Name: Rejestracja i modulacja aktywności padaczkowej w wycinkach mózgu gryzoni sprzężonych z układami mikroelektrod (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Poznaj metodę rejestracji i modulacji aktywności padaczkowej w wycinkach mózgu gryzoni przy użyciu układów mikroelektrod. Technika ta umożliwia badanie dynamiki obwodów neuronalnych w leczeniu epilepsji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

G.P. jest stypendystką Marie Skłodowska-Curie finansowaną przez Unię Europejską projektu MSCA-IF-2014 Re.B.Us, G.A. n.660689, w ramach programu ramowego H2020. Graficzny interfejs użytkownika mapMEA jest dostępny bezpłatnie na żądanie dla autorów ilaria.colombi@iit.it.

<ol><li>Fisher, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Operational+classification+of+seizure+types+by+the+International+League+Against+Epilepsy%3A+Position+Paper+of+the+ILAE+Commission+for+Classification+and+Terminology%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsia%22%5BJournal%5D)">Operational classification of seizure types by the International League Against Epilepsy: Position Paper of the ILAE Commission for Classification and Terminology.</a> Epilepsia. 58 (4), 522-530 (2017).</li>
<li>WHO. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Epilepsy+Facts+Sheet%22">Epilepsy Facts Sheet</a>. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs999/en/">http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs999/en/</a> (2017).</li>
<li>Fiest, K. M., Birbeck, G. L., Jacoby, A., Jette, N. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24652452">Stigma in epilepsy.</a> Curr Neurol Neurosci Rep. 14 (5), 444(2014).</li>
<li>Brodie, M. J., Barry, S. J., Bamagous, G. A., Norrie, J. D., Kwan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+treatment+response+in+newly+diagnosed+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Patterns of treatment response in newly diagnosed epilepsy.</a> Neurology. 78 (20), 1548-1554 (2012).</li>
<li>Tanriverdi, T., Poulin, N., Olivier, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+12+years+after+temporal+lobe+epilepsy+surgery%3A+a+long-term%2C+prospective+clinical+study%5BTitle%5D)+AND+%22Seizure%22%5BJournal%5D)">Life 12 years after temporal lobe epilepsy surgery: a long-term, prospective clinical study.</a> Seizure. 17 (4), 339-349 (2008).</li>
<li>Dingledine, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDingledine%2C+R+%22Brain+slices%22">Brain slices</a>. , Plenum Press. (1984).</li>
<li>Avoli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+and+pharmacological+mechanisms+leading+to+epileptiform+synchronization+in+the+limbic+system+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Network and pharmacological mechanisms leading to epileptiform synchronization in the limbic system in vitro.</a> Prog Neurobiol. 68 (3), 167-207 (2002).</li>
<li>Rutecki, P. A., Lebeda, F. J., Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epileptiform+activity+induced+by+changes+in+extracellular+potassium+in+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Epileptiform activity induced by changes in extracellular potassium in hippocampus.</a> J Neurophysiol. 54 (5), 1363-1374 (1985).</li>
<li>Mody, I., Lambert, J. D., Heinemann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+extracellular+magnesium+induces+epileptiform+activity+and+spreading+depression+in+rat+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Low extracellular magnesium induces epileptiform activity and spreading depression in rat hippocampal slices.</a> J Neurophysiol. 57 (3), 869-888 (1987).</li>
<li>Huberfeld, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamatergic+pre-ictal+discharges+emerge+at+the+transition+to+seizure+in+human+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutamatergic pre-ictal discharges emerge at the transition to seizure in human epilepsy.</a> Nat Neurosci. 14 (5), 627-634 (2011).</li>
<li>Pitkanen, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPitkanen%2C+A+%22Models+of+seizures+and+epilepsy%22">Models of seizures and epilepsy</a>. , (2017).</li>
<li>Rutecki, P. A., Lebeda, F. J., Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4-Aminopyridine+produces+epileptiform+activity+in+hippocampus+and+enhances+synaptic+excitation+and+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">4-Aminopyridine produces epileptiform activity in hippocampus and enhances synaptic excitation and inhibition.</a> J Neurophysiol. 57 (6), 1911-1924 (1987).</li>
<li>Gross, G. W., Rieske, E., Kreutzberg, G. W., Meyer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+fixed-array+multi-microelectrode+system+designed+for+long-term+monitoring+of+extracellular+single+unit+neuronal+activity+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">A new fixed-array multi-microelectrode system designed for long-term monitoring of extracellular single unit neuronal activity in vitro.</a> Neurosci Lett. 6 (2-3), 101-105 (1977).</li>
<li>Pine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recording+action+potentials+from+cultured+neurons+with+extracellular+microcircuit+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Recording action potentials from cultured neurons with extracellular microcircuit electrodes.</a> J Neurosci Methods. 2 (1), 19-31 (1980).</li>
<li>Reinartz, S., Biro, I., Gal, A., Giugliano, M., Marom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+dynamics+contribute+to+long-term+single+neuron+response+fluctuations%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Synaptic dynamics contribute to long-term single neuron response fluctuations.</a> Front Neural Circuits. 8, 71(2014).</li>
<li>Dossi, E., Blauwblomme, T., Nabbout, R., Huberfeld, G., Rouach, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-electrode+array+recordings+of+human+epileptic+postoperative+cortical+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Multi-electrode array recordings of human epileptic postoperative cortical tissue.</a> J Vis Exp. (92), (2014).</li>
<li>Boido, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortico-hippocampal+hyperexcitability+in+synapsin+I%2FII%2FIII+knockout+mice%3A+age-dependency+and+response+to+the+antiepileptic+drug+levetiracetam%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cortico-hippocampal hyperexcitability in synapsin I/II/III knockout mice: age-dependency and response to the antiepileptic drug levetiracetam.</a> Neuroscience. 171 (1), 268-283 (2010).</li>
<li>Gonzalez-Sulser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+4-aminopyridine+in+vitro+epilepsy+model+analyzed+with+a+perforated+multi-electrode+array%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">The 4-aminopyridine in vitro epilepsy model analyzed with a perforated multi-electrode array.</a> Neuropharmacology. 60 (7-8), 1142-1153 (2011).</li>
<li>Hajos, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintaining+network+activity+in+submerged+hippocampal+slices%3A+importance+of+oxygen+supply%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply.</a> Eur J Neurosci. 29 (2), 319-327 (2009).</li>
<li>Ivanov, A., Zilberter, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+state+of+energy+metabolism+in+brain+slices%3A+the+principal+role+of+oxygen+delivery+and+energy+substrates+in+shaping+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroenergetics%22%5BJournal%5D)">Critical state of energy metabolism in brain slices: the principal role of oxygen delivery and energy substrates in shaping neuronal activity.</a> Front Neuroenergetics. 3, 9(2011).</li>
<li>MultichannelSystems. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Manual+PH01%22">Manual PH01</a>. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.multichannelsystems.com/sites/multichannelsystems.com/files/documents/manuals/PH01_Manual.pdf">https://www.multichannelsystems.com/sites/multichannelsystems.com/files/documents/manuals/PH01_Manual.pdf</a> (2018).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+of+epileptiform+activity+can+be+independent+of+synaptic+transmission%2C+gap+junctions%2C+or+diffusion+and+is+consistent+with+electrical+field+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Propagation of epileptiform activity can be independent of synaptic transmission, gap junctions, or diffusion and is consistent with electrical field transmission.</a> J Neurosci. 34 (4), 1409-1419 (2014).</li>
<li>Panuccio, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+ictogenesis+and+parahippocampal+networks+in+a+rodent+model+of+temporal+lobe+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">In vitro ictogenesis and parahippocampal networks in a rodent model of temporal lobe epilepsy.</a> Neurobiol Dis. 39 (3), 372-380 (2010).</li>
<li>Barbarosie, M., Avoli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CA3-driven+hippocampal-entorhinal+loop+controls+rather+than+sustains+in+vitro+limbic+seizures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">CA3-driven hippocampal-entorhinal loop controls rather than sustains in vitro limbic seizures.</a> J Neurosci. 17 (23), 9308-9314 (1997).</li>
<li>Panuccio, G., Guez, A., Vincent, R., Avoli, M., Pineau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+control+of+epileptiform+excitability+in+an+in+vitro+model+of+limbic+seizures%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Adaptive control of epileptiform excitability in an in vitro model of limbic seizures.</a> Exp Neurol. 241, 179-183 (2013).</li>
<li>Benini, R., Avoli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+subicular+networks+gate+hippocampal+output+activity+in+an+in+vitro+model+of+limbic+seizures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Rat subicular networks gate hippocampal output activity in an in vitro model of limbic seizures.</a> J Physiol. 566 (Pt 3), 885-900 (2005).</li>
<li>D'Arcangelo, G., Panuccio, G., Tancredi, V., Avoli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repetitive+low-frequency+stimulation+reduces+epileptiform+synchronization+in+limbic+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Repetitive low-frequency stimulation reduces epileptiform synchronization in limbic neuronal networks.</a> Neurobiol Dis. 19 (1-2), 119-128 (2005).</li>
<li>Steidl, E. M., Neveu, E., Bertrand, D., Buisson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adult+rat+hippocampal+slice+revisited+with+multi-electrode+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The adult rat hippocampal slice revisited with multi-electrode arrays.</a> Brain Res. 1096 (1), 70-84 (2006).</li>
<li>Pulizzi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+wide-field+photostimuli+evoke+and+modulate+oscillatory+reverberating+activity+in+cortical+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Brief wide-field photostimuli evoke and modulate oscillatory reverberating activity in cortical networks.</a> Sci Rep. 6, 24701(2016).</li>
<li>Liu, M. G., Chen, X. F., He, T., Li, Z., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+multi-electrode+array+recordings+in+studies+of+network+synaptic+plasticity+in+both+time+and+space%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Use of multi-electrode array recordings in studies of network synaptic plasticity in both time and space.</a> Neuroscience Bulletin. 28 (4), 409-422 (2012).</li>
<li>Maier, N., Morris, G., Johenning, F. W., Schmitz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+approach+for+reliably+investigating+hippocampal+sharp+wave-ripples+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An approach for reliably investigating hippocampal sharp wave-ripples in vitro.</a> PLoS One. 4 (9), e6925(2009).</li>
<li>Aiba, I., Noebels, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spreading+depolarization+in+the+brainstem+mediates+sudden+cardiorespiratory+arrest+in+mouse+SUDEP+models%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Spreading depolarization in the brainstem mediates sudden cardiorespiratory arrest in mouse SUDEP models.</a> Sci Transl Med. 7 (282), 282ra246(2015).</li>
<li>MA, R., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMA%2C+R+%22Jasper%27s+Basic+Mechanisms+of+the+Epilepsies+%22">Jasper's Basic Mechanisms of the Epilepsies </a>. Avoli, M., Noebels, J. L., Rogawski, M. A., et al. , 4th, National Center for Biotechnology Information (US). Bethesda (MD). (2012).</li>
<li>Motamedi, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Termination+of+epileptiform+activity+by+cooling+in+rat+hippocampal+slice+epilepsy+models%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsy+Res%22%5BJournal%5D)">Termination of epileptiform activity by cooling in rat hippocampal slice epilepsy models.</a> Epilepsy Res. 70 (2-3), 200-210 (2006).</li>
<li>Yang, X. F., Duffy, D. W., Morley, R. E., Rothman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neocortical+seizure+termination+by+focal+cooling%3A+temperature+dependence+and+automated+seizure+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsia%22%5BJournal%5D)">Neocortical seizure termination by focal cooling: temperature dependence and automated seizure detection.</a> Epilepsia. 43 (3), 240-245 (2002).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

MEA są nieocenionym narzędziem do badań neurofizjologicznych i osiągnęły dojrzałość w ostatnich latach dzięki dziesięcioleciom badań i rozwoju. W porównaniu z konwencjonalnym rejestrowaniem potencjału pola, MEA oferują ogromną zaletę w postaci większej liczby punktów obserwacyjnych i znanej odległości między elektrodami, które mają kluczowe znaczenie dla dokładnego określenia interakcji sieci neuronalnych.
Technikę rejestracji MEA można również połączyć z innymi podejściami elektrofizjologicznymi, takimi jak zapis patch-clamp15, w celu zbadania związku między aktywnością pojedynczego neuronu a aktywnością sieci neuronalnej. Co więcej, możliwość jednoczesnej wizualizacji potencjałów pola i aktywności wielu jednostek może dostarczyć cennych informacji na temat korelacji między aktywnością małych zespołów neuronalnych a zbiorowymi sieciami neuronalnymi. Połączenie z barwnikami wrażliwymi na napięcie, obrazowaniem wapnia i optogenetyką29 pozwala na wnioskowanie o zjawiskach neurofizjologicznych przy użyciu podejść wielościennych. Oprócz badań farmakologicznych, możliwość wykonywania zarówno rejestracji, jak i stymulacji za pomocą tego samego systemu sprawia, że technika rejestracji MEA jest bardzo potężna i wszechstronna: na przykład możliwe jest badanie zjawisk plastyczności synaptycznej u podstaw tworzenia pamięci30, przy użyciu przedstawionych tutaj protokołów neuromodulacji, które są istotne dla DBS w leczeniu padaczki i wielu różnych zaburzeń mózgu. Niedawny dowód na to, że technika rejestracji MEA może być z powodzeniem zastosowana do ludzkiej tkanki mózgowej z padaczką16, pokazuje jej nieocenioną przydatność w badaniach nad padaczką, zarówno w celu zrozumienia podstawowych mechanizmów leżących u podstaw tej wyniszczającej choroby, jak i dostrojenia algorytmów DBS w celu jej złagodzenia.
Jednak MEA wymuszają przeprowadzanie eksperymentów elektrofizjologicznych w warunkach "granicznych" dla wycinków mózgu, ze względu na wymóg zanurzonej komory rejestracyjnej i konieczność pozostawienia wycinka mózgu na stałym podłożu, na którym zintegrowane są mikroelektrody. W związku z tym tkanka mózgowa może nie otrzymać odpowiedniego dopływu tlenu, co z kolei może wpłynąć na jakość nagrań.
Opisany tutaj protokół pozwala na wiarygodne rejestrowanie i badanie iktogenezy w sieciach limbicznych gryzoni sprzężonych z MEA przy użyciu modelu ostrej 4AP in vitro oraz na prowadzenie długotrwałych epok stymulacji elektrycznej, które dostarczają istotnych informacji do oceny polityki DBS.
Wcześniejsze badania nad elektryczną neuromodulacją padaczkowych sieci limbicznych oparte na wykorzystaniu konwencjonalnego zapisu potencjału pola wykorzystywały wycinki mózgu myszy lub szczura z podobnymi wynikami24,25; Jednak wykorzystanie tkanki mózgowej szczura okazało się trudniejsze, ze względu na słabsze połączenie w porównaniu z tkanką mózgową uzyskaną od myszy7. Jeśli chodzi o technikę MEA, wycinki mózgu myszy najlepiej nadają się ze względu na ich mniejszy rozmiar. Co więcej, biorąc pod uwagę wyższy wskaźnik występowania wyładowań podobnych do ictal w tkance mózgowej myszy w porównaniu ze szczurami, możliwe jest przetestowanie znacznie większej liczby wycinków mózgu w ciągu jednego dnia eksperymentalnego, co z kolei sprawia, że gromadzenie danych jest szybsze i bardziej wydajne, a także może zmniejszyć liczbę wykorzystywanych zwierząt.
Znaczenie w odniesieniu do istniejących metod:
Wyładowania ictal zarejestrowane przy użyciu opisanej tutaj komory niestandardowej wydają się być podobne pod względem czasu trwania i szybkości występowania do tych obserwowanych przy użyciu konwencjonalnej komory pierścieniowej MEA i tego samego typu MEA (mikroelektrody płaskie, por. 17). Należy jednak podkreślić, że grubość wycinka mózgu musi być znacznie zmniejszona przy użyciu konwencjonalnej okrągłej komory rejestracyjnej wraz z niską szybkością perfuzji (1 ml / min), co może utrudnić pomyślne przeprowadzenie eksperymentów neuromodulacyjnych ze względu na słabą łączność.
W tym protokole niestandardowa komora nagraniowa o małej objętości, inspirowana konstrukcją komory zapisu z zaciskiem krosowym, zapewnia stabilny i niezawodny przepływ laminarny, który ma kluczowe znaczenie dla pomyślnego dążenia do nagrań MEA; Pozwala również na zwiększenie grubości wycinka mózgu do 400 μm w celu osiągnięcia sprawiedliwego kompromisu między żywotnością tkanki a wewnętrzną łącznością. Rzeczywiście uznaje się, że przepływ laminarny roztworu rejestrującego w komorze jest wysoce pożądany dla elektrofizjologii wycinków mózgu, ponieważ nie mają na niego wpływu gradienty temperatury, tlenu i pH, które obserwuje się w okrągłych komorach rejestrujących o przepływie kołowym 19,20,31 (takich jak te dostarczane z komercyjnie dostępnym MEA). Takie gradienty wprowadzają błąd eksperymentalny i są również szkodliwe dla wycinka mózgu. Komory rejestracyjne o stosunkowo małej objętości (~1,5 ml) wraz z dużą szybkością perfuzji (5 - 6 ml/min)16,31 pozwalają na odpowiednią wymianę medium perfuzyjnego (≥3 razy/min). Niestandardową komorę można łatwo uzyskać ze źródeł komercyjnych w przystępnej cenie lub wyprodukować we własnym zakresie przy użyciu technologii druku 3D. Inne badania wykazały zapisy MEA z wycinków ludzkiego mózgu o grubości 400 μm16 przy użyciu konwencjonalnej komory pierścieniowej MEA, przy jednoczesnym utrzymaniu objętości ACSF na poziomie 1 ml i egzekwowaniu wysokiej szybkości perfuzji (5 - 6 ml / min) za pomocą pompy perystaltycznej o niskim poziomie hałasu. Autorzy zastosowali jednak inny model iktogenezy, tj. niski poziomMg2+, na który prawdopodobnie w mniejszym stopniu niż na model 4AP wpływają mechanizmy ehaptyczne polegające na znacznym wzroście zewnątrzkomórkowego stężenia K+ 11,22. Odkryliśmy, że wysoka szybkość perfuzji nie jest pożądana w modelu 4AP, prawdopodobnie ze względu na szybkie wypłukiwanie nagromadzonego zewnątrzkomórkowego K+, który może wymagać znacznego zwiększenia w zapisie ACSF16. W rzeczywistości zdarzenia ictal wydawały się bardziej "fragmentaryczne", gdy prędkość perfuzji ASCF została zwiększona do 2 - 3 ml / min, a wycinek mózgu był zanurzony w grubej warstwie ACSF, podczas gdy pełnoobjawowe wyładowania wykazujące silne składniki toniczno-kloniczne można było przywrócić po powrocie do niższej szybkości perfuzji (1 ml / min) i cieńszej warstwy ACSF na poziomie powierzchni tkanki (dane nie pokazane). Niestandardowa komora rejestracyjna opisana w tym protokole pozwala na wymianę medium perfuzyjnego 3 - 5 razy/min przy natężeniu przepływu 1 mL/min. W ten sposób ogólny dopływ tlenu do wycinków mózgu jest znacznie poprawiony nawet przy stosunkowo niskich szybkościach perfuzji, gwarantując jednocześnie stabilną temperaturę nagrywania i wysoki stosunek sygnału do szumu. Co najważniejsze, możliwe jest utrzymanie zewnątrzkomórkowego stężenia K+ na poziomie wartości fizjologicznej.
Model iktogenezy 4AP nie wymaga żadnych znaczących modyfikacji składu jonowego ACSF, takich jak obniżenie Mg2 + lub zwiększenie K + i oferuje unikalną zaletę utrzymania nienaruszonych zarówno transmisji pobudzających, jak i hamujących12, aspekt, który jest bardzo istotny w badaniach nad padaczką w świetle kluczowej roli zarówno sieci glutaminergicznej, jak i GABA-ergicznej w synchronizacji padaczkowej (por. 7). 4AP-ACSF zastosowany w tym protokole zawiera fizjologiczne stężenie K+ (3,25 mM) i nieco niższe stężenieMg2+ niż ACSF trzymający (1 mM w porównaniu z 1,3 mM). Stężenie to nadal mieści się w podanych wartościach fizjologicznych stężeniaMg2+ w płynie mózgowo-rdzeniowym gryzoni i jest stosowane w wielu laboratoriach (patrz na przykład17,18). Dla celów opisanego protokołu stwierdziliśmy, że ten niewielki spadek jest preferowany jako pomoc w efekcie 4AP.
W poprzednich pracach 4AP został zastosowany do wycinka mózgu, gdy był on już umieszczony w komorze zapisu17,18. O ile eksperymentator nie musi obserwować opóźnienia czasowego między aplikacją 4AP a wystąpieniem wzorców padaczkowych, stwierdzamy, że takie podejście jest raczej czasochłonne i nie nadaje się do kontynuowania przedłużonych sesji nagrywania i stymulacji opisanych w tym protokole. Wstępna inkubacja wycinków mózgu w 4AP w temperaturze 32 °C pozwala zaoszczędzić dużo czasu doświadczalnego, ponieważ wycinki mózgu mogą być wstępnie traktowane szeregowo, podczas gdy eksperyment jest kontynuowany przy użyciu innych skrawków tkanki.
Przedłużona żywotność wycinków mózgu może być przydatna do analizy funkcji sieci w dłuższej perspektywie. Co więcej, ich zwiększona odporność na powtarzającą się stymulację elektryczną jest bardzo korzystna, jeśli eksperymentator chce porównać kilka protokołów stymulacji, które muszą być wykonane w tym samym wycinku mózgu, aby uzyskać statystyczną solidność. W naszych rękach, przy testowaniu 3 protokołów stymulacji, z których każdy poprzedzony jest fazą kontrolną, a następnie fazą regeneracji, eksperyment może trwać 3 - 5 godzin. W tym kontekście, mapowanie MEA na żywo ma kluczowe znaczenie dla aktywacji prawidłowego szlaku i tłumienia, a nie faworyzowania iktogenezy poprzez stymulację elektryczną. Nasz przyjazny dla użytkownika graficzny interfejs użytkownika stanowi szybkie, proste i elastyczne narzędzie do mapowania elektrod różnych struktur mózgu. W przeciwieństwie do oprogramowania komercyjnego, możliwe jest dodawanie niestandardowych układów MEA nawet przy podstawowych umiejętnościach programowania. Obrazy można uzyskiwać w jasnym polu; Tak więc odpowiednia jest każda kamera ogólnego przeznaczenia, która ma dobrą rozdzielczość i mieści się w mikroskopie. Mikroskop odwrócony jest niezbędny do wizualizacji położenia mikroelektrod względem wycinka mózgu, ponieważ byłyby one ukryte pod tkanką, gdyby używano mikroskopu pionowego. Jednak mikroskop stereoskopowy jest zalecany jako dodatek do typu odwróconego, jeśli eksperymentator musi wykonać cięcia nożem, aby zakłócić określone ścieżki neuronalne.
Wreszcie, kolejną zaletą proponowanego podejścia jest tani i stosunkowo łatwy montaż większości wymaganych narzędzi, takich jak niestandardowa komora nagrywająca i komory przytrzymujące, ciepła kąpiel i kotwica warstwowa, a także niepotrzebne stosowanie kosztownej pompy perystaltycznej o niskim poziomie hałasu.
Ograniczenia techniki:
Zapis MEA nie pozwala na wizualizację bardzo wolnych fal, czyli przesunięć DC w sygnale. Takie odchylenia linii bazowej mogą pomóc w asymptotycznym pomiarze czasu trwania wyładowania i, co najważniejsze, mają fundamentalne znaczenie dla badania depresji rozprzestrzeniającej się w korze mózgowej (zjawisko, które odnosi się do nagłej nieoczekiwanej śmierci w padaczce32 i jest wspólne dla padaczki i migreny33).
Jeśli chodzi o neuromodulację elektryczną, opisany tutaj protokół pozwala na wykonanie kilku sesji stymulacji bez wpływu na żywotność wycinków mózgu. Z powodzeniem mogliśmy wykonać do 3 sesji stymulacji po 20 - 45 minut, podobnie jak w poprzedniej pracy25. Chociaż wycinki mózgu mogą prawdopodobnie wytrzymać większą liczbę sesji stymulacji lub dłuższe protokoły stymulacji, nie testowaliśmy wycinków mózgu pod tym względem. Zalecamy ograniczenie liczby protokołów stymulacji do 3 i unikanie długotrwałych (≥60 min) sesji stymulacji, które mogą znacznie obciążyć tkankę mózgową utrzymywaną w tych warunkach granicznych, aż do braku regeneracji po odstawieniu bodźca.
Kluczowe kroki w ramach protokołu:
Kilka krytycznych czynników może utrudniać skuteczne dążenie do rejestrowania i modulowania aktywności padaczkowej w wycinkach mózgu sprzężonych z MEA. Oprócz użytych gatunków gryzoni i jakości wycinków mózgu, szybkości perfuzji podczas nagrywania i dynamiki przepływu ACSF (tj. laminarnego kontra kołowego) w komorze rejestrującej, stwierdziliśmy, że najbardziej krytycznymi krokami są warunki regeneracji i długoterminowego utrzymania wycinków mózgu, a także tryb aplikacji 4AP.
Podczas korzystania z zanurzonej komory przetrzymywania ważne jest, aby przechowywać plastry mózgu w temperaturze pokojowej, aby zachować aktywność sieci tkanki mózgowej i sprzyjać indukcji wyładowań podobnych do ictalu przez aplikację 4AP. W naszych rękach regeneracja i konserwacja w temperaturze 32 °C pogorszyła stan tkanki mózgowej w ciągu 3 - 4 godzin od krojenia.
Inkubacja wycinków mózgu w 4AP-ACSF w temperaturze pokojowej i rejestrowanie w temperaturze 32 °C nie jest jednak pożądane. Stwierdziliśmy wiele trudności w zaobserwowaniu silnych nawracających wyładowań w tym stanie. Rzeczywiście, doniesiono, że niskie temperatury w zakresie 20–24 °C tłumią lub nawet zapobiegają iktogenezie indukowanej przez 4AP zarówno in vitro34 , jak i in vivo35. W związku z tym temperatury inkubacji i rejestracji 4AP muszą mieścić się w zakresie 30 - 34 °C i muszą być dopasowane. Aby uniknąć narażenia tkanki mózgowej na zbyt duży stres z powodu jednoczesnego wywołania nadpobudliwości przez 4AP i nagłego wystawienia wycinków mózgu z temperatury pokojowej na ciepły (32 °C) 4AP-ACSF, ważne jest, aby wykonać pośredni etap wstępnego ogrzewania i pozwolić plasterkom mózgu przyzwyczaić się do ACSF w temperaturze 32 °C przez 20 - 30 minut. Pominięcie tego kroku może wpłynąć na indukcję iktogenezy przez 4AP.
Kolejnym aspektem, o którym należy wspomnieć, jest znaczenie stężenia D-glukozy w ACSF po pokrojeniu. Stężenie 25 mM zachowuje wycinki mózgu lepiej niż stężenie 10 mM stosowane w wielu laboratoriach, a także poprawia tempo występowania aktywności ictal, która jest 2-krotnie szybsza (ułatwiając w ten sposób realizację długiej serii protokołów eksperymentalnych w kilku wycinkach mózgu każdego dnia).
Na koniec należy wspomnieć o kilku ważnych drobnych szczegółach podczas procedury krojenia. Po pierwsze, nie pozwól, aby nienaruszony mózg i plasterki mózgu zamarzły w cięciu na zimno ACSF. Schładzanie mózgu przez <2 minuty jest wystarczające, biorąc pod uwagę mały rozmiar mózgu myszy. Skrawki tkanek należy przenieść natychmiast z tacki buforowej do zlewek płuczkowych w temperaturze pokojowej. Płukanie cięcia ACSF jest bardzo ważne, w przeciwnym razie wysokie stężenie sacharozy spowoduje, że plastry mózgu przykleją się do nylonowej siatki komory trzymania. Aby skutecznie wypłukać tkankę, ważne jest, aby zminimalizować zawartość ACSF w pipecie transferowej, aby nie zanieczyszczać nadmiernie trzymającego ACSF. 2-stopniowe płukanie pomaga w minimalizacji zanieczyszczeń. Po zakończeniu procedury krojenia, skrawki tkanek powinny zostać natychmiast przeniesione ze zlewek do płukania do komory przetrzymywania, gdzie miękka nylonowa siatka zawieszona do połowy w pomieszczeniu ACSF umożliwia natlenienie tkanek po obu stronach. Ta sama zasada powinna być stosowana na wszystkich etapach następujących po procedurze krojenia: plastry mózgu nigdy nie powinny znajdować się na dnie zlewki, nie powinny stykać się z bokami komór do przechowywania i nigdy nie powinny stykać się ze sobą ani nachodzić na siebie.
Modyfikacje i rozwiązywanie problemów:
Skład ACSF może być modyfikowany w zależności od potrzeb eksperymentatora. Na przykład, leki mogą być dodawane w celu zbadania udziału określonych neuroprzekaźników lub kanałów jonowych w skuteczności neuromodulacji elektrycznej. Co więcej, kwas pirogronowy i askorbinowy (por. tabela 2) można pominąć, chociaż stwierdzamy, że odgrywają one potężną rolę neuroprotekcyjne. W Tabeli 3 przedstawiamy najczęstsze problemy, które można napotkać w tym protokole oraz sposoby ich rozwiązywania.
Wnioski:
Zapis MEA jest niewątpliwie nieocenioną techniką zajmowania się interakcjami sieci neuronalnych w zdrowiu i chorobie. Oprócz badań farmakologicznych możliwa jest również ocena protokołów neuromodulacji elektrycznej, które są istotne dla DBS stosowanych w padaczce i innych zaburzeniach neurologicznych. W tym protokole wykazaliśmy, że możliwe jest odtworzenie typowych eksperymentów stymulacji okresowej z podobnymi wynikami do tych uzyskanych przy konwencjonalnym rejestrowaniu potencjału pola zewnątrzkomórkowego i zewnętrznych elektrodach stymulujących. Rosnąca dostępność komercyjnego, przyjaznego dla użytkownika sprzętu i zaawansowanych narzędzi programowych sprawia, że technika nagrywania MEA nadaje się również do eksperymentów stymulacji w pętli zamkniętej, w celu zapewnienia doraźnej stymulacji tkanki mózgowej oraz zbadania udziału mechanizmów sprzężenia zwrotnego w odpowiedziach sieci neuronowych.

Epilepsja jest zagrażającym życiu postępującym zaburzeniem powodującym niekontrolowaną aktywność mózgu1; wiąże się z jednym z najwyższych obciążeń chorobowych oraz znacznym piętnem społecznym2,3. TLE jest najczęstszym zespołem (40%) i najczęściej (~ 30%) wykazuje oporność na leki przeciwpadaczkowe4. Choć chirurgiczna ablacja tkanki epileptogennej może poprawić stan pacjenta, nie jest ona możliwa do zastosowania u wszystkich chorych i nie może zagwarantować życia całkowicie wolnego od napadów5. Modulacja sieci limbicznych w epilepsji za pomocą elektrycznej DBS jest obiecującym podejściem w przypadkach, gdy leczenie farmakologiczne lub neurochirurgia nie są odpowiednie.
Przekroje mózgu gryzoni są cennym narzędziem do badania funkcjonowania sieci neuronalnych w warunkach zdrowia i choroby6 przy użyciu technik elektrofizjologii in vitro, ponieważ zachowują one, przynajmniej częściowo, oryginalną architekturę i łączność interesującego regionu (ROI) mózgu. W szczególności poziome połączone przekroje hipokampa i kory entorynalnej (hipokamp-EC) obejmują kluczowe sieci neuronalne zaangażowane w TLE i sąTherefore rutynowo wykorzystywane w badaniach nad TLE in vitro7.
Aktywność przypominającą napady drgawkowe można wywołać w preparatach przekrojów mózgu poprzez zmianę składu jonowego sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (ACSF), na przykład poprzez zmniejszenie stężenia magnezu przy jednoczesnym zwiększeniu stężenia potasu8,9,10, lub za pomocą manipulacji farmakologicznych, takich jak blokowanie hamującej aktywności GABAergicznej (szczegółowy przegląd patrz w11). Jednak modele te opierają się na niezrównoważonej zmianie pobudzenia i hamowania, przez co nie pozwalają na badanie interakcji i wspólnego wkładu sieci pobudzających i hamujących w iktogenezę. Ciągła perfuzja przekrojów mózgu lekiem konwulsyjnym 4AP nasila zarówno pobudną, jak i hamującą neurotransmisję, co pozwala na badanie ostrej iktogenezy przy zachowaniu ogólnej nienaruszonej aktywności synaptycznej12.
Układy MEA umożliwiają rejestrację aktywności elektrycznej generowanej przez sieci neuronowe z większej liczby punktów obserwacyjnych w porównaniu do konwencjonalnej rejestracji potencjałów polowych z przestrzeni pozakomórkowej, gdzie ograniczenia przestrzenne limitują liczbę elektrod, które można umieścić na powierzchni skrawka mózgu. Co więcej, chipy MEA oferują dodatkową zaletę w postaci znanej odległości międzyelektrodowej, co jest bardzo przydatne do śledzenia propagacji i oceny prędkości przemieszczania się rejestrowanych sygnałów. Chociaż początkowo zaprojektowano je do rejestracji z hodowli neuronów13,14, obecnie MEA są również wykorzystywane do charakterystyki cech elektrofizjologicznych ostrych skrawków mózgu uzyskanych od gryzoni15 i ludzi16. Zatem w kontekście badań nad epilepsją, MEA stanowią cenne narzędzie do precyzyjnego określania oddziaływań sieci neuronowych leżących u podstawy iktogenezy16,17,18.
Rejestracja za pomocą MEA wiąże się jednak z immanentnymi wyzwaniami technicznymi w zakresie uzyskania lub utrzymania stabilnego wzorca epileptiformnego podczas długich (kilkugodzinnych) protokołów eksperymentalnych. Po pierwsze, natlenienie tkanek może być niewystarczające w dużych, okrągłych komorach rejestracyjnych typu zanurzeniowego19,20, typowych dla komercyjnie dostępnych układów MEA, podczas gdy niski stosunek sygnału do szumu oraz niestabilność temperatury mogą wpływać na jakość rejestracji przy zastosowaniu wysokiego przepływu perfuzji (6 - 10 mL/min) w celu poprawy dopływu tlenu do skrawka mózgu (patrz np. uwagi techniczne dotyczące sprzętu do ogrzewania i perfuzji21). Po drugie, wyładowania nawracające charakteryzujące się komponentami o wysokiej częstotliwości, takimi jak wyładowania epileptiformne, są rzadko obserwowane przy użyciu komór rejestracyjnych typu zanurzeniowego19; dotyczy to w szczególności sytuacji, gdy ostry wzorzec epileptiformny jest indukowany chemicznie i angażuje mechanizmy efaptyczne, co ma miejsce w modelu 4AP22 (patrz11 w celu uzyskania szczegółowego przeglądu). Aby przezwyciężyć te ograniczenia, badacze zaproponowali kilka strategii. Na przykład zwiększenie szybkości perfuzji19,20 przy jednoczesnym zmniejszeniu grubości (≤300 µM) i powierzchni skrawka mózgu17,18 są kluczowymi czynnikami w celu zapewnienia odpowiedniego dopływu tlenu do tkanki. Ponadto poprawę żywotności skrawka mózgu można osiągnąć stosując perforowane MEA (pMEA), które umożliwiają perfuzję tkanki mózgowej z obu stron18.
Choć opisane podejścia znacząco poprawiły wykonalność rejestracji MEA z plastrów mózgu, nie zostały one przetestowane w warunkach długotrwałych (wielogodzinnych) sesji rejestracji i stymulacji elektrycznej, z których ta druga stanowi istotny stres dla tkanki mózgowej. Długotrwałe sesje rejestracji mogą być niezbędne do badania ewolucji w czasie specyficznych cech wzorców epileptiformnych, których nie udałoby się ujawnić podczas pomiarów krótkoterminowych. W kontekście badań nad DBS długotrwałe protokoły eksperymentalne mogą być wymagane w celu oceny i porównania efektów kilku paradygmatów stymulacji w tym samym plastrze mózgu.
W przypadku, gdy konieczny jest jedynie zapis spontanicznej aktywności elektrycznej, mapowanie elektrod względem ROI wykonuje się zazwyczaj a posteriori, t.j. podczas analizy danych; natomiast badanie odpowiedzi wywołanych lub paradygmatów elektrycznej neuromodulacji wymaga dostarczenia stymulacji do konkretnych ROI, co wymusza potrzebę szybkiego i łatwego mapowania elektrod w czasie rzeczywistym podczas eksperymentu.
W niniejszym materiale przedstawiamy prosty protokół eksperymentalny, który umożliwia indukcję i utrzymanie stabilnego wzorca epileptiformnego indukowanego 4AP w skrawkach mózgu dorosłych gryzoni. Obserwowana aktywność wiernie odtwarza cechy elektrofizjologiczne tego modelu, scharakteryzowane przy użyciu konwencjonalnych technik elektrofizjologii zewnątrzkomórkowej. Utrzymuje się ona przez kilka godzin i trwa dłużej niż ciągła stymulacja elektryczna w powtarzalnych, przedłużonych epokach. Komory służące do utrzymywania i inkubacji skrawków mózgu można łatwo złożyć, korzystając ze standardowych materiałów laboratoryjnych (Rycina 1A), natomiast specjalistyczną komorę rejestracyjną zapewniającą optymalną szybkość wymiany roztworu i przepływ laminarny (Rycina 1B) można nabyć z komercyjnych źródeł lub wykonać za pomocą technologii druku 3D w przystępnej cenie. Szybkie mapowanie obszarów ROI w celu monitorowania w czasie rzeczywistym oraz wyboru elektrod stymulujących jest możliwe dzięki intuicyjnemu, autorskiemu interfejsowi GUI o nazwie mapMEA, który jest dostępny bezpłatnie na żądanie.
<img alt="Schemat urządzenia mikroprzepływowego z wlotami/wylotami; układ wieloogniskowy do analizy dynamiki płynów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57548/57548fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Specjalistyczny sprzęt użyty w tym protokole. (A) Komory do rekonwalescencji, wstępnego ogrzewania i wstępnej inkubacji w 4AP, złożone z zlewki i szalki Petriego. Szalka Petriego powinna mieć mniejszą średnicę niż zlewka i być utrzymywana w miejscu za pomocą tłoka strzykawki. Dno szalki Petriego zastąpiono nylonową siatką (z miękkich pończoch) przyklejoną cyjanoakrylanem do krawędzi szalki. Tlen jest dostarczany przez zgiętą igłę rdzeniową (22 G), wprowadzoną między ścianki szalki Petriego a zlewkę. Pęcherzyki powinny wydobywać się z boku zlewki i nigdy nie osiągać nylonowej siatki, aby uniknąć przemieszczenia skrawka mózgu. Górna część szalki Petriego może służyć jako pokrywa, aby zapobiec odparowaniu ACSF i utrzymać saturację tlenem. (B) Specjalistyczna komora rejestracyjna. in: zbiornik wlotowy przeznaczony na kaniulę grzewczą i elektrodę odniesienia. out: zbiornik wylotowy przeznaczony na igłę ssącą. rec: komora rejestracyjna. (C) Szklana pipeta Pasteura, wygięta poprzez polerowanie ogniowe, używana do manipulowania tkanką i korygowania jej pozycji w komorze rejestracyjnej. (D) Specjalistyczny kotwiczka do przytrzymywania skrawka. (E) Końcowy montaż komory rejestracyjnej osadzonej na chipie MEA. Skrawek mózgu spoczywa na dnie, będąc utrzymywanym w miejscu przez kotwiczkę. Czerwona strzałka wskazuje rurkę PTFE pokrywającą kaniulę grzewczą, natomiast czerwone koło wskazuje elektrodę odniesienia, czyli nasycony pellet KCl zanurzony w ACSF w zbiorniku wlotowym. Niebieska strzałka wskazuje igłę ssącą w zbiorniku wylotowym. <a href="/files/ftp_upload/57548/57548fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

<table><tbody><tr><td>Poli-D-lizyna&nbsp;</td><td>Sigma-Adrich</td><td>P7886</td><td>Potrzebny do powlekania MEA</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Adrich</td><td>S9888</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Adrich</td><td>P9541</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Adrich</td><td>795488</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>CaCl2*2 H2O</td><td>Sigma-Adrich</td><td>C3306</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>D-Glukoza</td><td>Sigma-Adrich</td><td>RDD016</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Adrich</td><td>S5761</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>MgCl2*6 H2O</td><td>Sigma-Adrich</td><td>M2670</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>MgSO4*6 H2O</td><td>Sigma-Adrich</td><td>M5921</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Adrich</td><td>RDD023</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>kwas pirogronowy, 98%&nbsp;</td><td>Sigma-Adrich</td><td>107360</td><td>Chemiczna</td></tr><tr><td>4-aminopirydyna</td><td>Sigma-Adrich</td><td>A78403</td><td>Lek drgawkowy</td></tr><tr><td>STG-2004</td><td>System wielokanałowy</td><td>STG4004-1,6mA</td><td>4-kanałowy generator bodźców z napięciem (&plusmn; 8 V) i wyjście prądowe (&plusmn; 1,6 mA)</td></tr><tr><td>MEA1060</td><td>System wielokanałowy</td><td>Nie dotyczy</td><td>wzmacniacz MEA</td></tr><tr><td>planarny</td><td>system wielokanałowy</td> MEA <td>60MEA500/30iR-Ti bez pierścienia</td><td>Musi być bez pierścienia, aby umożliwić korzystanie z niestandardowej komory nagrywania</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do nagrywania</td><td>systemu wielokanałowego</td><td></td><td>McRack</td></tr><tr>Oprogramowanie sterujące <td>STG4004 systemem</td><td>wielokanałowym</td><td></td><td>McStimulus II</td></tr><tr><td>TC02</td><td>System wielokanałowy</td><td>TC02</td><td>Termostat 2-kanałowy</td></tr><tr><td>PH01</td><td>System wielokanałowy</td><td>PH01</td><td>Ogrzewanie perfuzyjne</td></tr><tr><td>MPH&nbsp;</td><td>System wielokanałowy</td><td>MPH&nbsp;</td><td>Uchwyt magnetyczny do PH01 i igły ssącej</td></tr><tr><td>Elastostil E43</td><td>Wacker</td><td>E43</td><td>Elastomerowy uszczelniacz stosowany do montażu niestandardowej komory zapisu na MEA</td></tr><tr><td>MEA Custom</td><td>Chamber Crisel Instrument</td><td>SKE-chamber MEA</td><td>Niestandardowa komora nagraniowa</td></tr><tr><td>Ag/AgCl elektroda, granulka, 1.0 mm&nbsp;</td><td>Crisel Instrument</td><td>64-1309</td><td>Elektroda referencyjna do niestandardowej komory nagraniowej</td></tr><tr><td>Tergazyme</td><td>Sigma-Adrich</td><td>Z273287-1EA</td><td>Enzymatyczny środek czyszczący</td></tr><tr><td>MATLAB</td> Środowisko programistyczne <td>Mathworks</td><td></td><td>do mapowania elektrod</td></tr><tr><td>VT1000S</td><td>Leica Biosystems</td><td>VT1000S</td><td>Vibratome</td></tr><tr><td></td><td>Warner Instruments</td><td>64-1309</td><td>Ag-AgCl Elektroda w postaci granulki 1,0 mm (E205). Elektroda referencyjna.</td></tr></tbody></table>

rejestracja i modulacja aktywności padaczkowej w wycinkach mózgu gryzoni sprzężonych z układami mikroelektrod

Recording and Modulation of Epileptiform Activity in Rodent Brain Slices Coupled to Microelectrode Arrays

Padaczka skroniowa (TLE) jest najczęstszym częściowym złożonym zespołem padaczkowym i najmniej reagującym na leki. Głęboka stymulacja mózgu (DBS) jest obiecującym podejściem, gdy leczenie farmakologiczne zawodzi lub neurochirurgia nie jest zalecana. Ostre wycinki mózgu sprzężone z układami mikroelektrod (MEA) stanowią cenne narzędzie do badania interakcji sieci neuronalnych i ich modulacji przez stymulację elektryczną. W porównaniu z konwencjonalnymi technikami zapisu zewnątrzkomórkowego zapewniają one dodatkowe zalety w postaci większej liczby punktów obserwacyjnych i znanej odległości między elektrodami, co pozwala na badanie ścieżki propagacji i prędkości sygnałów elektrofizjologicznych. Jednak natlenienie tkanek może być znacznie upośledzone podczas rejestracji MEA, co wymaga wysokiej szybkości perfuzji, co odbywa się kosztem zmniejszonego stosunku sygnału do szumu i wyższych oscylacji temperatury eksperymentalnej. Stymulacja elektryczna dodatkowo obciąża tkankę mózgową, utrudniając dążenie do długotrwałych epok nagrywania/stymulacji. Co więcej, elektryczna modulacja aktywności wycinka mózgu musi być ukierunkowana na określone struktury/ścieżki w obrębie wycinka mózgu, co wymaga, aby mapowanie elektrod było łatwe i szybkie wykonywane na żywo podczas eksperymentu. Tutaj pokazujemy, jak przeprowadzić rejestrację i modulację elektryczną aktywności padaczkowej indukowanej przez 4-aminopirydynę (4AP) w wycinkach mózgu gryzoni za pomocą płaskich MEA. Pokazujemy, że tkanka mózgowa uzyskana od myszy przewyższa tkankę mózgową szczura i dlatego lepiej nadaje się do eksperymentów MEA. Protokół ten gwarantuje wygenerowanie i utrzymanie stabilnego wzorca padaczkowego, który wiernie odtwarza cechy elektrofizjologiczne obserwowane przy konwencjonalnym rejestrowaniu potencjału pola, utrzymuje się przez kilka godzin i trwa dłużej niż trwała stymulacja elektryczna przez dłuższe epoki. Żywotność tkanek przez cały czas trwania eksperymentu osiąga się dzięki zastosowaniu niestandardowej komory rejestracyjnej o małej objętości, pozwalającej na przepływ laminarny i szybką wymianę roztworu nawet przy niskich (1 ml/min) szybkościach perfuzji. Szybkie mapowanie MEA w celu monitorowania w czasie rzeczywistym i wyboru elektrod stymulujących odbywa się za pomocą niestandardowego graficznego interfejsu użytkownika (GUI).

Ilustrujemy, jak przeprowadzić rejestrację i elektryczną modulację aktywności padaczkowej indukowanej przez 4-aminopirydynę w wycinkach mózgu gryzoni za pomocą układów mikroelektrod. Niestandardowa komora rejestracyjna utrzymuje żywotność tkanek podczas długotrwałych sesji eksperymentalnych. Mapowanie elektrod na żywo i wybór par stymulujących odbywa się za pomocą niestandardowego graficznego interfejsu użytkownika.

Rejestracja i modulacja aktywności padaczkowej w wycinkach mózgu gryzoni sprzężonych z układami mikroelektrod

Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common partial complex epileptic syndrome and the least responsive to medications. Deep brain stimulation (DBS) ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neuromodulacji w leczeniu padaczki, takie jak to, jaki obszar mózgu i protokół stymulacji są najbardziej odpowiednie. Główną zaletą tej techniki jest to, że wycinki mózgu gryzoni reprezentują uproszczony, realistyczny model obwodów mózgowych, podczas gdy układy mikroelektrod umożliwiają wielokrotną obserwację punktów w znanej odległości między elektrodami. Aby przygotować MEA, równomiernie rozprowadź elastomerowy uszczelniacz na dolnej powierzchni komory zapisu i upewnij się, że nie ma pęcherzyków.Następnie za pomocą pęsety zamontuj komorę nagrywającą na MEA i delikatnie dociśnij. Rozprowadzić warstwę szczeliwa wokół zewnętrznej krawędzi komory nagrywania. Następnie umieść zespół MEA/komory w zamkniętym, wilgotnym środowisku i pozwól mu utwardzić się w temperaturze pokojowej przez noc.Aby przygotować ławę do nagrywania, ustaw ciepłą kąpiel na 32 stopnie Celsjusza. Następnie wlej ACSF do komory do trzymania i podgrzewania. Roztwory należy przepłukać 95% mieszaniną tlenu i 5% dwutlenku węgla, a następnie usunąć wszelkie uwięzione pęcherzyki za pomocą odwróconej pipety Pasteura.Utrzymuj komorę przetrzymywania w temperaturze pokojowej i umieść komorę wstępnego podgrzewania w ciepłej kąpieli. Przygotuj poziome wycinki mózgu hipokampa i kory mózgowej zgodnie ze standardowymi procedurami i pozwól im zregenerować się w komorze przetrzymywania w temperaturze pokojowej przez co najmniej 60 minut. Wlać 4AP ACSF do komory inkubacyjnej.Następnie napełnij go 95% mieszaniną tlenu i 5% dwutlenku węgla i usuń wszelkie uwięzione pęcherzyki za pomocą odwróconej pipety Pasteura. Następnie przykryj komorę i przenieś ją do ciepłej kąpieli. Upewnij się, że temperatury ACSF i ACSF 4AP wynoszą od 30 do 32 stopni Celsjusza.Użyj pipety Pasteura z odwróconym szkłem, aby przenieść jeden plasterek mózgu do komory wstępnego podgrzewania i pozwól tkance odpocząć przez 25 do 30 minut. Następnie przenieś wycinek mózgu do komory inkubacyjnej 4AP ACSF i pozwól mu odpocząć przez 60 minut. Pozwól, aby 4AP ACSF przepłynął przez rurkę perfuzyjną do zlewki, aż w środku nie będzie powietrza.Następnie zatrzymaj przepływ roztworu. Umieść suchy chip MEA wewnątrz MEA amplifier i zabezpiecz amplifier głowica. Następnie za pomocą plastikowej pipety Pasteura przenieś 4AP ACSF do zbiornika wlotowego i wylotowego komory rejestracyjnej.Przymocuj kaniulę grzewczą do uchwytu magnetycznego i umieść jej końcówkę w porcie wlotowym komory nagrywania. Następnie przymocuj uchwyt magnetyczny do paska magnetycznego na głowicy wzmacniacza MEA. Podłącz rurkę perfuzyjną do kaniuli, a kaniulę do termostatu.Następnie umieść igłę ssącą w zbiorniku wylotowym. Sprawdź, czy występuje podciśnienie, zanurzając igłę ssącą w ACSF i sprawdź, czy jest ciągły hałas ssania o niskiej częstotliwości. Następnie ustaw regulator przepływu tak, aby pozwalał na natężenie przepływu jednego mililitra na minutę i rozpocznij perfuzowanie.Gdy 4AP ACSF przepłynie przez kaniulę, włącz termostat. Ustaw kaniulę grzewczą na 37 stopni Celsjusza, a podstawę MEA na 32 stopnie Celsjusza, aby osiągnąć temperaturę od 32 do 34 stopni Celsjusza wewnątrz komory nagrywającej. Następnie umieść zewnętrzną elektrodę odniesienia w zbiorniku wlotowym komory nagraniowej.Gdy poziom 4AP ACSF i temperatura nagrywania ustabilizują się zgodnie z potrzebami, przekręć kurki perfuzyjne i ssące do pozycji wyłączonej, aby je tymczasowo zatrzymać. Szybko przenieś jeden wycinek mózgu do komory zapisu MEA za pomocą pipety Pasteura z odwróconym szkłem. W razie potrzeby dostosuj jego położenie w obszarze nagrywania MEA za pomocą polerowanej, zakręconej pipety Pasteura lub miękkiej, kompaktowej, małej szczoteczki.Umieść kotwicę dociskową na wycinku mózgu. Ponownie uruchom perfuzję i ssanie, przekręcając ich kurki z powrotem do pozycji włączonej. Zrób zdjęcie wycinka mózgu za pomocą kamery zamontowanej na stoliku z odwróconym mikroskopem.Następnie uruchom skrypt mapMEA w oprogramowaniu komputerowym, aby uruchomić GUI w celu mapowania elektrod. Kliknij przycisk Przeglądaj, aby załadować obraz wycinka mózgu. Upewnij się, że elektroda referencyjna znajduje się w górnej kolumnie lewej połowy MEA.Następnie kliknij przycisk Aktywuj wskaźnik. Wybierz górną i dolną elektrodę w skrajnej lewej kolumnie matrycy, aby oznaczyć współrzędne XY do prostowania obrazu i mapowania elektrod. Z menu rozwijanego typu plasterka wybierz opcję Poziomy.Zaznacz pole wyboru Struktury domyślne. Korzystając z ponumerowanych przycisków pod obrazem wycinka mózgu, wybierz elektrody odpowiadające zwrotowi z inwestycji i kliknij odpowiednie przyciski w panelu struktury, aby je przypisać. Powtórz ten krok dla każdego zwrotu z inwestycji.Następnie naciśnij przycisk Zapisz. Oprogramowanie wygeneruje folder wyników zawierający tabelę przedstawiającą wybrane elektrody i ROI. W przypadku badania elektrofizjologii włącz jednostkę bodźca co najmniej 10 minut przed protokołem stymulacji, aby umożliwić samokalibrację i stabilizację.Następnie uruchom oprogramowanie sterujące bodźcem i sprawdź, czy stymulator i MEA amplifier są prawidłowo połączone, jak wskazuje zielona dioda LED na głównym panelu oprogramowania sterującego bodźcem. Ustaw stymulację w konfiguracji dwubiegunowej. Podłącz jednostkę stymulacyjną do ziemi.Następnie połącz pary elektrod stykające się z piramidalną warstwą komórek CA1 / bliższego subiculum spośród tych zmapowanych za pomocą mapy skryptu MEA. Aby uzyskać dane, naciśnij przycisk odtwarzania w głównym panelu oprogramowania do nagrywania. Zanotować co najmniej cztery zrzuty ictal.Następnie przeprowadź szybki test wejścia/wyjścia, aby określić najlepszą intensywność bodźca. W tym celu należy za pomocą panelu głównego zaprojektować kwadratowy dwufazowy dodatnio-ujemny impuls prądowy o czasie trwania 100 mikrosekund na fazę. W zakładce amplituda impulsu wprowadź początkową amplitudę impulsu wynoszącą 100 mikroamperów na fazę.Ustaw impuls stymulacji na 0,2 herca lub mniej, dodając interwał między impulsami wynoszący pięć sekund lub dłużej. Zwiększaj amplitudę bodźca o 50 do 100 kroków mikroamperowych przy każdej próbie, aż stymulacja będzie mogła niezawodnie wywołać zdarzenia podobne do międzynapadowych w korze przyhipokampowej. W celu elektrycznej modulacji iktogenezy limbicznej zaprogramuj jednostkę bodźca tak, aby dostarczała interesujący ją protokół stymulacji i wykorzystaj amplitudę bodźca zidentyfikowaną podczas testu wejścia/wyjścia.Po ustaniu stymulacji sprawdź, czy sieć powróciła do stanu sprzed bodźca, rejestrując co najmniej cztery wyładowania ictal. Rysunek ten przedstawia zapisy indukowanej przez 4AP aktywności ictal w korze śródwęchowej i korze okołęchowej podczas stanu kontrolnego, okresowego stymulacji przy jednym hercu oraz podczas rekonwalescencji po odstawieniu bodźca. Wykres ten przedstawia kwantyfikację wpływu okresowego stymulacji przy jednym hercu, co wskazuje na znaczne skrócenie całkowitego czasu chwytania podczas stymulacji.Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu trzech do czterech godzin, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o szybkim i prawidłowym umieszczeniu wycinka mózgu na MEA. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak manipulacja farmakologiczna, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące udziału neuroprzekaźników lub kanału jonowego w aktywności padaczkowej i efekcie neuromodulacji.Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie neurobiologii do zbadania interakcji sieci neuronalnych w zdrowiu i chorobie w hodowanych neuronach, a także w wycinkach mózgu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak rejestrować i elektrycznie modulować aktywność padaczkową indukowaną przez cztero-aminopirydynę w wycinkach mózgu gryzoni sprzężonych z MEA.

recording-modulation-epileptiform-activity-rodent-brain-slices

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film opisuje technikę rejestrowania aktywności padaczkowej wycinków organotypowych kory nosa i hipokampa ex vivo za pomocą elektrofizjologii lub ustawień EEG. Pomaga to w badaniu dynamiki i progresji epileptogenezy oraz w badaniach przesiewowych potencjalnych celów terapeutycznych w leczeniu padaczki.

Technika zapisu oparta na elektroencefalografii do rejestrowania aktywności padaczkowej

Ten protokół polega na użyciu układu mikroelektrod (MEA) do rejestrowania aktywności elektrycznej w wycinku mózgu wystawionym na działanie leku wywołującego drgawki. Procedura obejmuje umieszczenie wycinka mózgu w komorze rejestracyjnej MEA, zastosowanie stymulacji elektrycznej w celu wywołania sztucznych napadów i analizę uzyskanych sygnałów.

Monitorowanie aktywności elektrycznej neuronów wywołanej napadami padaczkowymi w wycinkach mózgu za pomocą układów mikroelektrod

Ten film demonstruje metodę zapisu EEG w wysokiej rozdzielczości w szczurzym modelu padaczki ogniskowej. Przedstawiono w nim etapy przygotowania szczura, podłączenia wielokanałowej mini-czapki EEG do skóry głowy szczura i zarejestrowania EEG w celu identyfikacji zdarzeń związanych z napadami charakterystycznych dla modelu padaczki.

Zapis elektroencefalograficzny w szczurzym modelu padaczki ogniskowej

Ten film pokazuje elektroencefalograficzny (EEG) zapis napadów padaczkowych u szczurów z padaczką. Szczur z elektrodami wszczepionymi w brzuszny hipokamp podłącza się do systemu rejestracji EEG i umieszcza w komorze z pleksi. Szczur może się swobodnie poruszać, podczas gdy aktywność mózgu jest rejestrowana w celu monitorowania występowania napadów.

Elektroencefalograficzny zapis napadów padaczkowych u szczurów z padaczką

Ten film pokazuje indukcję zdarzeń ictal w wycinkach kory koronalnej od transgenicznej myszy eksprymującej aktywowane światłem kanały kationowe w korowych pobudzających neuronach piramidowych. Wycinek umieszcza się w komorze nagrywającej, a elektrodę rejestrującą wprowadza się do powierzchownej warstwy korowej. Po perfuzji z lekiem wywołującym drgawki, który blokuje kanały potasowe, neurony stają się nadpobudliwe i generują spontaniczne zdarzenia ictal. Aby wygenerować zdarzenia ictal na...

Generowanie spontanicznych i na żądanie zdarzeń ictal w wycinkach kory mózgowej myszy

Tutaj opisujemy, jak wykonywać zapisy wieloelektrodowe tkanki ludzkiej kory padaczkowej. Szczegółowo zademonstrowano resekcję tkanki padaczkowej, przygotowanie plastrów i zapisy wieloelektrodowe zdarzeń międzynapadowych i ictalowych.

Wieloelektrodowe zapisy pooperacyjnej tkanki korowej ludzkiego epilepsji

Badania wykazały, że katodowa przezczaszkowa stymulacja prądem stałym może powodować efekt tłumiący napady oporne na leki. W tym badaniu opracowano konfigurację eksperymentalną in vitro, w której oceniano stymulację prądem stałym i rejestrację wieloelektrodową aktywności podobnej do napadu w przygotowaniu wycinków mózgu myszy. Ocenie poddano parametry stymulacji prądem stałym.

Stymulacja prądem stałym i wieloelektrodowa rejestracja aktywności podobnej do napadów w przygotowaniu do wycinka mózgu myszy

Protokół opisuje metodologię zewnątrzkomórkowego zapisu w korze ruchowej (MC) w celu ujawnienia zewnątrzkomórkowych właściwości elektrofizjologicznych u swobodnie poruszających się świadomych myszy, a także analizę danych lokalnych potencjałów pola (LFP) i skoków, co jest przydatne do oceny aktywności neuronalnej sieci leżącej u podstaw interesujących zachowań.

Wielokanałowy zapis zewnątrzkomórkowy w swobodnie poruszających się myszach

Tutaj przedstawiamy protokół użycia komplementarnych systemów układów mikroelektrod o wysokiej gęstości (CMOS-HD-MEAs) do rejestrowania aktywności podobnej do napadu z wycinków mózgu ex vivo.

Wysokiej jakości aktywność podobna do napadów padaczkowych z ostrych wycinków mózgu przy użyciu komplementarnego układu mikroelektrod o dużej gęstości z tlenkiem metalu i półprzewodnikiem

Ten protokół ma na celu stabilne umieszczanie grzbietowo-brzusznych zrośniętych asembloidów na wieloelektrodowych układach do modelowania padaczki in vitro.

Wieloelektrodowa platforma matrycowa do modelowania padaczki przy użyciu ludzkich pluripotencjalnych zespołów mózgowych pochodzących z komórek macierzystych

Protokół ten został opracowany, aby stworzyć niezawodny i łatwo dostępny system do rejestrowania swobodnie poruszającego się EEG gryzoni.

Opłacalny i minimalnie inwazyjny protokół do przewlekłej wielomiejscowej elektroencefalografii u swobodnie poruszających się myszy

Poznaj metodę rejestracji i modulacji aktywności padaczkowej w wycinkach mózgu gryzoni przy użyciu układów mikroelektrod. Technika ta umożliwia badanie dynamiki obwodów neuronalnych w leczeniu epilepsji.

Rejestracja i modulacja aktywności padaczkowej w wycinkach mózgu gryzoni sprzężonych z układami mikroelektrod

Przeglądaj więcej filmów