Identyfikacja miejsc wiązania genomu czynnika transkrypcyjnego Olig2 w ostro oczyszczonych komórkach PDGFRα+ za pomocą analizy sekwencjonowania immunoprecypitacji chromatyny niskokomórkowej

Ogólnym celem tego eksperymentu jest analiza wiązania całego genomu czynnika transkrypcyjnego oligodendrocytów dwa w ostro oczyszczonych komórkach prekursorowych oligodendrocytów mózgu poprzez przeprowadzenie immunopanningu, immunoprecypitacji chromatyny niskokomórkowej, sekwencjonowania wysokoprzepustowego i analizy danych bioinformatycznych. Metoda ta jest potężnym narzędziem do badania regulacji transkrypcji w całym genomie i mechanizmów epigenetycznych, które odgrywają ważną rolę w różnicowaniu i rozwoju komórek. Główną zaletą tej techniki jest to, że ma ona szerokie zastosowanie w sekwencji ChIP innych czynników transkrypcyjnych z dowolnym typem komórek o ograniczonej liczbie, w tym ostro oczyszczonymi komórkami pierwotnymi bez proliferacji in vitro.

Procedurę zademonstruje Yanan You, doktor habilitowany z mojego laboratorium. Jest współautorką niniejszej pracy. Aby wybrać komórki PDGFR-alfa-dodatnie, należy przygotować jedną płytkę do immunopanningu.

Przygotuj kolejne dwie płytki na komórki śródbłonka i zubożenie mikrogleju. Następnie pokryj 10-centymetrową szalkę Petriego 30 mikrolitrami koziej immunoglobuliny przeciw szczurom. Następnie należy zamieszać płytkę, aby upewnić się, że cała powierzchnia płytki jest równomiernie pokryta roztworem powlekającym.

Pozostaw szalkę Petriego na noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie rozcieńczyć 40 mikrolitrów szczurzego przeciwciała anty-PDGFR-alfa z 12 mililitrami DPBS zawierającymi 0,2% albuminy surowicy bydlęcej. Następnie umyj płytkę pokrytą immunoglobuliną G 10 mililitrami 1X DPBS trzy razy z rzędu.

Następnie inkubować płytkę pokrytą immunoglobuliną G z roztworem przeciwciała PDGFR-alfa w temperaturze pokojowej przez cztery godziny. Po czterech godzinach ostrożnie dodać DPBS wzdłuż bocznej ścianki płytki, aby trzykrotnie umyć płytkę pokrytą przeciwciałem anty-PDGFR-alfa przeciwko szczurom. Nie naruszaj powlekanej powierzchni płyty.

Następnie użyj 20 mililitrów DPBS z 2,3 mikrograma na mililitr BSL-1, aby pokryć dwie 15-centymetrowe płytki Petriego przez dwie godziny. Po inkubacji ostrożnie dodaj 20 mililitrów DPBS wzdłuż bocznej ścianki płytki, aby trzykrotnie umyć płytkę BSL-1. Nie naruszaj powlekanej powierzchni.

Po umyciu odwirować zawiesinę jednokomórkową o stężeniu 300 razy g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu dodać 15 mililitrów buforu immunologicznego do osadu komórkowego. Następnie inkubuj zawiesiny jednokomórkowe z dwóch mózgów myszy sekwencyjnie na dwóch szalkach Petriego pokrytych BSL-1.

Następnie pozostaw talerze na 15 minut w temperaturze pokojowej. Mieszać płytkę co pięć minut podczas inkubacji. Następnie delikatnie zakręć płytką, aby zebrać wszystkie nieprzylegające komórki z zawiesiny komórek.

Następnie wysiewaj komórki na szczurzej płytce pokrytej przeciwciałem PDGFR-alfa. Inkubować płytkę przez 45 minut w temperaturze pokojowej. Po upływie 45 minut ponownie zakręć talerzem.

Następnie wyrzuć zawiesinę komórek. Następnie przepłucz płytkę DPBS osiem razy, aby usunąć nieprzylegające komórki. Zbadaj płytkę pod mikroskopem.

Następnie dodaj roztwór do odrywania komórek na płytce pokrytej przeciwciałem PDGFR-alfa szczura. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut. W międzyczasie potrząśnij płytką, aby usunąć przylegające komórki, i zbadaj ją pod mikroskopem.

Następnie odwiruj komórki w temperaturze 300 razy g w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu ponownie zawieś osad komórkowy za pomocą jednego mililitra pożywki do hodowli komórek OPC. Następnie policz komórki za pomocą metody wykluczania błękitu trypanowego w hemocytometrze.

Po zliczeniu w hemocytometrze dodaj 20 000 oczyszczonych OPC do jednego mililitra pożywki do hodowli komórek OPC do reakcji ChIP. Następnie dodaj 27 mikrolitrów 36,5% formaldehydu w temperaturze pokojowej przez 10 minut. To naprawi komórki.

Po 10 minutach dodaj 50 mikrolitrów 2,5 molowej glicyny na utrwalone komórki przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Dodanie glicyny zatrzyma sieciowanie DNA-białko. Następnie przemyj usieciowane komórki jednym mililitrem buforu HBSS z koktajlem inhibitorów proteazy.

Następnie odwiruj komórki we wstępnie schłodzonej wirówce z prędkością 300 razy g w czterech stopniach Celsjusza. Po usieciowaniu oczyszczonych OPC, usieciowane komórki należy przemyć lodowatym roztworem HBSS, a pozostałe etapy ChIP należy przeprowadzić pod czterema stopniami, w przeciwnym razie przeciwciało nie będzie w stanie prawidłowo wytrącić genomowego DNA. Następnie dodaj 25 mikrolitrów kompletnego buforu do lizy do osadu komórkowego i pozostaw na lodzie na pięć minut.

Następnie odpipetuj 75 mikrolitrów lodowatego buforu HBSS z koktajlem inhibitorów proteazy. Następnie należy ścinać chromatynę lizatu komórkowego we wstępnie schłodzonym systemie sonikacyjnym z pięcioma cyklami po 30 sekund włączenia i 30 sekund przerwy. Po ścięciu chromatyny odwirować lizat komórkowy w temperaturze 14 000 razy g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Pod koniec wirowania zebrać supernatant. Następnie rozcieńczyć 100 mikrolitrów ściętej chromatyny równą objętością lodowatego buforu ChIP z inhibitorem proteazy. Następnie dodaj jeden mikrolitr króliczego przeciwciała anty-Olig2 do 180 mikrolitrów rozcieńczonej ściętej chromatyny.

Inkubować probówki na obracającym się kole przez 16 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza przy 40 obrotach na minutę. Następnie dodaj 10 mikrolitrów wstępnie umytych kulek białkowych powlekanych A do probówki reakcyjnej ChIP w chłodni. Ponownie inkubuj probówki ChIP w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez kolejne dwie godziny na obracającym się kole.

Po dwóch godzinach pozostaw probówkę reakcyjną ChIP na stojaku magnetycznym na minutę. Następnie umyj granulkę kulek 100 mikrolitrami czterech myjących każdy przez cztery minuty na obracającym się kole w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie dodaj 200 mikrolitrów buforu elucyjnego do granulki kulki.

Inkubować probówkę reakcyjną w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez cztery godziny. Po denaturacji dwuniciowego DNA należy zdefosforylować trzy główne końce jednoniciowego DNA, dodając fosfatazę alkaliczną krewetek. Następnie dodaj ogon poli-T do jednoniciowego DNA za pomocą końcowej deoksynukleotydylotransferazy.

Następnie wyżarzaj starter DNA poly-dA do jednoniciowej matrycy DNA. Następnie wzmocnij bibliotekę sekwencji ChIP przy użyciu starterów do przodu i do tyłu do indeksowania. Liczba cykli PCR w celu przygotowania biblioteki zależy od ilości wyjściowego DNA.

Dobre przygotowanie biblioteki wymaga dokładnego określenia ilościowego ilości wejściowego DNA. Zbyt wiele lub zbyt mało cykli PCR może wpływać na stężenie w bibliotece, a także na złożoność, prowadząc do artefaktów PCR. Użyj kulek paramagnetycznych, aby wybrać fragmenty w zakresie od 250 do 500 par zasad z biblioteki sekwencji ChIP amplifikowanej PCR.

Użyj mikroprzepływowego urządzenia do elektroforezy chipowo-kapilarnej, aby zbadać jakość wybranej biblioteki sekwencji ChIP. Aby ocenić czystość immunopankowanych OPC, przeprowadza się badania immunobarwienia. Użycie markera linii OPC przeciwciała NG2 pokazuje, że większość komórek immunologicznych przeciwciała PDGFR-alfa jest NG2-dodatnia.

Następnie przeprowadza się ilościowy PCR w celu weryfikacji wzbogacenia PDGFR-alfa. Uzyskany wykres wykazuje niewielką ekspresję Tuj1, markera neuronalnego wskazującego na znaczne wzbogacenie PDGFR-alfa w porównaniu z dysocjowanymi komórkami mózgowymi. Uzyskano podobne wyniki wykazujące niewielką ekspresję dla wszystkich innych markerów, takich jak GFAP, Mog i Mbp, co wskazuje na wzbogacenie PDGFR-alfa.

Następnie analizowana jest jakość biblioteki sekwencji ChIP. Elektroferogram reprezentuje wyraźny pik czynnika transkrypcyjnego Olig2 w zakresie od 250 do 500 par zasad po wybraniu wielkości produktu biblioteki PCR. W tym miejscu histogram pokazuje klonalność tagu, aby zweryfikować metryki kontroli jakości uzyskane przed wywołaniem szczytu.

Pasek wskazuje, że ponad 90% odczytów jest mapowanych tylko do jednej lokalizacji genomowej. Następnie uzyskuje się wykres korelacji nici, który przedstawia wzbogacony pik odpowiadający dominującej długości fragmentu. Na wykresie czerwone linie reprezentują odpowiednio długość odczytu przy 50 parach zasad i długość fragmentu przy 130 parach zasad, wskazując w ten sposób dane wysokiej jakości.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu trzech dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po jej opracowaniu technika ta utorowała naukowcom drogę do zbadania miejsca wiązania DNA w całym genomie czynników transkrypcyjnych i innych białek w komórkach pierwotnych lub rzadkich. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak oczyścić pierwotne OPC z mózgu myszy za pomocą immunopaningu i jak przeprowadzić eksperyment ChIP-seq przy użyciu małej liczby komórek.