">pRESTO: a toolkit for processing high-throughput sequencing raw reads of lymphocyte receptor repertoires.</a> Bioinformatics. 30 (13), 1930-1932 (2014).</li>
<li>Newman, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+digital+error+suppression+for+improved+detection+of+circulating+tumor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22NatureBiotechnology%22%5BJournal%5D)">Integrated digital error suppression for improved detection of circulating tumor DNA.</a> NatureBiotechnology. 34, 547-555 (2016).</li>
<li>Shugay, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAGERI%3A+Computational+pipeline+for+molecular-barcoded+targeted+resequencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLOSComputationalBiology%22%5BJournal%5D)">MAGERI: Computational pipeline for molecular-barcoded targeted resequencing.</a> PLOSComputationalBiology. 13 (5), e1005480(2017).</li>
<li>Wong, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+TP53+mutations+in+the+origin+and+evolution+of+therapy-related+acute+myeloid+leukaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Role of TP53 mutations in the origin and evolution of therapy-related acute myeloid leukaemia.</a> Nature. 518, 552-555 (2014).</li>
<li>Krimmel, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-deep+sequencing+detects+ovarian+cancer+cells+in+peritoneal+fluid+and+reveals+somatic+TP53+mutations+in+noncancerous+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Ultra-deep sequencing detects ovarian cancer cells in peritoneal fluid and reveals somatic TP53 mutations in noncancerous tissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 113 (21), 6005-6010 (2016).</li>
<li>Phallen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+detection+of+early-stage+cancers+using+circulating+tumor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22ScienceTranslationalMedicine%22%5BJournal%5D)">Direct detection of early-stage cancers using circulating tumor DNA.</a> ScienceTranslationalMedicine. 9, eaan2415(2017).</li>
<li>Egorov, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+profiling+of+immune+repertoires+for+minor+lymphocyte+counts+using+unique+molecular+identifiers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Quantitative profiling of immune repertoires for minor lymphocyte counts using unique molecular identifiers.</a> The Journal of Immunology. 194 (12), 6155-6163 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu demonstrujemy zestaw protokołów sekwencjonowania z korekcją błędów, które można łatwo wdrożyć do badania mutacji z niskimi VAF w różnych chorobach. Najważniejszym czynnikiem jest włączenie UMI do każdej cząsteczki przed sekwencjonowaniem, ponieważ umożliwiają one korekcję błędów surowych odczytów. Opisane tutaj metody pozwalają naukowcom na włączenie niestandardowych UMI zarówno do dostępnych na rynku paneli genowych, jak i samodzielnie zaprojektowanych oligonukleotydów specyficznych dla genów.
Standardowy protokół NGS wyklucza wykrycie mutacji z VAF poniżej 2% ze względu na wskaźnik błędów sekwencjonowania, a to ogranicza zastosowanie NGS w badaniach, w których kluczowe jest wykrycie rzadkich wariantów. Omijając standardowy poziom błędów NGS, ECS umożliwia czułe wykrywanie tych surowych wariantów. Na przykład wykrycie mutacji patogennych, gdy te mutacje pojawiają się po raz pierwszy (a więc przy niskim VAF) jest niezbędne do wczesnej interwencji w chorobie14,15. W badaniach nad białaczką wykrycie minimalnej choroby resztkowej (resztkowe komórki białaczkowe po leczeniu) informuje o stratyfikacji ryzyka i może być wykorzystane do informowania o opcjach leczenia w sposób, w jaki nie mogą tego zrobić oceny cytometrii binarnej przepływu. Ponadto ECS ma zastosowanie do wykrywania krążącego kwasu nukleinowego guza i oceny potencjału przerzutowego u pacjentów z guzami litymi poprzez ocenę obecności/braku, a także obciążenia wariantami niektórych mutacji, które są charakterystyczne dla guza pierwotnego16.
Jak pokazano w tabeli 1, moc wykorzystania modelu błędów opartego na rozkładzie dwumianowym i specyficznym dla pozycji do wywoływania wariantów zależy w dużej mierze od liczby sekwencjonowanych bibliotek, a także od głębokości sekwencjonowania użytego do zbudowania modelu błędów. Solidność modelu błędu wzrasta wraz ze wzrostem liczby próbek i większą głębokością sekwencjonowania. Zaleca się użycie co najmniej 10 sekwencjonowanych próbek ze średnim pokryciem odczytu z korekcją błędów wynoszącym 3000x na próbkę w celu zbudowania profilu błędów dla każdej próbki. Podejście oparte na konkretnej pozycji jest podobne do podejścia MAGERI, ale zamiast stosowania zagregowanego poziomu błędu dla wszystkich sześciu różnych typów podstawień (A>C/T>G, A>G/T>C, A>T/T>A, C>A/G>T, C>G/G>C, C>T/G>A)13, Każdą substytucję modelujemy niezależnie na każdej pozycji. Na przykład poziom błędu C>T w danej pozycji genomowej różni się od innego położenia. Nasze podejście uwzględnia również efekt partii sekwencjonowania, ponieważ podstawowy współczynnik substytucji obserwowany w jednym przebiegu sekwencjonowania może różnić się od innego przebiegu. Dlatego ważne jest, aby modelować każdą pozycję dla wszystkich typów podstawień, zwłaszcza gdy próbki z różnych serii sekwencjonowania są łączone w celu zbudowania modelu.
Ważną kwestią przy projektowaniu eksperymentu ECS jest pożądany próg wykrywalności. Piękno badań NGS polega na tym, że można je łatwo skalować pod względem genów/celów będących przedmiotem zainteresowania, progu wykrywania (podyktowanego głębokością sekwencjonowania) i liczby badanych osób. Na przykład, jeśli naukowcy są zainteresowani znalezieniem rzadkich mutacji w dwóch amplikonach o progu wykrywania 0,0001, mogą zebrać maksymalnie 75 próbek w jednym cyklu sekwencjonowania przy użyciu chemii MiSeq V2, która generuje do 15 milionów odczytów (2 amplikony * 10 000 cząsteczek * 10 odczytów w celu korekcji błędów * 75 próbek = 15 milionów odczytów sekwencjonowania). Naukowcy mogą zmieniać liczbę cząsteczek poddawanych sekwencjonowaniu lub liczbę zbiorczych próbek w jednym cyklu sekwencjonowania, aby dostosować próg wykrywania. W naszych badaniach naszym celem było znalezienie mutacji o progu detekcji 0,0001 VAF (1:10 000) przy użyciu panelu genów Illumina. Rutynowo używamy 250 ng wyjściowego DNA, aby zapewnić wychwycenie wystarczającej ilości cząsteczek w celu osiągnięcia wyżej wymienionego progu wykrywalności. Naukowcy mogą zdecydować się na rozpoczęcie od mniejszej ilości DNA (zalecane jest 50 ng), jeśli pożądana granica wykrywalności wynosi >0,001 VAF.
Ponieważ UMI są dołączane do indeksów i5, ustawienia sekwencjonowania muszą zostać odpowiednio zmienione. Na przykład użyliśmy 16 N UMI, a ustawienia sekwencjonowania to 2x144 sparowane odczyty końcowe, 8 cykli indeksu 1 i 16 cykli indeksu 2, w przeciwieństwie do zwykłych 8 cykli indeksu 2. Wzrost cyklu Indeksu 2 jest kompensowany spadkiem całkowitej liczby cykli przypisanych do odczytów. Jeśli badacze zdecydują się na użycie 12N UMI 10,17, ustawienia powinny zostać zmienione na 12 cykli indeksu 2.
Ta metoda sekwencjonowania oparta na UMI jest zoptymalizowana pod kątem korygowania błędów sekwencjonowania. Pozostaje nieoptymalna w radzeniu sobie z jackpottingiem PCR, który jest problemem dla wszystkich metod opartych na amplifikacji. Przeprowadziliśmy rundy walidacji post-sekwencjonowania i post-bioinformatycznej przy użyciu ddPCR i prawie nie wykrywamy żadnych fałszywych alarmów z powodu jackpotowania PCR. Niemniej jednak zaleca się, aby naukowcy przeprowadzili eksperymenty przy użyciu polimerazy o wysokiej wierności, aby zapewnić niskie błędy amplifikacji.

Wraz z wiekiem, narażenie na mutageny i błędy stochastyczne podczas podziału komórki powoduje akumulację aberracji somatycznych w genomie, co leży u podstaw fundamentalnej patogenezy przemian nowotworowych, chorób neurorozwojowych, zaburzeń pediatrycznych i normalnego starzenia się1,2. Mutacje somatyczne o potencjale wywołującym chorobę są ważnymi biomarkerami diagnostycznymi i prognostycznymi dla wczesnego wykrywania i zarządzania ryzykiem3,4,5. Aby lepiej zrozumieć klonogenezę fizjologiczną, która będzie informować o decyzjach klinicznych i badawczych, kluczowe znaczenie ma dokładna kwantyfikacja i charakterystyka tych mutacji. Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) jest obecnie wykorzystywane do badania mutacji klonalnych w heterogenicznych próbkach DNA; jednak NGS ogranicza się do identyfikacji mutacji we frakcji allelu wariantu >0,02 (VAF) — ze względu na nieodłączny wskaźnik błędów 0,5–2,0% platform sekwencjonowania6,7,8. W związku z tym śledzenie istotnych diagnostycznie i prognostowo wariantów somatycznych przy niższym VAF nie może być osiągnięte przy użyciu standardowego NGS.
Ostatnio opracowano różne metody w celu obejścia wskaźnika błędów NGS8,9,10,11. Metody te wykorzystują znakowanie molekularne, które umożliwia korekcję błędów po sekwencjonowaniu. Każda cząsteczka lub fragment genomu w bibliotece sekwencjonowania jest oznaczony losowym unikalnym identyfikatorem molekularnym (UMI), który jest specyficzny dla tej cząsteczki. UMI są konstruowane przez permutacje ciągu losowych nukleotydów (8-16 N). Drugi kod kreskowy specyficzny dla próbki jest również zintegrowany z przepływem pracy, który umożliwia multipleksowanie wielu próbek w tym samym cyklu sekwencjonowania NGS. Amplifikacja PCR jest wykonywana na bibliotece znakowanej molekularnie, a następnie biblioteka jest wysyłana do sekwencjonowania. Podczas przygotowywania biblioteki oczekuje się, że błędy zostaną losowo wprowadzone do fragmentu genomu podczas amplifikacji i sekwencjonowania PCR8. Aby usunąć losowe błędy sekwencjonowania, odczyty nieprzetworzonego sekwencjonowania są grupowane zgodnie z UMI. Oczekuje się, że artefakty z sekwencjonowania nie będą obecne we wszystkich odczytach z tym samym UMI w tej samej pozycji genomowej ze względu na stochastyczny charakter wprowadzenia, podczas gdy prawdziwy wariant zostanie wiernie amplifikowany i sekwencjonowany we wszystkich odczytach, które mają ten sam UMI. Artefakty są bioinformatyczne usuwane. W tym miejscu opisujemy trzy metody sekwencjonowania z korekcją błędów (ECS) zoptymalizowane w laboratorium dla DNA w celu identyfikacji wariantów pojedynczych nukleotydów (SNV) i małych insercji-delecji (Indels) oraz dla RNA w celu ułatwienia kwantyfikacji ekspresji genów poniżej progu błędu NGS.
Pierwsza metoda opisuje sposób poszukiwania rzadkiego zdarzenia somatycznego za pomocą starterów specyficznych dla genów, zaprojektowanych przez badaczy. Przed przygotowaniem biblioteki badacze powinni zaprojektować elementarze ukierunkowane na interesujące ich fragmenty. Użyliśmy aplikacji internetowej Primer3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/). Amplikony 200–250 pz są idealne do reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), ponieważ po włączeniu UMI będą generować nakładające się odczyty sparowanych końców z odczytami sparowanych końców 150 pz. Optymalne warunki projektowania podkładu, które należy zastosować, to: Minimalny rozmiar podkładu = 19; Optymalna wielkość podkładu = 25; Maksymalny rozmiar podkładu = 30; Minimum Tm = 64 °C; Optimum Tm = 70 °C; Maksymalne Tm = 74 °C; Maksymalna różnica Tm = 5 °C; Minimalna zawartość GC = 45; Maksymalna zawartość GC = 80; Liczba do zwrócenia = 20; Maksymalna stabilność końcowa 3' = 100.
W Metodzie 2 opisujemy metodę łączącą protokół ECS-DNA z chemią Illumina w celu zbadania klonalnych SNV i małych Indel, tak rzadkich jak 0,0001 VAF, przy użyciu dostępnych na rynku paneli genowych, które zawierają setki amplikonów. W naszym eksperymencie wykorzystaliśmy Panel Sekwencjonowania Szpiku TruSight (Illumina) i zaprojektowaliśmy rozszerzony panel, aby uwzględnić dodatkowe geny interesujące dla chorób szpiku u dzieci. Panele te nie oferowały unikalnych identyfikatorów molekularnych (UMI), które ułatwiałyby korekcję błędów, dlatego dodaliśmy do nich własną strategię adapterów. ECS powinien działać równie dobrze z każdym innym panelem zaprojektowanym do wzbogacania genów związanych z różnymi chorobami. Po wyizolowaniu DNA i późniejszym określeniu ilościowym z tkanki lub próbki będącej przedmiotem zainteresowania, zaleca się posiadanie co najmniej 500 ng podstawowego DNA na próbkę. Rutynowo tworzymy pojedynczą bibliotekę sekwencjonowania przy użyciu 250 ng DNA, aby uchwycić jak najwięcej unikalnych fragmentów genomu do dalszych odczytów, deduplikacji i obliczeń VAF. Opcjonalna biblioteka sekwencjonowania replik może być wykonana z pozostałych 250 ng DNA. Zawsze tworzymy dwie biblioteki replikacji na próbkę i bierzemy pod uwagę tylko te zdarzenia, które zostały wykryte niezależnie w obu replikacjach, jako prawdziwie dodatnie. Zaimplementowaliśmy również genomiczny model błędu dwumianowego specyficzny dla pozycji, aby zwiększyć dokładność wywoływania wariantów4,13.
Na koniec, opisujemy metodę łączącą sekwencjonowanie ECS z RNA w celu kwantyfikacji transkryptu przy użyciu gotowych paneli QIAseq Targeted RNA (Qiagen). Interfejsy UMI wymagane do deduplikacji i korekcji błędów zostały włączone do zestawów, a badacze mogą tworzyć biblioteki zgodnie z zaleceniami producenta. Z bioinformatycznego punktu widzenia naukowcy mogą postępować zgodnie z planem opracowanym dla ECS-DNA, który zostanie szczegółowo opisany w sekcji PROTOCOL.

<table><tbody><tr><td>Q5 High Fidelity Hot Start Master Mix</td><td>New England BioLabs</td><td>M0492S</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw testowy Qubit dsDNA HS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Bezpieczny barwnik żelowy DNA</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific S33102</td><td></td></tr><tr><td>Truseq Niestandardowy zestaw indeksu amplikonu</td><td>Illumina</td><td>FC-130-1003</td><td></td></tr><tr><td>Sekwencje adaptera UMI i5</td><td>Zintegrowane technologie</td> <td>DNA-NEBNext</td><td></td></tr> <tr><td>Ultra End Repair/dA-Tailing Module</td><td>New England BioLabs</td><td>E7442S</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II Ligation Module</td><td>New England BioLabs</td><td>E7595S</td><td></td></tr><tr><td>QX200 ddPCR EvaGreen Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1864034</td><td></td></tr><tr><td>QX200 Olej do wytwarzania kropelek do EvaGreen</td><td>Bio-Rad</td><td>1864005</td><td></td></tr><tr><td>QX200 Kroplowy cyfrowy system PCR</td><td>Bio-Rad</td><td>1864001</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR 96-dołkowe płytki</td><td>Bio-Rad</td><td>12001925</td><td></td></tr><tr><td>DG8 Wkłady do generatora kropel QX200/QX100</td><td>Uszczelki Bio-Rad</td><td>1864008</td><td></td></tr><tr><td>DG8 do generatora kropel QX200/QX100 Bioanalizator</td><td>Bio-Rad</td><td>1863009</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Agilent Genomics</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>TapeStation</td><td>Agilent Genomics</td><td>G2991AA</td><td></td></tr><tr><td>Panel sekwencjonowania szpiku TruSight</td><td>Illumina</td><td>FC-130-1010</td><td></td></tr><tr><td>Muszka 2</td><td></td> Dostosowany przez <td>Uniwersytet</td><td></td> Johnsa Hopkinsa</tr> <tr><td>panel ukierunkowanego RNA QIAseq</td><td>Qiagen-Rneasy</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Plus Mini Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td></td></tr></tbody></table>

wykrywanie rzadkich zdarzeń za pomocą sekwencjonowania dna i rna z korekcją błędów

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Konwencjonalne techniki sekwencjonowania nowej generacji (NGS) pozwoliły na ogromną charakterystykę genomu przez ponad dekadę. W szczególności NGS został wykorzystany do analizy spektrum mutacji klonalnych w nowotworach złośliwych. Chociaż są znacznie bardziej skuteczne niż tradycyjne metody Sangera, NGS ma problemy z identyfikacją rzadkich mutacji klonalnych i subklonalnych ze względu na wysoki poziom błędów wynoszący ~0,5–2,0%. W związku z tym standardowy NGS ma granicę wykrywalności dla mutacji, które są >0,02 frakcji allelu wariantu (VAF). Chociaż znaczenie kliniczne tak rzadkich mutacji u pacjentów bez znanej choroby pozostaje niejasne, pacjenci leczeni z powodu białaczki znacznie poprawiają wyniki, gdy choroba resztkowa wynosi <0,0001 za pomocą cytometrii przepływowej. Aby złagodzić to sztuczne tło NGS, opracowano liczne metody. W tym miejscu opisujemy metodę sekwencjonowania DNA i RNA z korekcją błędów (ECS), która polega na znakowaniu pojedynczych cząsteczek zarówno indeksem losowym 16 pz w celu korekcji błędów, jak i wskaźnikiem specyficznym dla pacjenta w pz 8 pz w celu multipleksowania. Nasza metoda może wykrywać i śledzić mutacje klonalne przy wariantowych frakcjach alleli (VAF) o dwa rzędy wielkości niższych niż granica wykrywalności NGS i tak rzadkich jak 0,0001 VAF.

Wykorzystując sekwencjonowanie celowane z korekcją błędów (Targeted Error-Corrected Sequencing) dla DNA, przeprowadziliśmy eksperyment dowodzący zasady działania, polegający na rozcieńczeniu zmutowanego DNA pacjenta w komercyjnym DNA genomicznym. Pacjent posiadał mutację w genie GATA1 (chrX:48650264, C&gt;G) z pierwotną wartością VAF wynoszącą 0,19. Wykazujemy na Rysunku 1, że ECS jest ilościowy do poziomu 1:10 000 dla pojedynczych wariantów nukleotydowych.
<img alt="Wykres serii rozcieńczeń GATA1; VAF w ECS vs. DNA guza; dopasowanie liniowe y=0,1864x, R²=0,99885." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57509/57509fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Seria rozcieńczeń SNV GATA1 wykazująca, że ECS jest ilościowa do poziomu 1:10 000. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57509/57509fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Wykazaliśmy również, że metoda ECS-DNA niezawodnie wykrywa rzadkie mutacje klonalne w genach często występujących w ostrej białaczce szpikowej (AML) u dorosłych w próbkach pobranych od zdrowych osób starszych4. Uzyskano próbki warstwy leukocytarnej (buffy coat) od 20 zdrowych osób biorących udział w Nurse's Health Study, zarchiwizowane w odstępie około 10 lat. W badaniu tych próbek zastosowano protokół panelu ECS-DNA. Na potrzeby tego eksperymentu zaadaptowano panel sekwencyjny Illumina TruSight Myeloid składający się z 568 amplikonów (więcej informacji na temat listy genów dostępnych pod adresem https://www.illumina.com/products/by-type/clinical-research-products/trusight-myeloid.html). Wysekwencjonowano 80 bibliotek od 20 osób (2 serie pobrań w różnych punktach czasowych, 2 powtórzenia na osobę w każdym punkcie czasowym) przy użyciu platformy Illumina NextSeq, co pozwoliło na uzyskanie średnio 47,7 miliona odczytów par końców (paired-end reads) oraz średnio 3,4 miliona skorygowanych błędów sekwencji konsensusowych na bibliotekę4. Średnie pokrycie nukleotydowe na bibliotekę wynosiło około 6 000x (3,4 miliona podzielone przez 568). Dla każdej próbki opracowano specyficzny dla pozycji profil błędów, wykorzystując zsekwencjonowane biblioteki pochodzące z innych próbek. Zidentyfikowano 109 klonalnych mutacji somatycznych, które występowały w obu powtórzeniach co najmniej jednego punktu czasowego pobrania. Mutacje te charakteryzowały się VAF w zakresie 0,0003–0,1451. Wybrano 21 mutacji z potwierdzoną reprezentacją w bazie COSMIC, a następnie wszystkie 21 mutacji zwalidowano w jednym lub dwóch punktach czasowych pobrania przy użyciu ddPCR (n = 34, Rysunek 2, zaadaptowano z Young et al. 20164).
<img alt="Wykres korelacji VAF pomiędzy ECS a ddPCR, regresja liniowa, R²=0,9965, dane eksperymentalne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57509/57509fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Mutacje zidentyfikowane za pomocą ECS zostały zweryfikowane metodą ddPCR, wykazując wysoce zgodne wartości VAF. (n=34, zmodyfikowano na podstawie Young et al. 20164). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57509/57509fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
W odniesieniu do poziomu ekspresji skorygowanego o błędy przy użyciu protokołu ECS-RNA, opracowaliśmy niestandardowy panel genów w oparciu o technologię QIAseq, składający się z 416 genów znanych z powiązania z różnymi nowotworami (adaptowany z panelu QIAseq Human Cancer Transcriptome) i przeprowadziliśmy amplifikację najczęściej ekspresjonowanego eksonu danego genu (lista genów w Supplementary Material 1). Biblioteki sekwenowano na platformie Illumina MiSeq w formacie paired-end, co dało średnio 8,3 miliona odczytów na bibliotekę, a nam udało się uzyskać średnio 0,417 miliona skorygowanych o błędy sekwencji konsensusowych. Wykazaliśmy, że poziom ekspresji transkryptów o niskiej liczebności (&lt;1 000 kopii transkryptu w 50 ng całkowitego RNA) jest wysoce powtarzalny między powtórzeniami (liczba punktów danych n = 300, Rysunek 3). Walidacja za pomocą ddPCR (sześć wybranych genów o różnym stopniu ekspresji) wykazała, że poziom ekspresji genów został prawidłowo uchwycony przez protokół ECS bez konieczności normalizacji.
<img alt="Wykresy rozrzutu liczby transkryptów ECS-RNA, korelacja logarytmiczna z ddPCR, pokazująca regresję liniową." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57509/57509fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Góra, korelacja liczby transkryptów metodą ECS-RNA pomiędzy powtórzeniami tej samej próbki (n = 300). Dół, liczba transkryptów zidentyfikowanych metodą ECS została zweryfikowana za pomocą ddPCR (n = 6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57509/57509fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) to potężne narzędzie do charakterystyki genomu, które jest ograniczone przez wysoki poziom błędów platformy (~0,5–2,0%). Opisujemy nasze metody sekwencjonowania z korekcją błędów, które pozwalają nam wyeliminować wskaźnik błędów NGS i wykryć mutacje przy frakcjach alleli wariantów tak rzadkich, jak 0,0001.

Wykrywanie rzadkich zdarzeń za pomocą sekwencjonowania DNA i RNA z korekcją błędów

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kilka kluczowych pytań w różnych dziedzinach badań, takich jak wykrywanie przedrakowych klonów, ocena prognostyczna pacjentów z białaczką po leczeniu oraz identyfikacja potencjalnie patogennych mutacji u dawców szpiku kostnego. Tę procedurę zademonstruje mi Spencer, który jest technikiem w laboratorium. Ten film opisuje, jak połączyć protokół sekwencjonowania z korekcją błędów z chemią Illumina i dostępnymi na rynku panelami genów w celu wykrywania klonalnych wariantów pojedynczych nukleotydów i małych indeli z czułością 1 na 10 000.Aby wprowadzić wymagane unikalne identyfikatory molekularne, niestandardowe adaptery 16N i5 i i7 wykorzystują PCR. Najpierw przygotuj Q5 Master Mix, który wykorzystuje polimerazę o wyższej wierności niż dostępna na rynku alternatywa. Następnie, dla każdej reakcji, połącz 37,5 mikrolitrów Q5 Master Mix, sześć mikrolitrów pięciu mikromolowych adapterów 16N i5, które są unikalnymi identyfikatorami molekularnymi, oraz sześć mikrolitrów adapterów i7.Jeśli celem jest multipleksowanie, użyj różnych adapterów i7 w oddzielnych próbkach. Teraz uruchom PCR, używając następujących parametrów: trzydzieści sekund w 98 stopniach Celsjusza, a następnie cztery do sześciu cykli po dziesięć sekund w 98 stopniach Celsjusza, trzydzieści sekund w 66 stopniach Celsjusza i trzydzieści sekund w 72 stopniach Celsjusza. Zakończ reakcję dwuminutowym przedłużeniem w temperaturze 72 stopni Celsjusza i przytrzymaj w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnie oba cykle PCR, które musisz na nich wykonać, najprawdopodobniej zależą od wielkości panelu genów, którego używasz, z naszego doświadczenia wynika, że czterocyklowy PCR jest wystarczający, jeśli panel genów ma około 1500 różnych ścieżek oligonukleotydów specyficznych dla genu, podczas gdy panel z około pięcioma do 600 parami oligonukleotydów wymaga około sześciu cykli PCR. Następnie oczyść reakcje PCR za pomocą kulek magnetycznych, dodaj 56,25 mikrolitra roztworu kulek magnetycznych do każdego produktu PCR o pojemności 75 mikrolitrów, a następnie przenieś każdą reakcję do oddzielnej 1,5 mililitrowej probówki o niskiej wiązalności, zmieszanej przez pipetowanie w górę iw dół co najmniej dziesięć razy i odczekaj pięć minut. Następnie przenieś mieszaniny do uchwytu magnetycznego i pozwól supernatantom oczyścić się przez dwie minuty.Następnie usunąć i wyrzucić supernatanty. Następnie dodaj 200 mikrolitrów 70% etanolu, odczekaj trzydzieści sekund, a następnie usuń etanol. Powtórz ten etap mycia etanolem raz, a następnie pozostaw kulki do wyschnięcia na powietrzu przez pięć minut.Na koniec wymyj zmodyfikowane biblioteki z kulek w dwudziestu mikrolitrach podwójnie destylowanej wody. Następnie umieść probówki na stojaku magnetycznym, aby oddzielić kulki magnetyczne od eluentu. Po pierwsze, należy dokonać dziesięciokrotnego seryjnego rozcieńczenia bibliotek ECS w porównaniu z poprzednim krokiem, aż do jednej części na 1000 w paskach PCR.Następnie przygotuj Master Mix w 1,5 mililitrowej tubce. Do każdej reakcji połącz 10 mikrolitrów ddPCR EvaGreen Mix, 0,2 mikrolitra startera P5, 0,2 mikrolitra startera P7 i 4,6 mikrolitra podwójnie destylowanej wody. Następnie odpipetuj 15 mikrolitrów EvaGreen Master Mix do nowego zestawu probówek, a na koniec dodaj pięć mikrolitrów od jednego do 1 000 oczyszczonego produktu ECS do Master Mix.Następnie wykonaj kropelki PCR za pomocą generatora kropel. Najpierw załaduj kasetę, odpipetuj 70 mikrolitrów oleju wytwarzającego kropelki do studzienki kasety, oznaczonego oleju i odpipetuj 20 mikrolitrów mieszaniny reakcyjnej ddPCR do dobrze oznakowanej próbki. Następnie przykryj kasetę gumową uszczelką i załaduj ją do generatora kropel, a następnie całe wytwarzanie kropel, aby kontynuować.Teraz, używając pipety wielokanałowej, powoli, przez pięć sekund, załaduj 45 mikrolitrów kropelek pobranych z każdej studzienki kasety na nową płytkę PCR. Następnie uszczelnij płytkę PCR folią aluminiową. Teraz wzmocnij sygnał w kropelkach, używając następujących warunków: pięć minut w 95 stopniach Celsjusza, a następnie 40 cykli po trzydzieści sekund w 95 stopniach Celsjusza i jedna minuta w 63 stopniach Celsjusza, a następnie schłodzić reakcję do czterech stopni Celsjusza przez pięć minut, a następnie podnieść ją do 90 stopni Celsjusza na pięć minut, a następnie trzymanie w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnie przygotuj maszynę do czytnika kropelek szablonu ddPCR. Wybierz parametry bezwzględnej kwantyfikacji i użycia QX200 ddPCR EvaGreen Supermix. Następnie przepuść reakcje przez czytnik kropel.Po zakończeniu analizy ddPCR należy zastosować te same progi dzielące do każdej próbki. Następnie znormalizuj każdą bibliotekę do żądanej liczby cząsteczek. Zacznij od wykonania 50 mikrolitrowych reakcji, składających się z 25 mikrolitrów Q5 Master Mix, dwóch mikrolitrów jednego mikromolowego startera P5, dwóch mikrolitrów jednego mikromolowego startera P7 i 21 mikrolitrów znormalizowanej biblioteki DNA.Następnie uruchom PCR przy użyciu następujących parametrów: 30 sekund w 98 stopniach Celsjusza, a następnie 16 cykli po 10 sekund w 98 stopniach Celsjusza, trzydzieści sekund w 66 stopniach Celsjusza i trzydzieści sekund w 72 stopniach Celsjusza, następnie dwie minuty w 72 stopniach Celsjusza i przytrzymaj w czterech stopniach Celsjusza. Następnie określ ilościowo stężenie DNA w bibliotekach i połącz biblioteki w równych ilościach molowych do sekwencjonowania, celując w około cztery nanomolowe. Teraz zsekwencjonuj pulę biblioteki ECS za pomocą platformy sekwencjonowania Illumina, z następującymi ustawieniami sekwencjonowania: dwa razy 144 odczyty sparowanych końców, osiem cykli indeksu pierwszego i 16 cykli indeksu drugiego.DNA pacjenta z mutacją w GATA1 rozcieńczono w komercyjnym genomowym DNA przy pierwotnym VAF wynoszącym 0,19. Korzystając z opisanego protokołu, ECS okazał się ilościowy na poziomie od 1 do 10 000 dla wariantu pojedynczego nukleotydu. Następnie próbki sierści buffy od dwudziestu zdrowych osób zostały przeanalizowane przy użyciu komercyjnego panelu sekwencjonowania, który składa się z 568 amplikonów.Podsumowując, 109 klonalnych mutacji somatycznych było obecnych w obu powtórzeniach co najmniej jednego punktu czasowego zbierania, przy czym wybrano warianty alleli o frakcjach w zakresie od 0,0003 do 0,1451,21 mutacji o znanych kosmicznych reprezentacjach, a każda z nich została zwalidowana za pomocą cyfrowego PCR kropelkowego. Aby zademonstrować skorygowany o błędy poziom ekspresji w protokole, wykorzystano dostosowany panel genów składający się z 415 genów, o których wiadomo, że są związane z różnymi nowotworami, do stworzenia biblioteki zbudowanej z najczęściej eksonu ekspresji każdego genu. Poziom ekspresji transkryptu o niskiej liczebności był wysoce powtarzalny między powtórzeniami.Następnie wykorzystano cyfrowy test PCR kropelkowy do walidacji sześciu wybranych genów o różnej ekspresji. Porównanie pokazuje, że poziom ekspresji genów został prawidłowo uchwycony przez protokół ECS, bez konieczności normalizacji. Kiedy już opanujesz technikę, możesz ją wygodnie wykonać w półtora dnia.Większość czasu będzie poświęcona na inkubację, a ręczna obsługa zajmie około 30-40% całkowitego wymaganego czasu, w zależności od tego, ile próbek naukowcy przetwarzają w tym samym czasie. Podczas próby wykonania tej procedury bardzo ważne jest, aby mieć replikowaną bibliotekę sekwencjonowania dla tej samej próbki. Da ci to większą pewność, że mutacje o niskiej częstotliwości są naprawdę pozytywne, jeśli sama mutacja jest niezależnie rdzeniem w obu powtórzeniach.Zgodnie z tą procedurą, można wykonać inne czynności, takie jak RNA ECS, aby odpowiedzieć na pytania, takie jak wykrywanie transkryptu o niskiej liczebności lub transkryptu fuzyjnego. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom głównie w dziedzinie nowotworów hematologicznych, a my używamy tej techniki do badania klonów przedbiałaczkowych u zdrowych osób, a także do wykrywania choroby o minimalnej ilości resztkowej u pacjentów z białaczką, którzy są w remisji.

rare-event-detection-using-error-corrected-dna-and-rna-sequencing

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Sekwencjonowanie puli DNA jest szybką i kosztowo efektywną strategią wykrywania rzadkich wariantów związanych ze złożonymi fenotypami w dużych kohortach. W niniejszym materiale opisujemy analizę obliczeniową sekwencjonowania nowej generacji pul 32 genów związanych z nowotworami przy użyciu pakietu oprogramowania SPLINTER. Metoda ta jest skalowalna i może być zastosowana do dowolnego analizowanego fenotypu.

Wykrywanie rzadkich wariantów genomicznych z sekwencjonowania pulującego przy użyciu SPLINTER

Ten film demonstruje cyfrowy PCR oparty na chipie — odmianę techniki cyfrowego PCR, która jest przydatna w wykrywaniu rzadkich wariantów transkryptu. Reakcja PCR jest podzielona na komory nanofluidycznego chipa, z których każdy działa jak niezależna reakcja. Detekcja sygnałów fluorescencyjnych z komór ze wzmocnionymi celami potwierdza obecność w próbce rzadkich wariantów transkryptu.

Cyfrowy PCR oparty na chipie do wykrywania rzadkich wariantów transkryptu za pomocą chipa nanofluidycznego

Blokowanie PCR typu dzikiego, a następnie sekwencjonowanie bezpośrednie, oferuje bardzo czułą metodę wykrywania mutacji somatycznych o niskiej częstotliwości w różnych typach próbek.

PCR blokujący typu dzikiego w połączeniu z sekwencjonowaniem bezpośrednim jako wysoce czuła metoda wykrywania mutacji somatycznych o niskiej częstotliwości

Tutaj prezentujemy protokół śledzenia zanieczyszczenia genomowym DNA (gDNA) w próbkach RNA. W prezentowanej metodzie wykorzystuje się startery specyficzne dla wewnętrznego transkrybowanego regionu dystansowego (ITS) genów rybosomalnego DNA (rDNA). Metoda ta nadaje się do niezawodnego i czułego wykrywania zanieczyszczenia DNA u większości eukariontów i prokariontów.

Ocena zanieczyszczenia DNA w próbkach RNA na podstawie rybosomalnego DNA

Ten manuskrypt opisuje technikę wykrywania mutacji o niskiej częstotliwości w ctDNA, ER-Seq. Metoda ta wyróżnia się unikalnym zastosowaniem dwukierunkowej korekcji błędów, specjalnego filtra tła i wydajnej akwizycji molekularnej.

Wykrywanie rzadkich mutacji w ctDNA za pomocą sekwencjonowania nowej generacji

Ten protokół dostarcza badaczom nowego narzędzia do monitorowania wierności transkrypcji w wielu organizmach modelowych.

Nadzór całego genomu nad błędami transkrypcji w organizmach eukariotycznych

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania mutacji somatycznych nowotworu w krążącym DNA obecnym w płynach biologicznych pacjenta (biofluidach). Nasza metoda oparta na kropelkowej cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy (dPCR) umożliwia ilościowe określenie częstości alleli mutacji nowotworowych (MAF), ułatwiając minimalnie inwazyjne uzupełnienie diagnozy i czasowego monitorowania odpowiedzi guza.

Wykrywanie i monitorowanie krążącego DNA związanego z nowotworem w płynach biologicznych pacjenta

Szybkie wykrywanie i wiarygodna ilościowa identyfikacja zdarzeń edycjonujących RNA na skalę genomową pozostają wyzwaniem i obecnie opierają się na bezpośrednich metodach sekwencjonowania RNA. Opisany tutaj protokół wykorzystuje elektroforezę żelową z gradientem mikrotemperatury (μTGGE) jako prostą, szybką i przenośną metodę wykrywania edycji RNA.

Podejście niesekwencjonujące do szybkiego wykrywania edycji RNA

W tym miejscu przedstawiamy protokół badania metylacji DNA w całym genomie w klinicznych badaniach przesiewowych pacjentów na dużą skalę przy użyciu technologii sekwencjonowania Methyl-Binding DNA Capture (MBDCap-seq lub MBD-seq) i późniejszej analizy bioinformatycznej.

Wychwytywanie DNA wiążącego metyl Sekwencjonowanie tkanek pacjenta

Sekwencjonowanie pojedynczych komórek jest coraz bardziej popularnym i dostępnym narzędziem do rozwiązywania problemów związanych ze zmianami genomowymi w wysokiej rozdzielczości. Udostępniamy protokół, który wykorzystuje sekwencjonowanie pojedynczych komórek do identyfikacji zmian liczby kopii w pojedynczych komórkach.

Wykrywanie zmian numeru kopii za pomocą sekwencjonowania pojedynczych komórek

Poznaj metodę sekwencjonowania z korekcją błędów wykorzystującą chemię Illumina i panele genowe do wykrywania rzadkich mutacji somatycznych z czułością 1:10 000. Technika umożliwia identyfikację klonów przedrakowych i ocenę minimalnej choroby resztkowej.

Wykrywanie rzadkich zdarzeń za pomocą sekwencjonowania DNA i RNA z korekcją błędów

Przeglądaj więcej filmów