Name: Szybki i łatwy proces generowania punktowych mutantów genomowych u C. elegans przy użyciu rybonukleoprotein CRISPR/Cas9 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Naucz się generować punktowe mutacje genomowe u C. elegans przy użyciu rybonukleoprotein CRISPR/Cas9 i szablonów naprawy HDR. Ta metoda umożliwia szybkie badanie wariancji genetycznej w kontekście endogennej kontroli regulacyjnej bez nadekspresji białek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nie ma żadnych konfliktów interesów związanych z tym raportem.

Wszystkie procedury opieki nad zwierzętami i eksperymentów były zgodne z wytycznymi National Institutes of Health i Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) na Uniwersytecie Michigan. Używaj roztworów wolnych od RNaz i końcówek do pipet przez cały czas trwania protokołu. Oczyść obszar roboczy, pipety, probówki i wirówkę roztworem do odkażania RNazy zgodnie z wytycznymi producenta (patrz tabela materiałów).
1. Wybór celu sgRNA
<ol>
	<li>Korzystając z przeglądarki internetowej, otwórz stronę internetową: http://crispor.tefor.net8
	<ol>
		<li>Wprowadź ~60 par zasad (bp) sekwencji otaczającej żądaną edycję będącą przedmiotem zainteresowania (tj. 30 pz 5' i 3' żądanej edycji).</li>
		<li>Wybierz genom Caenorhabditis elegans z menu rozwijanego.</li>
		<li>Z menu rozwijanego wybierz motyw przylegający do protospaceru (20 bp-NGG - SpCas9, SpCas9-HF1, eSPCas9 1.1).</li>
		<li>Kliknij przycisk Prześlij. Na stronie wyników wybierz sekwencję docelową o najwyższej pozycji, która znajduje się najbliżej interesującej Cię edycji. Jeśli w bocznej sekwencji wejściowej 60 pz nie ma odpowiednich miejsc docelowych, rozwiń sekwencję zapytań do 100 pz (tj. 50 pz po obu stronach żądanej edycji).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Z dostępnego źródła, np. synthego, otrzymaj 20-merowy docelowy sgRNA o następującej specyfikacji: 3 nmol; bez modyfikacji.</li>
	<li>Po otrzymaniu odwirować liofilizowaną probówkę zawierającą sgRNA o >12 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Dodać 60 μl TE wolnego od nukleaz do probówki i delikatnie zawiesić, pipetując w górę i w dół 15-20 razy za pomocą pipety P200. Końcowe stężenie wynosi 50 μM.</li>
</ol>
2. Projekt szablonu naprawy ukierunkowanego na homologię
<ol>
	<li>Zaprojektuj szablon ssODN HDR zawierający: 1) mutację będącą przedmiotem zainteresowania, 2) unikalne miejsce endonukleazy restrykcyjnej w ramce, 3) cichą mutację jednego lub obu Gs w sekwencji NGG PAM oraz 4) ramiona homologii 5' i 3' 50 bp flankujące pierwszą i ostatnią mutację. (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C)9,10.
	<ol>
		<li>Jeśli mutacja sekwencji NGG PAM nie jest możliwa, wprowadź 5 - 6 cichych mutacji w sekwencji rozpoznawania celu sgRNA, aby zapobiec rozszczepieniu matrycy ssODN HDR za pośrednictwem sgRNA.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Z dostępnego źródła, np. idtDNA, otrzymać "oligonukleotyd Ultramer DNA" o następujących parametrach: Skala: 4 nmol; Skład: Brak; Oczyszczanie: Standardowe odsalanie.</li>
	<li>Po otrzymaniu odwirować liofilizowaną probówkę zawierającą ssODN o >12 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Delikatnie zawiesić ssODN do końcowego stężenia 100 μM w ddH2O bez nukleaz, pipetując w górę i w dół 15 - 20 razy za pomocą pipety P200.</li>
</ol>
3. Projektowanie podkładów genotypowania
<ol>
	<li>Zaprojektuj zestaw starterów flankujący modyfikację genomu, aby wygenerować amplicon11.</li>
	<li>Zoptymalizuj warunki cykliczne PCR, aby wytworzyć pojedynczy i specyficzny amplicon11.</li>
</ol>
4. Przygotuj mieszankę do iniekcji
<ol>
	<li>Odwirować odczynniki z tabeli 1 z maksymalną prędkością przez 2 minuty w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>W podanej kolejności dodaj odczynniki z tabeli 1 do probówki PCR bez nukleazy.</li>
	<li>Dokładnie wymieszaj, delikatnie pipetując 10 razy w górę i w dół za pomocą pipety P20.</li>
	<li>Inkubować mieszaninę do wstrzykiwań przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
5. Protokół iniekcji
<ol>
	<li>Załaduj mikropipetę iniekcyjną około połową mieszanki iniekcyjnej 12. Zachowaj pozostałą mieszankę do wstrzykiwań na wypadek zatkania lub pęknięcia igły iniekcyjnej.</li>
	<li>Rozbij końcówkę mikropipety tak, aby ~20 - 30 p.s.i. dało stopniowo płynący roztwór12. 
	UWAGA: Końcówki o większej średnicy negatywnie wpływają na zdrowie zwierząt i zmniejszają plon potomstwa F1.</li>
	<li>Jeśli to możliwe, wstrzyknij 10 - 15 młodych dorosłych robaków w oba ramiona gonad12. Jeśli nie, wystarczy wstrzyknięcie do jednego ramienia gonady.</li>
	<li>Pozostawić zwierzętom, którym wstrzyknięto (P0) regenerację przez 1-2 godziny w temperaturze pokojowej na płytce z pożywką hodowlaną nicieni (NGM) o średnicy 35 mm wysiewanej przez OP50. Następnie, pojedynczo wstrzyknięte zwierzęta P0 do pojedynczych płytek NGM o średnicy 35 mm z nasionami OP50 za pomocą platynowego drutu drucianego pick12.</li>
</ol>
6. Ekran P0 Płyty i pojedynczy mCherry(+) F1s
<ol>
	<li>Dwa dni po wstrzyknięciu zidentyfikuj płytki P0 zawierające potomstwo F1 wyrażające mCherry w gardle za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego (<silna klasa = "xfig">Ryc. 1D, dzień 2 - 3). Wybierz trzy płytki P0, które zawierają najwięcej zwierząt mCherry(+) F1.</li>
	<li>Z każdej z trzech wybranych płytek P0 pojedynczo 8 - 12 mWiśnia(+) F1 zwierzęta, w sumie 24-36 mWiśnia(+) F1s za pomocą kilofa do robaków (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D, dzień 2 - 3). 
	UWAGA: Zwierzęta mCherry(-) można również wyodrębnić z tych tabliczek P0, ale prawdopodobieństwo zidentyfikowania poprawnie zredagowanych zwierząt jest znacznie mniejsze (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A).</li>
	<li>Pozostawić poszczególne F1s do samozapłodnienia i złożyć jaja przez 1 - 2 dni w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
7. PCR z pojedynczym robakiem i genotypowanie
<ol>
	<li>Po 1 - 2 dniach składania jaj przenieś F1s do pojedynczych nakrętek probówki paskowej PCR zawierających 7 μl buforu do lizy robaków za pomocą kilofa do robaków (Tabela 2, <klasa silna = "xfig" >Ryc. 1D, dzień 4 - 5).</li>
	<li>Odwirować probówki do PCR z maksymalną prędkością przez 1 minutę w temperaturze pokojowej, aby sprowadzić zwierzęta na dno probówki, i zamrozić probówki w temperaturze -80 °C przez 1 godzinę 
	UWAGA: Robaki mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C przez czas nieokreślony.</li>
	<li>Lizować zamrożone robaki w termocyklerze za pomocą następującego programu: 60 °C przez 60 min, 95 °C przez 15 min, 4 °C trzymać.</li>
	<li>Przygotuj PCR mastermix, jak pokazano w Tabeli 3.</li>
	<li>Dodaj 21 μl mastermixu PCR do czystych probówek PCR, a następnie dodaj 4 μl lizy robaków z kroku 3. Dobrze wymieszać za pomocą pipety i uruchomić program PCR zgodnie z wytycznymi producenta (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Oczyść reakcje PCR za pomocą zestawu DNA Clean and Concentrate, postępując zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów). Eluować DNA, dodając 10 μl wody do kolumny wirowej.</li>
	<li>Ustawić enzym restrykcyjny mastermix, jak pokazano w Tabeli 4.</li>
	<li>Dodać 10 μl mastermixu enzymu restrykcyjnego do każdej oczyszczonej reakcji PCR i inkubować przez 1 - 2 godziny w temperaturze 37 °C13.</li>
	<li>Oddziel strawione produkty PCR na 1,5% żelu agarozowym przy napięciu 120 V przy użyciu 1x buforu Tris-acetate-EDTA (TAE)14.</li>
</ol>
8. Identyfikacja i weryfikacja sekwencji edytowanych zwierząt
<ol>
	<li>Zbadaj próbki trawione enzymatycznie pod kątem obecności prążków, które wskazują na potencjalne edytowane zwierzęta14 (Rysunek 1D, dzień 4 - 5). 
	UWAGA: Załaduj kontrolę N2, aby zidentyfikować potencjalne mutacje indel, które można zaobserwować jako zmiany w wielkości pasma i/lub nieoczekiwane i złożone wzorce pasm trawienia enzymu restrykcyjnego.</li>
	<li>Po zidentyfikowaniu potencjalnie edytowanych zwierząt użyj pozostałych 3 μl lizy robaków i powtórz reakcję PCR. Nie czyść ani nie ograniczaj trawienia enzymu reakcji PCR po zakończeniu programu. Załaduj reakcję PCR na 1% żel agarozowy, oddziel i wyekstrahuj pasmo za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu15 (patrz Tabela Materiałów).</li>
	<li>Sekwencja Sangera16 żelowe DNA wyekstrahowane przy użyciu startera F1 w celu identyfikacji poprawnie edytowanych zwierząt (Rysunek 1A) 
	UWAGA: Odczyty heterozygoty będą zawierały nałożone piki ze względu na obecność typu dzikiego i zmodyfikowanego allelu.</li>
	<li>Aby uzyskać homozygotyczne zwierzęta ze zweryfikowanych heterozygotycznych edytowanych zwierząt, pobierz 8 - 12 zwierząt F2 i wykonaj kroki 7 - 8.</li>
</ol>

<ol><li>Dickinson, D. J., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Based+Methods+for+Caenorhabditis+elegans+Genome+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering.</a> Genetics. 202, 885-901 (2016).</li>
<li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing.+The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346, 1258096(2014).</li>
<li>Ma, D., Liu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+Editing+and+Its+Applications+in+Model+Organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics+Proteomics+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Genome Editing and Its Applications in Model Organisms.</a> Genomics Proteomics Bioinformatics. 13, 336-344 (2015).</li>
<li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas+systems+for+editing%2C+regulating+and+targeting+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat Biotechnol. 32, 347-355 (2014).</li>
<li>Kim, H. M., Colaiacovo, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9-Guided+Genome+Engineering+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9-Guided Genome Engineering in C. elegans.</a> Curr Protoc Mol Biol. 115, 31-31 (2016).</li>
<li>Yin, H., Kauffman, K. J., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+technologies+for+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Delivery technologies for genome editing.</a> Nat Rev Drug Discov. 16, 387-399 (2017).</li>
<li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Res. 24, 1012-1019 (2014).</li>
<li>Haeussler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+off-target+and+on-target+scoring+algorithms+and+integration+into+the+guide+RNA+selection+tool+CRISPOR%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR.</a> Genome Biol. 17, 148(2016).</li>
<li>Paix, A., Folkmann, A., Seydoux, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+genome+editing+using+CRISPR-Cas9+and+linear+repair+templates+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Precision genome editing using CRISPR-Cas9 and linear repair templates in C. elegans.</a> Methods. , (2017).</li>
<li>Prior, H., Jawad, A. K., MacConnachie, L., Beg, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Efficient%2C+Rapid+and+Co-CRISPR-Independent+Genome+Editing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Highly Efficient, Rapid and Co-CRISPR-Independent Genome Editing in Caenorhabditis elegans.</a> G3 (Bethesda). 7, 3693-3698 (2017).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5056/pcr-the-polymerase-chain-reaction">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. PCR: The Polymerase Chain Reaction.</a> J Vis Exp. , (2017).</li>
<li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+stable+transgenic+C.+elegans+using+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5070/restriction-enzyme-digests"> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests.</a> J Vis Exp. , (2017).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5057/dna-gel-electrophoresis">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. DNA Gel Electrophoresis .</a> J Vis Exp. , (2017).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5063/gel-purification">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Gel Purification.</a> J Vis Exp. , (2017).</li>
<li>Estrada-Rivadeneyra, D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29171728">Sanger sequencing.</a> FEBS J. , (2017).</li>
<li>Ludolph, A. C., Brettschneider, J., Weishaupt, J. H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22918486">Amyotrophic lateral sclerosis.</a> Curr Opin Neurol. 25, 530-535 (2012).</li>
<li>Evans, T. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEvans%2C+TC+%22WormBook%22">WormBook</a>. , The C. elegans Research Community, WormBook. (2006).</li>
<li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+in+C.elegans%3A+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337, 816-821 (2012).</li>
<li>Boyd, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Balanced+Look+at+the+Implications+of+Genomic+%28and+Other+%26%2334%3BOmics%26%2334%3B%29+Testing+for+Disease+Diagnosis+and+Clinical+Care%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">A Balanced Look at the Implications of Genomic (and Other &#34;Omics&#34;) Testing for Disease Diagnosis and Clinical Care.</a> Genes (Basel). 5, 748-766 (2014).</li>
<li>Saccon, R. A., Bunton-Stasyshyn, R. K., Fisher, E. M., Fratta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+SOD1+loss+of+function+involved+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Is SOD1 loss of function involved in amyotrophic lateral sclerosis?</a> Brain. 136, 2342-2358 (2013).</li>
<li>Acevedo-Arozena, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+assessment+of+the+SOD1G93A+low-copy+transgenic+mouse%2C+which+models+human+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">A comprehensive assessment of the SOD1G93A low-copy transgenic mouse, which models human amyotrophic lateral sclerosis.</a> Dis Model Mech. 4, 686-700 (2011).</li>
<li>Gurney, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neuron+degeneration+in+mice+that+express+a+human+Cu%2CZn+superoxide+dismutase+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation.</a> Science. 264, 1772-1775 (1994).</li>
</ol>

Dziękujemy członkom laboratorium Beg za krytyczną lekturę tego manuskryptu. Szczepy zostały dostarczone przez Caenorhabditis Genetics Center, które jest finansowane przez NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Badania w laboratorium Beg są wspierane przez granty NIH (R01 NS094678) i Muscular Dystrophy Association (MDA382300) dla A.A.B.

System CRISPR-Cas9 jest potężnym i skutecznym narzędziem do precyzyjnej modyfikacji genomu organizmów modelowych. Tutaj pokazujemy, że chimeryczne sgRNA20 w połączeniu z matrycami HDR ssODN umożliwiają wysoce wydajne generowanie punktowych mutacji genomowych u C. elegans. Co ważne, wykazaliśmy, że dostarczanie RNP zapewnia wysoką wydajność edycji, gdy fluorescencja jest używana jako marker koselekcji, podkreślając łatwość i niezawodność techniki.
Większość meto...

Ostatnie osiągnięcia technologiczne radykalnie przekształciły i przyspieszyły możliwość precyzyjnego inżynierii genomów. W szczególności system CRISPR-Cas9, który opiera się na endonukleazie Cas9 kierowanej przez RNA w celu wywołania pęknięcia podwójnej nici (DSB) w pobliżu docelowej sekwencji będącej przedmiotem zainteresowania, był szeroko stosowany do dokładnej inżynierii genomu większości organizmów modelowych wykorzystywanych w badaniach biomedycznych1,2,3,4. Co istotne, zastosowanie CRISPR-Cas9 umożliwiło edycję genomu nawet u trudnych gatunków, takich jak C. elegans5. Niezależnie od gatunku, generowanie mutacji punktowych za pomocą systemu edycji genomu opartego na CRISPR-Cas9 opiera się na trzech podstawowych komponentach: 1) endonukleazie Cas9, 2) pojedynczym przewodniku RNA (sgRNA), który kieruje endonukleazę Cas9 do sekwencji docelowej oraz 3) zaprojektowanym przez użytkownika szablonie naprawy ukierunkowanej na homologię (HDR) zawierającym pożądane zmiany będące przedmiotem zainteresowania2.
Istnieje kilka metod, które mogą być użyte do wprowadzenia do komórek ukierunkowanego nukleazy sgRNA i Cas9, w tym plazmid, RNA i metody dostarczania oparte na wirusach6. Ostatnio bezpośrednie dostarczanie wstępnie skompleksowanych rybonukleoprotein sgRNA-Cas9 (RNP) okazało się potężnym i wydajnym narzędziem w edycji genomu opartej na CRISPR-Cas97. Bezpośrednie dostarczanie wstępnie skompleksowanych RNP CRISPR-Cas9 ma kilka wyraźnych zalet, a mianowicie: 1) RNP omijają potrzebę transkrypcji i translacji komórkowej, 2) RNP są szybko usuwane, co może zwiększyć specyficzność poprzez skrócenie dostępnego czasu na rozszczepienie poza celem, oraz 3) RNP nie zawierają obcych elementów DNA/RNA, co pozwala uniknąć wprowadzenia nienatywnych sekwencji do genomu gospodarza poprzez losową integrację. Razem te atrybuty prawdopodobnie zapewniają krótkotrwałą eksplozję edycji CRISPR na celu, jednocześnie minimalizując efekty niecelowe.
Opisujemy prosty i skuteczny protokół wprowadzania specyficznych dla danego miejsca zmian genomowych u C. elegans. Protokół ten obejmuje celowanie w projekt matrycy HDR sgRNA i jednoniciowych oligonukleotydów (ssODN), kompleksowanie i dostarczanie sgRNA-Cas9 RNP oraz strategię genotypowania w celu jednoznacznej identyfikacji prawidłowo edytowanych zwierząt. Stosując tę strategię, nie tylko można odzyskać pożądane zmiany specyficzne dla danego miejsca, ale także inne niespecyficzne mutacje indel. W związku z tym nasza strategia pozwala na generowanie serii allelicznej przy użyciu jednej strategii, w której w pokoleniu F1 mogą być generowane zarówno mutanty monoalleliczne, dwualleliczne, jak i indelowe.

<table><tbody><tr><td>CRISPRevolution sgRNA&nbsp; EZ Kit</td><td>Synthego Inc.</td><td></td><td>chimeryczny sgRNA</td></tr><tr><td>wolny od nukleaz TE</td><td>Synthego Inc.</td><td>dostarczany z zestawem sgRNA, zestawem</td><td></td>EZ,</tr><tr><td>wodą wolną od nukleaz,</td><td>Synthego, Inc.</td><td>dostarczany z zestawem sgRNA EZ kit</td><td></td></tr><tr><td>4 nmole Ultramer DNA Oligo</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>ssODN HDR template</td></tr><tr><td>Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLS</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>1078728</td><td>Cas9 białko</td></tr><tr><td>pCFJ90&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>19327</td><td>Pmyo-2::mWiśniowy marker plazmid</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>DNA Clean & Koncentrator</td><td>Zymo Research</td><td>D4004</td><td></td></tr><tr><td>Zymoclean Gel Zestaw do odzyskiwania DNA</td><td>Zymo Research</td><td>D4002</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>M0494L</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Sigma</td><td>P2308</td><td></td></tr><tr><td>Szklane mikropipety ze szkła borokrzemianowego</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF100-78-10</td><td>OD: 1,0 mm. ID: 0,78 mm</td></tr><tr><td>Chlorowodorek Trizma</td><td>Sigma</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do odkażania RNaseZap</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr></tbody></table>

szybki i łatwy proces generowania punktowych mutantów genomowych u c. elegans przy użyciu rybonukleoprotein crispr/cas9

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Zgrupowany regularnie przeplatany system reaktorów palindromicznych (CRISPR) i związany z CRISPR białkiem 9 (Cas9) prokariotyczny adaptacyjny system obrony immunologicznej został dokooptowany jako potężne narzędzie do precyzyjnej inżynierii genomu eukariotycznego. W tym miejscu przedstawiamy szybką i prostą metodę wykorzystującą chimeryczne pojedyncze przewodnikowe RNA (sgRNA) i rybonukleoproteiny (RNP) CRISPR-Cas9 do wydajnego i precyzyjnego generowania punktowych mutacji genomowych u C. elegans. Opisujemy proces selekcji celu sgRNA, projektowanie szablonów naprawy ukierunkowanej na homologię (HDR), kompleksowanie i dostarczanie CRISPR-Cas9-RNP oraz strategię genotypowania, która umożliwia solidną i szybką identyfikację prawidłowo edytowanych zwierząt. Nasze podejście nie tylko pozwala na łatwe generowanie i identyfikację pożądanych zmutowanych genomowo zmutowanych zwierząt, ale także ułatwia wykrywanie innych złożonych alleli indel w ciągu około 4-5 dni przy wysokiej skuteczności i zmniejszonym obciążeniu badaniami przesiewowymi.

Mutacje w ludzkiej dysmutazie ponadtlenkowej 1 (SOD1) odpowiadają za ~10–20% przypadków rodzinnego stwardnienia bocznego zanikowego, wyniszczającej choroby neurodegeneracyjnej, która nieuchronnie prowadzi do paraliżu i śmierci17Ludzka SOD-1 jest białkiem konserwatywnym ewolucyjnie, wykazującym 55% identyczności i 70% podobieństwa z C. elegans białko SOD-1 (Rycina 1B). Aby wykazać prostotę, wykonalność i efektywność po...

Tutaj prezentujemy metodę inżynierii genomu C. elegans przy użyciu rybonukleoprotein CRISPR-Cas9 i szablonów naprawy zależnych od homologii.

Szybki i łatwy proces generowania punktowych mutantów genomowych u C. elegans przy użyciu rybonukleoprotein CRISPR/Cas9

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie genomowych mutacji punktowych u C.Elegans przy użyciu jednoniciowych szablonów naprawczych skierowanych do homologii oligonukleotydów i rybonukleoprotein CRISPR/Cas9. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neuronauki, takie jak określenie patologicznych konsekwencji zmienności genetycznej związanej z chorobą neurodegeneracyjną. Główną zaletą tej techniki jest to, że genomowe mutacje punktowe mogą być generowane szybko, co pozwala na funkcjonalne badanie zmienności genetycznej w kontekście endoginicznej kontroli regulacyjnej, unikając jednocześnie zastrzeżeń związanych z nadekspresją białek.Aby przeprowadzić selekcję celu sgRNA, otwórz stronę internetową pokazaną tutaj. Wprowadź około 60 par zasad sekwencji otaczającej żądaną edycję, która Cię interesuje. Po wybraniu genomu C.Elegans i motywu przylegającego do protospaceru zgodnie z protokołem tekstowym, kliknij przycisk Prześlij.Na stronie wyników wybierz sekwencję docelową o najwyższej pozycji, która znajduje się najbliżej interesującej Cię edycji. Po otrzymaniu odwirować liofilizowaną probówkę zawierającą sgRNA w temperaturze pokojowej i co najmniej 12 000 g przez jedną minutę. Dodaj 60 mikrolitrów TE wolnego od nukleaz do probówki i użyj pipety p200, aby delikatnie zawiesić, pipetując w górę iw dół 15 do 20 razy.Końcowe stężenie wynosi 50 mikromolów. Zaprojektuj szablon ssODN HDR zawierający mutację będącą przedmiotem zainteresowania, unikalne miejsce endonukleazy restrykcyjnej ramki, cichą mutację jednego lub obu G w sekwencji NGG PAM oraz 50 par zasad, pięć pierwszych i trzech pierwszych ramion homologii flankujących pierwszą i ostatnią mutację. Po otrzymaniu odwirować liofilizowaną probówkę zawierającą ssODN, jak właśnie pokazano, a następnie użyć DD H20 wolnego od nukleazy, aby delikatnie zawiesić ssODN do końcowego stężenia 100 mikromolowych.Aby przygotować mieszaninę do wstrzykiwań, należy odwirować pokazane tutaj odczynniki z maksymalną prędkością i czterema stopniami Celsjusza przez dwie minuty. W podanej kolejności dodaj odczynniki do probówki PCR bez nukleazy. Następnie za pomocą pipety p20 delikatnie i dokładnie wymieszaj zawartość.Inkubować probówkę w temperaturze pokojowej przez dziesięć minut. Po wstrzyknięciu zwierzętom P0 zgodnie z protokołem tekstowym, pozwól im dojść do siebie w temperaturze pokojowej przez jedną do dwóch godzin na 35-milimetrowej płytce NGM z nasionami OP50. Następnie, za pomocą kilofa ślimakowego z drutu platynowego, przenieś pojedyncze wstrzyknięte zwierzęta P0 na indywidualne płytki NGM o średnicy 35 milimetrów OP50.Dwa dni po wstrzyknięciu użyj mikroskopu fluorescencyjnego, aby zidentyfikować płytki P0 zawierające potomstwo F1, wykazujące ekspresję mCherry w gardle. Wybierz trzy płytki P0, które zawierają najwięcej zwierząt mCherry dodatnich F1. Z każdej z trzech wybranych płytek P0 użyj kilofa, aby wyłowić od ośmiu do 12 mCherry dodatnich zwierząt F1, co daje w sumie od 24 do 36 mCherry dodatnich F1.Pozwól poszczególnym F1 na samozapłodnienie i złóż jaja w temperaturze pokojowej przez jeden do dwóch dni. Po jednym do dwóch dni składania jaj użyj wykałacza do robaków, aby przenieść F1 do pojedynczych nakrętek probówek z paskami PCR zawierających siedem mikrolitrów buforu do lizy robaków. Odwiruj probówki do PCR z maksymalną prędkością i temperaturą pokojową przez jedną minutę, aby sprowadzić zwierzęta na dno probówki.Następnie zamroź probówki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na godzinę. Następnie poddaj zamrożone robaki lizie w termocyklerze za pomocą następującego programu. Następnie skonfiguruj główną mieszankę PCR, jak pokazano w tej tabeli.Dodaj 21 mikrolitrów głównej mieszanki PCR do czystych probówek PCR, a następnie dodaj cztery mikrolitry rurki do lizy ślimakowej i dobrze wymieszaj przez pipetowanie. Następnie uruchom program PCR zgodnie z wytycznymi producenta. Oczyść reakcje PCR za pomocą zestawu do czyszczenia i koncentratu DNA, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.Następnie rozcieńczyć DNA, dodając 10 mikrolitrów wody do kolumny wirowej. Po ustawieniu głównej mieszanki enzymów restrykcyjnych dodaj 10 mikrolitrów do każdej oczyszczonej reakcji PCR i inkubuj probówki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną do dwóch godzin. Następnie oddziel strawione produkty PCR na 1,5% żelu agarozowym za pomocą 1x buforu TAE o napięciu 120 woltów.Zbadaj próbki trawione enzymatycznie pod kątem obecności prążków, które wskazują na potencjalne edytowane zwierzęta. Po zidentyfikowaniu potencjalnych edytowanych zwierząt użyj pozostałych trzech mikrolitrów lizy robaków i powtórz PCR. Następnie natychmiast załaduj zakończone reakcje na 1% żel agarozowy przed oddzieleniem i ekstrakcją opaski za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu.Korzystając ze startera F1, przeprowadź sekwencjonowanie Sangera, aby zidentyfikować prawidłowo edytowane zwierzęta. Na koniec, aby uzyskać homozygotyczne zwierzęta ze zweryfikowanych heterozygotycznych edytowanych zwierząt, należy wybrać od ośmiu do 12 zwierząt F2 i przeprowadzić genotypowanie i weryfikację sekwencji zgodnie z protokołem tekstowym. Aby zademonstrować prostotę, wykonalność i skuteczność podejścia opartego na CRISPR/Cas9 RNP, gen C.Elegans sod-1 został ukierunkowany na wprowadzenie do genomu robaka związanego z chorobą wariantu G93a.Ten obraz żelu przedstawia wyniki genotypowania dla 24 zwierząt mCherry dodatnich F1. 10 zawierało modyfikację monoalliczną lub bialliczną, 10 było typu dzikiego, trzy były potencjalnymi indelami, a jeden był niepowodzeniem PCR. Aby zademonstrować, że fluorescencyjny marker mCherry wzbogaca się do modyfikacji genomu, wybrano osiem zwierząt mCherry ujemnych z każdej z trzech płytek P0.Tylko jedno zwierzę zostało poprawnie zmodyfikowane, podczas gdy 23 były typu dzikiego. Rysunek ten przedstawia chromatogram z produktu PCR ekstrahowanego żelem o pełnej długości, wykazując, że dokładne zmiany nukleotydowe zaprojektowane w matrycy ssODN HDR zostały wiernie włączone do genomu tego homozygotycznego zwierzęcia F1. Po opanowaniu, technika ta może być wykorzystana do generowania i identyfikacji punktowych mutacji genomowych u C.Elegans w ciągu czterech do pięciu dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o użyciu odczynników i technik wolnych od jąder zamkniętych, w tym wody wolnej od RNaz, końcówek do pipet filtrujących i rękawiczek. Po tej procedurze można przeprowadzić testy komórkowe, molekularne i behawioralne w celu zbadania fenotypów, które mogą wiązać się z mutacją będącą przedmiotem zainteresowania. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak precyzyjnie generować punktowe mutacje genomowe u C.Elegans przy użyciu chimerycznej pojedynczej przewodnikowej RNazy i rybonuclearprotein CRISPR/Cas9.

a-rapid-facile-pipeline-for-generating-genomic-point-mutants-c

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Ten film opisuje technikę szybkiego badania pojedynczego nicienia pod kątem markera genetycznego za pomocą badania przesiewowego PCR. W przykładowym protokole przeprowadzamy badania przesiewowe pod kątem edycji genomu opartej na CRISPR.

PCR z pojedynczym robakiem: metoda ekstrakcji i amplifikacji genomowego DNA

Ten film opisuje mikroiniekcję, powszechną metodę tworzenia transgenicznych szczepów C. elegans. W przykładzie zobaczymy mikroiniekcję użytą do wprowadzenia kompleksu rybonukleoproteinowego (RNP) do edycji genów zasad CRISPR.

Mikroiniekcja gonad: metoda dostarczania związków bezpośrednio do linii rozrodczej C. elegans

CRISPR/Cas9 to solidny system do wywoływania zakłóceń w genach i elementach genetycznych. W tym miejscu opisujemy protokół skutecznego tworzenia delecji genomowych w liniach komórkowych ssaków przy użyciu CRISPR/Cas9.

Generowanie delecji genomowych w liniach komórkowych ssaków za pomocą CRISPR/Cas9

Opisana tutaj technika genotypowania, która łączy reakcję łańcuchową fluorescencyjnej polimerazy (PCR) z elektroforezą żelu kapilarnego, pozwala na wysokoprzepustowe genotypowanie klonów nokautujących za pośrednictwem nukleazy. Omija ograniczenia, z jakimi borykają się inne techniki genotypowania, i jest bardziej opłacalna niż metody sekwencjonowania.

Wykorzystanie techniki fluorescencyjnej elektroforezy żelowej kapilarnej PCR do genotypowania mutantów nokautujących za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w formacie wysokoprzepustowym

Ukierunkowana edycja genomu w systemie modelowym Danio rerio (danio pręgowany) została znacznie ułatwiona dzięki pojawieniu się metod opartych na CRISPR. W niniejszym artykule opisujemy uproszczony, solidny protokół generowania i identyfikacji nonsensownych alleli pochodzących z CRISPR, który obejmuje test mobilności heterodupleksowej i identyfikację mutacji przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji.

Wydajna produkcja i identyfikacja nokautów genów generowanych przez CRISPR/Cas9 w systemie modelowym Danio rerio

Wykorzystanie wstępnie złożonego kompleksu rybonukleoproteinowego Cas9 (RNP) to potężna metoda precyzyjnej, efektywnej edycji genomu. W tym miejscu podkreślamy jego użyteczność w szerokim zakresie komórek i organizmów, w tym pierwotnych komórek ludzkich oraz zarówno klasycznych, jak i powstających organizmów modelowych.

Ulepszona edycja genomu za pomocą rybonukleoproteiny Cas9 w różnych komórkach i organizmach

Ten protokół zapewnia metodę ułatwiającą generowanie zdefiniowanych heterozygotycznych lub homozygotycznych zmian nukleotydowych za pomocą CRISPR-CAS9 w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych.

Generowanie zdefiniowanych modyfikacji genomowych z wykorzystaniem CRISPR-CAS9 w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych

Celem tego protokołu jest umożliwienie bezproblemowej edycji genomu C. elegans za pomocą CRISPR/Cas9 przy użyciu złożonych kompleksów rybonukleoproteinowych i markera co-CRISPR dpy-10 do badań przesiewowych. Protokół ten może być stosowany do dokonywania różnych modyfikacji genetycznych u C. elegans, w tym insercji, delecji, wymiany genów i podstawiania kodonów.

Edycja CRISPR/Cas9 genu rbm-3.2 C. elegans przy użyciu markera przesiewowego dpy-10 Co-CRISPR i złożonych kompleksów rybonukleoproteinowych.

Tutaj opisujemy prostą technikę przeznaczoną do efektywnego generowania genetycznie modyfikowanych myszy o nazwie CRISPR RNP Electroporation of Zygot (CRISPR-EZ). Metoda ta zapewnia edycję odczynników poprzez elektroporację do zarodków z wydajnością bliską 100%. Protokół ten jest skuteczny w przypadku mutacji punktowych, małych insercji genomowych i delecji w zarodkach ssaków.

Wydajna edycja genomu myszy za pomocą elektroporacji zygot CRISPR

Ten artykuł demonstruje inżynierię genomu pośredniczoną przez CRISPR-Cas9 w Steinernema hermafroditum, nicieniu entomopatogenicznym (EPN: pasożytniczym owadziem) oraz rozwijającym się modelem genetycznym. Opisana technologia jest przydatna do tworzenia mutantów, umożliwiając wyjaśnienie funkcji genów w biologii nicieni, które są istotne dla symbiozy mutualistycznej i pasożytniczej.

Mutageneza oparta na CRISPR-Cas9 w nicieniu entomopatogenicznym Steinernema hermafroditum oraz utrzymanie linii mutantów

Przepływ pracy z mikroiniekcją CRISPR/Cas9 do endogennego fluorescencyjnego oznaczania w linii komórkowej Caenorhabditis elegans w celu uzyskania homozygotycznych linii knock-in do analizy lokalizacji białka in vivo lokalizacji białka.

Endogenouszne fluorescencyjne oznaczanie genów specyficznych dla komórek germinalnych za pośrednictwem CRISPR/Cas9 u Caenorhabditis elegans

Naucz się generować punktowe mutacje genomowe u C. elegans przy użyciu rybonukleoprotein CRISPR/Cas9 i szablonów naprawy HDR. Ta metoda umożliwia szybkie badanie wariancji genetycznej w kontekście endogennej kontroli regulacyjnej bez nadekspresji białek.

Szybki i łatwy proces generowania punktowych mutantów genomowych u C. elegans przy użyciu rybonukleoprotein CRISPR/Cas9

Przeglądaj więcej filmów