Name: Oczyszczanie białek oddziałujących z RNA za pośrednictwem powinowactwa do destiobiotyny i streptawidyny w komórkach międzybłoniaka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Poznaj metodę oczyszczania białek wiążących RNA z motywem ARE w komórkach międzybłoniaka ACC-MESO-4 przy użyciu destiobiotyny i streptawidyny. Technika ta umożliwia badanie interakcji białko-RNA in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez szwajcarską narodową fundację nauki Sinergia grant CRSII3 147697, Stiftung für Angewandte Krebsforschung i Zürich Krebsliga.

1. Przygotowanie cytozolowej i jądrowej frakcji białkowej
<ol>
	<li>Płytka 4 x 106 komórek ACC-MESO-4 w kolbie do hodowli komórek T150 wyhodowanej w pożywce RPMI - 1640 uzupełnionej 10% FBS, 1x penicylina/streptomycyna (100x) i 2 mM L-Glutamina (200 mM). Gdy komórki osiągną zbieg 80-90% (~5-5,5 x 106 komórek), przystąp do ekstrakcji białek frakcji jądrowej i cytozolowej. 
	Uwaga: Linia komórkowa ACC-MESO-4 została uzyskana z RIKEN BioResource Centre11.</li>
	<li>Odessać pożywkę, przemyć komórki, dodając 15 ml 1x PBS, delikatnie przechylić płytkę kilka razy i odessać 1x PBS. Dodać 3 ml 0,25% trypsyny-EDTA i inkubować kolbę hodowlaną w temperaturze 37 °C przez 3 min. 
	UWAGA: Spójrz na komórki pod mikroskopem pod kątem oderwania; Jeśli kolba jest nadal podłączona, stuknij kolbą w dłoń 3 razy.</li>
	<li>Dodaj 7 ml pożywki RPMI-1640 uzupełnionej 10% FBS, 1x penicylina/streptomycyna (100x) i 2 mM L-glutaminy (200 mM), zbierz komórki w probówce o pojemności 15 ml i wiruj przy 200 x g przez 5 min.</li>
	<li>Odessać pożywkę i ponownie zawiesić osad komórkowy z 1,5 ml 1x PBS, a następnie przenieść komórki do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Wirować w temperaturze 500 x g i 4 °C przez 5 minut. Odrzucić supernatant. 
	UWAGA: Począwszy od tego etapu, wszystkie etapy wirowania należy wykonywać w temperaturze 4 °C i utrzymywać wszystkie odczynniki na lodzie.</li>
	<li>Zawiesić osad komórek w lodowatym 1,5 ml 1x PBS i odwirowywać komórki w temperaturze 500 x g i 4 °C przez 3 minuty. Wyrzucić supernatant. 
	UWAGA: Wymagane ilości odczynników CER I, CER II i NER to odpowiednio 10, 0,55 i 5 objętości szacowanej objętości upakowanych granulek komórek; w poniższym protokole przyjmuje się objętość 20 μl. Zalecamy przygotowanie tylko wymaganej ilości odczynnika CER I.</li>
	<li>Dodaj 200 μl lodowatego odczynnika do ekstrakcji cytoplazmatycznej (CER I) uzupełnionego 2 μl 1x inhibitora proteinazy, np. rozcieńczyć 1 tabletkę inhibitora proteazy (bez EDTA) w 500 μl wody, aby uzyskać 100x bulion. Taka ilość odczynnika CER I wystarcza do lizy 20 μl objętości upakowanej w komórkę.
	<ol>
		<li>Aby oszacować objętość wypełnionej granulki komórek, porównaj probówkę zawierającą osad komórkowy z probówką o pojemności 1,5 ml wypełnioną 10, 20, 50 lub 100 μL 1x PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ponownie zawiesić osad komórkowy, energicznie wirując probówkę przez 15 s i inkubować probówkę na lodzie przez 10 minut. Dodać 11 μl lodowatego odczynnika do ekstrakcji cytoplazmatycznej II (CER II) do probówki, energicznie wirować przez 5 s i inkubować 1 minutę na lodzie.</li>
	<li>Wirować energicznie przez 5 s i odwirować probówkę o temperaturze 16 000 x g i temperaturze 4 °C przez 5 minut. Przenieść supernatant do czystej, wstępnie schłodzonej probówki na lodzie. Supernatant to frakcja cytoplazmatyczna, która jest dalej wykorzystywana w eksperymencie RNA-pulldown.</li>
	<li>Zawiesić pozostały osad w 100 μl lodowatego odczynnika do ekstrakcji jądrowej (NER) uzupełnionego 1 μl inhibitora proteinazy (100x) i energicznie wirować przez 15 s. Zalecamy przygotowanie tylko wymaganej ilości odczynnika NER uzupełnionego inhibitorami proteazy.</li>
	<li>Inkubować próbkę na lodzie przez 40 minut, od czasu do czasu wirując przez 15 s (co 10 minut).</li>
	<li>Odwirować probówkę o stężeniu 16 000 x g przez 10 minut. Przenieść supernatant (jest to frakcja białka jądrowego) do czystej, wstępnie schłodzonej probówki.</li>
	<li>Natychmiast należy przystąpić do pomiaru stężenia białka metodą bicynkową (BCA) (patrz tabela materiałów). Aby kontrolować czystość białka każdej frakcji, należy przeprowadzić immunoblotting (<silna klasa="xfig">Rysunek 1) przeciwko α-tubulinie (dodatnie wykrycie tylko we frakcji cytozolowej) i polimerazie poliADP-rybozy - PARP (dodatnie wykrycie tylko we frakcji jądrowej). Wizualizacja białka znajduje się w sekcji 4.</li>
	<li>Aby zachować aktywność białek i ich stan naturalny, przygotuj 25 μl podwielokrotności ekstraktów cytozolowych i jądrowych. Podwielokrotności należy zamrozić błyskawicznie, umieszczając je w ciekłym azocie na 5 s i przechowywać bezpośrednio w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
2. Znakowanie RNA za pomocą Desthiobiotin
<ol>
	<li>Komercyjnie zsyntetyzować sondy RNA i oczyścić je metodą HPLC. Zawiesić wodą wolną od nukleaz w temperaturze 10 μM. 
	UWAGA: Sekwencje sond są wymienione w Tabeli 1.</li>
	<li>Użyj 50 pmol RNA na reakcję RNA-pulldown. Rozmrozić i przechowywać wszystkie odczynniki na lodzie z wyjątkiem PEG 30%, używanego do znakowania końca 3' oligonugolakukleotydu RNA.</li>
	<li>Przenieść 5 μl 10 μM sond RNA, oznaczonych jako CALB2 3' UTR (ARE), CALB2 3' UTR (mtARE) i Unrelated-RNA (IRE), do cienkościennych probówek wirówkowych o pojemności 0,5 ml i inkubować w maszynie do PCR w temperaturze 85 °C przez 5 minut. Natychmiast umieścić probówki na lodzie. 
	UWAGA: Ten krok jest ważny, ponieważ sprzyja rozluźnieniu i dostępności sondy RNA do znakowania.</li>
	<li>Dla pojedynczej reakcji 30 μl dodać do probówki zawierającej RNA następującą mieszaninę 10 μl: 3 μl wody wolnej od nukleaz, 3 μl 10x buforu reakcyjnego ligazy RNA, 1 μl inhibitora RNazy (40 U/μL), 1 μl bisfosforanu cytydyny destiobiotynylowanego (1 mM) i 2 μl ligazy T4 RNA (20 U/μL). 
	UWAGA: Aby przygotować główną mieszankę A dla 3 próbek w nadmiarze (3.2), zmieszaj 9,6 μl wody wolnej od nukleaz, 9,6 μl 10x buforu reakcyjnego ligazy RNA, 3,2 μl inhibitora RNazy (40 U/μL), 3,2 μl destiobiotynylowanego bisfosforanu cytydyny (1 mM) i 6,4 μl ligazy T4 RNA (20 U/μL).</li>
	<li>Dodać ostrożnie 15 μL PEG 30% do reakcji. Użyj innej wskazówki, aby wymieszać reakcję. Inkubować reakcję przez noc w temperaturze 16 °C.</li>
	<li>Następnego dnia przygotuj następujące preparaty: 5 M NaCl (świeży/bez nukleazy), chloroform: alkohol izoamylowy w proporcji 24:1 (np. na reakcję - 96 μl chloroformu i 4 μl alkoholu izoamylowego), lodowaty 100% etanolu i lodowaty 70% etanolu.</li>
	<li>Dodać 70 μl wody wolnej od nukleaz do probówek reakcyjnych znakujących RNA. Dodać 100 μl chloroformu: alkoholu izoamylowego i krótko odwirować. Odkręcanie przy 13 000 x g przez 3 min. Ostrożnie wyjmij TYLKO górną fazę i przenieś do nowej probówki 1,5 ml wolnej od nukleaz; Unikaj dotykania dolnej fazy.</li>
	<li>Dodać 10 μl 5 M NaCl, 1 μl glikogenu i 300 μl lodowatego 100% etanolu. Umieść probówkę w temperaturze -20 °C na 2 godziny 
	UWAGA: Na tym etapie eksperyment można kontynuować następnego dnia.</li>
	<li>Wirować przy 13 000 x g i temperaturze 4 °C przez 15 min. Ostrożnie wyrzucić supernatant, nie naruszając osadu. Dodać 300 μl lodowatego 70% etanolu i ponownie odwirować w temperaturze 13 000 x g i 4 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Całkowicie odrzucić supernatant i wysuszyć osad na powietrzu (15 min). Zawiesić osad w 20 μl wody wolnej od nukleaz. 
	UWAGA: Kontynuuj ściąganie RNA tego samego dnia.</li>
	<li>Inkubować RNA w temperaturze 90 °C przez 2 minuty i umieścić na lodzie. Umieść oznakowany RNA na lodzie podczas następnego etapu wstępnego mycia kulek magnetycznych streptawidyny. 
	UWAGA: Dłuższy czas inkubacji może uszkodzić sondę RNA.</li>
</ol>
3. Ściąganie białka RNA
<ol>
	<li>Wstępne mycie kulek magnetycznych streptawidyny i inkubacja z destiobiotyną-RNA
	<ol>
		<li>Użyj 50 μl kulek magnetycznych streptawidyny na 50 pmol RNA. Należy to jednak zoptymalizować w zależności od eksperymentu.</li>
		<li>Wirować probówkę z kulkami magnetycznymi streptawidyny przez 15 s i szybko usunąć 200 μl (mieszanka główna; wystarczająca na 3+1 reakcji) do czystej probówki o pojemności 1,5 ml za pomocą przeciętych końcówek do pipet. Umieść rurkę na stojaku magnetycznym tak, aby koraliki zebrały się z boku rurki i odczekaj 1 minutę. Usunąć płyn do sporządzania zawiesiny.</li>
		<li>Aby umyć kulki, wyjmij probówkę ze stojaka magnetycznego, dodaj 400 μl 0,1 M roztworu NaOH, 0,05 M NaCl i delikatnie odpipetuj kilka razy w górę i w dół. Umieść rurkę z powrotem na stojaku magnetycznym. Odczekać 1 minutę i zebrać supernatant. Powtórz ten krok ponownie.</li>
		<li>Umyj kulki 200 μl 100 mM NaCl. Usunąć supernatant.</li>
		<li>Dodać 200 μl 20 mM Tris (pH 7,5), ponownie zawiesić kulki przez pipetowanie, umieścić probówkę na stojaku magnetycznym, odczekać 1 minutę i usunąć supernatant. Powtórz ten krok.</li>
		<li>Wyjmij probówkę ze stojaka magnetycznego, dodaj 200 μl bufora do wychwytywania RNA i ponownie zawieś kulki magnetyczne streptawidyny przez krótkie wirowanie. Usuń 50 μl kulek magnetycznych streptawidyny i dodaj do każdej rurki z oznakowanym RNA za pomocą przeciętej końcówki pipety. Inkubować probówki przez 30 minut w temperaturze pokojowej na wałku.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wiązanie białka z RNA
	<ol>
		<li>Umieść probówki w stojaku magnetycznym, odczekaj 1 minutę i usuń supernatant.</li>
		<li>Dodać 50 μl 20 mM Tris (pH 7,5) do kulek i ponownie zawiesić przez pipetowanie. Umieść probówki w stojaku magnetycznym, odczekaj 1 minutę i usuń supernatant. Powtórz ten krok.</li>
		<li>Dodać 100 μl 1x buforu wiążącego białko-RNA do kulek i ponownie zawiesić przez pipetowanie.</li>
		<li>W międzyczasie przygotuj następującą mieszankę: 10 μL 10x buforu wiążącego białko-RNA, 30 μL 50% glicerolu, 50 μg białek cytoplazmatycznych i woda wolna od nukleaz do 100 μL. 
		UWAGA: Przygotować mieszankę wzorcową B dla 3 próbek w nadmiarze (3.3) w następujący sposób: 33 μl 10x buforu wiążącego białko-RNA, 99 μl 50% glicerolu, 165 μg białek cytoplazmatycznych i woda wolna od nukleaz do 330 μl. Probówkę z mieszanką główną B należy przechowywać na lodzie.</li>
		<li>Umieść probówki w stojaku magnetycznym, odczekaj 1 minutę i zbierz supernatant. Dodać 100 μl mieszanki wzorcowej B, zawiesić ponownie, delikatnie pipetując w górę i w dół, unikając tworzenia się pęcherzyków. Inkubować probówki reakcyjne przez 60 minut w temperaturze 4 °C na walcu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przemywanie i elucja
	<ol>
		<li>Umieść probówki w stojaku magnetycznym, zbierz supernatant (który przepływa - FT) i przenieś do nowej probówki. 
		UWAGA: Trzymaj ten FT na lodzie do późniejszej analizy.</li>
		<li>Odpipetować 100 μl 1x buforu do płukania na kulkach, delikatnie zawiesić, włożyć z powrotem do stojaka magnetycznego, odczekać 1 minutę i wyrzucić supernatant. Powtórz ten krok 2 razy.</li>
		<li>Dodać 40 μl buforu elucyjnego do kulek magnetycznych, mieszać pipetując w górę i w dół, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C na wytrząsarce probówkowej (950 obr./min) przez 30 min.</li>
		<li>Umieść probówki w stojaku magnetycznym, odczekaj 1 minutę i zbierz eluowaną próbkę (która jest eluatem - E). Umieścić na lodzie i użyć do dalszej analizy. 
		UWAGA: Na tym etapie każda badana sonda RNA składa się z próbki przepływowej (FT) i eluowanej (E).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Elektroforeza poliakrylamidowa i analiza Western Blot
UWAGA: Zobacz Tabelę 2, aby zapoznać się z przepisami dotyczącymi używanych w tej sekcji. Wykonaj Western blot zgodnie z metodą Laemmli12.
<ol>
	<li>Ręcznie odlewane żele 12% SDS-PAGE (10-dołkowe, dystans 1,5 mm, 66 μL). Przygotuj płynną mieszankę żelową: 4 ml 30% roztworu podstawowego akryloamidu i bisakryloamidu, 2,4 ml buforu Lower Tris, 3,2 ml dH2O, 9,6 μl TEMED, 96 μl 10% roztworu nadsiarczanu amonu (APS). Przygotuj mieszaninę żelu do układania: 3,25 ml dH2O, 0,5 ml 30% roztworu podstawowego akryloamidu i bisakryloamidu, 1,3 ml buforu Upper Tris, 10 μl TEMED, 20 μl 10% APS.</li>
	<li>Dodać 16,6 μl 6x buforu Laemmli (np. 14 ml Tris/HCl/SDS pH 6,8 (górny bufor Tris), 2 g SDS, 1,86 g DTT, 6 ml glicerolu i 0,012% błękitu bromofenolowego; przechowywanego w temperaturze -20 °C) do próbki FT i 6,6 μl 6x buforu Laemmli do próbki E. Próbki inkubować przez 5 minut w temperaturze 95 °C.</li>
	<li>Załadować próbki (20 μL FT i całe Elute ~40 μL) i uruchomić je na 30 minut przy napięciu 60 V, kontynuując przy napięciu 20 V przez noc.</li>
	<li>Za pomocą półsuchego systemu elektroblottyzacji przenieś białka na membranę PVDF na 80 minut przy 15 V. 
	UWAGA: Membrana PVDF musi być aktywowana przed wykonaniem transferu białka. Inkubować membranę w 100% metanolu przez 1 minutę, a następnie inkubować przez 2 minuty w ultraczystej wodzie.</li>
	<li>Po transferze białka inkubować żel SDS-PAGE z roztworem Coomassie przez 3 godziny, a następnie trzy etapy płukania ultraczystą wodą, każdy 30 minut.</li>
	<li>Pod koniec transferu białka pozostaw membranę PVDF do wyschnięcia na 1 godzinę. Reaktywuj błonę, jak wskazano w kroku 4.5. Zablokuj membranę 1 h za pomocą 5% BSA w 1x TTBS.</li>
	<li>Inkubować błonę z pierwszym przeciwciałem: HuR lub mezoteliną, oba rozcieńczone w stosunku 1:1000 w 5% BSA w 1x TTBS przez 4 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przemyć membranę trzy razy przez 7 minut w 1x TTBS i inkubować z króliczym przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z peroksydazą chrzanową (HRP) przeciwko mysiej peroksydazie chrzanowej (HRP) rozcieńczonym w stosunku 1:10 000 w 5% BSA, 1x TTBS.</li>
	<li>Wizualizacja białek za pomocą ulepszonej chemiluminescencji i cyfrowego imagera.</li>
</ol>

<ol><li>Glisovic, T., Bachorik, J. L., Yong, J., Dreyfuss, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-binding+proteins+and+post-transcriptional+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation.</a> FEBS Letters. 582 (14), 1977-1986 (2008).</li>
<li>Mayr, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+and+biological+roles+of+alternative+3%27UTRs%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Evolution and biological roles of alternative 3'UTRs.</a> Trends in Cell Biology. 26 (3), 227-237 (2016).</li>
<li>Matoulkova, E., Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+3%27+untranslated+region+in+post-transcriptional+regulation+of+protein+expression+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">The role of the 3' untranslated region in post-transcriptional regulation of protein expression in mammalian cells.</a> RNA Biology. 9 (5), 563-576 (2012).</li>
<li>von Roretz, C., Di Marco, S., Mazroui, R., Gallouzi, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turnover+of+AU-rich-containing+mRNAs+during+stress%3A+a+matter+of+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+RNA%22%5BJournal%5D)">Turnover of AU-rich-containing mRNAs during stress: a matter of survival.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 2 (3), 336-347 (2011).</li>
<li>Fallmann, J., Sedlyarov, V., Tanzer, A., Kovarik, P., Hofacker, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AREsite2%3A+An+enhanced+database+for+the+comprehensive+investigation+of+AU%2FGU%2FU-rich+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">AREsite2: An enhanced database for the comprehensive investigation of AU/GU/U-rich elements.</a> Nucleic Acids Research. 44, D90-D95 (2016).</li>
<li>Kresoja-Rakic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranscriptional+regulation+controls+calretinin+expression+in+malignant+pleural+mesothelioma%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Posttranscriptional regulation controls calretinin expression in malignant pleural mesothelioma.</a> Frontiers in Genetics. 8 (70), (2017).</li>
<li>Chu, C., Spitale, R. C., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technologies+to+probe+functions+and+mechanisms+of+long+noncoding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Technologies to probe functions and mechanisms of long noncoding RNAs.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 22 (1), 29-35 (2015).</li>
<li>Diamandis, E. P., Christopoulos, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biotin-%28strept%29avidin+system%3A+principles+and+applications+in+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The biotin-(strept)avidin system: principles and applications in biotechnology.</a> Clinical Chemistry. 37 (5), 625-636 (1991).</li>
<li>Hirsch, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easily+reversible+desthiobiotin+binding+to+streptavidin%2C+avidin%2C+and+other+biotin-binding+proteins%3A+Uses+for+protein+labeling%2C+detection%2C+and+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: Uses for protein labeling, detection, and isolation.</a> Analytical Biochemistry. 308 (2), 343-357 (2002).</li>
<li>Thermo Scientific. Magnetic bead technology for better assay development. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/brochures/1602577-Magnetic-Bead-Technology-Brochure.pdf">https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/brochures/1602577-Magnetic-Bead-Technology-Brochure.pdf</a> (2013).</li>
<li>Usami, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+four+malignant+pleural+mesothelioma+cell+lines+from+Japanese+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of four malignant pleural mesothelioma cell lines from Japanese patients.</a> Cancer Science. 97 (5), 387-394 (2006).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Coulson, R. M., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ferritin+synthesis+is+controlled+by+iron-dependent+translational+derepression+and+by+changes+in+synthesis%2Ftransport+of+nuclear+ferritin+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Ferritin synthesis is controlled by iron-dependent translational derepression and by changes in synthesis/transport of nuclear ferritin RNAs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (16), 7613-7617 (1993).</li>
<li>Leibold, E. A., Munro, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+protein+binds+in+vitro+to+a+highly+conserved+sequence+in+the+5%27+untranslated+region+of+ferritin+heavy-+and+light-subunit+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic protein binds in vitro to a highly conserved sequence in the 5' untranslated region of ferritin heavy- and light-subunit mRNAs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (7), 2171-2175 (1988).</li>
<li>Srikantan, S., Gorospe, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22201738">HuR function in disease.</a> Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 17, 189-205 (2012).</li>
<li>Morris, K. V., Mattick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rise+of+regulatory+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Genetics%22%5BJournal%5D)">The rise of regulatory RNA.</a> Nature Reviews: Genetics. 15 (6), 423-437 (2014).</li>
<li>Rinn, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+demarcation+of+active+and+silent+chromatin+domains+in+human+HOX+loci+by+noncoding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Functional demarcation of active and silent chromatin domains in human HOX loci by noncoding RNAs.</a> Cell. 129 (7), 1311-1323 (2007).</li>
<li>Zhao, J., Sun, B. K., Erwin, J. A., Song, J. J., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycomb+proteins+targeted+by+a+short+repeat+RNA+to+the+mouse+X+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Polycomb proteins targeted by a short repeat RNA to the mouse X chromosome.</a> Science. 322 (5902), 750-756 (2008).</li>
<li>McHugh, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Xist+lncRNA+interacts+directly+with+SHARP+to+silence+transcription+through+HDAC3%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3.</a> Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

3' UTR należą do niekodującego genomu3, a wszystkie niekodujące RNA mogą wchodzić w interakcje z białkami w celu pełnienia swojej funkcji7. Kiedy okazało się, że genom ssaków jest transkrybowany w sposób wszechobecny i wytwarza znaczną część długich, niekodujących RNA16, pojawiające się dowody wykazały, że te długie niekodujące RNA działają w regulacji ekspresji genów, gdy wchodzą w interakcje z kompleksami przebudowującymi chromatynę<sup class="xref...

Ekspresja genów i końcowy poziom produktu genu mogą być ściśle regulowane, wpływając na stabilność mRNA i szybkość translacji mRNA1. Te potranskrypcyjne mechanizmy regulacyjne są wywierane poprzez interakcje niekodującego RNA i/lub białek wiążących RNA (RBP) z docelowym mRNA. Zwykle jest to nieulegający translacji region 3' mRNA (3' UTR - należący do niekodującej części genomu2), który zawiera specyficzne elementy cis-regulatorowe (CRE), które są rozpoznawane przez czynniki transakcyjne, takie jak miRNA lub RBPs3. Najlepiej zbadanym elementem cis w obrębie 3' UTR jest motyw pierwiastka bogatego w adeninę (ARE), który jest rozpoznawany przez specyficzne białka wiążące AU (AUBP), a co za tym idzie, indukuje degradację/deadenylację mRNA (rozpad za pośrednictwem ARE) lub stabilizację mRNA4.
Rozmiar 3' UTR mRNA kalretyniny (CALB2) wynosi 573 bp długości i zawiera przypuszczalny pentamer AUUUA, zgodnie z przewidywaniami AREsite2, narzędzia bioinformatycznego5. Zgodnie z obecnością przypuszczalnego motywu ARE, test wektorowo-reporterowy pmirGLO wykazał stabilizacyjną rolę tego pierwiastka w CALB2 mRNA6. Wreszcie, ekstrakcja RNA in vitro została wykorzystana do zidentyfikowania AUBP, który stabilizuje mRNA kalretyniny poprzez motyw ARE.
Ponieważ wszystkie niekodujące RNA oddziałują z białkami7, pobieranie RNA in vitro jest dobrym sposobem i pierwszym wyborem do identyfikacji interaktorów RNA, które pomogą w rozszyfrowaniu mechanizmów molekularnych. W tej metodzie RNA-pulldown użyto komercyjnie zsyntetyzowanych sond RNA, które znakowano zmodyfikowaną formą biotyny (destiobiotyny) na końcu 3' nici RNA. RNA-destiobiotyna jest unieruchomiona poprzez interakcję ze streptawidyną na kulkach magnetycznych, które są używane do ściągania białek, które specyficznie oddziałują z związanym RNA będącym przedmiotem zainteresowania. Jako źródło białek wykorzystywane są niedenaturowane i aktywne białka z cytozolowej frakcji komórek międzybłoniaka. Takie białka związane z RNA są eluowane z kulek magnetycznych, przepuszczane przez 12% żel SDS-PAGE, przenoszone do błony i badane różnymi przeciwciałami.
W standardowej procedurze oczyszczania powinowactwa streptawidyny i biotyny, wymagane są surowe warunki denaturacji, aby przerwać silne nieodwracalne wiązanie biotyna-streptawidyna w celu wymycia związanych białek8, co może prowadzić do dysocjacji kompleksów białkowych. W przeciwieństwie do biotyny, destiobiotyna odwracalnie wiąże się ze streptawidyną i jest konkurencyjnie wypierana przez buforowany roztwór biotyny, co pozwala na delikatną elucję białek i unikanie izolacji naturalnie biotynylowanych cząsteczek9, co sugeruje, że technika ta jest idealna do izolowania natywnych kompleksów białkowych w warunkach natywnych.
Warunki wiązania in vitro i rygorystyczność, które są określane przez stężenie soli, środki redukujące i procent detergentów, powinny być zbliżone do tych obecnych w kontekście komórkowym, aby zidentyfikować prawdziwe interakcje in vivo. Warunki wiązania zaimplementowane w niniejszym dokumencie zostały wcześniej wykazane jako odpowiednie do identyfikacji HuR jako białka wiążącego AU10. Takie podejście może zaoszczędzić czas, ponieważ optymalizacja odpowiednich warunków wiązania może być czasochłonna i wymagająca. Ponadto metoda ta może być stosowana jako protokół wyjściowy dla każdego eksperymentu z RNA pulldown i może być stopniowo optymalizowana poprzez zmianę stężenia soli i detergentów, zmianę procentowej zawartości glicerolu i dodanie innych soli. Co więcej, wykazaliśmy, że nawet krótka 25-nukleotydowa sonda RNA zawierająca motyw pentamerowego ARE może być wykorzystana do zademonstrowania interakcji z określonym AUBP.

<table><tbody><tr><td>NE-PER Zestaw do ekstrakcji jądrowej i cytoplazmatycznej</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>78833</td><td></td></tr><tr><td>Tabletki inhibitora proteazy Pierce, wolne od EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A32965</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek Pierce BCA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Magnetyczny zestaw do wyciągania białka RNA&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20164</td><td>Zawiera koraliki magnetyczne, dlatego zestaw należy przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>Przebić RNA 3' Zestaw do zakończenia destiobiotynylacji&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20163</td><td>Zestaw jest częścią zestawu "Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit" i musi być przechowywany w temperaturze -20 stopni; C w przeciwieństwie do zestawu do opuszczania (4 & C).</td></tr><tr><td>DynaMag-2,&nbsp; stojak magnetyczny</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne Anti - HuR (MOUSE)</td><td>Thermo Fisher Scientific-Przeciwciało</td><td></td> <td>znajduje się w zestawie Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit&nbsp; - 1:1000 w 5% BSA 1x TTBS - drugorzędowe przeciwciało przeciw mysi królika 1:10 000 w 5% BSA 1x TTBS</td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne anty - &alpha; - tubulina (MOUSE)</td><td>Santa Cruz</td><td>8035</td><td>1:1000 w 5% BSA 1x TTBS - królicze przeciwciało wtórne przeciwko myszom 1:10 000 w 5% BSA 1x TTBS</td></tr><tr><td>Przeciwciało poliklonalne anty - PARP (KRÓLIK)</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>9542</td><td>1:1000 w 5% BSA 1x TTBS - kozie przeciwciało wtórne przeciwko królikowi 1:10 000 w 5% BSA 1x TTBS</td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne anty mezothelina (MOUSE)&nbsp;</td><td>Rockland</td><td>200-301-A87</td><td></td></tr><tr><td>Wtórne przeciwciało anty-królicze kozy</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>7074</td><td></td></tr><tr><td>Wtórne przeciwciało przeciw myszom królika</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-9044</td><td></td></tr><tr><td>RPMI - 1640 średnie</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>FBS - Filtrowana surowica bydlęca</td><td>Pan Biotech&nbsp;</td><td>P40-37500</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina - streptomycyna (100x)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór L-glutaminy (200 mM)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Trypsyna-EDTA (1x)</td><td>Gibco firmy Life technologies&nbsp;</td><td>25200-056</td><td></td></tr> Płytki szklane <tr><td>Mini-PROTEAN 3 Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>1653301</td><td></td></tr><tr><td>Mini Protean System&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1653308</td><td></td></tr><tr><td>Płytki dystansowe Mini-PROTEAN ze zintegrowanym elementem dystansowym 1,5 mm</td><td>Bio-Rad</td><td>1653312</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Comb, 10-dołkowy, 1,5 mm, 66 &micro; L</td><td>Bio-Rad</td><td>1653365</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Moduły odlewnicze Tetra Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>1658050</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap RNaza Roztwór do dekontaminacji</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Żel rotyforyczny 30 - wodny 30% roztwór podstawowy akrylamidu i bisakryloamidu w proporcji 37,5:1</td><td>Roth</td><td>3029</td><td></td></tr><tr><td>20% SDS&nbsp;</td><td>Membrana transferowa PanReac AppliChem</td><td>A3942</td><td></td></tr><tr><td>PVDF&nbsp;</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEF1002</td><td>Musi być aktywowany przez inkubację w czystym metanolu przez 1 minutę, a następnie mycie w wodzie przez 2 minuty&nbsp;</td></tr><tr><td>Półsucha komórka transferowa Trans-Blot SD&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1703940</td><td></td></tr><tr><td>Clarity Zachodni substrat ECL</td><td>Bio-Rad</td><td>1705061</td><td></td></tr><tr><td>FusionFX&nbsp; Digital Imager</td><td></td> <td>Vilber-synteza</td><td></td></tr> <tr><td>oligonukleotymetrii RNA</td><td>Mycrosynth AG, Szwajcaria</td> <td>-</td> <td>skala syntezy - 0,04 i mikro; mol - HPLC oczyszczona</td></tr><tr><td>albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny (HCl) 6 M</td><td>PanReac AppliChem</td><td>182883.1211</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Pure 1 M Tris, pH 7,5&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15567027</td><td></td></tr><tr><td>glicerol&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17904</td><td>50% sterylne podwielokrotności do przechowywania w temperaturze -20& deg; C</td></tr><tr><td>Koraliki magnetyczne Pierce Streptawidin&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88817</td><td>Należy pamiętać, że te kulki magnetyczne mają średnią średnicę 1 i mikro; m (zakres od 0,5 - 1,5 i mikro; m). Ponadto Dynabeads-M280 Streptawidyna, które są kulkami o jednorodnym rozmiarze 2,8 i mikro; m, są również używane w RNA-pulldown, ale należy pamiętać, że może to wpływać na proces oczyszczania.</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie G-250</td><td>Applichem</td><td>A3480</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan glinu-(14-18)-hydrat&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>368458</td><td></td></tr><tr><td>kwas ortofosforowy&nbsp;</td><td>Aplikacja</td><td>A0637</td><td></td></tr></tbody></table>

oczyszczanie białek oddziałujących z rna za pośrednictwem powinowactwa do destiobiotyny i streptawidyny w komórkach międzybłoniaka

Desthiobiotin-Streptavidin-Affinity Mediated Purification of RNA-Interacting Proteins in Mesothelioma Cells

Pobieranie RNA in vitro jest nadal często stosowane w pierwszych krokach protokołów mających na celu identyfikację białek wiążących RNA, które rozpoznają specyficzne struktury i motywy RNA. W tym protokole RNA-pulldown, komercyjnie zsyntetyzowane sondy RNA są znakowane zmodyfikowaną formą biotyny, destiobiotyną, na końcu 3' nici RNA, która odwracalnie wiąże się ze streptawidyną, a tym samym umożliwia elucję białek w bardziej fizjologicznych warunkach. RNA-destiobiotyna jest unieruchomiona poprzez interakcję ze streptawidyną na kulkach magnetycznych, które są używane do ściągania białek, które specyficznie oddziałują z interesującym RNA. Jako źródło białek wykorzystywane są niedenaturowane i aktywne białka z cytozolowej frakcji komórek międzybłoniaka. Opisana tutaj metoda może być zastosowana do wykrywania interakcji między znanymi białkami wiążącymi RNA a sondą RNA o długości 25 nukleotydów (nt) zawierającą sekwencję będącą przedmiotem zainteresowania. Jest to przydatne do uzupełnienia funkcjonalnej charakterystyki elementów stabilizujących lub destabilizujących obecnych w cząsteczkach RNA, uzyskanej za pomocą testu wektora reporterowego.

W tym eksperymencie wykorzystano fragment 3' UTR kalretyniny o długości 25 nt zawierający motyw ARE (CALB2 3' UTR (ARE) 25-nt), aby sprawdzić, czy wiąże on specyficznie białko HuR (Human-antigen R), znany stabilizator mRNA. Aby przetestować specyficzność elementu ARE, użyto sondy RNA CALB2 3' UTR (mtARE) o długości 25 nt zawierającej mutację motywu ARE, co w poprzednich badaniach wykazało zniesienie efektu stabilizacji motywu ARE6. Trzecia sonda RNA stanowi kontrol...

Znakowanie destiobiotyną syntetycznego oligo 25-nukleotydowego RNA, który zawiera motyw pierwiastka bogatego w adeninę (ARE), pozwala na specyficzne wiązanie cytozolowego białka wiążącego ARE.

Oczyszczanie białek oddziałujących z RNA za pośrednictwem powinowactwa do destiobiotyny i streptawidyny w komórkach międzybłoniaka

The in vitro RNA-pulldown is still largely used in the first steps of protocols aimed at identifying RNA-binding proteins that recognize specific RNA ...

Ogólnym celem tej procedury jest wychwycenie białka cytozolowego, które wiąże się ze specyficzną sekwencją znajdującą się w cząsteczce RNA w komórkach międzybłoniaka. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytanie w dziedzinie biologii RNA, takie jak to, czy przewidywane białko wiążące RNA może wiązać sekwencję bogatą w adenozynę lub urydynę w transkryptie. Główną zaletą tej techniki jest to, że uzupełnia ona funkcjonalną charakterystykę elementów stabilizujących lub destabilizujących ocenianych za pomocą testu reporterowego.Technikę tę zademonstruje dr Jelena Kresoja-Rakic, adiunkt z mojego laboratorium. Aby rozpocząć protokół, należy zaopatrzyć się w wcześniej przygotowane ogniwa ACC-MESO-4 o konfluencji od 80 do 90%. Odessać pożywkę, przemyć komórki 15 mililitrami soli fizjologicznej buforowanej fosforanem 1X lub PBS i odessać PBS.Następnie dodaj trzy mililitry 0,25% trypsyny-EDTA i inkubuj kolbę hodowlaną w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy minuty. Dodaj siedem mililitrów uzupełnionej pożywki RPMI-1640, zbierz komórki w 15-mililitrowej probówce i wiruj je z prędkością 200 razy g przez pięć minut. Następnie odessać pożywkę i ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą 1,5 mililitra 1X PBS.Następnie przenieś komórki do 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej. Ponownie wiruj komórki w temperaturze 500 razy g i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Po wirowaniu wyrzuć supernatant, ponownie zawieś osad ogniwa za pomocą 1,5 mililitra lodowatego 1X PBS i wiruj komórki w temperaturze 500 razy g i czterech stopniach Celsjusza przez trzy minuty.Odrzucić supernatant i oszacować objętość upakowanej osadu komórkowego, porównując probówkę zawierającą osad komórkowy z probówką o pojemności 1,5 mililitra z 10, 20, 50 i 100 mikrolitrami 1X PBS. Dodaj 200 mikrolitrów lodowatego odczynnika do ekstrakcji cytoplazmatycznej lub CER I, uzupełnionego dwoma mikrolitrami inhibitora proteinazy 1X. Energicznie wiruj osad przez 15 sekund i inkubuj probówkę na lodzie przez 10 minut.Dodać 11 mikrolitrów lodowatego odczynnika do ekstrakcji cytoplazmatycznej II lub CER II, energicznie wirować przez pięć sekund i inkubować probówkę przez jedną minutę na lodzie. Energicznie wirować próbkę przez pięć sekund i odwirować probówkę pod ciśnieniem 16 000 g przez pięć minut. Przenieść supernatant do czystej, wstępnie schłodzonej probówki na lodzie.Zawiesić pozostały osad w 100 mikrolitrach lodowatego odczynnika do ekstrakcji jądrowej lub NER, uzupełnionego jednym mikrolitrem inhibitora proteinazy i energicznie wirować przez 15 sekund. Próbkę inkubować na lodzie przez 40 minut i wirować co 10 minut przez 15 sekund. Odwirować probówkę z prędkością 16 000 g przez 10 minut.Przenieść supernatant, który jest jądrową frakcją białkową, do czystej, wstępnie schłodzonej probówki. Natychmiast zmierz stężenie białka metodą bicinchoninową. Następnie przygotuj 25 mikrolitrów podwielokrotności ekstraktów cytozolowych i jądrowych.Błyskawicznie zamroź te porcje, umieszczając je w ciekłym azocie na pięć sekund i przechowuj je bezpośrednio w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Przenieś pięć mikrolitrów 10-mikromolowych sond RNA do 0,5-mililitrowych, cienkościennych probówek wirówkowych i inkubuj je w maszynie do PCR w temperaturze 85 stopni Celsjusza przez pięć minut. Umieść probówki natychmiast na lodzie.Aby uzyskać pojedynczą reakcję o pojemności 30 mikrolitrów, dodaj 10 mikrolitrów wcześniej przygotowanej mieszanki do probówki zawierającej RNA. Ostrożnie dodaj 15 mikrolitrów PEG 30% do reakcji i użyj świeżej końcówki do wymieszania reakcji. Reakcję inkubować przez noc w temperaturze 16 stopni Celsjusza.Następnego dnia przygotuj odczynniki. Dodaj 70 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz do probówek reakcyjnych znakujących RNA. Dodać 100 mikrolitrów alkoholu chloroformowo-izoamylowego, krótko wirować i wirować próbkę z prędkością 13 000 razy g przez trzy minuty.Ostrożnie usuń tylko górną fazę. Unikaj dotykania dolnej fazy. Przenieś go do nowej, wolnej od nukleaz probówki o pojemności 1,5 mililitra.Dodaj 10 mikrolitrów pięciomolowego chlorku sodu, jeden mikrolitr glikogenu i 300 mikrolitrów lodowatego 100% etanolu. Umieść probówkę w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza na dwie godziny. Po dwóch godzinach odwirować w temperaturze 13 000 g i czterech stopniach Celsjusza przez 15 minut.Ostrożnie wyrzucić supernatant, nie naruszając osadu. Dodaj 300 mikrolitrów lodowatego 70% etanolu i ponownie odwiruj w temperaturze 13 000 g i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Całkowicie odrzucić supernatant i suszyć pelety na powietrzu przez 15 minut.Zawiesić osad w 20 mikrolitrach wody wolnej od nukleaz. Inkubuj RNA w temperaturze 90 stopni Celsjusza przez dwie minuty i umieść go na lodzie. Umieść oznakowany RNA na lodzie podczas następnego etapu wstępnego mycia kulek magnetycznych streptawidyny.Umyj wstępnie 50 mikrolitrów kulek magnetycznych streptawidyny na 50 pikomoli RNA. Wiruj rurkę z kulkami magnetycznymi streptawidyny przez 15 sekund. Po szybkim wirowaniu wyjmij 200 mikrolitrów do czystej, 1,5-mililitrowej rurki Safe-Lock za pomocą przeciętych końcówek pipet.Następnie umieść probówkę na stojaku magnetycznym, tak aby koraliki zebrały się z boku rurki i odczekaj minutę. Usunąć płyn do sporządzania zawiesiny. Aby umyć kulki, wyjmij rurkę ze stojaka magnetycznego, dodaj 400 mikrolitrów 0,1-molowego wodorotlenku sodu, 0,05-molowego roztworu chlorku sodu i delikatnie kilkakrotnie pipetuj w górę iw dół.Umieść rurkę z powrotem na stojaku magnetycznym i odczekaj minutę. Następnie zbierz supernatant. Umyj kulki 200 mikrolitrami 100-milimolowego chlorku sodu i usuń supernatant.Dodać 200 mikrolitrów 20-milimolowych tris, ponownie zawiesić kulki przez pipetowanie i umieścić probówkę na stojaku magnetycznym. Po jednej minucie usunąć supernatant. Następnie wyjmij probówkę ze stojaka magnetycznego, dodaj 200 mikrolitrów bufora do wychwytywania 1X RNA i ponownie zawieś kulki magnetyczne streptawidyny przez krótkie wirowanie.Usuń 50 mikrolitrów kulek magnetycznych streptawidyny i dodaj je do każdej oznakowanej probówki RNA za pomocą przeciętej końcówki pipety. Inkubować probówki przez 30 minut w temperaturze pokojowej na wałku. Po umieszczeniu probówki na stojaku magnetycznym przez jedną minutę, usunąć supernatant.Dodaj 50 mikrolitrów 20-milimolowych trisów do kulek i ponownie je zawieś. Następnie umieść rurki w stojaku magnetycznym. Po jednej minucie usunąć supernatant.Dodaj 100 mikrolitrów buforu wiążącego białko RNA 1X do kulek i ponownie je zawieś. Następnie umieść rurki z powrotem w stojaku magnetycznym. Gdy probówki znajdują się w stojaku przez jedną minutę, zebrać supernatant.Dodać 100 mikrolitrów mieszanki wzorcowej B, zawiesić ponownie, delikatnie pipetując w górę i w dół, unikając tworzenia się pęcherzyków. Inkubować probówki reakcyjne przez 60 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza na walcu. Przejdź do etapów płukania i elucji.Umieść probówki w stojaku magnetycznym, zbierz przepływ i przenieś go do nowej rurki. Odpipetować 100 mikrolitrów buforu myjącego 1X na kulki, delikatnie zawiesić, umieścić je z powrotem w stojaku, odczekać minutę i wyrzucić supernatant. Powtórz ten krok dwa razy.Dodać 40 mikrolitrów buforu elucyjnego do kulek magnetycznych, mieszać pipetując w górę iw dół, a następnie inkubować na wytrząsarce probówkowej. Umieść probówki w stojaku magnetycznym, odczekaj minutę i zbierz próbkę eluatu. Umieścić na lodzie i użyć do dalszej analizy.Aby wykazać czystość frakcji jądrowych/cytozolowych, białka analizowano za pomocą Western blot, który wykazał, że alfa-tubulina została wykryta tylko we frakcji cytozolowej, a białko PARP wykryto tylko we frakcji jądrowej. Eluat z sondy CALB2 three-prime UTR ARE wykazał wiązanie ludzkiego R i był nieobecny w eluacie z sondy ze zmutowanym i niepowiązanej sondy RNA, która wiąże białko reagujące na żelazo. Aby dodatkowo wykazać specyficzność między CALB three-prime UTR a ludzkim R, błonę sondowano przeciwciałem anty-mezotelinowym, a wszystkie trzy próbki eluatu nie wykazały obecności mezoteliny, co wskazuje, że stabilizujący motyw ARE w CALB2 three-prime UTR może specyficznie wiązać ludzkie białko R.Barwienie żelu Coomassie pokazuje, że do inkubacji z trzema różnymi sondami RNA użyto równych ilości białek. Po tej procedurze można wykonać dodatkową metodę skoncentrowaną na białku, taką jak immunoprecypitacja danego białka, w celu odpowiedzi na dodatkowe pytanie, np. jaka sekwencja się z nim wiąże. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią RNA do zbadania możliwych oddziałujących partnerów określonego RNA.

desthiobiotin-streptavidin-affinity-mediated-purification-rna

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Główną przeszkodą w analizach biochemicznych rybosomów zawierających powstające peptydylo-tRNA była obecność innych rybosomów w tych samych próbkach — rybosomów niezaangażowanych w translację konkretnej analizowanej sekwencji mRNA. Opracowaliśmy prostą metodologię pozwalającą na wyłączną puryfikację rybosomów zawierających interesujące nas powstające peptydylo-tRNA.

Izolacja rybosomów translacyjnych zawierających peptydylo-tRNA do analiz funkcjonalnych i strukturalnych

Ten film demonstruje test in vitro do ekstrakcji RNA w celu identyfikacji białek wiążących RNA (RBP), które oddziałują z sekwencjami elementów bogatych w adenylan-urydylan (ARE) w mRNA. Docelowe RBP z lizatu komórkowego miesza się z sondą RNA w celu utworzenia kompleksów RNA-białko. Kompleksy izoluje się poprzez oczyszczanie powinowactwa z wykorzystaniem powinowactwa znacznika destiobiotyny sondy RNA do kulki magnetycznej znakowanej streptawidyną.

Test ściągania białka RNA w celu wyizolowania białek wiążących RNA poprzez ekstrakcję powinowactwa

Interakcje RNA-białko leżą u podstaw wielu procesów komórkowych. W tym miejscu opisujemy metodę in vivo do izolowania specyficznego RNA i identyfikowania nowych białek, które są z nim związane. Może to rzucić nowe światło na to, w jaki sposób RNA są regulowane w komórce.

Izolacja nowych białek wiążących RNA metodą RaPID

Metodologia wirowania o zmodyfikowanej gęstości oparta na gradimencie została wykorzystana do izolacji komórek nabłonkowych z tkanki jelitowej Rhipicephalus microplus. Białka związane z powierzchnią poddano biotynylacji i oczyszczono za pomocą kulek magnetycznych streptawidyny w celu wykorzystania w dalszych zastosowaniach.

Oczyszczanie biotynylowanych białek powierzchniowych komórek z nabłonkowych komórek jelitowych Rhipicephalus microplus

Ten raport opisuje szybką i niezawodną metodę walidacji celów mRNA komórkowych miRNA. Metoda wykorzystuje syntetyczne biotynylowane miRNA oparte na zablokowanych kwasach nukleinowych (LNA) do wychwytywania docelowego mRNA. Następnie kulki magnetyczne pokryte streptawidyną są wykorzystywane do ściągania docelowego mRNA w celu ilościowego oznaczania w reakcji łańcuchowej polimerazy qPCR.

Test pulldown na bazie biotyny do walidacji celów mRNA komórkowych miRNA

Opisano procedurę tandemowej izolacji RNA (TRIP) w celu odzyskania endogennie utworzonych kompleksów mRNA-białko. W szczególności kompleksy RNA-białko są sieciowane in vivo, poliadenylowane RNA są izolowane z ekstraktów z kulkami oligo(dT), a poszczególne mRNA są wychwytywane za pomocą zmodyfikowanych oligonukleotydów antysensownych RNA. Białka związane z mRNA są wykrywane za pomocą analizy immunoblot.

Procedura izolacji tandemowego RNA oparta na oligonukleotydach w celu odzyskania eukariotycznych kompleksów mRNA-białko

Kompleksy RNA/białkowe oczyszczone przy użyciu strategii botyna-streptawidyna są eluowane do roztworu w warunkach denaturacji w formie nieodpowiedniej do dalszego oczyszczania i analizy funkcjonalnej. Tutaj opisujemy modyfikację tej strategii, która wykorzystuje fotorozszczepialny łącznik w RNA i delikatny etap elucji UV, dając natywne i w pełni funkcjonalne kompleksy RNA / białko.

Jednoetapowe oczyszczanie kompleksów makromolekularnych za pomocą RNA przyłączonego do biotyny i łącznika fotorozszczepialnego

Przedstawione tutaj są protokoły do testów biochemicznych in vitro z wykorzystaniem etykiet biotyny, które mogą być szeroko stosowane do badania interakcji białko-kwas nukleinowy.

Testy biochemiczne in vitro z wykorzystaniem etykiet biotyny do badania interakcji białko-kwas nukleinowy

Tutaj prezentujemy zmodyfikowany protokół CLIP-seq o nazwie FbioCLIP-seq z tandemowym oczyszczaniem FLAG-biotyna w celu określenia celów RNA białek wiążących RNA (RBP) w komórkach ssaków.

Profilowanie interakcji białko-RNA w całym transkryptomie poprzez sieciowanie krzyżowe i immunoprecypitację za pośrednictwem tandemowego oczyszczania FLAG-biotyna

Tutaj prezentujemy zoptymalizowaną metodę in vitro do odkrywania, ilościowego i walidacji interaktorów białkowych specyficznych sekwencji RNA, przy użyciu całkowitego ekstraktu białkowego z komórek ludzkich, kulek streptawidyny pokrytych biotynylowanym RNA oraz analizy spektrometrii mas.

Zoptymalizowana ilościowa analiza typu pull-down białek wiążących RNA przy użyciu krótkiego biotynylowanego RNA

Ten artykuł opisuje protokół badania interakcji DNA-białko za pomocą systemu interferometrii biowarstwowej (BLI) opartego na streptawidynie. Przedstawiono w nim podstawowe kroki i rozważania dotyczące wykorzystania podstawowej lub zaawansowanej kinetyki wiązania w celu określenia powinowactwa wiązania równowagi (KD) oddziaływania.

Analiza interakcji DNA-białko za pomocą interferometrii biowarstwowej opartej na streptawidynie

Poznaj metodę oczyszczania białek wiążących RNA z motywem ARE w komórkach międzybłoniaka ACC-MESO-4 przy użyciu destiobiotyny i streptawidyny. Technika ta umożliwia badanie interakcji białko-RNA in vitro.

Oczyszczanie białek oddziałujących z RNA za pośrednictwem powinowactwa do destiobiotyny i streptawidyny w komórkach międzybłoniaka (Wideo) | JoVE Journal

Oczyszczanie białek oddziałujących z RNA za pośrednictwem powinowactwa do destiobiotyny i streptawidyny w komórkach międzybłoniaka

Przeglądaj więcej filmów