Protokół blistra ssącego do badania reakcji przywołania ludzkich limfocytów T in vivo
11 sierpnia 2018
Tutaj prezentujemy demonstrację modelu przywołania pęcherza ssącego na skórę. Model ten umożliwia prosty dostęp do badania in vivo adaptacyjnych odpowiedzi immunologicznych u ludzi, na przykład w kontekście opracowywania szczepionek.
Ogólnym celem tego filmu jest zademonstrowanie metody przywoływania na skórę pęcherzy ssących, która pozwala nam zbierać limfocyty T i cytokiny specyficzne dla antygenu reprezentatywne dla adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej in vivo. Metoda ta może być stosowana do badania odpowiedzi komórkowych i odporności adaptacyjnej u ludzi. Główną zaletą tej technologii jest to, że pozwala nam na pobranie limfocytów T specyficznych dla antygenu bezpośrednio z miejsca reakcji immunologicznej przy użyciu stosunkowo nieinwazyjnej i bezpiecznej metody.
Podstawową zasadą przywołania skórnego jest zdeponowanie antygenu w warstwie skórnej skóry. U osób z istniejącą pamięcią immunologiczną antygenu limfocyty T będą migrować do miejsca reakcji i indukować lokalną odpowiedź immunologiczną, w której określone limfocyty T są klonalnie rozszerzane i różnicowane in situ. Indukcja pęcherzy ssących w wyniku tej reakcji pozwala nam na pobranie tych specyficznych limfocytów T, a także cytokin wytwarzanych in vivo.
W tej demonstracji wideo używamy PPD jako antygenu przypominającego. PPD jest powszechnie stosowany w diagnostyce zakażenia prątkami gruźlicy. Ale wywołuje również reakcje skórne u osób wcześniej zaszczepionych szczepionką BCG, jak zobaczysz w tym filmie.
Materiały do tuberkulinowej próby skórnej obejmują waciki nasączone alkoholem, jednomililitrową strzykawkę z krótką igłą o rozmiarze od 27 do 30 oraz roztwór PPD zatwierdzony do stosowania u ludzi. Użyj roztworu PPD o stężeniu 20 jednostek tuberkuliny na mililitr. Zdezynfekować fiolkę za pomocą wacika nasączonego alkoholem.
Należy pamiętać, że skład może się różnić w zależności od producenta. Następnie zlokalizuj miejsce wstrzyknięcia po brzusznej stronie przedramienia ochotnika i zdezynfekuj ten obszar za pomocą wacika nasączonego alkoholem. Użyj sterylnej strzykawki o średnicy jednego mililitra z igłą stałą o rozmiarze 29 i średnicy 12 milimetrów.
Delikatnie wymieszaj i zaaspiruj 0,1 mililitra roztworu PPD. Upewnij się, że nie ma widocznych bąbelków. Napręż skórę i skieruj igłę pod kątem od pięciu do piętnastu stopni, ze skosem skierowanym do góry.
Włóż końcówkę igły w warstwę skórną skóry i upewnij się, że końcówka jest prawie widoczna przez naskórek. Powoli wstrzyknąć 0,1 mililitra roztworu PPD. Przy prawidłowym podaniu natychmiast pojawi się grudka o długości od sześciu do dziesięciu milimetrów.
Grudka znika po około dziesięciu minutach. Wielokrotne składanie PPD jest możliwe, ale może wymagać dodatkowej zgody etycznej. W przypadku podania dwóch wstrzyknięć, należy dążyć do maksymalnej separacji, zachowując odpowiednią odległość od okolicy łokcia i nadgarstka.
Kliniczna reakcja skórna pojawia się w ciągu pierwszych 24 godzin i towarzyszy jej uczucie swędzenia. Zmierz wielkość reakcji skórnej od 48 do 72 godzin po wstrzyknięciu. Oceniając odpowiedź, ważne jest, aby mierzyć stwardnienie, a nie rumień.
Zbadaj palpacyjnie obrzęk kapelusza palcem. Następnie zaznacz krawędzie stwardnienia za pomocą długopisu. Na koniec użyj miękkiej linijki, aby zmierzyć średnicę stwardnienia i zanotuj wyniki w milimetrach.
Po siedmiu dniach nadszedł czas na wywołanie pęcherza ssącego. Do indukcji blistra ssącego skórę należy użyć pompy próżniowej z dołączoną komorą ssącą. Użyj urządzenia dostępnego na rynku lub dostosowanego do jego potrzeb.
Co ważne, pompa musi być regulowana w zakresie od minus 20 do minus 40 kilopaskali i zapewniać stałe i niezawodne podciśnienie. Dolna część komory ssącej składa się z płytki z małym otworem, który styka się ze skórą. Płytki mogą mieć jeden lub wiele otworów i mogą być stosowane różne rozmiary w celu dopasowania do reakcji skórnej.
Górna część komory powinna umożliwiać wizualne monitorowanie blistra. Przed indukcją należy zdezynfekować skórę i płytkę komory. Upewnij się, że ramię wygodnie odpoczywa
.Przymocuj i zabezpiecz komorę, tutaj za pomocą regulowanych pasków. Środek reakcji skórnej powinien być widoczny przez otwór w dolnej płytce. Włącz urządzenie ssące i ustaw podciśnienie na minus 20 kilopaskalów.
Po trzydziestu minutach zwiększ ciśnienie do minus 25 kilopaskala. Po 60 minutach jeszcze bardziej zwiększ ciśnienie do minus 30 kilopaskal. I utrzymuj ciśnienie tutaj, aż pojedynczy pęcherz zostanie w pełni uformowany.
Faza indukcji blistrów trwa zwykle około jednej do trzech godzin. Rzeczywiste tworzenie pęcherzy następuje stopniowo w ciągu ostatnich 30 minut, jak pokazano tutaj z dużą prędkością. Jeśli pojawią się oznaki pęknięcia pęcherza lub krwotoku, zaleca się powolne zmniejszanie ciśnienia i wczesne przerwanie indukcji.
Pęcherze mogą wyglądać jak pojedyncze lub wielokrotne łączące się pęcherze. Proces ten często wiąże się z uczuciem swędzenia. Po całkowitym uformowaniu blistra zwolnić ciśnienie i ostrożnie wyjąć komorę ssącą.
W prawidłowo wywołanych pęcherzach warstwa naskórka jest całkowicie oddzielona od warstwy skórnej skóry, pozostawiając jamę wypełnioną płynem. Chroń blister, nakładając miękki opatrunek na otaczający obszar skóry i umieszczając twardą nakrętkę na blistrze , tutaj z 15-mililitrowej plastikowej tubki. Zabezpiecz nakrętkę niealergiczną taśmą, a następnie miękkim, rozciągliwym bandażem.
Poinstruuj ochotnika, aby trzymał opatrunek ochronny przez noc. Następnego dnia ostrożnie zdejmij opatrunek i zdezynfekuj obszar pęcherza za pomocą sprayu. Użyj sterylnej strzykawki o pojemności 2 mililitrów z igłą o rozmiarze 23, aby zebrać zawartość blistra.
Wbić igłę w górną boczną stronę dachu blistra i powoli zasysać płyn. Unikaj dotykania dna jamy, ale upewnij się, że zebrałeś cały płyn, ponieważ objętość blistrów może być niska, jak w tym przykładzie. Zapadnięty pęcherz zagoi się bez blizn.
Nałóż opatrunek ochronny na blister. Następnie przenieś płyn z blistra do sterylnej probówki. Wirować przez cztery minuty w temperaturze 600 G za pomocą wirówki stołowej.
Następnie zbierz supernatant i ponownie zawieś osad komórkowy w 500 mikrolitrach pożywki komórkowej. Świeże komórki są teraz gotowe do zliczania i dalszej analizy. Ssące komórki pęcherzowe mogą być wykorzystywane do analizy in vitro, takiej jak cytometria przepływowa.
W tym eksperymencie z ochotnikami zaszczepionymi BCG wydajność komórek wahała się od 15 000 do ponad 200 000 komórek na blister. Tutaj wyizolowaliśmy komórki z pojedynczego blistra ssącego i stymulowaliśmy komórki za pomocą PPD in vitro, a następnie barwienia i cytometrii przepływowej. Dla porównania, przeprowadziliśmy równoległą analizę PBMC od tego samego ochotnika zaszczepionego PCG.
W panelach widać populacje limfocytów T CD4-dodatnich wybarwionych pod kątem międzykomórkowej produkcji TNF-alfa, interferonu gamma i IL2. U tego ochotnika ponad 30% limfocytów T CD4-dodatnich wyizolowanych ze skóry było specyficznych dla antygenu. W PBMC frakcja ta wynosiła mniej niż 1%Ponadto indywidualne profile cytokin komórek pęcherzowych były reprezentatywne zarówno dla komórek T pamięci centralnej, jak i efektorowych komórek T, co ilustruje, w jaki sposób ta metoda pozwala nam badać długotrwałe odpowiedzi pamięciowe generowane in vivo.
Tutaj rysunek A ilustruje, że płyn uzyskany z blistrów ssących może być analizowany pod kątem cytokin wytwarzanych in vivo. Na rysunku B hodowaliśmy komórki uzyskane z pęcherzy ssących przez cztery dni w obecności Mycobacterium tuberculosis, ilustrując, w jaki sposób ssące komórki pęcherzowe są zdolne do wytwarzania interferonu gamma i TNF alfa ex vivo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak indukować i zbierać komórki z pęcherzy ssących po osadzaniu się antygenu skórnego.
W tej demonstracji użyliśmy antygenu o szczególnym znaczeniu w dziedzinie badań nad gruźlicą. Jednak podstawowe zasady tej metodologii mogą być przydatne w dziedzinie odporności adaptacyjnej lub w badaniach nad czynnikami ukierunkowanymi na limfocyty T. Pamiętaj również, że etyka i bezpieczeństwo są priorytetem podczas pracy z wolontariuszami.
Pamiętaj również, że praca z próbkami ludzkimi może być niebezpieczna i że w laboratorium należy zawsze przestrzegać środków ostrożności.
Przegląd
W niniejszym filmie zaprezentowano metodę wywoływania pęcherzy ssących w skórze, która umożliwia pozyskiwanie specyficznych dla antygenu limfocytów T oraz cytokin in vivo. Technika ta jest szczególnie przydatna w badaniu adaptacyjnych odpowiedzi odpornościowych u ludzi, na przykład podczas opracowywania szczepionek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Immunologia
- Adaptacyjna odpowiedź immunologiczna
- Opracowywanie szczepionek
Wstęp
- Metoda pęcherzyka ssącego stanowi nieinwazyjny sposób badania odpowiedzi immunologicznych.
- Umożliwia ona pobieranie limfocytów T bezpośrednio z miejsca reakcji odpornościowej.
- PPD jest wykorzystywany jako antygen przypominający do oceny pamięci immunologicznej.
- Metoda ta może pomóc w zrozumieniu komórkowych mechanizmów odporności.
Cel badania
- Zaprezentowanie techniki pęcherzyków ssących do pozyskiwania komórek odpornościowych.
- Analiza odpowiedzi limfocytów T specyficznych dla antygenu u ludzi.
- Dostarczenie praktycznego przewodnika po wdrażaniu tej metody w badaniach.
Zastosowane metody
- Wstrzyknięcie PPD do warstwy skórnej skóry.
- Indukcja pęcherzy ssących w celu zebrania limfocytów T i cytokin.
- Pomiar reakcji skórnych po wstrzyknięciu.
- Pozyskiwanie płynu z pęcherzy do dalszej analizy.
Główne wyniki
- Wykazano skuteczną indukcję pęcherzy wysyskowych.
- Pozyskane limfocyty T oraz cytokiny mogą być analizowane in vitro.
- Ustanowiono przejrzystą metodologię pomiaru odpowiedzi odpornościowych.
- Wykazano bezpieczeństwo i skuteczność techniki pęcherzy wysyskowych.
Wnioski
- Metoda pęcherzyków ssących jest skuteczna w badaniu odporności adaptacyjnej.
- Technika ta może wspomagać badania i rozwój szczepionek.
- Stanowi ona cenne narzędzie do badań immunologicznych u ludzi.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla sektora przemysłowego
Badanie odpowiedzi przypominających limfocytów T u ludzi in vivo dostarcza kluczowych informacji mechanistycznych dla opracowywania szczepionek oraz walidacji celów immunoterapii. Metoda skórnej odpowiedzi przypominającej z wykorzystaniem pęcherza ssącego umożliwia bezpośredni dostęp do antygenowo swoistych limfocytów T oraz mikrośrodowisk cytokinowych w miejscu reakcji immunologicznej, co wspiera przedkliniczną redukcję ryzyka w przypadku czynników celujących w limfocyty T. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną na wczesnym etapie odkrywania leków poprzez powiązanie wyników ex vivo z biologią człowieka in vivo.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez izolację antygenowo specyficznych wielofunkcyjnych limfocytów T CD4+ bezpośrednio z ludzkiej tkanki.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez funkcjonalną walidację celów limfocytów T w systemie istotnym dla przebiegu choroby.
- Wartość strategiczna: Ułatwia identyfikację wiodących kandydatów poprzez dostarczenie wysokiej frakcji antygenowo specyficznych komórek do przesiewu mechanistycznego.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych do standaryzacji dalszych analiz z wykorzystaniem odczytów multipleksowych oraz cytometrii przepływowej.
- Wartość operacyjna: Dostarczanie ilościowych, powtarzalnych wyników produkcji cytokin oraz funkcjonalności limfocytów T ex vivo.
- Wartość strategiczna: Umożliwienie skalowalnego ponownego wykorzystania platformy do oceny wpływu związków na odpowiedzi ludzkich limfocytów T pamięci.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wykazuje istotność w kontekście choroby poprzez zastosowanie ludzkiego modelu pamięci immunologicznej po szczepieniu BCG w odpowiedzi na tuberkulinę, co jest zgodne z translacyjnymi strategiami poszukiwania biomarkerów.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną dzięki rejestracji profili centralnych i efektorowych limfocytów T pamięci generowanych in vivo.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu z uwzględnieniem analizy ryzyka poprzez ograniczanie niejednoznaczności mechanistycznej w badaniach nad odpornością komórkową.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w proces odkrywania nowych leków, od weryfikacji hipotez we wczesnej fazie badań, przez identyfikację wiodących cząsteczek, aż po walidację przedkliniczną, w szczególności w przypadku terapii modulujących limfocyty T oraz kandydatów na szczepionki.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez pozyskiwanie klonalnie rozszerzonych, zróżnicowanych limfocytów T z miejsca reakcji immunologicznej.
- Screening: Zapewnia gotowość do przeprowadzania analiz dzięki standaryzowanym protokołom indukcji pęcherzy i pobierania płynu, co pozwala na uzyskanie spójnej żywotności komórek do dalszych analiz.
- Analityka: Umożliwia ilościowe pomiary częstotliwości występowania limfocytów T specyficznych dla antygenu oraz polifunkcyjnych profili cytokin (np. IFN-γ, TNF-α, IL-2) w celu porównawczej oceny warunków.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną, wykazując, w jaki sposób komórki pochodzące z pęcherzy ssących odzwierciedlają długotrwałe odpowiedzi pamięciowe generowane in vivo.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy powtarzalną możliwość badania ludzkiej odporności adaptacyjnej w ramach programów szczepionkowych i immunoterapii.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna, walidacja celu, redukcja niejednoznaczności mechanistycznej w odpowiedziach odpornościowych człowieka.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność izolacji antygenowo specyficznych limfocytów T ze skóry ludzkiej.
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje typu go/no-go, efektywność kapitałowa i zredukowane ryzyko biologiczne na późnych etapach rozwoju immunoterapii.
- Wpływ na portfolio: Decyzje o priorytetyzacji i rozwoju skorygowane o ryzyko, oparte na danych o odpowiedzi odpornościowej istotnych dla człowieka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w badaniach z udziałem ochotników, skórnym podawaniu antygenów oraz technikach indukowania pęcherzy ssących.
- Wymagana jest regulowana pompa próżniowa (–20 do –40 kPa), sterylne strzykawki, antygen PPD oraz sprzęt do wirowania w celu przetwarzania komórek.
- Wymaga ujednolicenia protokołów pomiaru pęcherzy, pobierania materiału i przenoszenia płynów pomiędzy zespołami immunologicznymi i klinicznymi.
- Obejmuje kwestie adaptacji dla różnych modeli antygenowych i miejsc reakcji skórnych, przy jednoczesnym zachowaniu stałych gradientów podciśnienia.
- Uwzględnia ograniczenia praktyczne, takie jak zmienna wydajność komórkowa (15 000–200 000 komórek/pęcherz) oraz zależność od istniejącej pamięci immunologicznej ochotników.
