Name: Identyfikacja miejsc wiązania genomu czynnika transkrypcyjnego Olig2 w ostro oczyszczonych komórkach PDGFRα+ za pomocą analizy sekwencjonowania immunoprecypitacji chromatyny niskokomórkowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 29 s
Description: Odkryj analizę wiązania genomu czynnika Olig2 w komórkach PDGFRα+ z mózgu myszy przy użyciu niskokomórkowego ChIP-seq. Ta metoda umożliwia badanie regulacji transkrypcyjnej i mechanizmów epigenetycznych w różnicowaniu oligodendrocytów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

JQW, XD, RCDD, i YY były wspierane przez granty z National Institutes of Health R01 NS088353; Grant NIH 1R21AR071583-01; Staman Ogilvie Fund-Memorial Hermann Foundation; Inicjatywa UTHealth BRAIN i CTSA UL1 TR000371; oraz grant z University of Texas System Neuroscience and Neurotechnology Research Institute (Grant #362469).

<ol><li>Wu, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tcf7+is+an+important+regulator+of+the+switch+of+self-renewal+and+differentiation+in+a+multipotential+hematopoietic+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Tcf7 is an important regulator of the switch of self-renewal and differentiation in a multipotential hematopoietic cell line.</a> PLoS Genet. 8 (3), e1002565(2012).</li>
<li>Zuchero, J. B., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+and+extrinsic+control+of+oligodendrocyte+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Intrinsic and extrinsic control of oligodendrocyte development.</a> Curr Opin Neurobiol. 23 (6), 914-920 (2013).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+oligodendrocyte+differentiation+by+Olig2+and+Sox10%3A+evidence+for+reciprocal+interactions+and+dosage-dependent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Induction of oligodendrocyte differentiation by Olig2 and Sox10: evidence for reciprocal interactions and dosage-dependent mechanisms.</a> Dev Biol. 302 (2), 683-693 (2007).</li>
<li>Dong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Identification+of+Long+Non-coding+RNAs+in+Purified+Cell+Types+from+the+Brain+Reveals+Functional+LncRNA+in+OPC+Fate+Determination%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Identification of Long Non-coding RNAs in Purified Cell Types from the Brain Reveals Functional LncRNA in OPC Fate Determination.</a> PLoS Genet. 11 (12), e1005669(2015).</li>
<li>Hilgenberg, L. G., Smith, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+dissociated+mouse+cortical+neuron+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of dissociated mouse cortical neuron cultures.</a> J Vis Exp. (10), e562(2007).</li>
<li>Emery, B., Dugas, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+oligodendrocyte+lineage+cells+from+mouse+cortices+by+immunopanning%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Purification of oligodendrocyte lineage cells from mouse cortices by immunopanning.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013 (9), 854-868 (2013).</li>
<li>Cahoy, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcriptome+database+for+astrocytes%2C+neurons%2C+and+oligodendrocytes%3A+a+new+resource+for+understanding+brain+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function.</a> J Neurosci. 28 (1), 264-278 (2008).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RNA-sequencing+transcriptome+and+splicing+database+of+glia%2C+neurons%2C+and+vascular+cells+of+the+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex.</a> J Neurosci. 34 (36), 11929-11947 (2014).</li>
<li>Cheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+morphogenetic+protein+signaling+and+olig1%2F2+interact+to+regulate+the+differentiation+and+maturation+of+adult+oligodendrocyte+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Bone morphogenetic protein signaling and olig1/2 interact to regulate the differentiation and maturation of adult oligodendrocyte precursor cells.</a> Stem Cells. 25 (12), 3204-3214 (2007).</li>
<li>Andrews, S. FastQC: A quality control tool for high throughput sequencing data. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2018).</li>
<li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimmomatic%3A+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sequence+Alignment%2FMap+format+and+SAMtools%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li>
<li>Heinz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+combinations+of+lineage-determining+transcription+factors+prime+cis-regulatory+elements+required+for+macrophage+and+B+cell+identities%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities.</a> Mol Cell. 38 (4), 576-589 (2010).</li>
<li>Team, R. C. <a target="_blank" href="https://www.gbif.org/tool/81287/r-a-language-and-environment-for-statistical-computing">A language and environment for statistical computing.</a> R Foundation for Statistical Computing. , (2015).</li>
<li>Kharchenko, P. V., Tolstorukov, M. Y., Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+analysis+of+ChIP-seq+experiments+for+DNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Design and analysis of ChIP-seq experiments for DNA-binding proteins.</a> Nat Biotechnol. 26 (12), 1351-1359 (2008).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="https://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/gb-2008-9-9-r137">Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biol. 9 (9), R137(2008).</li>
<li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BEDTools%3A+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li>
<li>Robinson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+genomics+viewer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Integrative genomics viewer.</a> Nat Biotechnol. 29 (1), 24-26 (2011).</li>
<li>Bailey, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEME+SUITE%3A+tools+for+motif+discovery+and+searching%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">MEME SUITE: tools for motif discovery and searching.</a> Nucleic Acids Res. 37 (Web Server issue), W202-W208 (2009).</li>
<li>Sims, D., Sudbery, I., Ilott, N. E., Heger, A., Ponting, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequencing+depth+and+coverage%3A+key+considerations+in+genomic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Sequencing depth and coverage: key considerations in genomic analyses.</a> Nat Rev Genet. 15 (2), 121-132 (2014).</li>
<li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).</li>
<li>Consortium, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li>
<li>Mazzoni, E. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell-based+mapping+of+developmental+transcriptional+programs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell-based mapping of developmental transcriptional programs.</a> Nat Methods. 8 (12), 1056-1058 (2011).</li>
<li>Kheradpour, P., Kellis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+discovery+and+characterization+of+regulatory+motifs+in+ENCODE+TF+binding+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Systematic discovery and characterization of regulatory motifs in ENCODE TF binding experiments.</a> Nucleic Acids Res. 42 (5), 2976-2987 (2014).</li>
<li>Dugas, J. C., Tai, Y. C., Speed, T. P., Ngai, J., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+analysis+of+oligodendrocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional genomic analysis of oligodendrocyte differentiation.</a> J Neurosci. 26 (43), 10967-10983 (2006).</li>
<li>Gilfillan, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+and+possibilities+of+low+cell+number+ChIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Limitations and possibilities of low cell number ChIP-seq.</a> BMC Genomics. 13, 645(2012).</li>
<li>Raskatov, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+NF-kappaB-dependent+gene+transcription+using+programmable+DNA+minor+groove+binders%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Modulation of NF-kappaB-dependent gene transcription using programmable DNA minor groove binders.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1023-1028 (2012).</li>
<li>Cheneby, J., Gheorghe, M., Artufel, M., Mathelier, A., Ballester, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ReMap+2018%3A+an+updated+atlas+of+regulatory+regions+from+an+integrative+analysis+of+DNA-binding+ChIP-seq+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">ReMap 2018: an updated atlas of regulatory regions from an integrative analysis of DNA-binding ChIP-seq experiments.</a> Nucleic Acids Res. , (2017).</li>
<li>Yevshin, I., Sharipov, R., Valeev, T., Kel, A., Kolpakov, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTRD%3A+a+database+of+transcription+factor+binding+sites+identified+by+ChIP-seq+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">GTRD: a database of transcription factor binding sites identified by ChIP-seq experiments.</a> Nucleic Acids Res. 45 (D1), D61-D67 (2017).</li>
<li>Kulakovskiy, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HOCOMOCO%3A+a+comprehensive+collection+of+human+transcription+factor+binding+sites+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">HOCOMOCO: a comprehensive collection of human transcription factor binding sites models.</a> Nucleic Acids Res. 41 (Database issue), D195-D202 (2013).</li>
<li>Jain, D., Baldi, S., Zabel, A., Straub, T., Becker, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+promoters+give+rise+to+false+positive+%27Phantom+Peaks%27+in+ChIP-seq+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Active promoters give rise to false positive 'Phantom Peaks' in ChIP-seq experiments.</a> Nucleic Acids Res. 43 (14), 6959-6968 (2015).</li>
<li>Gerstein, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+the+human+regulatory+network+derived+from+ENCODE+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Architecture of the human regulatory network derived from ENCODE data.</a> Nature. 489 (7414), 91-100 (2012).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Sieci regulacji genów ssaków są bardzo złożone. ChIP-seq to potężna metoda badania interakcji białko-DNA w całym genomie. Protokół ten obejmuje sposób wykonywania sekwencji Olig2 ChIP przy użyciu niewielkiej liczby oczyszczonych OPC z mózgów myszy (zaledwie 20 tysięcy komórek na reakcję). Pierwszym kluczowym krokiem dla tego protokołu jest oczyszczenie OPC z mózgów myszy poprzez immunopanowanie za pomocą przeciwciała PDGFRα. W przypadku pozytywnej selekcji OPC z płytkami pokrytymi PDGFRα, OPC często słabo wiążą się z pły...

Ważne jest badanie białek (lub kompleksów białkowych) powiązań DNA oraz znaczników epigenetycznych, aby zbudować transkrypcyjne sieci regulacyjne zaangażowane w różne procesy biologiczne. W szczególności wiązania czynników transkrypcyjnych z genomowym DNA mogą odgrywać ważną rolę w regulacji genów, różnicowaniu komórek i rozwoju tkanek. Potężnym narzędziem do badania regulacji transkrypcji i mechanizmów epigenetycznych jest immunoprecypitacja chromatyny (ChIP). Ze względu na szybki postęp w technologii sekwencjonowania nowej generacji, ChIP w połączeniu z wysokoprzepustowym sekwencjonowaniem DNA (ChIP-seq) jest używany do analiz wiązań białko-DNA i znaczników epigenetycznych1. Jednak standardowy protokół ChIP-seq wymaga około 20 milionów komórek na reakcję, co utrudnia zastosowanie tej techniki, gdy liczba komórek jest ograniczona, takich jak izolowane komórki pierwotne i rzadkie populacje komórek.
Komórki linii oligodendrocytów, w tym komórki prekursorowe oligodendrocytów (OPC) i oligodendrocyty, są szeroko rozpowszechnione w całym mózgu i są niezbędne dla rozwoju i funkcjonowania mózgu. Jako rodzaj komórek prekursorowych, OPC są zdolne zarówno do samoodnawiania, jak i różnicowania. OPC służą nie tylko jako progenitory dla oligodendrocytów, ale także odgrywają ważną rolę w propagacji sygnalizacji neuronalnej, komunikując się z innymi typami komórek mózgowych2. Wcześniejsze badania sugerowały, że rozwój oligodendrocytów jest regulowany przez czynniki transkrypcyjne specyficzne dla linii, takie jak Olig2 i Sox103,4. Stwierdzono, że te czynniki transkrypcyjne wiążą się z regionami promotora lub wzmacniacza niektórych kluczowych genów, aby wpływać na ich ekspresję podczas specyfikacji i różnicowania oligodendrocytów. Trudno jest jednak zidentyfikować wiązanie DNA białka (lub kompleksu białkowego) będącego przedmiotem zainteresowania w ostro oczyszczonych pierwotnych OPC z bardzo ograniczoną liczbą komórek.
Ten protokół opisuje, jak systematycznie badać genomowe DNA immunoprecypitowane przez Olig2 w oczyszczonych mysich OPC w skali całego genomu przy użyciu techniki ChIP-seq. OPC z mózgów myszy zostały ostro oczyszczone przez immunopanning i użyte w eksperymencie ChIP bez proliferacji in vitro. Ograniczona liczba OPC może być uzyskana przez immunopanning i jest niewystarczająca dla standardowych eksperymentów sekwencyjnych ChIP. W tym artykule opisano niskokomórkowy protokół ChIP-seq z zaledwie 20 tysiącami komórek na reakcję ChIP dla czynników transkrypcyjnych. Krótko mówiąc, usieciowane komórki poddano lizie i sonikacji za pomocą urządzenia sonikacyjnego w celu ścinania chromatyny. Ściętą chromatynę inkubowano z przeciwciałem Olig2, a także kulkami pokrytymi białkiem A w celu wytrącenia genomowego DNA związanego z przeciwciałem Olig2. Po elucji z kulek pokrytych białkiem A i odwrotnym sieciowaniu, genomowe DNA wytrącone przez przeciwciało Olig2 oczyszczono przez ekstrakcję fenolowo-chloroformową. Otrzymany produkt został określony ilościowo i poddany T-tailingowi, przełączaniu i rozszerzaniu szablonów do wyżarzania podkładowego, dodaniu adapterów i wzmocnieniu, doborze rozmiaru biblioteki i etapach oczyszczania w celu budowy biblioteki ChIP-seq.
Po sekwencjonowaniu, jakość surowych odczytów zarówno z próbki przygotowanej z przeciwciałem czynnika transkrypcyjnego Olig2, jak i próbki kontrolnej została przeanalizowana. Przycięte zostały niskiej jakości pary baz oraz adapter zawierający odczytane fragmenty. Następnie przycięte odczyty zostały wyrównane do genomu referencyjnego myszy. Regiony genomu, które zostały znacznie wzbogacone do odczytów ChIP, w porównaniu z próbką kontrolną, zostały wykryte jako piki. Znaczące piki, reprezentujące potencjalne miejsca wiązania czynników transkrypcyjnych, przefiltrowano i zwizualizowano w przeglądarce genomu.
Zauważalnie, metoda opisana w tym protokole może być szeroko stosowana do sekwencji ChIP-seq innych czynników transkrypcyjnych z dowolnym typem komórki o ograniczonej liczbie.

<table><tbody><tr><td>Odczynnik/ Sprzęt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Banderiaea simplicifolia lektyna 1</td><td>Vector Laboratories</td><td># L-1100</td><td></td></tr><tr><td>Szczurze przeciwciało anty-PDGFRa</td><td>BD Bioscience</td><td># 558774</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do dysocjacji tkanki nerwowej (P)</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td># 130-092-628</td><td></td></tr><tr><td>Technologie</td><td></td> <td>Accutase STEMCELL# 07920</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Thermo Fisher</td><td># 15596026</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-NG2 Siarczan chondroityny Proteoglikan</td><td>Millipore</td><td># AB5320</td><td></td></tr><tr><td>Urządzenie do sonikacji Bioruptor Pico</td><td>Diagenoda</td> <td># B01060001</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw True MicroChIP</td><td>Diagenode</td> <td># C01010130</td><td></td></tr><tr><td>Fenol:Chloroform:Alkohol izoamylowy (25:24:1, v / v)</td><td>Thermo Fisher</td><td># 15593031</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do czyszczenia żelu NucleoSpin i PCR</td><td>MACHEREY-NAGEL</td><td># 740609</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania Quant-iT PicoGreen dsDNA</td><td>Thermo Fisher</td><td># P11496</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw DNA SMART ChIP-Seq</td><td>Clontech Laboratories</td><td># 634865</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Voulter</td><td># A63880</td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>Thermo Fisher</td><td># AM9516</td><td></td></tr><tr><td>pico-green</td><td>Thermo Fisher</td><td># P11496</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>Thermo Fisher</td><td># 14190-144</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green master mix</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td># 1725124</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Fisher Scientific</td><td># 11-320-033</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (P/S)</td><td>Fisher Scientific</td><td># 15140122</td><td></td></tr><tr><td>N-2 Suplement</td><td>Fisher Scientific</td><td># 17502048</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Suplement</td><td>Fisher Scientific</td><td># 17504044</td><td></td></tr><tr><td>insulina</td><td>Sigma</td><td># I6634</td><td>Przygotować roztwór insuliny o stężeniu 0,5 mg/ml, rozpuszczając 5 mg insuliny w 10 ml wody i 50 μm; l z 1 N HCl.</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej, odpowiednia do hodowli komórkowych (BSA)</td><td>Sigma</td><td># A4161</td><td>Przygotować 4% roztwór BSA, rozpuszczając 4 g BSA w 100 ml D-PBS i dostosować pH do 7,4</td></tr><tr><td>Białko podstawowe czynnika wzrostu fibroblastów, rekombinowane przez człowieka (bFGF)</td><td>EMD Millipore</td><td># GF003</td><td></td></tr><tr><td>HUMAN PDGF-AA</td><td>VWR</td><td># 102061-188</td><td></td></tr><tr><td>poli-D-lizyna</td><td>VWR</td><td># IC15017510</td><td>Przygotować 1 mg/ml roztwór poli-D-lizyny, rozpuszczając 10 mg poli-D-lizyny w 10 ml wody i rozcieńczać 100 razy podczas używania.</td></tr><tr><td>Jednorazowe szalki Petriego Falcon, sterylne, Corning, 100x15mm</td><td>VWR</td><td># 25373-100</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe szalki Petriego Falcon, sterylne, Corning, 150x15mm</td><td>VWR#</td> <td>25373-187</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, 10X, bez wapnia, bez magnezu, bez fenolu Red</td><td>Fisher Scientific</td><td># 14185-052</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Stemcell Technologies</td><td># 07050</td><td></td></tr> koktajl <tr><td>inhibitorów proteazy</td><td>Sigma</td><td># 11697498001</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FastQC</td><td>[10] http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</td><td></td> <td>Uzyskiwanie wskaźników kontroli jakości odczytów surowych i przyciętych</td></tr><tr><td>Trimmomatic 0.33</td><td>[11] http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic</td><td></td><td>Przycinanie i filtrowanie surowych odczytów</td></tr><tr><td>GENCODE mm10</td><td>ftp://ftp.sanger.ac.uk/pub/gencode/Gencode_mouse/release_M15/GRCm38.primary_assembly.genome.fa.gz</td><td></td><td>Genom referencyjny myszy</td></tr><tr><td>Bowtie2 2.2.4</td><td>[12] http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml</td><td></td><td>Wyrównanie odczytuje do genomu referencyjnego</td></tr><tr><td>SAMTools 1.5</td><td>[13] http://samtools.sourceforge.net/</td><td></td> <td>Konwersja pliku SAM do formatu BAM</td></tr><tr><td>HOMER 4.9.1</td><td>[14] http://homer.ucsd.edu/homer/</td><td></td> <td>Tworzenie katalogu znaczników i opisywanie wzbogaconych regionów genomowych symbolami genów</td></tr><tr><td>R 3.2.2</td><td>[15] https://www.R-project.org/</td><td></td> <td>Programowanie skryptów i uruchamianie funkcji</td></tr><tr><td>SPP 1.13</td><td>[16] https://github.com/hms-dbmi/spp</td><td></td><td>Tworzenie wykresu korelacji krzyżowej nici</td></tr><tr><td>MACS2 2.2.4</td><td>[17] https://github.com/taoliu/MACS</td><td></td><td>Znajdowanie regionów wzbogacenia ChIP nad kontrolą</td></tr><tr><td>BEDTools 2.25</td><td>[18] http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/</td><td></td> <td>Arytmetyka genomu</td></tr><tr><td>bedGraphToBigWig</td><td>http://hgdownload.cse.ucsc.edu/admin/exe/</td><td></td> <td>Konwertowanie pliku bedGraph na przeglądarkę</td></tr><tr><td>bigwig IGV 2.3.58</td><td>[19] http://software.broadinstitute.org/software/igv/</td><td></td> <td>Wizualizacja i przeglądanie znaczące piki ChIP-seq</td></tr><tr>program<td>Microsoft Excel</td><td></td><td></td><td>Spreasheet</td></tr><tr><td>KODUJ czarną listę https://sites.google.com/site/anshulkundaje/projects/blacklists</td><td></td><td></td><td>Filtrowanie pików</td></tr><tr><td>mm10.chrom.sizes</td><td>http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/mm10/bigZips/mm10.chrom.sizes.</td><td></td><td>Konwersja pliku bedGraph do</td></tr><tr><td>bazy danych motywów bigwig ENCODE</td><td>[25] http://compbio.mit.edu/encode-motifs/</td><td></td> <td>Kompleksowa baza danych motywów wymagana do wzbogacania motywów</td></tr><tr><td>MEME-ChIP</td><td>[20] http://meme-suite.org/index.html</td><td></td><td>Analiza wzbogacania motywów i odkrywanie motywów</td></tr><tr><td>Nazwy starterów używane do qPCR</td><td></td><td></td><td>Sekwencje starterów używane do qPCR</td></tr><tr><td>Mbp-F:</td><td></td><td></td><td>CTATAAATCGGCTCACACAAGG</td></tr><tr><td>Mbp-R:</td><td></td><td></td><td>AGGCGTTATATTAAGAAGC</td></tr><tr><td>Iba1-F:</td><td></td><td></td><td>ACTGCCAGTAAGACAACC</td></tr><tr><td>Iba1-R:</td><td></td><td></td><td>GCTTTTCCTCCCTGCAAATCC</td></tr><tr><td>Mog-F:</td><td></td><td></td><td>GGCTTCTTGGAGGAAGGGAC</td></tr><tr><td>Mog-R:</td><td></td><td></td><td>TGAATTGTCCTGCATAGCTGC</td></tr><tr><td>GAPDH-F</td><td></td><td></td><td>ATGACATCAAGAAGGTGGTG</td></tr><tr><td>GAPDH-R</td><td></td><td></td><td>CATACCAGGAATGAGCTTG</td></tr><tr><td>Tuj1-F</td><td></td><td></td><td>TTTTCGTCTCTAGCCGCGTG</td></tr><tr><td>Tuj1-R</td><td></td><td></td><td>GATGACCTCCCAGAACTTGGC</td></tr><tr><td>PDGFR&alpha;-F</td><td></td><td></td><td>AGAGTTACACGTTTGAGCTGTC</td></tr><tr><td>PDGFR&alpha;-R</td><td></td><td></td><td>GTCCCTCCACGGTACTCCT</td></tr></tbody></table>

identyfikacja miejsc wiązania genomu czynnika transkrypcyjnego olig2 w ostro oczyszczonych komórkach pdgfrα+ za pomocą analizy sekwencjonowania immunoprecypitacji chromatyny niskokomórkowej

Identifying Transcription Factor Olig2 Genomic Binding Sites in Acutely Purified PDGFR&#945;+ Cells by Low-cell Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Analysis

W komórkach ssaków transkrypcja genów jest regulowana w sposób specyficzny dla typu komórki przez interakcje czynników transkrypcyjnych z genomowym DNA. Uważa się, że czynniki transkrypcyjne specyficzne dla linii odgrywają istotną rolę w specyfikacji i różnicowaniu komórek podczas rozwoju. ChIP sprzężony z wysokoprzepustowym sekwencjonowaniem DNA (ChIP-seq) jest szeroko stosowany do analizy miejsc wiązania w całym genomie czynników transkrypcyjnych (lub związanego z nimi kompleksu) z genomowym DNA. Jednak do jednej standardowej reakcji ChIP wymagana jest duża liczba komórek, co utrudnia badanie ograniczonej liczby izolowanych komórek pierwotnych lub rzadkich populacji komórek. W celu zrozumienia mechanizmu regulacyjnego specyficznego dla linii oligodendrocytów czynnika transkrypcyjnego Olig2 w ostro oczyszczonych mysich OPC, przedstawiono szczegółową metodę wykorzystującą ChIP-seq do identyfikacji miejsc wiązania Olig2 (lub kompleksu Olig2) w całym genomie. Po pierwsze, protokół wyjaśnia, w jaki sposób oczyścić OPC z dodatnim receptorem alfa czynnika wzrostu pochodzenia płytkowego (PDGFRα) z mózgów myszy. Następnie przeprowadza się ChIP za pośrednictwem przeciwciała Olig2 i budowę biblioteki. W ostatniej części opisano oprogramowanie i procedury bioinformatyczne wykorzystywane do analizy Olig2 ChIP-seq. Podsumowując, w artykule przedstawiono metodę analizy obejmujących cały genom wiązań czynnika transkrypcyjnego Olig2 w ostro oczyszczonych OPC mózgu.

Przeprowadzono ChIP-seq dla małej liczby komórek oraz analizy bioinformatyczne w celu zbadania potencjalnych oddziaływań czynnika transkrypcyjnego Olig2 z genomicznym DNA w świeżo oczyszczonych OPC mózgu. Rycina 1 przedstawia ogólny schemat zarówno procedur eksperymentalnych, jak i analizy danych. W niniejszym protokole mózgi myszy postnatalnych poddano dysocjacji do zawiesiny jednokomórkowej. Po dysocjacji tkanki przeprowadzono immunopanning w celu oczyszcze...

Tutaj prezentujemy protokół, który jest przeznaczony do analizy całego genomu wiązania czynnika transkrypcyjnego oligodendrocytów 2 (Olig2) w ostro oczyszczonych komórkach prekursorowych oligodendrocytów mózgu (OPC) poprzez przeprowadzanie niskokomórkowej immunoprecypitacji chromatyny (ChIP), przygotowanie biblioteki, sekwencjonowanie wysokoprzepustowe i analizę danych bioinformatycznych.

Identyfikacja miejsc wiązania genomu czynnika transkrypcyjnego Olig2 w ostro oczyszczonych komórkach PDGFRα+ za pomocą analizy sekwencjonowania immunoprecypitacji chromatyny niskokomórkowej

In mammalian cells, gene transcription is regulated in a cell type specific manner by the interactions of transcriptional factors with genomic DNA. ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest analiza wiązania całego genomu czynnika transkrypcyjnego oligodendrocytów dwa w ostro oczyszczonych komórkach prekursorowych oligodendrocytów mózgu poprzez przeprowadzenie immunopanningu, immunoprecypitacji chromatyny niskokomórkowej, sekwencjonowania wysokoprzepustowego i analizy danych bioinformatycznych. Metoda ta jest potężnym narzędziem do badania regulacji transkrypcji w całym genomie i mechanizmów epigenetycznych, które odgrywają ważną rolę w różnicowaniu i rozwoju komórek. Główną zaletą tej techniki jest to, że ma ona szerokie zastosowanie w sekwencji ChIP innych czynników transkrypcyjnych z dowolnym typem komórek o ograniczonej liczbie, w tym ostro oczyszczonymi komórkami pierwotnymi bez proliferacji in vitro.Procedurę zademonstruje Yanan You, doktor habilitowany z mojego laboratorium. Jest współautorką niniejszej pracy. Aby wybrać komórki PDGFR-alfa-dodatnie, należy przygotować jedną płytkę do immunopanningu.Przygotuj kolejne dwie płytki na komórki śródbłonka i zubożenie mikrogleju. Następnie pokryj 10-centymetrową szalkę Petriego 30 mikrolitrami koziej immunoglobuliny przeciw szczurom. Następnie należy zamieszać płytkę, aby upewnić si

identifying-transcription-factor-olig2-genomic-binding-sites-acutely

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Przedstawiamy tutaj procedurę immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) służącą do analizy lokalizacji w całym genomie izoform białek różniących się domeną wiążącą histony. Zastosowaliśmy ją w analizie ChIP-Seq w celu zidentyfikowania celów demetylazy histonów KDM5A/JARID1A/RBP2.

Analiza całogenomowa z wykorzystaniem metody ChIP w celu identyfikacji specyficznych dla izoform celów genowych

ChIRP to nowatorska i szybka technika mapowania genomowych miejsc wiązania długich niekodujących RNA (lncRNAs). Metoda ta wykorzystuje specyficzność komplementarnych, kafelkowych oligonukleotydów, co pozwala na wyliczenie genomowych miejsc związanych z lncRNA.

Izolacja chromatyny poprzez oczyszczanie RNA (ChIRP)

Ten film opisuje protokół testu immunoprecypitacji chromatyny (ChIP), który jest klasyczną techniką demonstracji interakcji białko-DNA. Technika ta służy do identyfikacji docelowych genów w ludzkich komórkach przewlekłej białaczki limfocytowej.

Test immunoprecypitacji chromatyny: technika badania interakcji białko-DNA w komórkach

W tym filmie demonstrujemy technikę immunoprecypitacji chromatyny w celu identyfikacji miejsc wiązania białek w określonych regionach genomowego DNA komórek prekursorowych oligodendrocytów poprzez selektywną immunoprecypitację fragmentów chromatyny związanych z białkiem. Metoda ta pomaga badać interakcje kilku białek regulatorowych, w tym czynników transkrypcyjnych zaangażowanych w regulację genów.

Immunoprecypitacja chromatyny w celu identyfikacji docelowych miejsc wiązania białek w genomowym DNA

Opisujemy solidną metodę immunoprecypitacji chromatyny przy użyciu pierwotnych limfocytów T. Metoda opiera się na standardowych podejściach, ale wykorzystuje określony zestaw warunków i odczynników, które poprawiają wydajność dla ograniczonej liczby komórek. Co ważne, przedstawiono szczegółowy opis fazy analizy danych.

Wydajna immunoprecypitacja chromatyny przy użyciu ograniczonych ilości biomasy

Połączenie immunoprecypitacji chromatyny i sekwencjonowania ultra-wysokoprzepustowego (ChIP-seq) może zidentyfikować i zmapować interakcje białko-DNA w danej tkance lub linii komórkowej. Przedstawiono sposób generowania wysokiej jakości szablonu ChIP do późniejszego sekwencjonowania, na przykładzie doświadczenia z czynnikiem transkrypcyjnym TCF7L2.

Generowanie wysokiej jakości matrycy DNA do immunoprecypitacji chromatyny do sekwencjonowania wysokoprzepustowego (ChIP-seq)

W tej pracy zapewniamy eksperymentalny przepływ pracy, w jaki sposób aktywne wzmacniacze mogą być identyfikowane i eksperymentalnie weryfikowane.

Przewidywanie i walidacja elementów regulatorowych genów aktywowanych podczas różnicowania embrionalnych komórek macierzystych indukowanego kwasem retinowym

Ten protokół opisuje kombinatoryczne zastosowanie ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq i profilowania rybosomów dla linii komórkowych i komórek pierwotnych. Umożliwia śledzenie zmian w wiązaniu czynnika transkrypcyjnego, transkrypcji de novo, przetwarzaniu RNA, obrocie i translacji w czasie oraz wyświetlanie ogólnego przebiegu zdarzeń w aktywowanych i/lub szybko zmieniających się komórkach.

Analiza w czasie rzeczywistym wiązania czynników transkrypcyjnych, transkrypcji, translacji i obrotu w celu wyświetlenia globalnych zdarzeń podczas aktywacji komórkowej

Przewlekła białaczka limfocytowa (CLL) jest najczęstszą białaczką w zachodnim świecie. Czynniki transkrypcyjne NFAT są ważnymi regulatorami rozwoju i aktywacji w wielu typach komórek. W tym miejscu przedstawiamy protokół stosowania immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) w ludzkich komórkach PBL w celu identyfikacji nowych genów docelowych NFAT2.

Test immunoprecypitacji chromatyny w celu identyfikacji nowych genów docelowych NFAT2 w przewlekłej białaczce limfocytowej

Immunoprecypitacja chromatyny w połączeniu z sekwencjonowaniem nowej generacji (ChIP-seq) to metoda stosowana do ustalania interakcji między czynnikami transkrypcyjnymi a kontrolowanymi przez nie sekwencjami genomowymi. Protokół ten przedstawia techniki wykonywania sekwencji ChIP-seq z biofilmami bakteryjnymi, na przykładzie biofilmu bakteryjnego Salmonella enterica Typhimurium serovar.

Odkrywanie celów regulatorowych CsgD w biofilmie Salmonelli przy użyciu immunoprecypitacji chromatyny i sekwencjonowania wysokoprzepustowego (ChIP-seq)

Informujemy o zastosowaniu ilościowego wychwytywania konformacji chromosomów, a następnie sekwencjonowania wysokoprzepustowego w ciałach embrionalnych generowanych z embrionalnych komórek macierzystych. Technika ta pozwala na identyfikację i ilościowe określenie kontaktów między domniemanymi wzmacniaczami a regionami promotorowymi danego genu podczas różnicowania embrionalnych komórek macierzystych.

Identyfikacja kontaktów wzmacniacz-promotor w ciałach embrionalnych poprzez ilościowe wychwytywanie konformacji chromosomów (4C)

Odkryj analizę wiązania genomu czynnika Olig2 w komórkach PDGFRα+ z mózgu myszy przy użyciu niskokomórkowego ChIP-seq. Ta metoda umożliwia badanie regulacji transkrypcyjnej i mechanizmów epigenetycznych w różnicowaniu oligodendrocytów.

Identyfikacja miejsc wiązania genomu czynnika transkrypcyjnego Olig2 w ostro oczyszczonych komórkach PDGFRα+ za pomocą analizy sekwencjonowania immunoprecypitacji chromatyny niskokomórkowej (Wideo) | JoVE Journal

Identyfikacja miejsc wiązania genomu czynnika transkrypcyjnego Olig2 w ostro oczyszczonych komórkach PDGFRα+ za pomocą analizy sekwencjonowania immunoprecypitacji chromatyny niskokomórkowej

Przeglądaj więcej filmów