Jednorodny, rozdzielczy w czasie test rezonansowy oparty na transferze energii Förstera do wykrywania wydzielania insuliny
10 maja 2018
Tutaj prezentujemy jednorodny FRET (HTRF) jako skuteczną metodę szybkiego wykrywania insuliny wydzielanej przez komórki.
Ogólnym celem tej procedury jest indukcja i dokładne określenie ilościowe poziomów insuliny wydzielanej przez komórki wydzielające insulinę. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie cukrzycy, takie jak główne mechanizmy stymulowanego przez glukozę wydzielania insuliny w komórkach beta trzustki. Główną zaletą tej techniki jest to, że może ona dokładnie i szybko określić ilościowo wydzielanie insuliny w odpowiedzi na stymulację glukozy i wykryć potencjalny wpływ leku na wydzielanie.
Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku terapii i odkrywania leków w leczeniu cukrzycy typu 2, ponieważ pozwoli nam lepiej zrozumieć mechanizmy dysfunkcji metabolicznej wywołanej przez leki. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w wydzielanie insuliny z unieśmiertelnionych linii komórek beta, może być również stosowana do innych systemów, takich jak nienaruszone wyspy trzustkowe. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności z wieloma etapami obsługi komórek i preparatami lekowymi.
Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy chcieliśmy opracować szybki test do zbadania działania leków dopaminergicznych na wydzielanie insuliny. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy obsługi komórek są trudne do nauczenia się ze względu na delikatną naturę komórek i znaczenie precyzji dla zapewnienia spójności testu między eksperymentami. Najpierw wyhoduj komórki INS-1E zgodnie z opisem w protokole tekstowym.
Gdy komórki osiągną pożądane zbiegowisko, odessać pożywkę. Umyj komórki pięcioma mililitrami soli fizjologicznej buforowanej fosforanem. Następnie dodaj 0,5 mililitra 025% trypsyny do komórek, a następnie pozostaw komórki w inkubatorze na trzy do czterech minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Dezaktywuj trypsynę, dodając dziewięć mililitrów kompletnego podłoża. Następnie przenieś komórki do 15-mililitrowej probówki wirówkowej. Następnie odwiruj komórki, aby utworzyły osad.
Po odwirowaniu rozpuść osad w pięciu mililitrach świeżego podłoża. Odpipetować 10 mikrolitrów ponownie zawieszonych komórek z probówki i wymieszać z 10 mikrolitrami barwnika trypanowego niebieskiego witalnego, aby ocenić żywotność. Następnie użyj hemocytometru, aby policzyć liczbę żywych i martwych komórek i upewnij się, że 90% komórek jest żywych.
Po zliczeniu dodaj milion komórek na mililitr w świeżej pożywce RPMI 1640, a następnie zasiej 0,5 mililitra 500 000 komórek INS-1E w każdym dołku 24-dołkowej płytki pokrytej poli-L-lizyną. Pozostawić płytkę w inkubatorze na cały dzień. Następnego dnia usuń pożywkę i dodaj 500 mikrolitrów świeżej pożywki RPMI 1640 do każdej z studzienek.
Inkubować płytkę przez kolejne 24 godziny, aby komórki rozprzestrzeniły się na powierzchni studzienki. Aby wykonać test, należy najpierw przygotować bufor KRB, a następnie odessać pożywkę z każdej z studzienek i dwukrotnie przemyć wstępnie podgrzaną solą fizjologiczną buforowaną fosforanami. Następnie dodaj 450 mikrolitrów buforu KRB, uzupełnionego albuminą surowicy bydlęcej, ale bez glukozy, do każdej studzienki.
Pozostaw płytkę hodowlaną w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla na godzinę. Przygotować seryjne rozcieńczenia leków w buforze KRB, uzupełnione 10-krotnym końcowym stężeniem 200 milimolowej glukozy. Po etapie głodu glukozy odpipetować 50 mikrolitrów seryjnie rozcieńczonych leków w każdym z odpowiednich dołków.
W celu stymulacji glukozy dodaj odpowiednie seryjnie rozcieńczone leki w obecności 20 milimolowej glukozy. Następnie inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 90 minut. Po zakończeniu stymulacji zbierz supernatanty i przenieś je do oznakowanych 1,5-mililitrowych probówek wirówkowych.
Przenieść 10 mikrolitrów każdego zebranego supernatantu do 96-dołkowej płytki. Dodaj 90 mikrolitrów KRB do każdego dołka, aby uzyskać stosunek rozcieńczenia od 1 do 10. Wymieszaj rozcieńczenia, aby zapewnić jednorodność.
Następnie należy uzyskać krzywą standardową insuliny dla testu insuliny HTRF. Następnie dodaj 10 mikrolitrów każdej ze standardowych próbek insuliny i rozcieńczone supernatanty testowe do 96-dołkowej płytki. Przygotować mieszaninę przeciwciał w dawcy od jednego do dwóch, aby zaakceptować stosunek w buforze wykrywającym.
Po przygotowaniu mieszanki przeciwciał dodaj 30 mikrolitrów do każdej z studzienek na 96-dołkowej płytce. Uszczelnić płytkę i inkubować w temperaturze pokojowej. Po dwóch godzinach inkubacji odczytać tabliczkę z mieszaniną przeciwciał na czytniku płytek.
Do odczytu należy użyć odpowiedniego modułu optycznego HTRF o długości fali 665 i 620 nanometrów i użyć 200 lamp błyskowych dla każdej studzienki. Najpierw wykreślana jest krzywa wzorcowa insuliny w celu ekstrapolacji rzeczywistych wartości insuliny z próbek testowych. Krzywa standardowa pokazuje, że uzyskany ratiometryczny odczyt fluorescencji znacznie wzrasta w funkcji predefiniowanych standardowych stężeń insuliny ludzkiej.
Następnie badany jest podstawowy poziom wydzielania insuliny z komórek INS-1E w obecności lub braku 20-milimolowej glukozy. Z wykresu wynika, że komórki wydzielają około 100 nanogramów na mililitr insuliny w obecności glukozy. Co ciekawe, poziom insuliny jest prawie o połowę niższy i wynosi około 15 nanogramów na mililitr przy braku glukozy.
Następnie komórki są inkubowane w obecności rosnących stężeń dopaminy z 20 milimolową glukozą. Wydzielana insulina jest normalizowana do średniej wartości procentowej maksymalnej insuliny z każdego dołka. Wykres pokazuje, że dopamina hamuje GSIS, wskazując tym samym na funkcjonalne znaczenie receptorów dopaminergicznych w GSIS.
Ten wykres pokazuje, że bromokryptyna, lek na cukrzycę typu 2, jest silniejsza w indukowaniu GSIS niż dopamina. Wykresy te pokazują, że wraz ze wzrostem stężenia kwinpirolu, agonista D2, choć mniej skuteczny niż bromokryptyna, wykazuje podobną siłę działania jak dopamina w stymulowaniu GSIS. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu czterech do pięciu godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.
Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o dokładnym i konsekwentnym pipetowaniu. Po tej procedurze można przeprowadzić inne testy funkcjonalne, takie jak cykliczny test AMP HDRF, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak wpływ leku dopaminergicznego na dalszą sygnalizację. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się metabolizmem do zbadania innych szlaków wydzielania wewnętrznego zarówno w unieśmiertelnionych liniach komórkowych, jak i wyspach trzustkowych.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak dokładnie mierzyć wydzielanie insuliny z komórek za pomocą HDRF.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia homogeniczną fluorescencję rezonansową z przeniesieniem energii rozdzieloną w czasie (HTRF) jako wydajną metodę szybkiego wykrywania insuliny wydzielanej przez komórki. Technika ta jest szczególnie istotna dla zrozumienia stymulowanej glukozą sekrecji insuliny w komórkach beta trzustki.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Badania nad cukrzycą
- Mechanizmy wydzielania insuliny
- Testy komórkowe
Wstęp
- Wydzielanie insuliny ma kluczowe znaczenie dla metabolizmu glukozy.
- Zrozumienie mechanizmów wydzielania może pomóc w terapii cukrzycy.
- Obecne metody mogą charakteryzować się niewystarczającą szybkością i dokładnością.
- Technika HTRF stanowi obiecującą alternatywę dla kwantyfikacji.
Cel badania
- W celu dokładnego ilościowego oznaczenia wydzielania insuliny z komórek wydzielających insulinę.
- W celu zbadania mechanizmów glukozostymulowanego wydzielania insuliny.
- W celu oceny wpływu leków na wydzielanie insuliny.
Zastosowane metody
- Technika homogenicznego FRET z rozdzielczością czasową (HTRF).
- Indukcja wydzielania insuliny w beta-komórkach trzustkowych.
- Kwantyfikacja poziomów insuliny w odpowiedzi na glukozę.
- Zastosowanie zarówno w unieśmielonych liniach komórkowych, jak i w nienaruszonych wysepkach trzustkowych.
Główne wyniki
- Metoda HTRF umożliwia szybki i dokładny pomiar wydzielania insuliny.
- Zidentyfikowano kluczowe mechanizmy wydzielania stymulowanego glukozą.
- Wykazano potencjał w zastosowaniach związanych z odkrywaniem leków.
- Uzyskano wgląd w dysfunkcje metaboliczne związane z cukrzycą.
Wnioski
- HTRF jest cennym narzędziem w badaniach nad cukrzycą.
- Umożliwia lepsze zrozumienie dynamiki wydzielania insuliny.
- Może przyczynić się do postępów w strategiach terapeutycznych w cukrzycy typu 2.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Dokładne ilościowe określenie wydzielania insuliny jest niezbędne do minimalizacji ryzyka w programach poszukiwania leków na cukrzycę, umożliwiając mechaniczną ocenę wpływu związków na stymulowane glukozą wydzielanie insuliny (GSIS). Test oparty na technice HTRF zapewnia szybki, powtarzalny i skalowalny odczyt, który wspiera wczesną walidację celów terapeutycznych oraz identyfikację wiodących związków w badaniach nad chorobami metabolicznymi. Dzięki dostarczaniu ilościowych, ratiometrycznych danych fluorescencyjnych, metoda ta zwiększa pewność prognostyczną w profilowaniu farmakologicznym modulatorów dopaminergicznych i innych sekretygogów insuliny.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesna faza odkrywania leków i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych dotyczących dopaminergicznej regulacji wydzielania insuliny.
- Wartość operacyjna: Wspiera walidację funkcjonalną celów, takich jak receptory podobne do D2, poprzez zależną od dawki inhibicję GSIS.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia selekcję związków z portfolio poprzez rozróżnienie ich potencji i skuteczności w modulowaniu uwalniania insuliny.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Gotowość testu: Generuje zstandaryzowane, ilościowe pomiary insuliny odpowiednie dla formatów wysokoprzepustowych badań przesiewowych.
- Powtarzalność: Zapewnia stabilne sygnały o niskiej wariancji dzięki odporności czasowo rozdzielonego FRET na zakłócenia.
- Skalowalność: Kompatybilność z formatami płytek 96-dołkowych umożliwia równoległe testowanie bibliotek leków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie chorobowe: Modeluje dynamikę wydzielania insuliny u ludzi z wykorzystaniem komórek INS-1E, linii pochodzącej z insulinoma szczura, istotnej dla funkcji komórek beta.
- Ciągłość translacyjna: Łączy wyniki badań podstawowych z walidacją przedkliniczną poprzez potwierdzenie wpływu leków na GSIS.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Wyjaśnia udział konkretnych szlaków (np. sygnalizacji dopaminergicznej) przed przejściem z związkami do badań in vivo.
Integracja potoku i przepływu pracy
Analiza insuliny metodą HTRF wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od przesiewowego badania zaangażowania celu po walidację funkcjonalną w programach dotyczących chorób metabolicznych, szczególnie w przypadkach, gdy wydzielanie insuliny służy jako kluczowy biomarker farmakodynamiczny.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących szlaków regulujących egzocytozę insuliny, takich jak hamowanie cAMP za pośrednictwem GPCR.
- Screening: Umożliwia standaryzację testów i powtarzalną kwantyfikację insuliny w supernatantach hodowli.
- Analityka: Zapewnia ratiometryczne odczyty HTRF przy 665nm i 620nm, które pozwalają na ekstrapolację stężeń insuliny za pomocą krzywych standardowych.
- Badania translacyjne: Łączy dane o sekrecji in vitro z istotnością przedkliniczną poprzez modelowanie odpowiedzi ludzkich komórek beta na glukozę i leki.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do oceny różnorodnych sekretagogów i związków hamujących w różnych wskazaniach metabolicznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności w mechanistycznych interpretacjach wpływu leku na sekrecję.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność eksperymentów dzięki ustandaryzowanym protokołom obsługi komórek i przygotowania odczynników.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go, dostarczając wczesnych, ilościowych informacji na temat obciążeń metabolicznych lub potencjału terapeutycznego.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację związków z uwzględnieniem ryzyka na podstawie ich modulacji GSIS.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w technikach hodowli komórkowych, w szczególności w prowadzeniu linii komórkowych wydzielających insulinę, takich jak INS-1E.
- Metoda zależy od dostępu do czytników płytek kompatybilnych z HTRF, posiadających funkcję podwójnej długości fali wzbudzenia i emisji.
- Konieczna jest standaryzacja przygotowania odczynników, w tym buforu KRB, mieszanin przeciwciał oraz rozcieńczeń leków.
- Wymagane są rozważania dotyczące adaptacji przy przejściu z unieśmiertelnionych linii komórkowych na pierwotne wyspowe komórki lub modele pochodzenia ludzkiego.
- Ograniczeniem jest konieczność dokładnej optymalizacji gęstości wysiewu komórek oraz czasów inkubacji w celu zapewnienia spójnych odpowiedzi sekrecyjnych.
