Ocena inkluzji eksonów indukowanej przez oligonukleotydy antysensowne przełączające splicing w fibroblastach pacjentów z SMA

Ogólnym celem tego protokołu lipotransfekcji jest wprowadzenie oligonukleotydów antysensownych do komórek i ocena skuteczności tych leków w zakresie włączania eksonów do komórek SMA. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie terapii antysensownej. Takich jak skuteczność nowych oligonukleotydów antysensownych w leczeniu pacjentów.

Główną zaletą tej techniki jest to, że jest wystarczająco szybka, łatwa i czuła do testowania różnych substancji chemicznych oligonukleotydów antysensownych. Chociaż metoda ta może być stosowana do transfekcji oligonukleotydów antysensownych do fibroblastów, może być również stosowana do innych typów komórek, takich jak pierwotne mioblasty i różne inne linie komórkowe. Procedurę zademonstruje Aleks, technik z mojego laboratorium.

Najpierw rozmrozić 10-mikromolowy roztwór mieszalnika LNA/DNA na lodzie. Rozcieńczyć roztwór mieszalnika w pożywce pozbawionej surowicy do wymaganego stężenia w probówce o pojemności 1,5 mililitra. Następnie rozcieńczyć odczynnik do transfekcji i dodać rozcieńczony odczynnik do transfekcji do mieszalnika w stosunku jeden do jednego.

Bardzo ważne jest, aby zbieg komórek wynosił około 65 do 80% podczas transfekcji. Jeśli zbieg wynosi ponad 80%, wydajność transfekcji zostanie zmniejszona. Następnie inkubować mieszaninę odczynników do transfekcji w temperaturze pokojowej przez 10 minut.

Po 10 minutach odpipetować do probówki 900 mikrolitrów pożywki pozbawionej surowicy z 5% płodową surowicą bydlęcą. Nie należy dodawać FBS przed inkubacją z odczynnikiem do transfekcji i mieszalnikami LNA/DNA, ponieważ wpływa to również na skuteczność transfekcji. Następnie odessaj starą pożywkę z płytki hodowlanej.

Teraz dodaj jeden mililitr pożywki zawierającej mieszalnik LNA/DNA do płytki hodowlanej. Następnie pozostaw płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 24 do 48 godzin. Po inkubacji odessać pożywkę z płytki hodowlanej.

Następnie odpipetuj jeden mililitr odczynnika GPC do komórek. Następnie kilkakrotnie umyj studzienki odczynnikiem GPC. Po kilku płukaniach zbierz komórki w probówce o pojemności 1,5 mililitra i trzymaj próbki na lodzie.

Następnie wiruj rurkę z dużą prędkością przez 30 sekund. Następnie przechowuj probówkę w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez godzinę. Teraz rozmrozić próbkę w temperaturze pokojowej i szybko ją zawirować.

Następnie dodaj 200 mikrolitrów chloroformu do próbki i energicznie potrząsaj nią przez 15 sekund. Następnie inkubuj probówkę w temperaturze pokojowej przez trzy minuty. Po trzech minutach odwirować próbkę o masie 12 000 g przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po zakończeniu wirowania zbierz fazę wodną z górnej części probówki wirówkowej. Następnie przenieś fazę wodną do nowej probówki. Następnie dodaj 500 mikrolitrów izopropanolu i jeden mikrolitr ośmiu mikrogramów na mikrolitr glikogenu klasy RNA do fazy wodnej.

Szybko wirować próbkę przez 10 sekund i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Po inkubacji odwirować próbkę o masie 12 000 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zdekantować supernatent po zakończeniu cyklu.

Dodaj jeden mililitr zimnego 75% etanolu i krótko wiruj, aby umyć otrzymany granulek. Ponownie odwirować próbkę o masie 7500 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie wyrzuć cały etanol i wysusz granulki w temperaturze pokojowej.

Po wyschnięciu osadu rozpuść go w 30 mikrolitrach wody wolnej od DNAzy/RNAzy. Następnie inkubować próbkę w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 10 minut. Następnie odczytaj stężenie RNA na 260 nanometrach w spektrofotometrze i dostosuj je do 15 nanogramów na mikrolitr.

Aby utworzyć główną mieszaninę RT-PCR, dodaj dwa reakcyjne X RT-PCR, jednoetapową mieszaninę enzymów RT-PCR, startery do przodu i do tyłu oraz wodę destylowaną wolną od RNAzy/DNAzy. Rozprowadzić mieszaninę wzorcową do 0,2 milimetrowych probówek PCR i dodać całkowitą ilość RNA dla każdej odpowiedniej próbki. Następnie rozpocznij reakcję PCR.

Po zakończeniu RT-PCR dodaj pięć mikrolitrów sześciokrotnego barwnika ładującego do amplifikowanego produktu. Następnie załaduj pięć mikrolitrów mieszanki na 2% żel agarozowy. Uruchom urządzenie do elektroforezy przy napięciu 100 V na 40 minut.

W pierwszej kolejności badana jest wydajność różnych mieszalników. W tym celu analizuje się włączenie poziomów eksonu 7 SMN2 i GAPDH do fibroblastów SMA transfekowanych mieszaczkami. Obraz żelu pokazuje włączenie eksonu 7, gdzie górne i dolne pasma reprezentują ekson 7 dołączony i wykluczony RNA SMN2.

Skuteczność inkluzji jest również określana ilościowo na 78 do 98% w przypadku transfekcji mieszalnikami od jednego do pięciu. Z drugiej strony, nie uzyskuje się istotnych wyników, gdy do transfekcji fibroblastów SMA pacjenta stosuje się mieszanie od sześciu do ośmiu sztuk w porównaniu z kontrolą. W eksperymencie GAPDH jest używany jako kontrola.

Następnie przeprowadza się ilościowy PCR w celu analizy względnej ekspresji SMN2 o pełnej długości w porównaniu z GAPDH. Gwałtowny wzrost ilości poziomu transkryptu SMN2 obserwuje się po transfekcji mieszalnikami od jednego do trzeciego i numer pięć, w porównaniu z kontrolą. Badany jest również poziom ekspresji białka SMN, który wykazuje wzrost poziomu ekspresji białka SMN u pacjenta z fibroblastami transfekowanymi mieszankami od jednego do pięciu.

Obserwuje się gwałtowny wzrost poziomu białka SMN od 1,5 do 1,9 razy. W tym przypadku stosowaną kontrolką jest kofilina. Wręcz przeciwnie, mieszanie od sześciu do ośmiu nie zmienia poziomu ekspresji białka SMN.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak transfekować oligo antysensowne do fibroblastów i ocenić skuteczność in vitro.