Izolacja i charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych dorosłego Schistosoma japonicum

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z pożywki dorosłego Schistosoma japonicum hodowanego in vitro. Metoda ta pozwala skutecznie wyizolować EV w pożywce do hodowli in vitro od dorosłego Schistosoma japonicum. Główną zaletą tej techniki jest możliwość skutecznego odizolowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z krótkoterminowej pożywki do hodowli in vitro, co może zminimalizować stres, który potencjalnie może prowadzić do niefizjologicznego wydzielania EV.

Demonstrację poprowadzi Juntao Liu, technik z mojego laboratorium. Zbierz pasożyty do 500-mililitrowej zlewki i umyj je dokładnie, ale delikatnie trzy razy za pomocą 200 mililitrów ciepłego PBS. Utrzymuj krótkie płukanie i użyj sedymentacji grawitacyjnej, aby oddzielić pasożyty.

Następnie na 90-milimetrowych szalkach ułóż około 200 par robaków na naczynie. W naczyniu umyj pasożyty jeszcze dwa razy za pomocą sedymentacji grawitacyjnej. Do tych prań użyj ciepłego podłoża RPMI uzupełnionego paciorkowcem.

Zastąp drugie pranie 40 mililitrami pożywki bez antybiotyków. Następnie hoduj pasożyty w temperaturze 37 stopni Celsjusza poniżej 5% dwutlenku węgla przez dwie godziny. Po dwóch godzinach przenieś pożywkę z płytek do probówek wirówkowych, a następnie połącz jaja i resztki robaków w ilości 2 000 g przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnie zebrać i przenieść supernatant do świeżej probówki. Następnie przefiltruj supernatant przez filtr strzykawkowy o grubości 0,22 mikrona i zbierz przefiltrowany roztwór do worka dializacyjnego z granicą masy cząsteczkowej 3,5 kilodaltonów. Następnie dializuje roztwór, używając 8% roztworu PEG8000 w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.

Ten krok jest ważny dla zwiększenia wydajności pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Następnego dnia przenieś dializowany roztwór do nowej probówki i dodaj 0,5 objętości całkowitego odczynnika do izolacji egzosomów. Wymieszaj roztwór, aż stanie się jednorodny i inkubuj przez noc w temperaturze około pięciu stopni Celsjusza.

Następnego ranka odwirować mieszaninę w stężeniu 15 000 g przez godzinę w temperaturze około pięciu stopni Celsjusza. Następnie odessać i wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad EV w dwóch mililitrach PBS. Śrut prawdopodobnie nie będzie widoczny.

W przypadku analizy western blot należy najpierw określić stężenie białka w próbce, na przykład za pomocą testu BCA. Następnie przygotuj od 10 do 20 mikrogramów EV w 22,5 mikrolitrach buforu RIPA. Następnie dodaj 7,5 mikrolitra bufora ładującego 4X i podgrzewaj mieszaninę w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut.

Po obróbce cieplnej oddzielić białka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych na 12% żelu SDS-PAGE. Po uruchomieniu żelu białka są przenoszone do błony PVDF. Zbadaj błonę przeciwciałami anty-CD63 w rozcieńczeniu jeden do 1 000.

Następnie należy potraktować membranę anty-króliczą IgG-HRP w rozcieńczeniu od jednego do 5 000. Teraz użyj odczynnika do wykrywania ECL, aby opracować membranę, a następnie przeprowadź analizę w systemie obrazowania chemiluminescencyjnego. Zacznij od przeniesienia pięciu mikrogramów próbki do polipropylenowej probówki ultrawirówkowej i dostosuj objętość do 12 mililitrów za pomocą pożywki RPMI-1640.

Następnie odwirować próbkę o masie 110 000 g przez 90 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odwirowaniu ostrożnie odessać i wyrzucić supernatant. Następnie przygotuj 2X zawiesinę pęcherzyków zewnątrzkomórkowych, dodając jeden mililitr rozcieńczalnika C do granulki.

Zawiesić osad za pomocą delikatnego pipetowania. Teraz przygotuj świeży roztwór barwnika 2X. Dodaj dwa mikrolitry barwnika etanolowego PKH67 do jednego mililitra rozcieńczalnika C w probówce do mikrofuge i dobrze wymieszaj.

Następnie wybarwić próbkę, mieszając ze sobą dwa roztwory i inkubując mieszaninę w temperaturze pokojowej przez cztery minuty. Następnie przerwij barwienie, dodając cztery mililitry FBS i odczekaj kolejną minutę. Następnie dodaj pożywkę RPMI-1640, aby dostosować objętość do 12 mililitrów i odkręć zawiesinę, aby wyizolować poplamione pęcherzyki.

Usunąć i wyrzucić sklarowany osad. Następnie ponownie zamieszaj granulowane pojazdy elektryczne z oznaczeniem PKH67 w 12 mililitrach pożywki RPMI-1640. Następnie powtórz wirowanie, ale tym razem zbierz pęcherzyki w jednym mililitrze PBS.

Do testu wychwytu należy przygotować przez noc hodowle komórek ssaków na płytkach sześciodołkowych. Następnego ranka dodaj pięć mikrogramów pęcherzyków znakowanych PKH67 do każdej studzienki i kontynuuj hodowlę przez dwie do czterech godzin. Po inkubacji usunąć pożywkę i dwukrotnie przemyć komórki PBS.

Następnie utrwal komórki przez 15 minut, umyj je dwukrotnie PBS i wybarwij DAPI przed obrazowaniem. Schistosomy w fazie wątroby pobrano od królików 28 dni po zakażeniu. Następnie pobrano pęcherzyki zewnątrzkomórkowe od robaków schistosomów i poddano analizie.

Ich wielkość cząstek, określona przez analizę nanocząstek Malvern, wahała się od 100 do 400 nanometrów, przy czym większość populacji zbliżała się do 220 nanometrów. Transmisyjna mikroskopia elektronowa wykazała, że pęcherzyki zewnątrzkomórkowe są okrągłe i mają średnicę od 100 do 200 nanometrów. Analiza Western blot wykazała, że izolowane pęcherzyki zewnątrzkomórkowe zostały rozpoznane za pomocą przeciwciał CD63, które są typowym markerem pęcherzyków zewnątrzkomórkowych.

Mikroskopia fluorescencyjna pęcherzyków zewnątrzkomórkowych znakowanych PKH67 zinternalizowanych przez komórki klonu NCTC 1469 wykazała, że pęcherzyki zewnątrzkomórkowe były rozmieszczone głównie w cytoplazmie komórek biorcy. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyizolować EV w pożywce hodowlanej in vitro od dorosłego Schistosoma japonicum.