Name: Izolacja i charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych dorosłego Schistosoma japonicum (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Naucz się izolować pęcherzyki zewnątrzkomórkowe z dorosłych Schistosoma japonicum w krótkoterminowej kulturze in vitro. Ta metoda minimalizuje stres pasożyta, zapewniając fizjologiczną sekrecję EV do badań biologii pasożytniczej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było, częściowo lub w całości, wspierane przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (31472187 i 31672550) oraz Program Innowacji Nauk i Technologii Rolniczych Chińskiej Akademii Nauk Rolniczych.

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez lokalną komisję etyczną Instytutu Badań Weterynaryjnych w Szanghaju, Chińskiej Akademii Nauk Rolniczych (numer zezwolenia: SHVRIAU-14-0101).
1. Hodowla schistoposomów in vitro
Uwaga: Schistosomy stanowią zagrożenie biologiczne. Pracownicy powinni nosić rękawice lateksowe przez cały czas pracy z robakami, zawiesinami schistosomalnymi lub innymi pokrewnymi materiałami biologicznymi. Króliki nowozelandzkie zostały zarażone ~ 2,000 cerkarii poprzez ekspozycję brzuszną. Schistosomy w fazie wątroby pobrano od królików zakażonych S. japonicum cercariae po 28 dniach od zakażenia przez perfuzję żył wątrobowych i krezkowych. Procedury zbierania robaków zostały omówione w poprzednich publikacjach opisujących badania na myszach18.
<ol>
	<li>Zbierz pasożyty w zlewce o pojemności 500 ml. Umyj je dokładnie i delikatnie 3x 200 ml podgrzanego (37 °C) PBS (pH 7,4).</li>
	<li>Oddziel ~200 par robaków na każdą szalkę Petriego o średnicy 90 mm. Następnie dokładnie i delikatnie umyć pasożyty 2x 50 ml podgrzanej (37 °C) pożywki hodowlanej RPMI-1640 zawierającej 100 j. penicyliny i 100 mg/ml streptomycyny.</li>
	<li>Utrzymuj pasożyty w 40 ml podgrzanej pożywki hodowlanej RPMI-1640 bez antybiotyków w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO2 przy gęstości ~5 par robaków / ml przez 2 godziny na szalce Petriego o średnicy 90 mm 
	Notatki: Pożywka RPMI 1640 nie powinna zawierać surowicy, w przeciwnym razie zostaną wprowadzone egzogenne pęcherzyki zewnątrzkomórkowe.</li>
</ol>
2. Wstępnie poddane obróbce media
<ol>
	<li>Zebrać pożywkę hodowlaną, a następnie odwirować pożywkę w temperaturze 4 °C w temperaturze 2 000 × g przez 30 minut w celu usunięcia jaj i resztek robaków.</li>
	<li>Przenieść supernatant do świeżej probówki, a następnie przefiltrować roztwór za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 μm.</li>
	<li>Przefiltrowany roztwór należy zebrać do worka do dializacji (granica masy cząsteczkowej: 3,5 kD), a następnie dializować roztwór przy użyciu 8% roztworu PEG8000 w temperaturze 4 °C przez noc. 
	Notatki: Ten krok jest ważny dla wzbogacenia SjEVs w celu zwiększenia wydajności izolacji SjEVs.</li>
</ol>
3. Izolacja SjEVs
<ol>
	<li>Przenieś dializowany roztwór do nowej probówki, a następnie dodaj 0,5 objętości całkowitego odczynnika do izolacji egzosomów.</li>
	<li>Dobrze wymieszaj roztwór, wirując lub pipetując w górę iw dół, aby zapewnić jednorodność roztworu.</li>
	<li>Inkubować mieszaninę w temperaturze od 2 °C do 8 °C przez noc.</li>
	<li>Odwirować mieszaninę w temperaturze 15 000 × g przez 1 godzinę w temperaturze od 2 °C do 8 °C.</li>
	<li>Odessać i wyrzucić supernatant. 
	Notatki: EV znajdują się w granulce na dnie rurki (w większości przypadków niewidoczne).</li>
	<li>Zawiesić osad EVs w 2 ml PBS, a następnie przechowywać roztwór EVs w temperaturze -80 °C do czasu dalszej analizy.</li>
</ol>
4. Charakterystyka EV za pomocą Western Blotting
<ol>
	<li>Oznaczyć stężenie białka w próbce SjEVs, np. za pomocą testu BCA.</li>
	<li>Przygotuj 10 - 20 μg EV w buforze RIPA o pojemności 22,5 μl. Następnie dodać 7,5 μl 4x bufora ładującego i podgrzewać przez 5 minut w temperaturze 95 °C.</li>
	<li>Oddziel białka SjEVs za pomocą 12% żelu SDS-PAGE.</li>
	<li>Przenieś białka do błony PVDF, a następnie sonduj przeciwciałami anty-CD63 (rozcieńczenie 1:1,000), a następnie sonduj anty-króliczą IgG-HRP (rozcieńczenie 1:5,000).</li>
	<li>Użyj odczynnika do wykrywania ECL do opracowania membrany i wykryj sygnały za pomocą systemu obrazowania chemiluminescencyjnego.</li>
</ol>
5. Charakterystyka EV za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej
<ol>
	<li>Dodaj 2 μl izolowanych SjEVs do siatek pokrytych formą o oczkach 200, a następnie pozostaw do wyschnięcia w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Plamić 2% kwasem fosfowolframowym przez 1 minutę, a następnie pozostawić do wyschnięcia w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Załaduj siatki na uchwyt próbki transmisyjnego mikroskopu elektronowego i wystaw na działanie wiązki elektronów 80 kV w celu uchwycenia obrazu.</li>
</ol>
6. Etykieta SjEVs z PKH67 i testem wychwytu komórek
Uwagi: Wszystkie kolejne kroki były wykonywane w temperaturze otoczenia (20 - 25 °C), chyba że zaznaczono inaczej.
<ol>
	<li>Przenieś 5 μg roztworu SjEVs do stożkowej dolnej probówki polipropylenowej i dostosuj objętość do 12 ml, dodając pożywkę RPMI 1640.</li>
	<li>Odwirować SjEVs w temperaturze 110 000 × g przez 90 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzania SjEVs.</li>
	<li>Po odwirowaniu ostrożnie odessać supernatant. 
	nuta: Barwnika etanolowego PKH67 nie należy dodawać bezpośrednio do granulatu SjEV, ponieważ spowodowałoby to niejednorodne zabarwienie i zmniejszoną żywotność komórek.</li>
	<li>Przygotować roztwór zawiesiny 2x EV, dodając 1 ml rozcieńczalnika C do granulki SjEV; aby zapewnić całkowitą dyspersję, ponownie zawiesić za pomocą delikatnego pipetowania.</li>
	<li>Tuż przed barwieniem w rozcieńczalniku C przygotuj świeży 2x roztwór barwnika, dodając 2 μl roztworu barwnika etanolowego PKH67 do 1 ml rozcieńczalnika C w probówce wirówki polipropylenowej i dobrze mieszając do dyspersji.</li>
	<li>Szybko dodaj 1 ml zawiesiny 2x EV (krok 6.4) do 1 ml 2x roztworu barwnika (krok 6.5) i natychmiast wymieszaj próbkę przez pipetowanie.</li>
	<li>Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 4 minuty.</li>
	<li>Zatrzymaj barwienie, dodając 4 ml FBS, a następnie inkubuj przez 1 minutę.</li>
	<li>Dodać RPMI1640 pożywkę, aby dostosować objętość do 12 ml, a następnie odwirować w temperaturze 110 000 × g w temperaturze 4 °C przez 90 minut.</li>
	<li>Usunąć supernatant i dodać RPMI1640 pożywkę, aby ponownie zawiesić granulki SjEV oznaczone PKH67.</li>
	<li>Odwirować w temperaturze 110 000 × g w temperaturze 4 °C przez 90 minut w celu jednokrotnego umycia, a następnie dodać PBS w celu ponownego zawieszenia granulek SjEVs.</li>
</ol>
7. Test wychwytu komórek SjEVs
<ol>
	<li>Komórki nasienne ssaków, takie jak NCTC, klonują 1469 komórek lub HEK293T komórek na płytkach 6-dołkowych (2× 10,5 komórek na dołek) i hodują komórki przez noc.</li>
	<li>Dodać 5 μg SjEV znakowanych PKH67, a następnie hodować komórki w temperaturze 37 °C przez 2-4 godziny.</li>
	<li>Po inkubacji usunąć pożywkę i dwukrotnie przemyć komórki PBS.</li>
	<li>Utrwal komórki 4% roztworem formaldehydu przez 15 minut i umyj jeszcze dwukrotnie PBS.</li>
	<li>Barwienie jąder komórkowych 4′,6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI).</li>
	<li>Obserwuj komórki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.</li>
</ol>

<ol><li>Tetta, C., Ghigo, E., Silengo, L., Deregibus, M. C., Camussi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+as+an+emerging+mechanism+of+cell-to-cell+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles as an emerging mechanism of cell-to-cell communication.</a> Endocrine. 44 (1), 11-19 (2013).</li>
<li>Abels, E. R., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+to+Extracellular+Vesicles%3A+Biogenesis%2C+RNA+Cargo+Selection%2C+Content%2C+Release%2C+and+Uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Introduction to Extracellular Vesicles: Biogenesis, RNA Cargo Selection, Content, Release, and Uptake.</a> Cell Mol Neurobiol. 36 (3), 301-312 (2016).</li>
<li>Riaz, F., Cheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome-like+vesicles+of+helminths%3A+implication+of+pathogenesis+and+vaccine+development%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Exosome-like vesicles of helminths: implication of pathogenesis and vaccine development.</a> Ann Transl Med. 5 (7), 175(2017).</li>
<li>Zhang, H. G., Grizzle, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+and+cancer%3A+a+newly+described+pathway+of+immune+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Exosomes and cancer: a newly described pathway of immune suppression.</a> Clin Cancer Res. 17 (5), 959-964 (2011).</li>
<li>Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis%2C+secretion%2C+and+intercellular+interactions+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 255-289 (2014).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+RNA+is+enriched+and+stable+in+exosomes%3A+a+promising+biomarker+for+cancer+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Circular RNA is enriched and stable in exosomes: a promising biomarker for cancer diagnosis.</a> Cell Res. 25 (8), 981-984 (2015).</li>
<li>Marcilla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+in+parasitic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles in parasitic diseases.</a> J Extracell Vesicles. 3, 25040(2014).</li>
<li>Cwiklinski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Extracellular+Vesicles+of+the+Helminth+Pathogen%2C+Fasciola+hepatica%3A+Biogenesis+Pathways+and+Cargo+Molecules+Involved+in+Parasite+Pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">The Extracellular Vesicles of the Helminth Pathogen, Fasciola hepatica: Biogenesis Pathways and Cargo Molecules Involved in Parasite Pathogenesis.</a> Mol Cell Proteomics. 14 (12), 3258-3273 (2015).</li>
<li>Buck, A. H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25421927">Exosomes secreted by nematode parasites transfer small RNAs to mammalian cells and modulate innate immunity.</a> Nat Commun. 5, 5488(2014).</li>
<li>Sotillo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+secreted+by+Schistosoma+mansoni+contain+protein+vaccine+candidates%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles secreted by Schistosoma mansoni contain protein vaccine candidates.</a> Int J Parasitol. 46 (1), 1-5 (2016).</li>
<li>Nowacki, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+and+small+non-coding+RNA-enriched+extracellular+vesicles+are+released+by+the+pathogenic+blood+fluke+Schistosoma+mansoni%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Protein and small non-coding RNA-enriched extracellular vesicles are released by the pathogenic blood fluke Schistosoma mansoni.</a> J Extracell Vesicles. 4, 28665(2015).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome-like+vesicles+derived+by+Schistosoma+japonicum+adult+worms+mediates+M1+type+immune-+activity+of+macrophage%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol+Res%22%5BJournal%5D)">Exosome-like vesicles derived by Schistosoma japonicum adult worms mediates M1 type immune- activity of macrophage.</a> Parasitol Res. 114 (5), 1865-1873 (2015).</li>
<li>Koh, Y. Q., Almughlliq, F. B., Vaswani, K., Peiris, H. N., Mitchell, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+enrichment+by+ultracentrifugation+and+size+exclusion+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci+%28Landmark+Ed%29%22%5BJournal%5D)">Exosome enrichment by ultracentrifugation and size exclusion chromatography.</a> Front Biosci (Landmark Ed). 23, 865-874 (2018).</li>
<li>Safdar, A., Saleem, A., Tarnopolsky, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+endurance+exercise-derived+exosomes+to+treat+metabolic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">The potential of endurance exercise-derived exosomes to treat metabolic diseases.</a> Nat Rev Endocrinol. 12 (9), 504-517 (2016).</li>
<li>Livshits, M. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26616523">Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol.</a> Sci Rep. 5, 17319(2015).</li>
<li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+extracellular+vesicles+containing+small+RNAs+from+the+eggs+of+Schistosoma+japonicum%5BTitle%5D)+AND+%22Parasit+Vectors%22%5BJournal%5D)">Release of extracellular vesicles containing small RNAs from the eggs of Schistosoma japonicum.</a> Parasit Vectors. 9 (1), 574(2016).</li>
<li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+S.+japonicum+exosome-like+vesicles+reveals+their+regulatory+roles+in+parasite-host+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of S. japonicum exosome-like vesicles reveals their regulatory roles in parasite-host interactions.</a> Sci Rep. 6, 25885(2016).</li>
<li>Lewis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Schistosomiasis.</a> Curr Protoc Immunol. , Chapter 19 Unit 19 11(2001).</li>
<li>Cheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+miRNAs%3A+roles+in+cancer+diagnosis%2C+prognosis+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Circulating miRNAs: roles in cancer diagnosis, prognosis and therapy.</a> Adv Drug Deliv Rev. 81, 75-93 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ostatnie badania nad EV wykazały, że schistosomy EV odgrywają ważną rolę w interakcjach gospodarz-patogen 3,9,12,16. Aby jeszcze bardziej zająć się ich funkcjami regulacyjnymi, konieczne jest wyizolowanie EV od schistosomów. W tym miejscu opisujemy alternatywną metodę izolacji SjEV. Metoda ta pozwala uzyskać szeroki zakres wielkości SjEV, od 100 nm do 400 nm, u dorosłych S. japonicum. ...

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs) to populacja małych pęcherzyków błonowych otoczonych różnymi białkami, lipidami i kwasami nukleinowymi. Ostatnie badania wykazały, że EV odgrywają kluczową rolę w komunikacji między komórkami i biorą udział w regulacji wielu procesów fizjologicznych, w tym rozwoju komórek, regulacji immunologicznej, angiogenezy i migracji komórek2,3,4,5. Coraz więcej dowodów wskazuje, że EV, krążące egzosomy i ich ładunek miRNA stanowią potencjalne biomarkery niektórych chorób6.
Wykazano, że kilka pierwotniaków, takich jak Trichomonas vaginalis, Trypanosoma cruzi i Leishmania spp., są zdolne do wydzielania EV; dodatkowo odkryto, że robaki wydzielają EV do żywych gospodarzy7. Wykazano, że pasożytnicze EV są zaangażowane w utrzymanie infekcji, chorobotwórczości8 i regulację immunologiczną9. Ostatnie badania nad schistosomami, zarówno Schistosoma mansoni (S. mansoni) 10,11, jak i S. japonicum12 wykazały, że dorosłe schistosomy wydzielają pęcherzyki podobne do egzosomów, które mogą być zaangażowane w funkcjonalne regulacje określonych procesów biologicznych.
Do tej pory do izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych użyto kilku metod, takich jak ultrawirowanie, ultrafiltracja13, użycie odczynników na bazie polimerów, chromatografia wykluczająca rozmiar i izolacja immunoaffinity. Te różne metody mają swoje zalety i ograniczenia14. Ogólnie rzecz biorąc, ultrawirowanie jest uważane za złoty standard metody izolacji pęcherzyków. Jednak ta metoda cierpi z powodu ograniczenia potencjalnej agregacji EV14.
W schistosomach opisano kilka metod izolacji EV: obejmują one ultrawirowanie11,12,10 oraz użycie komercyjnego zestawu do izolacji EV16 dla kilku etapów (jaja16, schistosomula11, dorosłe schistosomomy10,12,17). Biorąc pod uwagę, że mikropęcherzyki mają szeroki zakres rozmiarów od kilkuset nanometrów do tysięcy nanometrów, opracowaliśmy alternatywną metodę, która łączy się z użyciem wirówki laboratoryjnej, ultrafiltracji i komercyjnego zestawu do izolacji EV w celu wyizolowania EV od dorosłego Schistosoma japonicum. Izolowane EV miały zazwyczaj średnicę 100 - 400 nm i były z powodzeniem internalizowane przez komórki biorcze.

<table><tbody><tr><td>Materiał</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Total Exosome Isolation Reagent (z pożywki do hodowli komórkowych)</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC 4478359</td><td></td><td>Do izolowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych S. japonicum</td></tr><tr><td>PKH67</td><td>Sigma-aldrich</td><td>MINI67</td><td>Do znakowania Evs</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC 11875119</td><td></td><td>Do hodowli pasożytów</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC 15140122</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,22&mu; m filtr strzykawkowy</td><td>Merck</td><td>SLGP033RB</td><td></td></tr><tr><td>Wężyk do dializy SnakeSkin</td><td>Thermo SCIENTIFIC</td><td>68035</td><td></td></tr><tr><td>PEG8000</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100159&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>RIPA</td><td>Beyotime</td><td>P0013B</td><td></td></tr><tr><td>EMD Millipore&handel; Immobilon&handel; Zachodni chemiluminescencyjny substrat HRP (ECL)</td><td>Fisher WBKLS0100</td><td>&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td> <td>DAPI</td><td>4083</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw BCA</td><td>Beyotime</td><td>P0010</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała CD63</td><td>Sangon Biotech</td><td>D160973-0025</td><td></td></tr><tr><td>PVDF</td><td>Bio-Rad</td><td>1704273</td><td></td></tr><tr><td>Formvar/Carbon 400 mesh</td><td>Ted Pella</td><td>01754-F</td><td></td></tr><tr><td>Kwas fosfowolframowy</td><td>Ted Pella</td><td>19402</td><td></td></tr><tr><td>anty-mysie IgG-HRP</td><td>CWBIO</td><td>CW0102</td><td></td></tr><tr><td>NCTC klon 1469 komórek</td><td>ATCC</td><td>ATCC & reg; CCL-9.1 i handel;</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>HyClone</td><td>SV30087.02</td><td></td></tr><tr><td>Equipments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GE system obrazowania chemoluminescencji</td><td>GE</td><td>ImageQuant LAS4000mini</td><td></td></tr><tr><td>Transmisyjna mikroskopia elektronowa</td><td>Hitachi</td><td>H-7600</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q woda</td><td>Milli-Q</td><td>Milli-Q Elix</td><td></td></tr><tr><td>Eppendor Wirówka&nbsp;</td><td>Wirówka Eppendorf</td><td>5804R</td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer Nano</td><td>Malvern</td><td>Zetasizer Nano ZS&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka</td><td>Beckman</td><td>Optima L-100 XP Ultrawirówka</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>ESCO</td><td>CCL-107B</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Mikroskop Zeiss</td><td>Zeiss Axin Observer Z1</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja i charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych dorosłego schistosoma japonicum

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs) to błoniaste pęcherzyki uwalniane przez różne komórki do mikrośrodowiska zewnątrzkomórkowego. EV reprezentują populację niejednorodnych pęcherzyków, których wielkość waha się od 40 do 1000 nm. Zgromadzone dowody wskazują, że EV odgrywają ważną rolę regulacyjną w interakcjach między patogenem a gospodarzem. Dogłębne zrozumienie schistosomów EV powinno dostarczyć informacji na temat mechanizmów leżących u podstaw interakcji schistosom-gospodarz, umożliwiając opracowanie nowych strategii zwalczania schistosomatozy. W tym miejscu dążymy do dalszego badania funkcji EV w schistosomach, przedstawiając protokół izolacji i charakterystyki EV od dorosłego Schistosoma japonicum (S. japonicum). EV wyizolowano z pożywki do hodowli in vitro za pomocą wirowania w połączeniu z komercyjnym zestawem do izolacji egzosomów. Izolowane S. japonicum EVs (SjEVs) mają zazwyczaj średnicę 100 - 400 nm i charakteryzują się transmisyjną mikroskopią elektroniczną i western blot. Zastosowanie SjEV znakowanych barwnikiem PKH67 wykazało, że SjEV są internalizowane przez komórki biorcze. Ogólnie rzecz biorąc, nasz protokół zapewnia alternatywną metodę izolowania EV od dorosłych schistosomów; izolowane SjEV mogą być odpowiednie do analizy funkcjonalnej.

Aby określić wydajność izolowanych SjEV z zastosowaniem opisanego protokołu, wykorzystano test białkowy BCA do oznaczenia stężenia białka w SjEV wyizolowanych z 28-dniowych dorosłych schistosomów. Jak pokazano w Tabeli 1, stężenie białka w SjEV wynosiło od 208 µg do 250 µg na 100 mL medium (Tabela 1). Wielkość cząstek, określona za pomocą analizy nanocząsteczek Malvern, wykazała, że izolowane SjEV miały rozmiary od 100 nm do 400 nm, przy czym najliczniejs...

Tutaj prezentujemy protokół opisujący izolację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) w pożywce hodowlanej in vitro od dorosłego Schistosoma japonicum.

Izolacja i charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych dorosłego Schistosoma japonicum

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of ...

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z pożywki dorosłego Schistosoma japonicum hodowanego in vitro. Metoda ta pozwala skutecznie wyizolować EV w pożywce do hodowli in vitro od dorosłego Schistosoma japonicum. Główną zaletą tej techniki jest możliwość skutecznego odizolowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z krótkoterminowej pożywki do hodowli in vitro, co może zminimalizować stres, który potencjalnie może prowadzić do niefizjologicznego wydzielania EV.Demonstrację poprowadzi Juntao Liu, technik z mojego laboratorium. Zbierz pasożyty do 500-mililitrowej zlewki i umyj je dokładnie, ale delikatnie trzy razy za pomocą 200 mililitrów ciepłego PBS. Utrzymuj krótkie płukanie i użyj sedymentacji grawitacyjnej, aby oddzielić pasożyty.Następnie na 90-milimetrowych szalkach ułóż około 200 par robaków na naczynie. W naczyniu umyj pasożyty jeszcze dwa razy za pomocą sedymentacji grawitacyjnej. Do tych prań użyj ciepłego podłoża RPMI uzupełnionego paciorkowcem.Zastąp drugie pranie 40 mililitrami pożywki bez antybiotyków. Następnie hoduj pasożyty w temperaturze 37 stopni Celsjusza poniżej 5% dwutlenku węgla przez dwie godziny. Po dwóch godzinach przenieś pożywkę z płytek do probówek wirówkowych, a następnie połącz jaja i resztki robaków w ilości 2 000 g przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnie zebrać i przenieść supernatant do świeżej probówki. Następnie przefiltruj supernatant przez filtr strzykawkowy o grubości 0,22 mikrona i zbierz przefiltrowany roztwór do worka dializacyjnego z granicą masy cząsteczkowej 3,5 kilodaltonów. Następnie dializuje roztwór, używając 8% roztworu PEG8000 w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.Ten krok jest ważny dla zwiększenia wydajności pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Następnego dnia przenieś dializowany roztwór do nowej probówki i dodaj 0,5 objętości całkowitego odczynnika do izolacji egzosomów. Wymieszaj roztwór, aż stanie się jednorodny i inkubuj przez noc w temperaturze około pięciu stopni Celsjusza.Następnego ranka odwirować mieszaninę w stężeniu 15 000 g przez godzinę w temperaturze około pięciu stopni Celsjusza. Następnie odessać i wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad EV w dwóch mililitrach PBS. Śrut prawdopodobnie nie będzie widoczny.W przypadku analizy western blot należy najpierw określić stężenie białka w próbce, na przykład za pomocą testu BCA. Następnie przygotuj od 10 do 20 mikrogramów EV w 22,5 mikrolitrach buforu RIPA. Następnie dodaj 7,5 mikrolitra bufora ładującego 4X i podgrzewaj mieszaninę w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut.Po obróbce cieplnej oddzielić białka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych na 12% żelu SDS-PAGE. Po uruchomieniu żelu białka są przenoszone do błony PVDF. Zbadaj błonę przeciwciałami anty-CD63 w rozcieńczeniu jeden do 1 000.Następnie należy potraktować membranę anty-króliczą IgG-HRP w rozcieńczeniu od jednego do 5 000. Teraz użyj odczynnika do wykrywania ECL, aby opracować membranę, a następnie przeprowadź analizę w systemie obrazowania chemiluminescencyjnego. Zacznij od przeniesienia pięciu mikrogramów próbki do polipropylenowej probówki ultrawirówkowej i dostosuj objętość do 12 mililitrów za pomocą pożywki RPMI-1640.Następnie odwirować próbkę o masie 110 000 g przez 90 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odwirowaniu ostrożnie odessać i wyrzucić supernatant. Następnie przygotuj 2X zawiesinę pęcherzyków zewnątrzkomórkowych, dodając jeden mililitr rozcieńczalnika C do granulki.Zawiesić osad za pomocą delikatnego pipetowania. Teraz przygotuj świeży roztwór barwnika 2X. Dodaj dwa mikrolitry barwnika etanolowego PKH67 do jednego mililitra rozcieńczalnika C w probówce do mikrofuge i dobrze wymieszaj.Następnie wybarwić próbkę, mieszając ze sobą dwa roztwory i inkubując mieszaninę w temperaturze pokojowej przez cztery minuty. Następnie przerwij barwienie, dodając cztery mililitry FBS i odczekaj kolejną minutę. Następnie dodaj pożywkę RPMI-1640, aby dostosować objętość do 12 mililitrów i odkręć zawiesinę, aby wyizolować poplamione pęcherzyki.Usunąć i wyrzucić sklarowany osad. Następnie ponownie zamieszaj granulowane pojazdy elektryczne z oznaczeniem PKH67 w 12 mililitrach pożywki RPMI-1640. Następnie powtórz wirowanie, ale tym razem zbierz pęcherzyki w jednym mililitrze PBS.Do testu wychwytu należy przygotować przez noc hodowle komórek ssaków na płytkach sześciodołkowych. Następnego ranka dodaj pięć mikrogramów pęcherzyków znakowanych PKH67 do każdej studzienki i kontynuuj hodowlę przez dwie do czterech godzin. Po inkubacji usunąć pożywkę i dwukrotnie przemyć komórki PBS.Następnie utrwal komórki przez 15 minut, umyj je dwukrotnie PBS i wybarwij DAPI przed obrazowaniem. Schistosomy w fazie wątroby pobrano od królików 28 dni po zakażeniu. Następnie pobrano pęcherzyki zewnątrzkomórkowe od robaków schistosomów i poddano analizie.Ich wielkość cząstek, określona przez analizę nanocząstek Malvern, wahała się od 100 do 400 nanometrów, przy czym większość populacji zbliżała się do 220 nanometrów. Transmisyjna mikroskopia elektronowa wykazała, że pęcherzyki zewnątrzkomórkowe są okrągłe i mają średnicę od 100 do 200 nanometrów. Analiza Western blot wykazała, że izolowane pęcherzyki zewnątrzkomórkowe zostały rozpoznane za pomocą przeciwciał CD63, które są typowym markerem pęcherzyków zewnątrzkomórkowych.Mikroskopia fluorescencyjna pęcherzyków zewnątrzkomórkowych znakowanych PKH67 zinternalizowanych przez komórki klonu NCTC 1469 wykazała, że pęcherzyki zewnątrzkomórkowe były rozmieszczone głównie w cytoplazmie komórek biorcy. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyizolować EV w pożywce hodowlanej in vitro od dorosłego Schistosoma japonicum.

isolation-characterization-extracellular-vesicles-from-adult

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Tutaj udostępniamy szczegółowy protokół izolowania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) z całych tkanek, w tym próbek mózgu i nowotworów. Metoda ta oferuje powtarzalną technikę ekstrakcji EV z tkanki stałej w celu dalszych analiz.

Ekstrakcja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z całej tkanki

Ten artykuł przedstawia metody generowania, oczyszczania i ilościowego oznaczania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych Caenorhabditis elegans.

Oczyszczanie i analiza pęcherzyków zewnątrzkomórkowych Caenorhabditis elegans

Obecny protokół opisuje izolację mikroRNA z gruczołów ślinowych kleszczy i oczyszczonych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Jest to uniwersalna procedura, która łączy w sobie powszechnie używane odczynniki i materiały eksploatacyjne. Metoda pozwala również na użycie niewielkiej liczby kleszczy, co skutkuje wysokiej jakości mikroRNA, które można łatwo zsekwencjonować.

Izolacja mikroRNA z kultur gruczołów ślinowych ex vivo kleszczy i pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Tutaj opisujemy wzbogacanie małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z tkanki raka wątroby za pomocą zoptymalizowanej metody różnicowego ultrawirowania.

Metoda wzbogacania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z tkanki raka wątroby

Tutaj prezentujemy protokół izolowania egzosomów pochodzących z śledziony myszy za pomocą kombinacji trawienia z kolagenazą typu I i ultrawirowania.

Izolacja i charakterystyka egzosomów pochodzących z tkanek śledziony myszy

Ten protokół ma na celu izolację i oczyszczenie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych mięśni szkieletowych (SkM-EVs) z tkanek mięśni gryzoni poprzez mechaniczne oderwanie, dysocjację enzymatyczną, filtrację i ultrawirowanie różnicowe. Świadczy o spójności i niezawodności. Wyizolowane SkM-EV dostarczają informacji na temat homeostazy i chorób mięśni, z potencjalnymi zastosowaniami jako biomarkery diagnostyczne lub nośniki terapeutyczne.

Enzymatyczna izolacja śródmiąższowych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych mięśni szkieletowych

Tutaj opisujemy warunki hodowli in vitro, izolację i zwiększoną generację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) z Echinococcus granulosus. Małe pojazdy elektryczne charakteryzowały się dynamicznym rozpraszaniem światła i transmisyjną mikroskopią elektronową. Wychwyt przez komórki dendrytyczne pochodzące ze szpiku kostnego i ich modulację fenotypową badano za pomocą mikroskopii konfokalnej i cytometrii przepływowej.

Izolacja i wychwyt komórek dendrytycznych małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Echinococcus granulosus

Ten protokół opisuje izolację małych dodatkowych pęcherzyków z murzyniego mięśnia szkieletu i szpiku kostnego z wykorzystaniem trawienia enzymatycznego i chromatografii wykluczającej rozmiar, umożliwiającą powtarzalne odzyskiwanie frakcji wzbogaconych w pęcherzyki z tkanek o złożonej strukturze i niskim wydajności, do dalszej analizy molekularnej.

Izolacja małych zewnątrzkomórkowych wezykuł od mysiej tkanki kostnej i szpiku kostnego przez chromatografię wykluczającą na podstawie wielkości

Opisujemy metodę in vitro hodowli schistosomul pasożytniczego płazińca Schistosoma mansoni, polegającą na pozyskiwaniu i transformacji zakaźnych cerkariów z pośredniego żywiciela – słodkowodnego ślimaka Biomphalaria glabrata.

Transformacja cerkarii i hodowla in vitro schistosomul Schistosoma mansoni

Schistosoma mansoni jaja są silnymi stymulatorami odpowiedzi immunologicznej typu Th2 (T helper type 2), charakterystycznej dla infekcji pasożytniczych, astmy i zapalenia alergicznego. Niniejszy protokół wykorzystuje wstrzykiwanie jaj S. mansoni w celu wywołania indukowanej cytokinami CD4 Th2 odpowiedzi zapalnej w płucach, charakteryzującej się tworzeniem ziarniaków wokół jaj, eozynofilią oraz alternatywną aktywacją makrofagów.

Wykorzystanie jaj Schistosoma mansoni jako modelu in vivo stanu zapalnego płuc wywołanego przez helminty

Naucz się izolować pęcherzyki zewnątrzkomórkowe z dorosłych Schistosoma japonicum w krótkoterminowej kulturze in vitro. Ta metoda minimalizuje stres pasożyta, zapewniając fizjologiczną sekrecję EV do badań biologii pasożytniczej.

Izolacja i charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych dorosłego Schistosoma japonicum

Przeglądaj więcej filmów