Name: Trójwymiarowe hodowle organotypowe narządów zmysłów przedsionkowych i słuchowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Poznaj metodę trójwymiarowych hodowli organotypowych narządów przedsionkowych i słuchowych myszy w żelu kolagenowym. Technika zachowuje naturalną architekturę tkanek i umożliwia badanie mechanicznego oraz molekularnego sygnałowania w rozwoju ucha wewnętrznego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Dr. A. Jacobo, Dr. J. Salvi i A. Petelskiemu za ich wkład w oryginalne badania, na których opiera się ten protokół. Dziękujemy również J. Llamas i W. Makmura za pomoc techniczną i hodowlę zwierząt. Dziękujemy za stypendium szkoleniowe NIDCD T32 DC009975, grant NIDCD R01DC015530, Robertson Therapeutic Development Fund oraz Caruso Family Foundation za dofinansowanie. Na koniec dziękujemy za wsparcie ze strony Instytutu Medycznego Howarda Hughesa, którego dr Hudspeth jest badaczem.

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Komitety ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Uniwersytetu Rockefellera oraz Uniwersytetu Południowej Kalifornii.
1. (Opcjonalnie) Przygotowanie roztworu kolagenu I ze ścięgien mysiego ogona
Uwaga: Roztwory Collagen I są dostępne na rynku. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi przygotowania żelu.
<ol>
	<li>Poddaj eutanazji 5 - 10 młodych dorosłych (w wieku 3-5 tygodni) myszy dowolnego dzikiego szczepu dwutlenkiem węgla zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez odpowiedni Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt16. Zbierz ogony i zdezynfekuj je, zanurzając w 70% etanolu na co najmniej 4 godziny w temperaturze pokojowej. 
	nuta: Należy unikać inkubacji trwającej ponad 48 godzin, gdyż powoduje ona nadmierne odwodnienie tkanek i utrudnia proces ekstrakcji ścięgien.</li>
	<li>Usuń skórę z każdego ogona, wprowadzając podłużne cięcie ostrzem skalpela i cofając całą skórę kleszczami. Przenieś oskórowane ogony na 100-milimetrową szalkę Petriego wypełnioną czystym 70% etanolem i pokrój je na 10-milimetrowe segmenty. 
	nuta: Odrzuć najcieńsze części ogonów, którymi trudno jest manipulować.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy przymocuj każdy segment ogona do dna szalki Petriego i użyj drugiej pary cienkich kleszczy, aby wydobyć ścięgna z ogona pojedynczo. Poszczególne włókna ścięgien powinny wyłaniać się z minimalnym oporem. 
	nuta: Stare, kleszcze #5 dobrze sprawdzają się na tym etapie.</li>
	<li>Przygotować 100 ml 0,1% roztworu (objętościowo) kwasu octowego w sterylnej wodzie molekularnej i dodać 10 ml tego roztworu do sterylnej 100-milimetrowej szalki Petriego. Przenieś ścięgna na szalkę Petriego i pozostaw na 1 godzinę w temperaturze pokojowej w celu denaturacji kolagenu I.</li>
	<li>Użyj sterylnego skalpela lub nożyczek do irydektomii z, zakrzywionymi końcówkami, aby rozdrobnić ścięgno na fragmenty o średnicy 1 - 2 mm. Przenieś rozdrobnione ścięgna do sterylnej probówki o pojemności 50 ml i dodaj 0,1% kwasu octowego, aby doprowadzić objętość do 50 ml. 
	nuta: Użyj czterech lub pięciu ogonków na każde 50 ml kwasu, aby uzyskać stężenie kolagenu I 2,0 - 2,5 mg / ml.</li>
	<li>Przechowywać roztwór kolagenu I w lodówce w temperaturze 4 °C przez co najmniej 48 godzin, aby ułatwić całkowitą denaturację białek. Wir z wirem stołowym ustawionym na maksymalną prędkość przez 1 minutę dwa razy dziennie.</li>
	<li>Zmierzyć stężenie białka w roztworze za pomocą testu kwasu bicinchoninowego, dostosować stężenie kolagenu I do 2,0 - 2,5 mg/ml przez dodanie 0,1% roztworu kwasu octowego i przechowywać w temperaturze 4 °C. 
	nuta: Roztwór kolagenu I można przechowywać przez rok do dwóch lat.</li>
	<li>(Opcjonalnie) Odwirować roztwór kolagenu I w temperaturze 2 000 x g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C i użyć półprzezroczystej frakcji górnej (około połowy objętości), aby uzyskać optycznie przezroczyste żele kolagenowe w sekcji 4.</li>
</ol>
2. Rozwarstwienie narządów przedsionkowych i słuchowych
<ol>
	<li>Poddaj ciężarne myszy dowolnego szczepu eutanazji dwutlenkiem węgla zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez odpowiedni Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt16. Ekstrakcja i odcięcie głów zarodkom. 
	nuta: Myszy Lfng-CreERT2/tdTomato mogą być używane do umożliwienia trwałego znakowania komórek podporowych po ekspozycji na 4-hydroksytamoksyfen17.</li>
	<li>Wysterylizuj wszystkie powierzchnie robocze i narzędzia do preparacji, w tym dwie pary kleszczy #5 i nóż do włosów18, czyszcząc je 70% etanolem.</li>
	<li>Podziel każdą głowę na dwie połowy, wprowadzając podłużne cięcie sterylnym ostrzem skalpela lub używając dwóch par kleszczy #5. Wyodrębnij kości skroniowe, które zawierają uszy wewnętrzne19, i umieść je w 15 ml lodowatego roztworu soli Hanka (HBSS) na 60-milimetrowej szalce Petriego. Trzymaj danie na lodzie. 
	nuta: Zarodki w różnych stadiach zaawansowania od E13,5 do E18,5 zostały z powodzeniem wykorzystane.</li>
	<li>(Opcjonalnie) Umyj uszy wewnętrzne, delikatnie potrząsając nimi w stożkowej probówce o pojemności 50 ml zawierającej 30 ml lodowatego HBSS i wymieniając HBSS trzy lub cztery razy. Trzymaj probówkę na lodzie. 
	nuta: Ten krok ogranicza ewentualne zanieczyszczenie kultury tkankowej i szybko podnosi temperaturę do 4 °C, co zapobiega degradacji tkanek i śmierci komórek.</li>
	<li>Używając dwóch par cienkich kleszczy #5, oddziel ucho wewnętrzne od kości skroniowej i przenieś uszy, trzy lub cztery na raz, na 60-milimetrową szalkę Petriego wypełnioną lodowatym HBSS.</li>
	<li>Wypreparuj przedsionkowe narządy zmysłów.
	<ol>
		<li>Ustaw uszy przyśrodkową stroną do góry i zlokalizuj łagiewkę. Za pomocą dwóch par kleszczy #5 usuń chrząstkę otaczającą narządy przedsionkowe. Delikatnie przeciąć nerw przedsionkowy, połączenie między łagiewką a woreczkiem oraz kanały półkoliste, jak pokazano na <silna klasa = "xfig">Rysunek 1. Delikatnie wyciągnij łagiewkę i przyczepione bańki górnego i poziomego kanału półkolistego z ucha. 
		nuta: Metoda ta może być stosowana w przypadku uszu wewnętrznych stopni E16.5 - E18.5. Zachowaj fragmenty chrząstki w sekcji 3 poniżej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wypreparuj ślimak.
	<ol>
		<li>Usuń tkankę chrzęstną otaczającą narząd słuchu za pomocą dwóch par kleszczy #5. Delikatnie odetnij połączenie między podstawą ślimaka a woreczkiem, jak pokazano na Rysunek 1. 
		nuta: W przypadku etapów E13.5 - E14.5 należy zmiękczyć chrząstkę przed rozbiorem, traktując ucho wewnętrzne 0,25% kolagenazą I w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Zachowaj fragmenty chrząstki w sekcji 3 poniżej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Za pomocą pipety o pojemności 200 μl wyposażonej w szeroką, nieprzywierającą końcówkę, przenieść łagiewkę i ślimaki na 30-milimetrową szalkę Petriego wypełnioną pożywką wzrostową zawierającą DMEM/F12 uzupełnioną 33 mM Dglukozy, 19 mM wodorowęglanu sodu, 15 mM kwasu 4(2hydroksyetylo)-1piperazynoetanosulfonowego (HEPES), 1 mM glutaminy, 1 mM nikotynamidu, 20 mg/L naskórkowego czynnika wzrostu, Czynnik wzrostu fibroblastów 20 mg/l, insulina 10 mg/l, transferyna 5,5 mg/l i selenin sodu 5 μg/l.</li>
	<li>Preparaty łagiewki należy przechowywać do 3 godzin w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowej zagazowanym 5% dwutlenkiem węgla, aby umożliwić gojenie się nacięć w nabłonku wprowadzonych podczas sekcji. Preparaty ślimakowe należy przenieść do żelu kolagenowego 10 minut po rozwarstwieniu. 
	nuta: Ponieważ preparacja odbywa się w lodowatym HBSS, nie ma potrzeby wstępnego podgrzewania podłoża do 37 °C.</li>
</ol>
3. (Opcjonalnie) Dostosuj sztywność żelu Collagen I, dodając różne stężenia chondrocytów
Uwaga: Metoda izolacji chondrocytów została zmodyfikowana przez Gosset et al.20
<ol>
	<li>Przygotować 1% roztwór kolagenazy I w sterylnym 1x PBS i przechowywać 100 - 200 μl podwielokrotności w temperaturze -80 °C. W razie potrzeby rozmrażać na lodzie, unikając wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania.</li>
	<li>Użyj cienkich kleszczy, aby zebrać kawałki chrząstki pozostałe po rozwarstwieniu narządów przedsionkowych i słuchowych z 10-12 uszu. Oddziel tkanki łączne i wewnętrzne ucha od chrząstki. Przenieś chrząstkę na 30-milimetrową szalkę Petriego i dodaj 300 μl sterylnego podłoża wzrostowego.</li>
	<li>Użyj sterylnego ostrza skalpela lub nożyczek do irydektomii z, zakrzywionymi końcówkami, aby zmielić tkankę, aby uzyskać kawałki chrząstki o długości około 0,5 mm.</li>
	<li>Dodaj kolagenazę I do pożywki z chrząstką, aby uzyskać końcowe stężenie enzymu 0,25%. Przenieść szalkę do inkubatora do hodowli tkankowej w temperaturze 37 °C, zagazowanego 5% dwutlenkiem węgla. Pipetować energicznie za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl co 20 minut, aż kawałki chrząstki rozdzielą się i nie będą już rozróżnialne w roztworze, a następnie inkubować przez dodatkowe 20 minut 
	nuta: W przypadku preparatów łagiewki izolację chondrocytów można przeprowadzić na etapie 2.9; Trwa to około 2 godzin (3 - 4 rundy pipetowania).</li>
	<li>Zebrać zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i dostosować objętość do 10 ml za pomocą sterylnego 1x PBS. Wirować przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 10 ml sterylnego 1x PBS. Wirować przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant. 
	nuta: Bardzo ważne jest, aby dwukrotnie umyć komórki; wszelkie pozostałe kolagenazy strawię kolagen I żel.</li>
	<li>Używając pipety o pojemności 200 μl, dodaj 100 μl pożywki hodowlanej do osadu komórkowego i delikatnie pipetuj do ponownego zawieszenia. Policz komórki za pomocą hemocytometru i utrzymuj je na lodzie przed użyciem.</li>
	<li>Aby zwiększyć sztywność żelu, dodaj chondrocyty do zneutralizowanego roztworu żelu kolagenu I (sekcja 1) i szybko wymieszaj, aby rozprowadzić komórki w żelu przed zestaleniem. 
	nuta: Moduł sprężystości żelu kolagenowego I (miara sztywności) wzrasta liniowo wraz z liczbą dodanych chondrocytów11. Zależność ta jest opisana przez eksperymentalnie wyznaczoną funkcję liniową E = 206·Nc + 15, w której E jest modułem sprężystości w paskalach, a Nc jest liczbą chondrocytów w milionach. Szczegółowy protokół pomiarów sztywności żelu znajduje się w oryginalnym artykule11.</li>
</ol>
4. Umieść przedsionkowy lub słuchowy narząd zmysłów w żelu Collagen I
<ol>
	<li>W sterylnej probówce o pojemności 1,5 ml przygotuj roztwór polimeryzacji kolagenu I, mieszając 160 μl 10x PBS ze wskaźnikiem pH czerwieni fenolowej, 133 μl 0,34 M wodorotlenku sodu, 70 μl 0,9 M wodorowęglanu sodu i 40 μl 1 M HEPES. Trzymaj probówkę na lodzie. 
	nuta: Ten przepis zapewnia roztwór polimeryzacyjny potrzebny do przygotowania 2 ml żelu kolagenowego I, ale w razie potrzeby można go skalować.</li>
	<li>Wymieszaj 100 μl roztworu polimeryzacyjnego i 400 μl roztworu kolagenu I na lodzie, delikatnie pipetując w górę iw dół w schłodzonej probówce o pojemności 1,5 ml. Aby zwiększyć sztywność żelu, dodać 50 μl pożywki zawierającej chondrocyty i delikatnie wymieszać, jak opisano w sekcji 3.</li>
	<li>Przenieść 500 μl zobojętnionego roztworu kolagenu I na schłodzoną 30-milimetrową szalkę Petriego z 10-milimetrową wkładką ze szklanym dnem lub do studzienki na czterodołkowej płytce. 
	nuta: Bardzo ważne jest, aby wszystkie odczynniki były trzymane na lodzie, aby zapobiec szybkiej i nierównomiernej polimeryzacji kolagenu I.</li>
	<li>Szybko przenieś ślimaki lub łagiewki do zneutralizowanego roztworu kolagenu I i dostosuj narządy do pożądanych pozycji za pomocą sterylnego noża do włosów18 lub pary cienkich kleszczy. 
	nuta: Polimeryzacja kolagenu I staje się zauważalna po 1 - 2 minutach, gdy roztwór staje się mętny.</li>
	<li>Po polimeryzacji roztworu wokół tkanki umieścić szalkę Petriego lub płytkę czterodołkową na 20 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowych gazowanym 5% dwutlenkiem węgla, aby zapewnić pełną polimeryzację.</li>
	<li>Dodać 3 ml pożywki wzrostowej uzupełnionej 0,5% płodową surowicą bydlęcą (FBS) na szalkę Petriego lub 500 μl tej samej pożywki na dołek czterodołkowej płytki. Utrzymywać kulturę w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowych zagazowanym 5% dwutlenkiem węgla. W razie potrzeby uzupełnij pożywkę wzrostową 10 μM 5-etynylo-2'-deoksyurydyną (EdU) w celu oznaczenia proliferujących komórek. 
	nuta: W razie potrzeby można zastosować wyższe stężenia FBS.</li>
</ol>
5. Iniekcje wirusowe w trójwymiarowych kulturach narządów zmysłów przedsionkowych i słuchowych
<ol>
	<li>Rozmrozić żądanego wirusa na lodzie i wymieszać z roztworem błękitu trypanowego w stożkowej probówce o pojemności 0,5 ml, aby uzyskać końcowe stężenie barwnika 0,05%. Użyj 10 - 20x barwnika, aby uniknąć znacznego rozcieńczenia wirusa. Przechowywać na lodzie. 
	nuta: Adenowirus serotyp 5 najlepiej sprawdza się w infekowaniu komórek podporowych w klasie łagiewki<sup="xref">19, podczas gdy wirus związany z adenowirusem Anc80 może infekować zarówno komórki rzęsate, jak i komórki podporowe łagiewki i ślimaka21.</li>
	<li>Odłamać końcówkę szklanej igły przygotowanej na ściągaczu do mikropipet czystymi, cienkimi kleszkami, obserwując ją przy największym powiększeniu lornetkowego mikroskopu preparacyjnego. 
	nuta: Ważne jest, aby zoptymalizować ustawienia ściągacza igłowego. Najlepiej sprawdzają się igły z trzonkiem 9 - 12 mm i otworami 20 - 30 μm.</li>
	<li>Wyjąć posiew narządów zmysłów z inkubatora. Przymocuj igłę do mikroiniektora i napełnij go 2 - 3 μl mieszaniny barwnika i wirusa. Wsuń igłę do narządu zmysłu, obserwując go pod lornetkowym mikroskopem preparacyjnym.</li>
	<li>Delikatnie przebić końcówkę igły przez mezenchymalne i nabłonkowe warstwy dachu trójwymiarowej hodowli łagiewki. Wstrzykiwać mieszaninę wirusową, aż jamy łagiewki i bańki wypełnią się niebieskim barwnikiem. 
	nuta: Ponieważ umożliwia łatwy dostęp do narządów zmysłów, 10-milimetrowa szalka Petriego ze szklanym dnem jest optymalna do wstrzykiwań.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowych gazowanym 5% dwutlenkiem węgla. 
	nuta: Gdy w konstrukcie wirusa stosuje się zielone lub czerwone białko fluorescencyjne, fluorescencja jest widoczna 24 godziny po transdukcji wirusa.</li>
</ol>

<ol><li>Oesterle, E. C., Tsue, T. T., Reh, T. A., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hair-cell+regeneration+in+organ+cultures+of+the+postnatal+chicken+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Hair-cell regeneration in organ cultures of the postnatal chicken inner ear.</a> Hear Res. 70 (1), 85-108 (1993).</li>
<li>Meyers, J. R., Corwin, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shape+change+controls+supporting+cell+proliferation+in+lesioned+mammalian+balance+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Off+J+Soc+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Shape change controls supporting cell proliferation in lesioned mammalian balance epithelium.</a> J Neurosci Off J Soc Neurosci. 27 (16), 4313-4325 (2007).</li>
<li>Cunningham, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adult+mouse+utricle+as+an+in+vitro+preparation+for+studies+of+ototoxic-drug-induced+sensory+hair+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The adult mouse utricle as an in vitro preparation for studies of ototoxic-drug-induced sensory hair cell death.</a> Brain Res. 1091 (1), 277-281 (2006).</li>
<li>Warchol, M. E., Lambert, P. R., Goldstein, B. J., Forge, A., Corwin, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+proliferation+in+inner+ear+sensory+epithelia+from+adult+guinea+pigs+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regenerative proliferation in inner ear sensory epithelia from adult guinea pigs and humans.</a> Science. 259 (5101), 1619-1622 (1993).</li>
<li>Lin, V., Golub, J. S., Nguyen, T. B., Hume, C. R., Oesterle, E. C., Stone, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Notch+activity+promotes+nonmitotic+regeneration+of+hair+cells+in+the+adult+mouse+utricles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Off+J+Soc+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Notch activity promotes nonmitotic regeneration of hair cells in the adult mouse utricles.</a> J Neurosci Off J Soc Neurosci. 31 (43), 15329-15339 (2011).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-regulation+of+the+Notch+and+Wnt+signaling+pathways+promotes+supporting+cell+proliferation+and+hair+cell+regeneration+in+mouse+utricles%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Co-regulation of the Notch and Wnt signaling pathways promotes supporting cell proliferation and hair cell regeneration in mouse utricles.</a> Sci Rep. 6, 29418(2016).</li>
<li>Chai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+induces+proliferation+of+sensory+precursors+in+the+postnatal+mouse+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling induces proliferation of sensory precursors in the postnatal mouse cochlea.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (21), 8167-8172 (2012).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5%2B+cells+regenerate+hair+cells+via+proliferation+and+direct+transdifferentiation+in+damaged+neonatal+mouse+utricle%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Lgr5+ cells regenerate hair cells via proliferation and direct transdifferentiation in damaged neonatal mouse utricle.</a> Nat Commun. 6, 6613(2015).</li>
<li>Doetzlhofer, A., White, P. M., Johnson, J. E., Segil, N., Groves, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+growth+and+differentiation+of+mammalian+sensory+hair+cell+progenitors%3A+a+requirement+for+EGF+and+periotic+mesenchyme%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro growth and differentiation of mammalian sensory hair cell progenitors: a requirement for EGF and periotic mesenchyme.</a> Dev Biol. 272 (2), 432-447 (2004).</li>
<li>White, P. M., Stone, J. S., Groves, A. K., Segil, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGFR+signaling+is+required+for+regenerative+proliferation+in+the+cochlea%3A+conservation+in+birds+and+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">EGFR signaling is required for regenerative proliferation in the cochlea: conservation in birds and mammals.</a> Dev Biol. 363 (1), 191-200 (2012).</li>
<li>Gnedeva, K., Jacobo, A., Salvi, J. D., Petelski, A. A., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastic+force+restricts+growth+of+the+murine+utricle%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Elastic force restricts growth of the murine utricle.</a> eLife. 6, (2017).</li>
<li>Aragona, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanical+checkpoint+controls+multicellular+growth+through+YAP%2FTAZ+regulation+by+actin-processing+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A mechanical checkpoint controls multicellular growth through YAP/TAZ regulation by actin-processing factors.</a> Cell. 154 (5), 1047-1059 (2013).</li>
<li>Dong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidation+of+a+universal+size-control+mechanism+in+Drosophila+and+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Elucidation of a universal size-control mechanism in Drosophila and mammals.</a> Cell. 130 (6), 1120-1133 (2007).</li>
<li>Low, B. C., Pan, C. Q., Shivashankar, G. V., Bershadsky, A., Sudol, M., Sheetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YAP%2FTAZ+as+mechanosensors+and+mechanotransducers+in+regulating+organ+size+and+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">YAP/TAZ as mechanosensors and mechanotransducers in regulating organ size and tumor growth.</a> FEBS Lett. 588 (16), 2663-2670 (2014).</li>
<li>Zhao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+YAP+oncoprotein+by+the+Hippo+pathway+is+involved+in+cell+contact+inhibition+and+tissue+growth+control%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Inactivation of YAP oncoprotein by the Hippo pathway is involved in cell contact inhibition and tissue growth control.</a> Genes Dev. 21 (21), 2747-2761 (2007).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22AVMA+Guidelines+for+the+Euthanasia+of+Animals%3A+2013+Edition%22">AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition</a>. , (2013).</li>
<li>Semerci, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lunatic+fringe-mediated+Notch+signaling+regulates+adult+hippocampal+neural+stem+cell+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Lunatic fringe-mediated Notch signaling regulates adult hippocampal neural stem cell maintenance.</a> eLife. 6, (2017).</li>
<li>Tuan, R. S., Lo, C. W. Developmental biology protocols. <a target="_blank" href="http://www.springer.com/series/7651">Methods in molecular biology</a>. , Humana Press. Totowa, N.J. 137(2000).</li>
<li>Brandon, C. S., Voelkel-Johnson, C., May, L. A., Cunningham, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+adult+mouse+utricle+and+adenovirus-mediated+supporting-cell+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp+JoVE%22%5BJournal%5D)">Dissection of adult mouse utricle and adenovirus-mediated supporting-cell infection.</a> J Vis Exp JoVE. (61), (2012).</li>
<li>Gosset, M., Berenbaum, F., Thirion, S., Jacques, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+and+phenotyping+of+murine+chondrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Primary culture and phenotyping of murine chondrocytes.</a> Nat Protoc. 3 (8), 1253-1260 (2008).</li>
<li>Landegger, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+AAV+vector+enables+safe+and+efficient+gene+transfer+to+the+mammalian+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A synthetic AAV vector enables safe and efficient gene transfer to the mammalian inner ear.</a> Nat Biotechnol. 35 (3), 280-284 (2017).</li>
<li>Burns, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reinforcement+of+cell+junctions+correlates+with+the+absence+of+hair+cell+regeneration+in+mammals+and+its+occurrence+in+birds%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Reinforcement of cell junctions correlates with the absence of hair cell regeneration in mammals and its occurrence in birds.</a> J Comp Neurol. 511 (3), 396-414 (2008).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+polarized+extension+and+planar+cell+polarity+in+the+cochlea+by+the+vertebrate+PCP+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Regulation of polarized extension and planar cell polarity in the cochlea by the vertebrate PCP pathway.</a> Nat Genet. 37 (9), 980-985 (2005).</li>
<li>Chacon-Heszele, M. F., Ren, D., Reynolds, A. B., Chi, F., Chen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cochlear+convergent+extension+by+the+vertebrate+planar+cell+polarity+pathway+is+dependent+on+p120-catenin%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Camb+Engl%22%5BJournal%5D)">Regulation of cochlear convergent extension by the vertebrate planar cell polarity pathway is dependent on p120-catenin.</a> Dev Camb Engl. 139 (5), 968-978 (2012).</li>
<li>Yamamoto, N., Okano, T., Ma, X., Adelstein, R. S., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+II+regulates+extension%2C+growth+and+patterning+in+the+mammalian+cochlear+duct%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Camb+Engl%22%5BJournal%5D)">Myosin II regulates extension, growth and patterning in the mammalian cochlear duct.</a> Dev Camb Engl. 136 (12), 1977-1986 (2009).</li>
<li>Tada, M., Heisenberg, C. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergent+extension%3A+using+collective+cell+migration+and+cell+intercalation+to+shape+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Camb+Engl%22%5BJournal%5D)">Convergent extension: using collective cell migration and cell intercalation to shape embryos.</a> Dev Camb Engl. 139 (21), 3897-3904 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Sygnały molekularne, które pośredniczą we wzroście i różnicowaniu w uchu wewnętrznym podczas rozwoju, zostały szeroko zbadane 5,6,7,8,9,10. Jednak dowody uzyskane z systemu modelu łagiewki sugerują, że sygnały mechaniczne, wyczuwane przez połączenia komórkowe i aktywację sygnalizacji Hippo, również odgrywają ważną rolę w tyc...

Badanie większości aspektów rozwoju organów ssaków zostało ułatwione przez systemy in vitro. Obecnie stosuje się dwie główne metody hodowli przedsionkowych narządów zmysłów: preparaty free-floating1 i adherent2. Obie metody pozwalają na badanie podatności komórek rzęsatych 3 i regeneration1,4 in vitro. Ponadto ustalono role rozwojowe klasy Notch<sup="xref">5,6, Wnt7,8 i receptora naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR)9,10 kaskad sygnalizacyjnych w uchu wewnętrznym zostało częściowo ustalone dzięki zastosowaniu in vitro kultury nabłonka sensorycznego. Jednak wzrost i różnicowanie komórek jest kontrolowane, nie tylko poprzez sygnalizację przez morfogeny, ale także poprzez fizyczne i mechaniczne wskazówki, takie jak kontakty międzykomórkowe, sztywność macierzy zewnątrzkomórkowej oraz mechaniczne rozciąganie lub zwężanie. Rola takich bodźców mechanicznych jest trudna do zbadania w rozwijającym się uchu wewnętrznym in vivo. Co więcej, istniejące metody hodowli swobodnie pływających i przylegających nie są odpowiednie dla takich badań in vitro. W niniejszej pracy opisano metodę trójwymiarowej hodowli organotypowej w żelach kolagenu I o różnej sztywności. Metoda ta w znacznym stopniu zachowuje architekturę in vivo narządów zmysłów przedsionkowych i ślimakowych oraz umożliwia badanie wpływu siły mechanicznej na wzrost i różnicowanie11.
Ponieważ wiadomo, że bodźce mechaniczne aktywują zdarzenia molekularne, takie jak szlak sygnałowy Hippo12,13,14,15, ważne jest, aby móc połączyć stymulację mechaniczną z manipulacjami biochemicznymi i genetycznymi. Opisana tutaj metoda hodowli pozwala na dostarczanie genów za pośrednictwem wirusa i dlatego może być wykorzystana do badania zarówno mechanicznej, jak i molekularnej sygnalizacji podczas rozwoju ucha wewnętrznego11.

<table><tbody><tr><td>#10 Ostrza chirurgiczne</td><td>Miltex</td><td>4-110</td><td></td></tr><tr><td>#5 Kleszcze</td><td>Dumont</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>100 mm szalka Petriego</td><td>Sigma</td><td>P5856-500EA</td><td></td></tr><tr><td>250 uL końcówki do pipet z dużym otworem</td><td>USA Scientific</td><td>1011-8406</td><td></td></tr><tr><td>30 mm szklana szalka Petriego</td><td>Matsunami Glass USA Corporation</td><td>D35-14-1.5-U</td><td></td></tr><tr><td>4 dołki talerz</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>4-Hydroksytamoksyfen&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H7904</td><td></td></tr><tr><td>60&nbsp; mm szalka Petriego</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>123TS1</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>537020</td><td></td></tr><tr><td>Ad-GFP</td><td>Vector Biolabs</td><td>1060</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFP, frakcja IgY kurczaka</td><td>Invitrogen</td><td>A10262&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Myo7A</td><td>Proteus Biosciences</td><td>25-6790</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Sox2 (Y-17)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-17320</td><td></td></tr><tr><td>Test kwasu bicunchoninowego</td> Zestaw do obrazowania <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 647</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10340</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza I</td><td>Gibco</td><td>17100017</td><td></td></tr><tr><td>D-glukoza</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>Naskórkowy czynnik wzrostu</td><td>Sigma</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16140063</td><td></td></tr><tr><td>Czynnik wzrostu fibroblastów</td><td>Sigma</td><td>F5392</td><td></td></tr><tr><td>Płonący/brązowy ściągacz do mikropipet</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Sigma</td><td>G8540</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometr HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Daigger</td><td>EF16034F</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma</td><td>I3536</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do irydektomii&nbsp;</td><td>Instrumenty medyczne Zepf</td><td>08-1201-10&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Mikroiniektor</td><td>Narishige</td><td>IM-6</td><td></td></tr><tr><td>Nikotynamid</td><td>Sigma</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>PBS (10X), pH 7,4</td><td>Gibco</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1X), pH 7,4</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Wskaźnik pH czerwieni fenolowej&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P4633&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Czysty etanol, 200 Proof</td><td>Decon Labs&nbsp;</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>RFP przeciwciało</td><td>ChromoTek</td><td>&nbsp; 5F8</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Selenin sodu</td><td>Sigma</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>Wir stołowy&nbsp;</td><td>VWR</td><td>97043-562</td><td></td></tr><tr><td>Transferrin</td><td>Sigma</td><td>T8158</td><td></td></tr><tr><td>Trypan niebieski&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T6146</td><td></td></tr></tbody></table>

trójwymiarowe hodowle organotypowe narządów zmysłów przedsionkowych i słuchowych

Three-dimensional Organotypic Cultures of Vestibular and Auditory Sensory Organs

Narządy zmysłów ucha wewnętrznego są trudne do zbadania u ssaków ze względu na ich niedostępność do eksperymentalnej manipulacji i obserwacji optycznej. Co więcej, chociaż istniejące techniki hodowli pozwalają na zaburzenia biochemiczne, metody te nie zapewniają środków do badania wpływu siły mechanicznej i sztywności tkanek podczas rozwoju narządów czuciów ucha wewnętrznego. W tym miejscu opisujemy metodę trójwymiarowej hodowli organotypowej nienaruszonej mysiej łagiewki i ślimaka, która pozwala przezwyciężyć te ograniczenia. Opisana tutaj technika regulacji trójwymiarowej sztywności matrycy pozwala na manipulowanie siłą sprężystą przeciwdziałającą wzrostowi tkanki. Metoda ta może być zatem wykorzystana do badania roli sił mechanicznych podczas rozwoju ucha wewnętrznego. Ponadto hodowle umożliwiają dostarczanie genów za pośrednictwem wirusa, które można wykorzystać do eksperymentów dotyczących przyrostu i utraty funkcji. Ta metoda hodowli zachowuje wrodzone komórki rzęsate i komórki podporowe i służy jako potencjalnie lepsza alternatywa dla tradycyjnej dwuwymiarowej hodowli narządów zmysłów przedsionkowych i słuchowych.

Organy sensorywne przedsionkowe i słuchowe z zarodkowych uszu, hodowane w żelach z kolagenu I o sztywności 40 Pa, naśladujących niską sztywność warunków zarodkowych11, zachowują stosunkowo prawidłowe struktury trójwymiarowe (Rycina 1) oraz utrzymują komórki rzęsate i komórki podporowe (Rysunek 2 i Rycina 3). Chociaż gęstość komórek wspierających spada o ponad 30% (test t Stude...

Trójwymiarowe organotypowe hodowle mysiej łagiewki i ślimaka w optycznie czystych żelach kolagenowych I zachowują wrodzoną morfologię tkanek, pozwalają na mechaniczną stymulację poprzez dostosowanie sztywności matrycy i umożliwiają dostarczanie genów za pośrednictwem wirusa.

Trójwymiarowe hodowle organotypowe narządów zmysłów przedsionkowych i słuchowych

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. ...

Ogólnym celem tej procedury jest ustalenie trójwymiarowych kultur organotypowych mysich narządów zmysłów przedsionkowych i słuchowych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad uchem wewnętrznym, takie jak, jakie są role siły mechanicznej i sztywności tkanek podczas rozwoju narządów czuciowych ucha wewnętrznego. Główną zaletą tej techniki jest to, że w dużej mierze zachowuje ona wrodzoną architekturę ślimaka przedsionkowego i pozwala nam badać zarówno sygnalizację molekularną, jak i mechaniczną podczas rozwoju ucha wewnętrznego.Dr Hudspeth i ja po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, kiedy zdaliśmy sobie sprawę, że trójwymiarowe hodowle mogą zapewnić warunki morfologiczne do badania wzrostu narządów przedsionkowych in vitro. Po pierwsze, użyj 70% etanolu do oczyszczenia i zdezynfekowania obszaru roboczego oraz wszystkich niezbędnych narzędzi preparacyjnych, w tym kleszczy numer pięć i noża do włosów. Następnie użyj sterylnego ostrza skalpela, aby wykonać podłużne cięcie, podziel głowę myszy na dwie połówki i usuń kości skroniowe.Przenieść 15 mililitrów buforu HBSS na 60-milimetrową szalkę Petriego na lodzie. Następnie użyj dwóch par cienki

three-dimensional-organotypic-cultures-vestibular-auditory-sensory

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Niniejsza procedura opisuje metodę izolacji i hodowli mysiego narządu Cortiego z lub bez listka spiralnego i neuronów zwoju spiralnego. Prezentujemy również metodę ekspresji egzogennego genu reporterowego w eksplantacie narządu Cortiego za pomocą elektroporacji.

Kultura pierwotna i elektroporacja plazmidowa mysiego narządu Cortiego.

Opisano prostą procedurę krojenia narządu Cortiego za pomocą wibratomu, a następnie przeprowadzenia immunohistochemii i mikroskopii konfokalnej. Procedura ta pozwala na lepsze zachowanie drobnej cytoarchitektury narządu Cortiego u ssaków, a w konsekwencji umożliwia dokładną kwantyfikację typów komórek.

Krojenie w wibratomie w celu lepszego zachowania cytoarchitektury organu Cortiego ssaków

Ten film demonstruje proces izolowania eksplantatów spiralnych zwojów z ucha wewnętrznego i ich wspólnej hodowli z organem Cortiego na matrycy wieloelektrodowej. Spiralne zwoje są ostrożnie ekstrahowane i dzielone na mniejsze skrawki tkanek lub eksplantaty. Te eksplantaty są hodowane w obszarze aktywnym matrycy wieloelektrodowej, aby promować wzrost procesów neuronalnych.

Hodowla eksplantatów neuronów spiralnych myszy na matrycach wieloelektrodowych

Analiza funkcji przedsionkowych komórek rzęsatych jest skomplikowana przez ich lokalizację głęboko w najtwardszej części czaszki, kości skroniowej skalistej. W większości badań nad funkcjonalnymi komórkami rzęsatymi wykorzystano dokładnie izolowane komórki rzęsate. W tym artykule opisano częściowo nienaruszony preparat nabłonka przedsionkowego myszy do badań elektrofizjologicznych i mikroskopii dwufotonowej.

Izolowany, częściowo nienaruszony preparat nabłonka czuciowego przedsionkowego myszy do elektrofizjologii i mikroskopii dwufotonowej o wysokiej rozdzielczości

Przedstawiamy protokół hodowli pierwotnych eksplantatów neuronów spiralnych myszy na matrycach wieloelektrodowych w celu zbadania profili odpowiedzi neuronalnej i optymalizacji parametrów stymulacji. Takie badania mają na celu poprawę interfejsu neuron-elektroda implantów ślimakowych z korzyścią dla słuchu pacjentów, a także zużycia energii przez urządzenie.

Hodowla eksplantatów neuronów zwojów spiralnych i elektrofizjologia na układach wieloelektrodowych

W tym badaniu prezentujemy metodę obrazowania w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopii konfokalnej do obserwacji komórek poruszających się w kierunku uszkodzonej tkanki poprzez inkubację ex vivo z nabłonkiem ślimaka zawierającym narząd Cortiego.

Obrazowanie poklatkowe żywych komórek in vitro w celu zbadania migracji komórek w kierunku narządu Cortiego

Pisklę jest opłacalnym, dostępnym i szeroko dostępnym organizmem modelowym do różnych badań. W tym miejscu szczegółowo opisano szereg protokołów, aby zrozumieć mechanizmy molekularne leżące u podstaw rozwoju i regeneracji ucha wewnętrznego ptaków.

Metody in ovo i ex ovo do badania rozwoju ucha wewnętrznego ptaków

Przedstawione tutaj są metody dostarczające szczegółowych instrukcji do preparowania, dysocjacji, hodowli i rejestracji patch-clamp z neuronów zwojów przedsionkowych i spiralnych ucha wewnętrznego.

Izolowanie i hodowla somaty przedsionkowej i spiralnej zwoju zwojowego od noworodków gryzoni w celu nagrań typu patch-clamp

Obecny protokół aktualizuje poprzednie protokoły i zawiera stosunkowo proste podejścia do hodowli wysokiej jakości eksplantatów ślimakowych. Zapewnia to niezawodne pozyskiwanie danych i obrazowanie w wysokiej rozdzielczości w żywych i stałych komórkach. Protokół ten wspiera trwający trend badania komórek ucha wewnętrznego.

Eksplantaty ślimakowe całego noworodka jako model in vitro

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół izolacji i hodowli pierwotnych komórek rzęsatych ślimaka od myszy. Początkowo narząd Cortiego został wypreparowany z noworodków (w wieku 3-5 dni) mysich ślimaków pod mikroskopem. Następnie komórki trawiono enzymatycznie do zawiesiny jednokomórkowej i identyfikowano za pomocą immunofluorescencji po kilku dniach w hodowli.

Izolacja i hodowla pierwotnych komórek rzęsatych ślimaka od nowonarodzonych myszy

Tutaj opisujemy technikę pobierania ludzkich narządów przedsionkowych w warunkach fizjologicznych podczas labiryntektomii i ich analizę za pomocą barwienia immunologicznego.

Pobieranie końcowych narządów przedsionkowych w warunkach fizjologicznych podczas labiryntektomii

Poznaj metodę trójwymiarowych hodowli organotypowych narządów przedsionkowych i słuchowych myszy w żelu kolagenowym. Technika zachowuje naturalną architekturę tkanek i umożliwia badanie mechanicznego oraz molekularnego sygnałowania w rozwoju ucha wewnętrznego.

Trójwymiarowe hodowle organotypowe narządów zmysłów przedsionkowych i słuchowych

Przeglądaj więcej filmów