Dostarczanie wirusów z przewodników CRISPR do mysiej prostaty w celu zmiany genów

Ogólnym celem tej procedury chirurgicznej jest zmiana ekspresji genów w mysiej prostacie poprzez wirusowe dostarczanie prowadnic CRISPR Cas9 do indukcji raka prostaty. Metoda ta może pomóc w rozwiązaniu nowych pytań w biologii raka prostaty dotyczących analizy i walidacji nowych genów w warunkach in vivo. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia szybką edycję wielu genów poprzez celowanie tylko w podzbiór komórek gruczołu krokowego, jak widać w scenariuszu ludzkim.

Ktoś, kto jest nowy w procedurze, może na początku zmagać się z rozmiarem narządu i precyzją, która jest potrzebna do pomyślnego zakończenia operacji. Aby świeżo przygotować całkowitą objętość 5 mililitrów środka znieczulającego, wymieszaj 0,15 mililitra jednego mg na mililitr chlorowodorku medetomidyny, 0,4 mililitra 5 mg na mililitr midazolamu i 0,25 mililitra 10 mg na mililitr butorfenolu. Następnie dodaj 4,2 mililitra sterylnej wody z solą fizjologiczną.

Aby odwrócić skutki chlorowodorku medetomidyny po operacji, zmieszaj 0,1 mililitra 5 mg na mililitr atipamezolu z 4,9 mililitra sterylnej wody z solą fizjologiczną jako antidotum na znieczulenie. Przygotuj aseptyczne środowisko chirurgiczne poprzez odpowiednią dezynfekcję i sterylizację oraz autoklaw narzędzi chirurgicznych. Aby dostarczyć wirusa do prostaty, po znieczuleniu ośmiotygodniowego samca myszy zgodnie z protokołem tekstowym; Zbadaj głębokość znieczulenia, oceniając rozluźnienie mięśni, wycofanie pedału i wyczuwalne odruchy.

Gdy zaobserwuje się utratę odruchów, ogol dolną część brzucha zwierzęcia. Za pomocą sterylnego bawełnianego wacika ostrożnie zakryj oczy zwierzęcia weterynaryjną maścią okulistyczną, aby zapobiec ślepocie spowodowanej kseroftalmią. Następnie użyj 70% etanolu i 10% jodu prowidonu, aby wytrzeć ogolony brzuch, aby zdezynfekować obszar operacyjny.

Następnie za pomocą sterylnych nożyczek chirurgicznych wykonaj około centymetrowe pionowe nacięcie skóry w dolnej linii środkowej brzucha. Następnie za pomocą cienkich kleszczy punktowych podnieś otrzewną, aby zapobiec uszkodzeniu narządów, które leżą pod spodem; i użyj nożyczek chirurgicznych, aby ostrożnie wykonać ośmiomilimetrowe lub krótsze nacięcie przez otrzewną. Delikatnie odsuń tkankę tłuszczową na bok, aby odsłonić pęcherzyk nasienny.

Następnie za pomocą kleszczy pierścieniowych ostrożnie podnieś pęcherzyk nasienny, aż będzie można zidentyfikować przednią część prostaty. Teraz za pomocą strzykawki insulinowej o pojemności 0,5 mililitra i igły o rozmiarze 30 i średnicy 8 milimetrów; Wstrzyknąć łączną objętość 30 mikrolitrów roztworu wirusa do przedniego nabłonka prostaty. Zminimalizuj wyciek i upewnij się, że płyn został wchłonięty w tkance, tworząc mały pęcherzyk.

Następnie umieść pęcherzyk nasienny z powrotem w jamie brzusznej. Aby upewnić się, że płyn zostanie wchłonięty w tkance w postaci małego pęcherzyka i bez wycieków, należy wstrzykiwać go równolegle do pęcherzyka nasiennego i zgodnie z kształtem przedniego płata prostaty. Za pomocą igły stożkowej i 13-milimetrowego koła 3/8 zszyj krocze dwoma do trzech prostych przerywanych szwów wchłanialnego szwu 6-0.

Następnie uniesienie skóry kleszczami, aby uniknąć uszkodzenia otrzewnej; Zszyj skórę trzema sterylnymi klipsami o wymiarach 4,8 na 6,5 milimetra. Aby uzyskać lepszą rekonwalescencję po operacji, użyj sterylnej strzykawki o pojemności 1 mililitra i igły o wymiarach 27 na 1/2 cala, aby podać antidotum na znieczulenie w dawce 0,1 mililitra na gram masy ciała we wstrzyknięciu dootrzewnowym. Następnie ostrożnie umieść zwierzę z powrotem w klatce.

Trzymaj klatkę na poduszce grzewczej przez godzinę po zabiegu, aby zapobiec hipotermii do czasu całkowitego wyzdrowienia. Zwierzę powinno się obudzić po kilku minutach od wstrzyknięcia. Kontynuuj codzienne monitorowanie i leczenie zwierzęcia zgodnie z protokołem tekstowym.

A kiedy rana się zamknie, usuń klipsy do skóry. Aby ocenić dostarczenie wirusa do mysiej prostaty, próbki analizowano trzy miesiące po operacji. Jak pokazano tutaj, myszy użyte w tym badaniu wykazywały ekspresję GFP w komórkach, które były wystawione na działanie białka Cree wyrażanego przez wirusa.

Sygnał GFP pokazuje aktywność Cree w nabłonku prostaty, ale nie to, czy edycja genów została wywołana przez przewodnik CRISPR. Te sekcje immunohistochemiczne identyfikują ogniskowe obszary komórek o wysokiej ekspresji pAKT, co wskazuje na utratę P10. W tych panelach barwienie dla pAKT i GFP zidentyfikowało podwójnie dodatnie komórki, co potwierdziło transformację komórek gruczołu krokowego przez wirusa związanego z adenowirusem.

Ogólnie rzecz biorąc, wyniki te pokazują, że in vivo edycję genu CRISPR-Cas9 można przeprowadzić w nabłonku prostaty przy użyciu myszy Rosa26-LSL-Cas9-EGFP i wirusa związanego z adenowirusem. Po opanowaniu zabieg można wykonać w 15 minut. Technika ta utorowała drogę do badań w dziedzinie raka prostaty w celu zbadania wielu genów z jednoczesnym in vivo.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak dostarczyć substrat do mysiej prostaty. Nie zapominaj, że praca z niektórymi wirusami może być bardzo niebezpieczna i zawsze należy zachować środki ostrożności podczas wykonywania tych procedur.