Rejestracja i modulacja aktywności padaczkowej w wycinkach mózgu gryzoni sprzężonych z układami mikroelektrod
15 maja 2018
Ilustrujemy, jak przeprowadzić rejestrację i elektryczną modulację aktywności padaczkowej indukowanej przez 4-aminopirydynę w wycinkach mózgu gryzoni za pomocą układów mikroelektrod. Niestandardowa komora rejestracyjna utrzymuje żywotność tkanek podczas długotrwałych sesji eksperymentalnych. Mapowanie elektrod na żywo i wybór par stymulujących odbywa się za pomocą niestandardowego graficznego interfejsu użytkownika.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neuromodulacji w leczeniu padaczki, takie jak to, jaki obszar mózgu i protokół stymulacji są najbardziej odpowiednie. Główną zaletą tej techniki jest to, że wycinki mózgu gryzoni reprezentują uproszczony, realistyczny model obwodów mózgowych, podczas gdy układy mikroelektrod umożliwiają wielokrotną obserwację punktów w znanej odległości między elektrodami. Aby przygotować MEA, równomiernie rozprowadź elastomerowy uszczelniacz na dolnej powierzchni komory zapisu i upewnij się, że nie ma pęcherzyków.
Następnie za pomocą pęsety zamontuj komorę nagrywającą na MEA i delikatnie dociśnij. Rozprowadzić warstwę szczeliwa wokół zewnętrznej krawędzi komory nagrywania. Następnie umieść zespół MEA/komory w zamkniętym, wilgotnym środowisku i pozwól mu utwardzić się w temperaturze pokojowej przez noc.
Aby przygotować ławę do nagrywania, ustaw ciepłą kąpiel na 32 stopnie Celsjusza. Następnie wlej ACSF do komory do trzymania i podgrzewania. Roztwory należy przepłukać 95% mieszaniną tlenu i 5% dwutlenku węgla, a następnie usunąć wszelkie uwięzione pęcherzyki za pomocą odwróconej pipety Pasteura.
Utrzymuj komorę przetrzymywania w temperaturze pokojowej i umieść komorę wstępnego podgrzewania w ciepłej kąpieli. Przygotuj poziome wycinki mózgu hipokampa i kory mózgowej zgodnie ze standardowymi procedurami i pozwól im zregenerować się w komorze przetrzymywania w temperaturze pokojowej przez co najmniej 60 minut. Wlać 4AP ACSF do komory inkubacyjnej.
Następnie napełnij go 95% mieszaniną tlenu i 5% dwutlenku węgla i usuń wszelkie uwięzione pęcherzyki za pomocą odwróconej pipety Pasteura. Następnie przykryj komorę i przenieś ją do ciepłej kąpieli. Upewnij się, że temperatury ACSF i ACSF 4AP wynoszą od 30 do 32 stopni Celsjusza.
Użyj pipety Pasteura z odwróconym szkłem, aby przenieść jeden plasterek mózgu do komory wstępnego podgrzewania i pozwól tkance odpocząć przez 25 do 30 minut. Następnie przenieś wycinek mózgu do komory inkubacyjnej 4AP ACSF i pozwól mu odpocząć przez 60 minut. Pozwól, aby 4AP ACSF przepłynął przez rurkę perfuzyjną do zlewki, aż w środku nie będzie powietrza.
Następnie zatrzymaj przepływ roztworu. Umieść suchy chip MEA wewnątrz MEA amplifier i zabezpiecz amplifier głowica. Następnie za pomocą plastikowej pipety Pasteura przenieś 4AP ACSF do zbiornika wlotowego i wylotowego komory rejestracyjnej.
Przymocuj kaniulę grzewczą do uchwytu magnetycznego i umieść jej końcówkę w porcie wlotowym komory nagrywania. Następnie przymocuj uchwyt magnetyczny do paska magnetycznego na głowicy wzmacniacza MEA. Podłącz rurkę perfuzyjną do kaniuli, a kaniulę do termostatu.
Następnie umieść igłę ssącą w zbiorniku wylotowym. Sprawdź, czy występuje podciśnienie, zanurzając igłę ssącą w ACSF i sprawdź, czy jest ciągły hałas ssania o niskiej częstotliwości. Następnie ustaw regulator przepływu tak, aby pozwalał na natężenie przepływu jednego mililitra na minutę i rozpocznij perfuzowanie.
Gdy 4AP ACSF przepłynie przez kaniulę, włącz termostat. Ustaw kaniulę grzewczą na 37 stopni Celsjusza, a podstawę MEA na 32 stopnie Celsjusza, aby osiągnąć temperaturę od 32 do 34 stopni Celsjusza wewnątrz komory nagrywającej. Następnie umieść zewnętrzną elektrodę odniesienia w zbiorniku wlotowym komory nagraniowej.
Gdy poziom 4AP ACSF i temperatura nagrywania ustabilizują się zgodnie z potrzebami, przekręć kurki perfuzyjne i ssące do pozycji wyłączonej, aby je tymczasowo zatrzymać. Szybko przenieś jeden wycinek mózgu do komory zapisu MEA za pomocą pipety Pasteura z odwróconym szkłem. W razie potrzeby dostosuj jego położenie w obszarze nagrywania MEA za pomocą polerowanej, zakręconej pipety Pasteura lub miękkiej, kompaktowej, małej szczoteczki.
Umieść kotwicę dociskową na wycinku mózgu. Ponownie uruchom perfuzję i ssanie, przekręcając ich kurki z powrotem do pozycji włączonej. Zrób zdjęcie wycinka mózgu za pomocą kamery zamontowanej na stoliku z odwróconym mikroskopem.
Następnie uruchom skrypt mapMEA w oprogramowaniu komputerowym, aby uruchomić GUI w celu mapowania elektrod. Kliknij przycisk Przeglądaj, aby załadować obraz wycinka mózgu. Upewnij się, że elektroda referencyjna znajduje się w górnej kolumnie lewej połowy MEA.
Następnie kliknij przycisk Aktywuj wskaźnik. Wybierz górną i dolną elektrodę w skrajnej lewej kolumnie matrycy, aby oznaczyć współrzędne XY do prostowania obrazu i mapowania elektrod. Z menu rozwijanego typu plasterka wybierz opcję Poziomy.
Zaznacz pole wyboru Struktury domyślne. Korzystając z ponumerowanych przycisków pod obrazem wycinka mózgu, wybierz elektrody odpowiadające zwrotowi z inwestycji i kliknij odpowiednie przyciski w panelu struktury, aby je przypisać. Powtórz ten krok dla każdego zwrotu z inwestycji.
Następnie naciśnij przycisk Zapisz. Oprogramowanie wygeneruje folder wyników zawierający tabelę przedstawiającą wybrane elektrody i ROI. W przypadku badania elektrofizjologii włącz jednostkę bodźca co najmniej 10 minut przed protokołem stymulacji, aby umożliwić samokalibrację i stabilizację.
Następnie uruchom oprogramowanie sterujące bodźcem i sprawdź, czy stymulator i MEA amplifier są prawidłowo połączone, jak wskazuje zielona dioda LED na głównym panelu oprogramowania sterującego bodźcem. Ustaw stymulację w konfiguracji dwubiegunowej. Podłącz jednostkę stymulacyjną do ziemi.
Następnie połącz pary elektrod stykające się z piramidalną warstwą komórek CA1 / bliższego subiculum spośród tych zmapowanych za pomocą mapy skryptu MEA. Aby uzyskać dane, naciśnij przycisk odtwarzania w głównym panelu oprogramowania do nagrywania. Zanotować co najmniej cztery zrzuty ictal.
Następnie przeprowadź szybki test wejścia/wyjścia, aby określić najlepszą intensywność bodźca. W tym celu należy za pomocą panelu głównego zaprojektować kwadratowy dwufazowy dodatnio-ujemny impuls prądowy o czasie trwania 100 mikrosekund na fazę. W zakładce amplituda impulsu wprowadź początkową amplitudę impulsu wynoszącą 100 mikroamperów na fazę.
Ustaw impuls stymulacji na 0,2 herca lub mniej, dodając interwał między impulsami wynoszący pięć sekund lub dłużej. Zwiększaj amplitudę bodźca o 50 do 100 kroków mikroamperowych przy każdej próbie, aż stymulacja będzie mogła niezawodnie wywołać zdarzenia podobne do międzynapadowych w korze przyhipokampowej. W celu elektrycznej modulacji iktogenezy limbicznej zaprogramuj jednostkę bodźca tak, aby dostarczała interesujący ją protokół stymulacji i wykorzystaj amplitudę bodźca zidentyfikowaną podczas testu wejścia/wyjścia.
Po ustaniu stymulacji sprawdź, czy sieć powróciła do stanu sprzed bodźca, rejestrując co najmniej cztery wyładowania ictal. Rysunek ten przedstawia zapisy indukowanej przez 4AP aktywności ictal w korze śródwęchowej i korze okołęchowej podczas stanu kontrolnego, okresowego stymulacji przy jednym hercu oraz podczas rekonwalescencji po odstawieniu bodźca. Wykres ten przedstawia kwantyfikację wpływu okresowego stymulacji przy jednym hercu, co wskazuje na znaczne skrócenie całkowitego czasu chwytania podczas stymulacji.
Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu trzech do czterech godzin, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o szybkim i prawidłowym umieszczeniu wycinka mózgu na MEA. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak manipulacja farmakologiczna, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące udziału neuroprzekaźników lub kanału jonowego w aktywności padaczkowej i efekcie neuromodulacji.
Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie neurobiologii do zbadania interakcji sieci neuronalnych w zdrowiu i chorobie w hodowanych neuronach, a także w wycinkach mózgu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak rejestrować i elektrycznie modulować aktywność padaczkową indukowaną przez cztero-aminopirydynę w wycinkach mózgu gryzoni sprzężonych z MEA.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia metodę rejestracji i elektrycznej modulacji aktywności epileptiformnej indukowanej 4-aminopirydyną w skrawkach mózgu gryzoni przy użyciu macierzy mikroelektrod (MEAs). Układ eksperymentalny zapewnia długotrwałą żywotność tkanki i wykorzystuje specjalnie zaprojektowany graficzny interfejs użytkownika do mapowania elektrod w czasie rzeczywistym oraz wyboru par stymulacyjnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Elektrofizjologia
- Neuronauka
- Badania nad epilepsją
Wprowadzenie
- Metoda ta odpowiada na kluczowe pytania dotyczące neuromodulacji w leczeniu padaczki.
- Przekroje mózgu gryzoni służą jako uproszczony model obwodów mózgowych.
- Macierze mikroelektrod umożliwiają prowadzenie wielu obserwacji w znanych odstępach międzyelektrodowych.
Cel badania
- Zoptymalizowanie protokołów stymulacji w leczeniu epilepsji.
- Ocena wpływu modulacji elektrycznej na aktywność epileptyformną.
- Przedstawienie szczegółowych metodologii przygotowania MEA oraz preparatów skrawków mózgu.
Zastosowane metody
- Główną platformą badawczą jest wykorzystanie preparatów przekrojów mózgu gryzoni ex vivo oraz macierzy mikroelektrod.
- Przygotowywane są przekroje mózgu obejmujące hipokamp i korę, które następnie inkubuje się z 4-aminopirydyną (4AP) w celu wywołania aktywności epileptiformnej.
- Kluczowe etapy metodologiczne obejmują rekonwalescencję przekrojów mózgu, warunki inkubacji oraz precyzyjną kontrolę temperatury podczas przeprowadzania eksperymentów.
- Dostosowany interfejs graficzny użytkownika wspomaga mapowanie elektrod oraz konfigurację stymulacji.
Główne wyniki
- Metoda ta skutecznie umożliwia rejestrację wyładowań ictalnych oraz zdarzeń przypominających okresy interiktalne dzięki zastosowaniu zaprojektowanych protokołów stymulacji bipolarnej.
- Mapowanie elektrod pozwala na optymalny wybór obszarów zainteresowania (ROIs) do stymulacji.
- Wyniki pozwolą pogłębić zrozumienie modulacji obwodów mózgowych istotnych w przebiegu epilepsji.
Wnioski
- Niniejsza praca przedstawia sprawdzoną metodę badania modulacji aktywności epileptiformnej indukowanej przez 4AP.
- Wyniki wspierają zastosowania w opracowywaniu strategii leczenia epilepsji oraz pogłębiają zrozumienie dynamiki obwodów neuronalnych.
Najczęściej zadawane pytania
Zastosowanie w przemyśle
Ta metoda umożliwia przedkliniczną ocenę strategii neuromodulacji w epilepsji, zapewniając stabilny, długotrwały model aktywności epileptiformnej w skrawkach mózgu gryzoni. Wspiera ona walidację celów oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego protokołów stymulacji przed badaniami in vivo. Platforma ta zwiększa wiarygodność prognostyczną w identyfikacji optymalnych obszarów mózgu i parametrów stymulacji dla rozwoju DBS.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez izolowanie aktywności sieci epileptyformnej w określonych obszarach mózgu.
- Wartość operacyjna: Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez długotrwałą modulację elektryczną i śledzenie odpowiedzi sieciowej.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia selekcję projektów badawczych poprzez identyfikację protokołów stymulacji, które niezawodnie modulują zdarzenia iktalne.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Generuje stabilne, powtarzalne wzorce epileptформiczne trwające kilka godzin, co umożliwia spójne przesiewowanie związków lub stymulacji.
- Wyjściowe dane ilościowe: Umożliwia pomiar częstotliwości i czasu trwania wyładowań ictalnych jako odczytów farmakodynamicznych.
- Skalowalność: Kompatybilność z wieloelektrodowymi macierzami (multi-electrode arrays) w celu równoległego testowania konfiguracji stymulacji.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Modelowanie fenotypów padaczki płata skroniowego z wykorzystaniem aktywności indukowanej 4AP w skrawkach hipokampa i kory.
- Ciągłość translacyjna: Łączenie etapu odkryć z walidacją przedkliniczną poprzez badanie wpływu neuromodulacji na regenerację sieci.
- Decyzje w oparciu o analizę ryzyka: Określanie kryteriów go/no-go na podstawie redukcji zdarzeń przypominających napady wywołanej przez stymulację.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania, od walidacji celu po przedkliniczne przesiewy neuromodulacyjne, umożliwiając iteracyjne udoskonalanie strategii stymulacji.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących mechanizmów sieciowych leżących u podstaw propagacji i modulacji aktywności epileptiformnej.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne odczyty elektrofizjologiczne do oceny parametrów stymulacji w różnych warunkach.
- Analityka: Zapewnia mierzalne wskaźniki, takie jak czas trwania napadu i odstępy między zdarzeniami, do analizy porównawczej.
- Badania translacyjne: Łączy odpowiedzi sieciowe na poziomie skrawka z potencjalnymi klinicznymi wynikami DBS poprzez wskaźniki regeneracji.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do testowania wielu podejść do neuromodulacji w zestandaryzowanym modelu epileptiformnym.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność w odniesieniu do celu poprzez umożliwienie długotrwałej, stabilnej obserwacji sieci epileptiformnych podczas kontrolowanej stymulacji.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność dzięki zastosowaniu perfuzji laminarnej, kontroli temperatury oraz mapowaniu elektrod w czasie rzeczywistym za pomocą GUI.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową poprzez zmniejszenie wskaźnika niepowodzeń na późniejszych etapach rozwoju neuromodulacji dzięki wczesnemu zrozumieniu mechanizmów.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia dostosowany do ryzyka rozwój protokołów stymulacji w oparciu o powtarzalne tłumienie zdarzeń napadowych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie elektrofizjologii, przygotowywania skrawków mózgu oraz obsługi MEA.
- Zależność od systemów perfuzji, regulacji temperatury i jednostek izolacji bodźców w celu uzyskania stabilnych rejestracji.
- Konieczność standaryzacji orientacji skrawków, czasu inkubacji i protokołów stymulacji dla wszystkich użytkowników.
- Adaptacja do innych obszarów mózgu wymaga walidacji indukcji aktywności epileptiformnej oraz dokładności mapowania elektrod.
- Ograniczenia praktyczne obejmują degradację sygnału przy niskich przepływach perfuzji oraz dryft termiczny podczas długotrwałych eksperymentów.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Title
0:39
Preparation of the MEA/Custom Chamber Assembly
1:15
Preparation of the Recording Bench
2:52
Preparation of the MEA Set-up
4:39
MEA Live Mapping
6:33
Recording and Electrical Modulation of the Epileptiform Activity
8:49
Results: Representative Experiment of Electrical Modulation of Ictogenesis Using Brain Slices Coupled to MEAs
9:21
Conclusion
