Identyfikacja miejsc wiązania genomu czynnika transkrypcyjnego Olig2 w ostro oczyszczonych komórkach PDGFRα+ za pomocą analizy sekwencjonowania immunoprecypitacji chromatyny niskokomórkowej
16 kwietnia 2018
Tutaj prezentujemy protokół, który jest przeznaczony do analizy całego genomu wiązania czynnika transkrypcyjnego oligodendrocytów 2 (Olig2) w ostro oczyszczonych komórkach prekursorowych oligodendrocytów mózgu (OPC) poprzez przeprowadzanie niskokomórkowej immunoprecypitacji chromatyny (ChIP), przygotowanie biblioteki, sekwencjonowanie wysokoprzepustowe i analizę danych bioinformatycznych.
Ogólnym celem tego eksperymentu jest analiza wiązania całego genomu czynnika transkrypcyjnego oligodendrocytów dwa w ostro oczyszczonych komórkach prekursorowych oligodendrocytów mózgu poprzez przeprowadzenie immunopanningu, immunoprecypitacji chromatyny niskokomórkowej, sekwencjonowania wysokoprzepustowego i analizy danych bioinformatycznych. Metoda ta jest potężnym narzędziem do badania regulacji transkrypcji w całym genomie i mechanizmów epigenetycznych, które odgrywają ważną rolę w różnicowaniu i rozwoju komórek. Główną zaletą tej techniki jest to, że ma ona szerokie zastosowanie w sekwencji ChIP innych czynników transkrypcyjnych z dowolnym typem komórek o ograniczonej liczbie, w tym ostro oczyszczonymi komórkami pierwotnymi bez proliferacji in vitro.
Procedurę zademonstruje Yanan You, doktor habilitowany z mojego laboratorium. Jest współautorką niniejszej pracy. Aby wybrać komórki PDGFR-alfa-dodatnie, należy przygotować jedną płytkę do immunopanningu.
Przygotuj kolejne dwie płytki na komórki śródbłonka i zubożenie mikrogleju. Następnie pokryj 10-centymetrową szalkę Petriego 30 mikrolitrami koziej immunoglobuliny przeciw szczurom. Następnie należy zamieszać płytkę, aby upewnić się, że cała powierzchnia płytki jest równomiernie pokryta roztworem powlekającym.
Pozostaw szalkę Petriego na noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie rozcieńczyć 40 mikrolitrów szczurzego przeciwciała anty-PDGFR-alfa z 12 mililitrami DPBS zawierającymi 0,2% albuminy surowicy bydlęcej. Następnie umyj płytkę pokrytą immunoglobuliną G 10 mililitrami 1X DPBS trzy razy z rzędu.
Następnie inkubować płytkę pokrytą immunoglobuliną G z roztworem przeciwciała PDGFR-alfa w temperaturze pokojowej przez cztery godziny. Po czterech godzinach ostrożnie dodać DPBS wzdłuż bocznej ścianki płytki, aby trzykrotnie umyć płytkę pokrytą przeciwciałem anty-PDGFR-alfa przeciwko szczurom. Nie naruszaj powlekanej powierzchni płyty.
Następnie użyj 20 mililitrów DPBS z 2,3 mikrograma na mililitr BSL-1, aby pokryć dwie 15-centymetrowe płytki Petriego przez dwie godziny. Po inkubacji ostrożnie dodaj 20 mililitrów DPBS wzdłuż bocznej ścianki płytki, aby trzykrotnie umyć płytkę BSL-1. Nie naruszaj powlekanej powierzchni.
Po umyciu odwirować zawiesinę jednokomórkową o stężeniu 300 razy g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu dodać 15 mililitrów buforu immunologicznego do osadu komórkowego. Następnie inkubuj zawiesiny jednokomórkowe z dwóch mózgów myszy sekwencyjnie na dwóch szalkach Petriego pokrytych BSL-1.
Następnie pozostaw talerze na 15 minut w temperaturze pokojowej. Mieszać płytkę co pięć minut podczas inkubacji. Następnie delikatnie zakręć płytką, aby zebrać wszystkie nieprzylegające komórki z zawiesiny komórek.
Następnie wysiewaj komórki na szczurzej płytce pokrytej przeciwciałem PDGFR-alfa. Inkubować płytkę przez 45 minut w temperaturze pokojowej. Po upływie 45 minut ponownie zakręć talerzem.
Następnie wyrzuć zawiesinę komórek. Następnie przepłucz płytkę DPBS osiem razy, aby usunąć nieprzylegające komórki. Zbadaj płytkę pod mikroskopem.
Następnie dodaj roztwór do odrywania komórek na płytce pokrytej przeciwciałem PDGFR-alfa szczura. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut. W międzyczasie potrząśnij płytką, aby usunąć przylegające komórki, i zbadaj ją pod mikroskopem.
Następnie odwiruj komórki w temperaturze 300 razy g w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu ponownie zawieś osad komórkowy za pomocą jednego mililitra pożywki do hodowli komórek OPC. Następnie policz komórki za pomocą metody wykluczania błękitu trypanowego w hemocytometrze.
Po zliczeniu w hemocytometrze dodaj 20 000 oczyszczonych OPC do jednego mililitra pożywki do hodowli komórek OPC do reakcji ChIP. Następnie dodaj 27 mikrolitrów 36,5% formaldehydu w temperaturze pokojowej przez 10 minut. To naprawi komórki.
Po 10 minutach dodaj 50 mikrolitrów 2,5 molowej glicyny na utrwalone komórki przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Dodanie glicyny zatrzyma sieciowanie DNA-białko. Następnie przemyj usieciowane komórki jednym mililitrem buforu HBSS z koktajlem inhibitorów proteazy.
Następnie odwiruj komórki we wstępnie schłodzonej wirówce z prędkością 300 razy g w czterech stopniach Celsjusza. Po usieciowaniu oczyszczonych OPC, usieciowane komórki należy przemyć lodowatym roztworem HBSS, a pozostałe etapy ChIP należy przeprowadzić pod czterema stopniami, w przeciwnym razie przeciwciało nie będzie w stanie prawidłowo wytrącić genomowego DNA. Następnie dodaj 25 mikrolitrów kompletnego buforu do lizy do osadu komórkowego i pozostaw na lodzie na pięć minut.
Następnie odpipetuj 75 mikrolitrów lodowatego buforu HBSS z koktajlem inhibitorów proteazy. Następnie należy ścinać chromatynę lizatu komórkowego we wstępnie schłodzonym systemie sonikacyjnym z pięcioma cyklami po 30 sekund włączenia i 30 sekund przerwy. Po ścięciu chromatyny odwirować lizat komórkowy w temperaturze 14 000 razy g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Pod koniec wirowania zebrać supernatant. Następnie rozcieńczyć 100 mikrolitrów ściętej chromatyny równą objętością lodowatego buforu ChIP z inhibitorem proteazy. Następnie dodaj jeden mikrolitr króliczego przeciwciała anty-Olig2 do 180 mikrolitrów rozcieńczonej ściętej chromatyny.
Inkubować probówki na obracającym się kole przez 16 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza przy 40 obrotach na minutę. Następnie dodaj 10 mikrolitrów wstępnie umytych kulek białkowych powlekanych A do probówki reakcyjnej ChIP w chłodni. Ponownie inkubuj probówki ChIP w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez kolejne dwie godziny na obracającym się kole.
Po dwóch godzinach pozostaw probówkę reakcyjną ChIP na stojaku magnetycznym na minutę. Następnie umyj granulkę kulek 100 mikrolitrami czterech myjących każdy przez cztery minuty na obracającym się kole w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie dodaj 200 mikrolitrów buforu elucyjnego do granulki kulki.
Inkubować probówkę reakcyjną w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez cztery godziny. Po denaturacji dwuniciowego DNA należy zdefosforylować trzy główne końce jednoniciowego DNA, dodając fosfatazę alkaliczną krewetek. Następnie dodaj ogon poli-T do jednoniciowego DNA za pomocą końcowej deoksynukleotydylotransferazy.
Następnie wyżarzaj starter DNA poly-dA do jednoniciowej matrycy DNA. Następnie wzmocnij bibliotekę sekwencji ChIP przy użyciu starterów do przodu i do tyłu do indeksowania. Liczba cykli PCR w celu przygotowania biblioteki zależy od ilości wyjściowego DNA.
Dobre przygotowanie biblioteki wymaga dokładnego określenia ilościowego ilości wejściowego DNA. Zbyt wiele lub zbyt mało cykli PCR może wpływać na stężenie w bibliotece, a także na złożoność, prowadząc do artefaktów PCR. Użyj kulek paramagnetycznych, aby wybrać fragmenty w zakresie od 250 do 500 par zasad z biblioteki sekwencji ChIP amplifikowanej PCR.
Użyj mikroprzepływowego urządzenia do elektroforezy chipowo-kapilarnej, aby zbadać jakość wybranej biblioteki sekwencji ChIP. Aby ocenić czystość immunopankowanych OPC, przeprowadza się badania immunobarwienia. Użycie markera linii OPC przeciwciała NG2 pokazuje, że większość komórek immunologicznych przeciwciała PDGFR-alfa jest NG2-dodatnia.
Następnie przeprowadza się ilościowy PCR w celu weryfikacji wzbogacenia PDGFR-alfa. Uzyskany wykres wykazuje niewielką ekspresję Tuj1, markera neuronalnego wskazującego na znaczne wzbogacenie PDGFR-alfa w porównaniu z dysocjowanymi komórkami mózgowymi. Uzyskano podobne wyniki wykazujące niewielką ekspresję dla wszystkich innych markerów, takich jak GFAP, Mog i Mbp, co wskazuje na wzbogacenie PDGFR-alfa.
Następnie analizowana jest jakość biblioteki sekwencji ChIP. Elektroferogram reprezentuje wyraźny pik czynnika transkrypcyjnego Olig2 w zakresie od 250 do 500 par zasad po wybraniu wielkości produktu biblioteki PCR. W tym miejscu histogram pokazuje klonalność tagu, aby zweryfikować metryki kontroli jakości uzyskane przed wywołaniem szczytu.
Pasek wskazuje, że ponad 90% odczytów jest mapowanych tylko do jednej lokalizacji genomowej. Następnie uzyskuje się wykres korelacji nici, który przedstawia wzbogacony pik odpowiadający dominującej długości fragmentu. Na wykresie czerwone linie reprezentują odpowiednio długość odczytu przy 50 parach zasad i długość fragmentu przy 130 parach zasad, wskazując w ten sposób dane wysokiej jakości.
Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu trzech dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po jej opracowaniu technika ta utorowała naukowcom drogę do zbadania miejsca wiązania DNA w całym genomie czynników transkrypcyjnych i innych białek w komórkach pierwotnych lub rzadkich. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak oczyścić pierwotne OPC z mózgu myszy za pomocą immunopaningu i jak przeprowadzić eksperyment ChIP-seq przy użyciu małej liczby komórek.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia protokół analizy wiązania czynnika transkrypcyjnego oligodendrocytów 2 (Olig2) w całej obrębie genomu w ostro oczyszczonych prekursorach oligodendrocytów (OPCs) mózgu. Metoda obejmuje immunoprecypitację chromatyny (ChIP) z małej liczby komórek, sekwencjonowanie wysokoprzepustowe oraz bioinformatyczną analizę danych, a jej celem jest pogłębienie wiedzy na temat regulacji transkrypcyjnej i mechanizmów epigenetycznych zaangażowanych w różnicowanie komórek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Genomika
- Różnicowanie komórek
- Regulacja transkrypcyjna
Wstęp
- Komórki prekursorowe oligodendrocytów (OPCs) są kluczowe dla mielinizacji w ośrodkowym układzie nerwowym.
- Zrozumienie wzorców wiązania czynników transkrypcyjnych, takich jak Olig2, może dostarczyć istotnych informacji na temat procesów różnicowania.
- Niniejszy protokół ułatwia badanie dynamiki transkrypcyjnej w komórkach pierwotnych.
- Możliwość zastosowania niskiej liczby komórek jest korzystna w badaniach z ograniczoną ilością próbek.
Cel badania
- Analiza wiązania Olig2 w całym genomie w komórkach OPC.
- Zaprezentowanie niezawodnej metody badania regulacji transkrypcyjnej.
- Przedstawienie informacji na temat mechanizmów epigenetycznych wpływających na różnicowanie OPC.
Zastosowane metody
- Główną wykorzystaną platformą jest immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) z niską liczbą komórek, połączona z sekwencjonowaniem wysokoprzepustowym.
- Model biologiczny obejmuje świeżo oczyszczone OPC wyizolowane z mózgów myszy.
- Kluczowe etapy obejmują immunopanning w celu oczyszczania komórek oraz serię procedur wirowania i inkubacji dla ChIP.
- Krytyczne kroki obejmują sieciowanie i fragmentację chromatyny w celu zapewnienia efektywnego wiązania przeciwciał.
- Analiza jest wspierana przez techniki bioinformatyczne służące do przetwarzania danych z sekwencjonowania.
Główne wyniki
- Protokół umożliwia badanie wzorców wiązania Olig2 w obrębie genomu.
- Uzyskane wyniki pozwalają zrozumieć regulację transkrypcyjną oraz wpływy epigenetyczne na różnicowanie OPC.
- Otrzymane dane mogą prowadzić do lepszego zrozumienia procesów remielinizacji w schorzeniach neurologicznych.
- Metoda wykazuje wysoką powtarzalność w badaniu innych czynników transkrypcyjnych w podobnych warunkach.
Wnioski
- Niniejsze badanie umożliwia szczegółową analizę dynamiki czynników transkrypcyjnych w pierwotnych komórkach neuronalnych.
- Podkreśla ono wszechstronność protokołu w odniesieniu do różnych czynników transkrypcyjnych oraz ograniczonych populacji komórek.
- Wyniki te przyczyniają się do głębszego zrozumienia mechanizmów różnicowania komórkowego oraz potencjalnych celów terapeutycznych.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Metoda ta umożliwia analizę wiązania czynników transkrypcyjnych w całym genomie w rzadkich komórkach pierwotnych, rozwiązując kluczowy problem wąskiego gardła w walidacji celów w programach badawczych nad chorobami neurorozwojowymi i neurodegeneracyjnymi. Poprzez pokonanie ograniczeń związanych z liczbą komórek, wspiera ona mechanistyczne ograniczanie ryzyka w badaniach nad specyficznymi dla linii czynnikami transkrypcyjnymi, takimi jak Olig2 w szlakach różnicowania oligodendrocytów. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną we wczesnej fazie odkryć, łącząc regulację transkrypcyjną z decyzjami dotyczącymi losu komórek w systemach istotnych fizjologicznie.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie wiązania genomicznego czynnika transkrypcyjnego Olig2 w celu wyjaśnienia jego roli w specyfikacji prekursorowych komórek oligodendrocytów.
- Wartość operacyjna: Możliwość zastosowania w przypadku pierwotnych komórek o niskiej liczebności, co pozwala na badanie czynników transkrypcyjnych w świeżo oczyszczonych populacjach bez konieczności ekspansji in vitro.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie ilościowych danych o wiązaniu w całym genomie, odpowiednich do standaryzacji testów i oceny powtarzalności.
- Wartość operacyjna: Umożliwia generowanie bibliotek do sekwencjonowania z tak małej liczby jak 20 000 komórek, co pozwala na skalowalne badanie dynamiki czynników transkrypcyjnych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wspiera modelowanie systemów istotnych dla chorób poprzez mapowanie wiązania Olig2 w pierwotnych OPC, co dostarcza informacji dla strategii poszukiwania biomarkerów remielinizacji.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ciągłość od etapu odkryć do walidacji przedklinicznej dzięki profilowaniu transkrypcyjnemu opartemu na podstawach epigenetycznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania, od testowania hipotez dotyczących celu po identyfikację związku wiodącego, w szczególności w odniesieniu do programów sterowanych przez czynniki transkrypcyjne w biologii gleju.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez mapowanie oddziaływań Olig2-DNA w natywnych kontekstach komórkowych.
- Przesiewanie: Umożliwia przygotowanie testów dzięki ilościowym wynikom ChIP-seq, które pozwalają na porównanie warunków wiązania.
- Analityka: Dostarcza wysokiej pewności wyznaczania szczytów genomicznych z mapowaniem unikalnych odczytów >90%, co ułatwia porównywanie warunków.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez wgląd w mechanizmy epigenetyczne w pierwotnych komórkach nerwowych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Zaprojektowano jako szeroko stosowalną platformę dla ChIP-seq przy niskiej liczbie komórek dla różnych czynników transkrypcyjnych i pierwotnych typów komórek.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w regulacji transkrypcyjnej poprzez umożliwienie bezpośredniego mapowania miejsc wiązania w rzadkich komórkach pierwotnych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przepływy pracy ChIP dla niskich ilości materiału wejściowego, poprawiając odtwarzalność w laboratoriach badających rzadkie populacje.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez dostarczenie danych z walidacji celów opartych na epigenetyce na wczesnym etapie odkrywania.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów czynników transkrypcyjnych z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o wierność wiązania w całym genomie w komórkach istotnych dla danej jednostki chorobowej.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie immunopanningu, pracy z chromatyną oraz przygotowywania bibliotek do sekwencjonowania nowej generacji.
- Zależne od systemów sonikacji do fragmentacji chromatyny oraz infrastruktury do immunoprecypitacji z użyciem kulek magnetycznych.
- Konieczna jest międzyzespołowa standaryzacja walidacji przeciwciał oraz rygorystyczności płukania w celu uzyskania powtarzalnej wydajności ChIP.
- Adaptacja do różnych systemów modelowych wymaga optymalizacji warunków fiksacji i lizy komórek dla zróżnicowanych tkanek pierwotnych.
- Ograniczenie praktyczne: ilość DNA wejściowego bezpośrednio wpływa na liczbę cykli PCR i złożoność biblioteki, co wymaga precyzyjnej kwantyfikacji w celu uniknięcia artefaktów.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Title
1:10
Purification of PDGFRα Positive Oligodendrocyte Lineage Cells from Mouse
5:03
Low-cell ChIP Preparation and ChIP Library Construction for High-throughput Sequencing
9:41
Results: Use of ChIP Analysis to Study Genome-wide Binding of the Olig2 in OPCs
11:42
Conclusion
