Szybki i łatwy proces generowania punktowych mutantów genomowych u C. elegans przy użyciu rybonukleoprotein CRISPR/Cas9

Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie genomowych mutacji punktowych u C.Elegans przy użyciu jednoniciowych szablonów naprawczych skierowanych do homologii oligonukleotydów i rybonukleoprotein CRISPR/Cas9. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neuronauki, takie jak określenie patologicznych konsekwencji zmienności genetycznej związanej z chorobą neurodegeneracyjną. Główną zaletą tej techniki jest to, że genomowe mutacje punktowe mogą być generowane szybko, co pozwala na funkcjonalne badanie zmienności genetycznej w kontekście endoginicznej kontroli regulacyjnej, unikając jednocześnie zastrzeżeń związanych z nadekspresją białek.

Aby przeprowadzić selekcję celu sgRNA, otwórz stronę internetową pokazaną tutaj. Wprowadź około 60 par zasad sekwencji otaczającej żądaną edycję, która Cię interesuje. Po wybraniu genomu C.Elegans i motywu przylegającego do protospaceru zgodnie z protokołem tekstowym, kliknij przycisk Prześlij.

Na stronie wyników wybierz sekwencję docelową o najwyższej pozycji, która znajduje się najbliżej interesującej Cię edycji. Po otrzymaniu odwirować liofilizowaną probówkę zawierającą sgRNA w temperaturze pokojowej i co najmniej 12 000 g przez jedną minutę. Dodaj 60 mikrolitrów TE wolnego od nukleaz do probówki i użyj pipety p200, aby delikatnie zawiesić, pipetując w górę iw dół 15 do 20 razy.

Końcowe stężenie wynosi 50 mikromolów. Zaprojektuj szablon ssODN HDR zawierający mutację będącą przedmiotem zainteresowania, unikalne miejsce endonukleazy restrykcyjnej ramki, cichą mutację jednego lub obu G w sekwencji NGG PAM oraz 50 par zasad, pięć pierwszych i trzech pierwszych ramion homologii flankujących pierwszą i ostatnią mutację. Po otrzymaniu odwirować liofilizowaną probówkę zawierającą ssODN, jak właśnie pokazano, a następnie użyć DD H20 wolnego od nukleazy, aby delikatnie zawiesić ssODN do końcowego stężenia 100 mikromolowych.

Aby przygotować mieszaninę do wstrzykiwań, należy odwirować pokazane tutaj odczynniki z maksymalną prędkością i czterema stopniami Celsjusza przez dwie minuty. W podanej kolejności dodaj odczynniki do probówki PCR bez nukleazy. Następnie za pomocą pipety p20 delikatnie i dokładnie wymieszaj zawartość.

Inkubować probówkę w temperaturze pokojowej przez dziesięć minut. Po wstrzyknięciu zwierzętom P0 zgodnie z protokołem tekstowym, pozwól im dojść do siebie w temperaturze pokojowej przez jedną do dwóch godzin na 35-milimetrowej płytce NGM z nasionami OP50. Następnie, za pomocą kilofa ślimakowego z drutu platynowego, przenieś pojedyncze wstrzyknięte zwierzęta P0 na indywidualne płytki NGM o średnicy 35 milimetrów OP50.

Dwa dni po wstrzyknięciu użyj mikroskopu fluorescencyjnego, aby zidentyfikować płytki P0 zawierające potomstwo F1, wykazujące ekspresję mCherry w gardle. Wybierz trzy płytki P0, które zawierają najwięcej zwierząt mCherry dodatnich F1. Z każdej z trzech wybranych płytek P0 użyj kilofa, aby wyłowić od ośmiu do 12 mCherry dodatnich zwierząt F1, co daje w sumie od 24 do 36 mCherry dodatnich F1.

Pozwól poszczególnym F1 na samozapłodnienie i złóż jaja w temperaturze pokojowej przez jeden do dwóch dni. Po jednym do dwóch dni składania jaj użyj wykałacza do robaków, aby przenieść F1 do pojedynczych nakrętek probówek z paskami PCR zawierających siedem mikrolitrów buforu do lizy robaków. Odwiruj probówki do PCR z maksymalną prędkością i temperaturą pokojową przez jedną minutę, aby sprowadzić zwierzęta na dno probówki.

Następnie zamroź probówki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na godzinę. Następnie poddaj zamrożone robaki lizie w termocyklerze za pomocą następującego programu. Następnie skonfiguruj główną mieszankę PCR, jak pokazano w tej tabeli.

Dodaj 21 mikrolitrów głównej mieszanki PCR do czystych probówek PCR, a następnie dodaj cztery mikrolitry rurki do lizy ślimakowej i dobrze wymieszaj przez pipetowanie. Następnie uruchom program PCR zgodnie z wytycznymi producenta. Oczyść reakcje PCR za pomocą zestawu do czyszczenia i koncentratu DNA, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.

Następnie rozcieńczyć DNA, dodając 10 mikrolitrów wody do kolumny wirowej. Po ustawieniu głównej mieszanki enzymów restrykcyjnych dodaj 10 mikrolitrów do każdej oczyszczonej reakcji PCR i inkubuj probówki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną do dwóch godzin. Następnie oddziel strawione produkty PCR na 1,5% żelu agarozowym za pomocą 1x buforu TAE o napięciu 120 woltów.

Zbadaj próbki trawione enzymatycznie pod kątem obecności prążków, które wskazują na potencjalne edytowane zwierzęta. Po zidentyfikowaniu potencjalnych edytowanych zwierząt użyj pozostałych trzech mikrolitrów lizy robaków i powtórz PCR. Następnie natychmiast załaduj zakończone reakcje na 1% żel agarozowy przed oddzieleniem i ekstrakcją opaski za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu.

Korzystając ze startera F1, przeprowadź sekwencjonowanie Sangera, aby zidentyfikować prawidłowo edytowane zwierzęta. Na koniec, aby uzyskać homozygotyczne zwierzęta ze zweryfikowanych heterozygotycznych edytowanych zwierząt, należy wybrać od ośmiu do 12 zwierząt F2 i przeprowadzić genotypowanie i weryfikację sekwencji zgodnie z protokołem tekstowym. Aby zademonstrować prostotę, wykonalność i skuteczność podejścia opartego na CRISPR/Cas9 RNP, gen C.Elegans sod-1 został ukierunkowany na wprowadzenie do genomu robaka związanego z chorobą wariantu G93a.

Ten obraz żelu przedstawia wyniki genotypowania dla 24 zwierząt mCherry dodatnich F1. 10 zawierało modyfikację monoalliczną lub bialliczną, 10 było typu dzikiego, trzy były potencjalnymi indelami, a jeden był niepowodzeniem PCR. Aby zademonstrować, że fluorescencyjny marker mCherry wzbogaca się do modyfikacji genomu, wybrano osiem zwierząt mCherry ujemnych z każdej z trzech płytek P0.

Tylko jedno zwierzę zostało poprawnie zmodyfikowane, podczas gdy 23 były typu dzikiego. Rysunek ten przedstawia chromatogram z produktu PCR ekstrahowanego żelem o pełnej długości, wykazując, że dokładne zmiany nukleotydowe zaprojektowane w matrycy ssODN HDR zostały wiernie włączone do genomu tego homozygotycznego zwierzęcia F1. Po opanowaniu, technika ta może być wykorzystana do generowania i identyfikacji punktowych mutacji genomowych u C.Elegans w ciągu czterech do pięciu dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o użyciu odczynników i technik wolnych od jąder zamkniętych, w tym wody wolnej od RNaz, końcówek do pipet filtrujących i rękawiczek. Po tej procedurze można przeprowadzić testy komórkowe, molekularne i behawioralne w celu zbadania fenotypów, które mogą wiązać się z mutacją będącą przedmiotem zainteresowania. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak precyzyjnie generować punktowe mutacje genomowe u C.Elegans przy użyciu chimerycznej pojedynczej przewodnikowej RNazy i rybonuclearprotein CRISPR/Cas9.