Name: Protokół blistra ssącego do badania reakcji przywołania ludzkich limfocytów T in vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: Poznaj metodę ssącego blistra skórnego do pobierania antygenspecyficznych limfocytów T i cytokin in vivo. Ta nieinwazyjna technika umożliwia badanie odpowiedzi immunologicznej człowieka w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Chcielibyśmy podziękować Madsowi Radmerowi Jensenowi za jego praktyczne i akademickie rady; Lau Lindqvist i Kaare Svejstrup za dostarczenie fachowej wiedzy technicznej; Helene Bæk Juel, Jonathanowi Filskovowi, Signe T. Schmidt i Solveig W. Harpøth za pomoc techniczną; personelowi poradni gruźliczej w Gentofte w celu odbycia szkolenia w zakresie podawania PPD; oraz wszystkim ochotnikom do udziału w badaniu. Projekt ten jest finansowany przez Komisję Europejską w ramach programu H2020 [numer grantu TBVAC2020 643381], a partnerom konsorcjum serdecznie dziękujemy za owocne dyskusje.

Wszystkie opisane poniżej metody, w tym wykorzystanie ochotników, zostały zatwierdzone przez Duński Komitet Etyki Badań Zdrowotnych (H-15002988) oraz Duńską Agencję Ochrony Danych (jr.nr. 2015-57-0102). PPD musi być certyfikowanym produktem dopuszczonym do stosowania u ludzi i podawanym w odpowiedniej dawce dostarczonej przez producenta. Wszelkie odchylenia w dawkowaniu lub podawaniu mogą wymagać dodatkowych zgód etycznych, a ochotnicy muszą wyrazić świadomą zgodę.
1. Test skórny tuberkuliny
<ol>
	<li>Uzyskaj ustną i pisemną świadomą zgodę od wolontariusza. Przed wstrzyknięciem należy upewnić się, że ochotnik rozumie i akceptuje procedurę, w tym możliwe działania niepożądane. 
	UWAGA: Kryteria włączenia specyficzne dla tego protokołu to wiek > 18 lat i udokumentowane szczepienie BCG. Kryteria włączenia mogą się różnić w zależności od pytania badawczego (tj. dodatkowym kryterium włączenia mogą być dowody na dodatnie TST).</li>
	<li>Należy użyć gotowego roztworu PPD do stosowania u ludzi [20 jednostek tuberkulinowych (TU)/ml]. Zdezynfekować gumowe wieczko fiolki za pomocą wacika nasączonego alkoholem.</li>
	<li>Przygotować miejsce wstrzyknięcia
	<ol>
		<li>Zlokalizuj miejsce wstrzyknięcia po brzusznej stronie przedramienia ochotnika.</li>
		<li>Połóż rękę dłonią do góry na gładkiej powierzchni i wybierz obszar w górnej jednej trzeciej przedramienia, około 5-10 cm od stawu łokciowego. Trzymaj się z dala od blizn, żył lub uszkodzonej skóry.</li>
		<li>Zdezynfekuj obszar za pomocą wacika nasączonego alkoholem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie roztworu PPD
	<ol>
		<li>Użyj sterylnej strzykawki o pojemności 1 ml ze stałą igłą o gramaturze 27 - 30 G/krótką (np. 12 mm).</li>
		<li>Delikatnie wymieszaj i zaaspiruj 0,1 ml roztworu PPD. Upewnij się, że nie ma widocznych bąbelków.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Śródskórne wstrzyknięcie PPD 
	UWAGA: W tym kroku opisano, jak wykonać pojedyncze osadzanie PPD, ale możliwe jest wielokrotne osadzanie PPD w tym samym ramieniu. Może to jednak wymagać szczególnej zgody etycznej.
	<ol>
		<li>Rozciągnąć skórę i skierować igłę pod kątem 5 - 15° do skóry, skosem skierowanym do góry.</li>
		<li>Włóż końcówkę igły w warstwę skórną skóry i upewnij się, że końcówka jest prawie widoczna przez naskórek.</li>
		<li>Powoli wstrzyknąć 0,1 ml roztworu PPD. 
		UWAGA: Przy prawidłowym podaniu natychmiast pojawi się blada grudka o wielkości 6 - 10 mm. Grudka znika po około 10 minutach.</li>
		<li>W przypadku wykonywania dwóch lub więcej osadów należy dążyć do maksymalnego odstępu (5 - 10 cm) od miejsc wstrzyknięcia, zachowując odpowiednią odległość od okolicy łokcia i nadgarstka. 
		UWAGA: Zapobiega to potencjalnemu zbieganiu się odpowiedzi testu skórnego i umożliwia nieprzerwane ustawienie dwóch komór ssących.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Ocena reakcji skórnej - Dzień 3
<ol>
	<li>Po 48 - 72 godzinach zwróć uwagę na wielkość reakcji skórnej. Zmierz stwardnienie (obrzęk), a nie rumień (zaczerwienienie) reakcji.</li>
	<li>Palcami obmacać twardy obrzęk, a następnie zaznaczyć krawędzie stwardnienia za pomocą długopisu. Użyj linijki, aby zmierzyć średnicę stwardnienia i zanotuj wynik w mm. 
	UWAGA: Odczyt wielkości stwardnienia może pomóc w wyborze średnicy otworu komory ssącej.</li>
</ol>
3. Indukcja pęcherza ssącego - Dzień 7
<ol>
	<li>Zamontuj jednostkę ssącą. 
	Uwaga: Urządzenia ssące to pompy próżniowe z dołączonymi komorami do indukcji pęcherza ssącego. Urządzenie użyte w tej demonstracji jest wykonane na zamówienie, ale na rynku dostępne są również urządzenia ssące. Pompa musi być regulowana w zakresie od -20 do -40 kPa i zapewniać stałe i niezawodne podciśnienie. Przed przeprowadzeniem eksperymentów z użyciem tej metody należy uzyskać regionalną zgodę etyczną.
	<ol>
		<li>Najpierw przygotuj komorę ssącą, montując dolną kryzę i płytę okienka z komorą i wężem łączącym. Mocno przymocuj wąż łączący komorę do pompy próżniowej. 
		Uwaga: Komory powinny zawierać dolną płytkę z otworem do indukcji blistra, która powinna być przystosowana do kontaktu z ludzką skórą, oraz górną płytkę z okienkiem, pozwalającą na wizualne monitorowanie blistra.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Określ optymalną średnicę otworu płytki otworu w stosunku do wielkości reakcji skórnej; im większy rozmiar otworu, tym większy pęcherz.</li>
	<li>Zdezynfekuj kryzę i skórę ochotnika za pomocą wacików nasączonych alkoholem.</li>
	<li>Przymocuj komorę ssącą do skóry.
	<ol>
		<li>Upewnij się, że ręka wolontariusza wygodnie odpoczywa</li>.
		<li>Upewnij się, że otwór w dolnej płycie komory ssącej znajduje się nad reakcją PPD, tak aby widoczny był środek reakcji skórnej.</li>
		<li>Zabezpiecz komorę luźno za pomocą pasków: po zastosowaniu podciśnienia komora będzie przylegać do skóry i utrzymywać swoją pozycję.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Włącz urządzenie ssące i wyreguluj ciśnienie na -20 kPa.</li>
	<li>Po 30 minutach zwiększyć podciśnienie do -25 kPa.</li>
	<li>Po 60 minutach należy jeszcze bardziej zwiększyć podciśnienie do -30 kPa.</li>
	<li>Utrzymywać ciśnienie na poziomie -30 kPa aż do całkowitego uformowania się pęcherza. Upewnij się, że podciśnienia podane w tym protokole są specyficzne dla dostosowanego instrumentu. Może być konieczne nieznaczne dostosowanie ciśnienia podczas stosowania protokołu w innych ustawieniach. 
	UWAGA: Faza indukcji pęcherza trwa od 60 do 180 minut (1 - 3 h), przy czym rzeczywiste tworzenie się pęcherzy następuje w ciągu ostatnich 30 minut. Pęcherze często wiążą się ze swędzeniem. Blistry mogą występować jako pojedyncze lub wielokrotne łączące się blistry. Jeśli dojdzie do pęknięcia pęcherza lub krwotoku, zaleca się przerwanie indukcji pęcherza poprzez powolne zmniejszanie ciśnienia.</li>
	<li>Po całkowitym uformowaniu blistra zwolnij ciśnienie i ostrożnie wyjmij komorę ssącą ze skóry, nie rozrywając blistra.</li>
	<li>Nałóż miękki opatrunek na otaczającą skórę i umieść twardą nakrętkę (np. z plastikowej tubki o pojemności 50 ml) na blistrze .</li>
	<li>Zabezpiecz nakrętkę niealergiczną taśmą chirurgiczną, a następnie miękkim, rozciągliwym bandażem.</li>
	<li>Poinstruuj ochotnika, aby unikał nadmiernego wysiłku fizycznego w okolicy pęcherza przez następne 12 - 24 godziny.</li>
</ol>
4. Zbiór płynu do pęcherzy - Dzień 8
<ol>
	<li>W 8 dniu delikatnie zdjąć opatrunek ochronny i zdezynfekować blister sprayem do dezynfekcji skóry.</li>
	<li>Użyj sterylnej strzykawki o pojemności 2 ml z igłą 23G, aby pobrać zawartość blistra. Wbić igłę w górną/boczną stronę dachu blistra i powoli zassać płyn. Unikaj dotykania podłogi jamy, ale upewnij się, że zebrałeś cały płyn.</li>
	<li>Nałóż opatrunek na zapadnięty pęcherz</li>.
	<li>Przenieść płyn z blistra do sterylnej probówki. Zwróć uwagę na głośność.</li>
	<li>Odwirować płyn blistrowy o masie 600 x g za pomocą wirówki stołowej przez 4 minuty.</li>
	<li>Przenieść supernatant do innej probówki i ponownie zawiesić osad komórkowy w 500 μl pożywki komórkowej. 
	UWAGA: Komórki są teraz gotowe do zliczania i dalszej analizy. Supernatanty mogą być przechowywane w temperaturze od -20 do -80 °C do czasu użycia.</li>
</ol>
5. Analizy pęcherzy ssących i płynów
UWAGA: Dostarczanie instrukcji do analizy komórek i płynów uzyskanych z pęcherzy odsysających skórę nie wchodzi w zakres tego protokołu. Jednak w celu uzyskania reprezentatywnych wyników dla niniejszego raportu przeprowadzono wewnątrzkomórkową cytometrię przepływową i analizy multipleksowe. Metodologia została opisana pokrótce poniżej.
<ol>
	<li>Cytometria przepływowa
	<ol>
		<li>Stymulować zawiesiny 1 x 105 świeżych komórek wyizolowanych z pęcherzy ssących od 1 ochotnika zaszczepionego BCG z 10 μg/ml PPD i inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Dołącz niestymulowane komórki do równoległej inkubacji.</li>
		<li>Stymulować zawiesiny 1 x 106 PBMC otrzymanych od 1 ochotnika zaszczepionego BCG za pomocą 10 μg/ml PPD i inkubować mieszaninę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Dołącz niestymulowane komórki do równoległej inkubacji.</li>
		<li>Po 2 godzinach potraktować wszystkie komórki preparatem Brefaldin A i monenzyną i inkubować je przez 6 godzin w temperaturze 37°C.</li>
		<li>Zabarwić komórki panelem Live/Dead-stain-BV510, anty-CD4-AF780, anty-CD3-BV421, anty-CD8-PerCP-Cy5.5, anty-CCR7-PE, anty-CD45RA-BV786, anty-IFN-γ-AF700, anty-TNF-α-PE-Cy7 i anty-IL-2-FITC.</li>
		<li>Uwzględnij formanty FMO w panelu PBMC.</li>
		<li>Wykonaj analizę cytometrii przepływowej za pomocą cytometru przepływowego i przeanalizuj wyniki za pomocą odpowiedniego oprogramowania.</li>
		<li>Bramka na podzbiorach CD3 + CD4 + CD8- wytwarzających cytokiny przy użyciu następującej strategii bramkowania: singlelets - > żywotne CD3 + - > CD4 + CD8- - > IFN-γ+, TNF-α+ lub IL-2+.</li>
		<li>Bramka na populacjach komórek pamięci efektorowej przy użyciu następującej strategii bramkowania: singlelety - > żywotne CD3+ - > CD4+CD8- - > CCR7-CD45RA-.</li>
		<li>Obliczanie indywidualnych profili cytokin za pomocą bramkowania logicznego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Demonstracje uwalniania cytokin
	<ol>
		<li>Aby wykazać uwalnianie cytokin in vivo, należy użyć analizy multipleksowej w celu ilościowego określenia poziomów IL-2, IFN-γ, TNF-α, IL-10 i IL-13 w rozmrożonym płynie ssącym z blistra uzyskanym od 4 ochotników.</li>
		<li>W celu wykazania uwalniania cytokin przez komórki uzyskane z pęcherzy ssących ex vivo, należy użyć świeżych komórek pęcherza ssącego i PBMC uzyskanych od 1 ochotnika zaszczepionego BCG.</li>
		<li>Zainfekuj PBMC i odsysanie komórek pęcherza 100 jednostkami tworzącymi kolonie (CFU) Mtb H37Rv i inkubuj je przez 4 dni.</li>
		<li>Użyj analizy multipleksowej, aby określić ilościowo poziomy IL-2, IFN-γ, TNF-α, IL-10 i IL-13 we wszystkich supernatantach hodowlanych.</li>
		<li>Dostosuj pomiary powyżej zakresu obliczeń testu do górnej granicy obliczeń.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Kiistala, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suction+blister+device+for+separation+of+viable+epidermis+from+dermis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Suction blister device for separation of viable epidermis from dermis.</a> Journal of Investigative Dermatology. 50 (2), 129-137 (1968).</li>
<li>Akbar, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+cutaneous+response+to+recall+antigen+in+humans+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Immunology%22%5BJournal%5D)">Investigation of the cutaneous response to recall antigen in humans in vivo.</a> Clinical & Experimental Immunology. 173 (2), 163-172 (2013).</li>
<li>Hatje, L. K., Richter, C., Blume-Peytavi, U., Kottner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blistering+time+as+a+parameter+for+the+strength+of+dermoepidermal+adhesion%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Blistering time as a parameter for the strength of dermoepidermal adhesion: a systematic review and meta-analysis.</a> British Journal of Dermatology. 172 (2), 323-330 (2015).</li>
<li>Smith, T. J., Wilson, M. A., Young, A. J., Montain, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+suction+blister+model+reliably+assesses+skin+barrier+restoration+and+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A suction blister model reliably assesses skin barrier restoration and immune response.</a> Journal of Immunological Methods. 417, 124-130 (2015).</li>
<li>Maranda, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+management+of+leukoderma+after+burn%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Burns%3A+Journal+of+the+International+Society+of+Burn+Injuries%22%5BJournal%5D)">Surgical management of leukoderma after burn: A review.</a> Burns: Journal of the International Society of Burn Injuries. 44 (2), 256-262 (2017).</li>
<li>Wilhelm, K. P., Wilhelm, D., Bielfeldt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+wound+healing%3A+an+emphasis+on+clinical+studiea%5BTitle%5D)+AND+%22Skin+Research+and+Technology%3A+Official+Journal+of+the+International+Society+for+Bioengineering+and+the+Skin+%28ISBS%29+and+the+International+Society+for+Digital+Imaging+of+Skin+%28ISDIS%29+and+the+International+Society+for+Skin+Imaging+%28ISSI%29%22%5BJournal%5D)">Models of wound healing: an emphasis on clinical studiea.</a> Skin Research and Technology: Official Journal of the International Society for Bioengineering and the Skin (ISBS) and the International Society for Digital Imaging of Skin (ISDIS) and the International Society for Skin Imaging (ISSI). 23 (1), 3-12 (2017).</li>
<li>Maini, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comparison+of+Human+Neutrophils+Acquired+from+Four+Experimental+Models+of+Inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A Comparison of Human Neutrophils Acquired from Four Experimental Models of Inflammation.</a> PLoS ONE. 11 (10), (2016).</li>
<li>Kenney, R. T., Rangdaeng, S., Scollard, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+blister+immunocytology.+A+new+method+to+quantify+cellular+kinetics+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Skin blister immunocytology. A new method to quantify cellular kinetics in vivo.</a> Journal of Immunological Methods. 97 (1), 101-110 (1987).</li>
<li>Carvalho, J. C. O., Palero, J. A., Jurna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+suction+blistering+in+human+skin+using+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of suction blistering in human skin using optical coherence tomography.</a> Biomedical Optics Express. 6 (12), 4790-4795 (2015).</li>
<li>Belson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+the+clinical+and+activated+T+cell+response+to+repeat+delayed-type+hypersensitivity+skin+challenges+in+human+subjects%2C+with+KLH+and+PPD%2C+as+a+potential+model+to+test+T+cell-targeted+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammation+Research%3A+Official+Journal+of+the+European+Histamine+Research+Society+...+%5Bet+al.%5D%22%5BJournal%5D)">Characterisation of the clinical and activated T cell response to repeat delayed-type hypersensitivity skin challenges in human subjects, with KLH and PPD, as a potential model to test T cell-targeted therapies.</a> Inflammation Research: Official Journal of the European Histamine Research Society ... [et al.]. 65 (5), 389-404 (2016).</li>
<li>Vukmanovic-Stejic, M., Reed, J. R., Lacy, K. E., Rustin, M. H. A., Akbar, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mantoux+Test+as+a+model+for+a+secondary+immune+response+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Letters%22%5BJournal%5D)">Mantoux Test as a model for a secondary immune response in humans.</a> Immunology Letters. 107 (2), 93-101 (2006).</li>
<li>Thakur, A., Pedersen, L. E., Jungersen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+markers+and+correlates+of+protection+for+vaccine+induced+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Immune markers and correlates of protection for vaccine induced immune responses.</a> Vaccine. 30 (33), 4907-4920 (2012).</li>
<li>CDC. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22TB+%7C+Fact+Sheets+-+Tuberculin+Skin+Testing+for+TB%22">TB | Fact Sheets - Tuberculin Skin Testing for TB</a>. , 
 <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/tb/publications/factsheets/testing/skintesting.htm">https://www.cdc.gov/tb/publications/factsheets/testing/skintesting.htm</a> (2018).</li>
<li>Vukmanovic-Stejic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Varicella+Zoster-Specific+CD4%2BFoxp3%2B+T+Cells+Accumulate+after+Cutaneous+Antigen+Challenge+in+Humans%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Varicella Zoster-Specific CD4+Foxp3+ T Cells Accumulate after Cutaneous Antigen Challenge in Humans.</a> The Journal of Immunology. 190 (3), 977-986 (2013).</li>
<li>Reed, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+erosion+in+memory+T+cells+induced+by+telomerase+inhibition+at+the+site+of+antigenic+challenge+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Telomere erosion in memory T cells induced by telomerase inhibition at the site of antigenic challenge in vivo.</a> The Journal of Experimental Medicine. 199 (10), 1433-1443 (2004).</li>
<li>Tatovic, D., Young, P., Kochba, E., Levin, Y., Wong, F. S., Dayan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine-Needle+Aspiration+Biopsy+of+the+Lymph+Node%3A+A+Novel+Tool+for+the+Monitoring+of+Immune+Responses+after+Skin+Antigen+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Fine-Needle Aspiration Biopsy of the Lymph Node: A Novel Tool for the Monitoring of Immune Responses after Skin Antigen Delivery.</a> The Journal of Immunology. 195 (1), 386-392 (2015).</li>
<li>Bond, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmacytoid+dendritic+cells+infiltrate+the+skin+in+positive+tuberculin+skin+test+indurations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Plasmacytoid dendritic cells infiltrate the skin in positive tuberculin skin test indurations.</a> Journal of Investigative Dermatology. 132 (1), 114-123 (2012).</li>
<li>Bell, L. C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Molecular+Dissection+of+the+Effects+of+HIV-1+in+Active+Tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">In Vivo Molecular Dissection of the Effects of HIV-1 in Active Tuberculosis.</a> PLoS Pathogens. 12 (3), e1005469(2016).</li>
<li>Tomlinson, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+profiling+of+innate+and+adaptive+human+immune+responses+to+mycobacteria+in+the+tuberculin+skin+test%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Transcriptional profiling of innate and adaptive human immune responses to mycobacteria in the tuberculin skin test.</a> European Journal of Immunology. 41 (11), 3253-3260 (2011).</li>
<li>Nayak, S., Acharjya, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mantoux+test+and+its+interpretation%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Dermatology+Online+Journal%22%5BJournal%5D)">Mantoux test and its interpretation.</a> Indian Dermatology Online Journal. 3 (1), 2-6 (2012).</li>
<li>Vukmanovic-Stejic, M., Reed, J. R., Lacy, K. E., Rustin, M. H. A., Akbar, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mantoux+Test+as+a+model+for+a+secondary+immune+response+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Letters%22%5BJournal%5D)">Mantoux Test as a model for a secondary immune response in humans.</a> Immunology Letters. 107 (2), 93-101 (2006).</li>
<li>Menzies, D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9872812">Interpretation of Repeated Tuberculin Tests.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 159 (1), 15-21 (1999).</li>
<li>Pitzalis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+migration+of+the+human+helper-inducer+memory+T+cell+subset%3A+confirmation+by+in+vivo+cellular+kinetic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Selective migration of the human helper-inducer memory T cell subset: confirmation by in vivo cellular kinetic studies.</a> European Journal of Immunology. 21 (2), 369-376 (1991).</li>
<li>Kool, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suction+blister+fluid+as+potential+body+fluid+for+biomarker+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Suction blister fluid as potential body fluid for biomarker proteins.</a> Proteomics. 7 (20), 3638-3650 (2007).</li>
<li>Flynn, J. L., Chan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunology+of+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunology of tuberculosis.</a> Annual Review of Immunology. 19, 93-129 (2001).</li>
<li>Kagina, B. M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+T+cell+frequency+and+cytokine+expression+profile+do+not+correlate+with+protection+against+tuberculosis+after+bacillus+Calmette-Gu%C3%A9rin+vaccination+of+newborns%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Specific T cell frequency and cytokine expression profile do not correlate with protection against tuberculosis after bacillus Calmette-Guérin vaccination of newborns.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 182 (8), 1073-1079 (2010).</li>
<li>García-Basteiro, A. L., Ruhwald, M., Lange, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+tuberculosis+vaccine+trials+under+financial+constraints%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Vaccines%22%5BJournal%5D)">Design of tuberculosis vaccine trials under financial constraints.</a> Expert Review of Vaccines. 15 (7), 799-801 (2016).</li>
<li>Luabeya, A. K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First-in-human+trial+of+the+post-exposure+tuberculosis+vaccine+H56%3AIC31+in+Mycobacterium+tuberculosis+infected+and+non-infected+healthy+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">First-in-human trial of the post-exposure tuberculosis vaccine H56:IC31 in Mycobacterium tuberculosis infected and non-infected healthy adults.</a> Vaccine. 33 (33), 4130-4140 (2015).</li>
<li>Tameris, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+candidate+TB+vaccine%2C+MVA85A%2C+induces+highly+durable+Th1+responses%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">The candidate TB vaccine, MVA85A, induces highly durable Th1 responses.</a> PloS One. 9 (2), e87340(2014).</li>
<li>Woodworth, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit+vaccine+H56%2FCAF01+induces+a+population+of+circulating+CD4+T+cells+that+traffic+into+the+Mycobacterium+tuberculosis-infected+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Subunit vaccine H56/CAF01 induces a population of circulating CD4 T cells that traffic into the Mycobacterium tuberculosis-infected lung.</a> Mucosal Immunology. 10 (2), 555-564 (2016).</li>
<li>Gideon, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variability+in+tuberculosis+granuloma+T+cell+responses+exists%2C+but+a+balance+of+pro-+and+anti-inflammatory+cytokines+is+associated+with+sterilization%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Variability in tuberculosis granuloma T cell responses exists, but a balance of pro- and anti-inflammatory cytokines is associated with sterilization.</a> PLoS Pathogens. 11 (1), e1004603(2015).</li>
<li>Ruhwald, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+efficacy+of+the+C-Tb+skin+test+to+diagnose+Mycobacterium+tuberculosis+infection%2C+compared+with+an+interferon+%CE%B3+release+assay+and+the+tuberculin+skin+test%3A+a+phase+3%2C+double-blind%2C+randomised%2C+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Respiratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Safety and efficacy of the C-Tb skin test to diagnose Mycobacterium tuberculosis infection, compared with an interferon γ release assay and the tuberculin skin test: a phase 3, double-blind, randomised, controlled trial.</a> The Lancet Respiratory Medicine. 5 (4), 259-268 (2017).</li>
<li>He, X., de Oliveira, V. L., Keijsers, R., Joosten, I., Koenen, H. J. P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+Isolation+from+Human+Skin+for+Phenotypic+Analysis+and+Ex+Vivo+Cell+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (110), e52564(2016).</li>
<li>Koskela, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blister+fluid+and+serum+cytokine+levels+in+severe+sepsis+in+humans+reflect+skin+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Anaesthesiologica+Scandinavica%22%5BJournal%5D)">Blister fluid and serum cytokine levels in severe sepsis in humans reflect skin dysfunction.</a> Acta Anaesthesiologica Scandinavica. 61 (1), 53-61 (2017).</li>
<li>Wada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+skin+blister+fluids+from+children+with+Epstein-Barr+virus-associated+lymphoproliferative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Characterization of skin blister fluids from children with Epstein-Barr virus-associated lymphoproliferative disease.</a> The Journal of Dermatology. 45 (4), 444-449 (2018).</li>
<li>Andersson, C., Rajala, T., Särkkä, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+models+for+epidermal+nerve+fiber+data%5BTitle%5D)+AND+%22Statistics+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hierarchical models for epidermal nerve fiber data.</a> Statistics in Medicine. 37 (3), 357-374 (2018).</li>
<li>Ramshanker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Prednisolone+on+Serum+and+Tissue+Fluid+IGF-I+Receptor+Activation+and+Post-Receptor+Signaling+in+Humans%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Endocrinology+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Effects of Prednisolone on Serum and Tissue Fluid IGF-I Receptor Activation and Post-Receptor Signaling in Humans.</a> The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 102 (11), 4031-4040 (2017).</li>
<li>Bouma, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCL20+neutralization+by+a+monoclonal+antibody+in+healthy+subjects+selectively+inhibits+recruitment+of+CCR6%2B+cells+in+an+experimental+suction+blister%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Clinical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">CCL20 neutralization by a monoclonal antibody in healthy subjects selectively inhibits recruitment of CCR6+ cells in an experimental suction blister.</a> British Journal of Clinical Pharmacology. 83 (9), 1976-1990 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Niniejszy manuskrypt opisuje praktyczną procedurę badania odpowiedzi ludzkiej pamięci immunologicznej in vivo, wykorzystującą przywoływanie antygenu skórnego i pobieranie komórek przez indukcję pęcherzy ssących. TST wykorzystano jako przykład śródskórnego odkładania antygenu i wycofania szczepionki BCG. Na koniec przedstawiono przykład charakterystyki próbki SB za pomocą cytometrii przepływowej i analizy cytokin multipleksowych, wykazując, że około jedna trzecia komórek SB to specyficzne dla antygenu wielofunkcyjne limfocyty T fenotypu pamięci efektorowej.
Kluczowe etapy tego protokołu obejmują technikę wstrzyknięcia śródskórnego, indukcję pęcherza ssącego i nakłucie blistra. Po pierwsze, prawidłowe osadzanie śródskórne wymaga przeszkolonego personelu. Nieprawidłowe osadzanie może prowadzić do nieoptymalnych wyników. PPD jest ogólnie dobrze znanym i bezpiecznym antygenem skórnym, ale jego skład może się różnić w zależności od producenta, co ogranicza porównywalność 13,20. Niniejszy raport zawiera instrukcje dotyczące pojedynczego osadzania śródskórnego 2 TU i opcjonalnie dwóch równoległych osadzania (2 x 2 TU), które mogą wymagać dodatkowego zatwierdzenia etycznego. Jednak w innych badaniach stosowano 10 TU, które zwiększają prawdopodobieństwo wystąpienia silnej reakcji skórnej10,21. Podczas etapu indukcji SB niewielki stopniowy wzrost podciśnienia zmniejszy ryzyko krwotoku i pęknięcia pęcherza. Szanse na zanieczyszczenie krwinkami czerwonymi lub leukocytami z krwiobiegu są na ogół niskie2. Technika aseptycznego nakłuwania zapobiega skażeniu mikrobiologicznemu, a unikanie kontaktu między igłą do nakłuwania a dnem pęcherza skórnego zmniejsza zanieczyszczenia zanieczyszczeń lub zalegających komórek skóry. Jednak niektórzy badacze wolą zbierać płyn SB poprzez wywieranie nacisku na przebity pęcherz10. Może być konieczne nakłucie przegród w blistrze. Sama technika SB jest minimalnie inwazyjna; Zapadnięte SB goją się bez blizn, a infekcje są bardzo rzadkie. 2 Jednak może wystąpić pewien stopień hipopigmentacji i prawdopodobnie należy unikać indukcji SB u osób z historią bliznowacenia koloidalnego.
Ograniczenia techniczne obejmują niską całkowitą wydajność komórek, a co za tym idzie ograniczone możliwości długoterminowego przechowywania. Zależności między wydajnością leukocytów, klinicznymi odpowiedziami TST, rozmiarem pęcherza i zanieczyszczeniem erytrocytów zostały dokładnie opisane w innym miejscu 2,10. W przedstawionych tutaj eksperymentach BCG-recall (ryc. 1) mediana całkowitej wydajności z każdego blistra wynosiła 50 000, co sugeruje eksperyment na małą skalę z użyciem tych komórek, zwłaszcza jeśli SBC są badanesamodzielnie15. Jednak specyficzna populacja limfocytów T w próbce SB w większości przekracza to, co znajduje się w próbkach PBMC zarówno pod względem względnej, jak i bezwzględnej liczby komórek. W przykładzie przedstawionym na rysunku 2 liczba potrójnie dodatnich limfocytów T specyficznych dla PPD w próbce 100 000 komórek SB była ponad 2 razy większa niż liczba stwierdzona w 1 x 106 PBMC od tego samego dawcy (dane nie pokazane). Wizualna ocena reakcji TST jest najpowszechniejszą metodą kliniczną oceny pamięci M. tuberculosis. Warto zauważyć, że podstawowa adaptacyjna reakcja immunologiczna nie osiąga szczytu w tym samym czasie, co kliniczna reakcja skórna 2,21. Nie u wszystkich osób zaszczepionych BCG lub narażonych na Mtb rozwiną się silne reakcje TST i strategie klasyfikacji, a postępowanie z próbkami od osób niereagujących na TST, a także wcześniejsze uczulenie na prątki w badanej populacji, muszą być brane pod uwagę przed rozpoczęciem badania wycofania przy użyciu tej metody. Ponadto, zarówno w próbkowaniu SB, jak i ocenie wizualnej, istnieje możliwość teoretycznego błędu systematycznego u osób ze zmniejszoną reakcją skórną z powodu globalnej lub związanej ze skórą upośledzenia odporności, co obserwuje się na przykład w zakażeniu wirusem HIV i niektórych grupach wiekowych 2,13,18,20. Ponadto dobrze znane jest immunologiczne wzmocnienie reakcji TST za pomocą wielokrotnych testów20,22. Jednak fenotypy komórek SB pozostają raczej stałe, gdy TST są powtarzane10. Obserwacja ta potwierdza rolę przypominania SB w badaniach podłużnych komórkowych odpowiedzi immunologicznych.
W przypadku immunologów z komórek T wycofanie SB pozwala na pobranie dużych frakcji komórek specyficznych dla antygenu. Jednak czas SB dla próbki z osadzania PPD ma kluczowe znaczenie, ponieważ zarówno skład komórkowy, jak i mikrośrodowisko cytokin zmieniają się w czasie. W tym protokole pęcherze indukowano 7 dni po prowokacji, a izolowane komórki były głównie limfocytami T pamięci efektorowej CD4 +, w tym wysokimi frakcjami komórek z koekspresją IFN-γ, TNF-α i IL-2. Obserwacje te są zgodne z wcześniejszymi badaniami opisującymi, w jaki sposób aktywacja, proliferacja i różnicowanie limfocytów T zachodzi w skórze przygotowanej PPD 2,15,21. Kinetyczne badania SB u osób uczulonych na PPD sugerują, że bardzo wczesna reakcja skóry jest niespecyficzna; jednak już w ciągu pierwszych dni po prowokacji PPD odpowiedź zostaje zdominowana przez limfocyty T CD4 + (opisano zarówno fenotypy pamięci centralnej, jak i pamięci efektorowej), a po 3 dniach odpowiedź jest zdominowana przez wysokie frakcje cytokin specyficznych dla PPD wytwarzających limfocyty T CD4 + 2,8,10,15,21. Ta adaptacyjna odpowiedź cytokin pozostaje wykrywalna przez ponad 2 tygodnie 2,8,10,23. Dzień 7 po TST wydaje się być najbardziej optymalnym punktem czasowym dla zbierania limfocytów T pamięci CD4 +wytwarzających cytokiny 2. Jednak inne punkty czasowe mogą być oczywiście istotne w zależności od antygenu i odpowiedzi będącej przedmiotem zainteresowania. Warto zauważyć, że w jednym z badań stwierdzono, że adaptacyjna odpowiedź PPD osiąga szczyt nieco wcześniej ze spadkiem wydzielania cytokin prozapalnych już 5 dni po TST10.
Płyn SB zawiera wysoki poziom zarówno cytokin prozapalnych, jak i innych białek, które okazały się reprezentatywne dla mikrośrodowiska skóry15,24. Badania kinetyczne wykazały, że poziomy TNF-α i IFN-γ w płynie SB osiągają szczyt po 3 dniach, podczas gdy poziomy IL-2 osiągają szczyt po 7 dniach 2,10, co prawdopodobnie odzwierciedla dominację reakcji adaptacyjnych na tym późniejszym etapie. Ponieważ komórki SB zostały aktywowane in vivo, wykazują wysokie spontaniczne uwalnianie cytokin, a także potencjał do specyficznego uwalniania po ponownej stymulacji (ryc. 3 i 4).
Niniejszy raport koncentruje się na odporności limfocytów T CD4 +. Jak wykazano na rycinie 2, większość izolowanych limfocytów T była rzeczywiście CD4 +, podczas gdy w płynie ssącym nie było prawie żadnych limfocytów T CD8 +. Jest to zgodne z innymi badaniami SB PPD-recall wykazującymi niskie proporcje i gorszą zdolność migracyjną limfocytów T CD8 + w porównaniu z limfocytami T CD4 + 2,8,10,23. Preferowana byłaby dalsza charakterystyka wkładu CD8+; Wykracza to jednak poza zakres niniejszego sprawozdania.
Limfocyty T są uważane za niezbędne do kontroli immunologicznej Mtb; Jednak trudno było zidentyfikować wiarygodny korelat ochrony odzwierciedlonej w adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej z krwi25,26. Ta przeszkoda poważnie utrudnia opracowywanie nowych szczepionek przeciwko gruźlicy, ponieważ obecnie nie ma alternatywy dla dużych i bardzo kosztownych badań klinicznych nad skutecznością27. Twórcy szczepionki przeciw gruźlicy określają immunogenność szczepionki, oceniając małe i przejściowe zmiany w populacjach limfocytów T specyficznych dla szczepionkiwe krwi 28,29. Wątpliwe jest jednak, czy niewielka frakcja krążących limfocytów T specyficznych dla antygenu znajdująca się we krwi jest istotna (tj. zdolna do migracji do miejsca infekcji i reprezentatywna dla bogatego w limfocyty T mikrośrodowiska kontrolującego Mtb)27,30,31.
Opierając się na wcześniejszych badaniach i danych przedstawionych w niniejszym dokumencie, model przypominania skóry SB stanowi niewykorzystany potencjał w badaniu limfocytów T specyficznych dla szczepionki. Model ten nie tylko umożliwia przypomnienie sobie odpowiedzi na szczepionkę wygenerowanej kilkadziesiąt lat temu, ale także umożliwia ocenę prawdziwego potencjału pamięciowego w kontekście specyficznym dla tkanki 15,18,19,21. Nowatorskie, specyficzne testy skórne, które obejmują antygeny składające się również z kandydujących podjednostek szczepionek przeciw gruźlicy, sugerują nowe możliwości oceny szczepionek przy użyciu tego modelu28,32. Co więcej, analizy transkryptomiczne sugerują, że komórkowa odpowiedź immunologiczna generowana w skórze z prowizją PPD jest podobna do odpowiedzi znalezionej w płucu18 zakażonym Mtb.
Podczas gdy biopsje stemplujące skórę pozwalają również na pobranie komórek ze skóry i dostarczają informacji przestrzennych, w porównaniu z próbkowaniem SB, metoda ta jest bardziej inwazyjna i wymaga przetwarzania enzymatycznego lub mechanicznego w celu przygotowania zawiesin jednokomórkowych33. Pomiary cytokin i markerów komórkowych są porównywalne między tymi dwiema metodami 2,10.
Metoda blistrów ssących została już zastosowana w wielu dziedzinach badań medycznych poza dermatologią, samodzielnie lub w połączeniu z ogólnoustrojowym lub miejscowym wyzwaniem skórnym. Przykłady obejmują badania nad sepsą, chorobą limfoproliferacyjną związaną z wirusem Epsteina-Barr, neuropatią cukrzycową, wpływem glikokortykosteroidów na spożycie oraz badaniami na ludziach testującymi przeciwciała terapeutyczne lub modele terapii ukierunkowanych na limfocyty T 10,34,35,36,37,38.
Z terapeutycznego punktu widzenia, metoda przypominania skórnego SB oferuje wyjątkowe korzyści w badaniu potencjału pamięci centralnych limfocytów T i - zarówno z biologicznego, jak i technicznego punktu widzenia - skóra wydaje się zapewniać odpowiedni przedział do pobierania próbek 2,15,18,19,21 . W szczególności, w porównaniu z tradycyjnym, biernym pobieraniem próbek krążących PBMC, metoda przypominania skórnego SB pozwala na badanie limfocytów T, które udowodniły zdolność do migracji z węzła chłonnego w odpowiedzi na odpowiedni antygen i zakończenia lokalnej ekspansji i różnicowania w specyficznym dla tkanki kontekście in vivo 15,18,19,21.
Podsumowując, zademonstrowany tutaj model może być istotny dla badaczy zajmujących się ludzką odpornością adaptacyjną i czynnikami ukierunkowanymi na limfocyty T (tj. w wakcynologii chorób zakaźnych lub badaniach nad rakiem). Model TST zastosowany w tym protokole ma oczywiście szczególne znaczenie w dziedzinie wakcynologii gruźlicy. Jednak podstawowa koncepcja tego modelu ma szerokie zastosowanie w innych dziedzinach badań.

Skóra SB to sztucznie wywołany pęcherz, który pozwala na pobieranie komórek i płynów bezpośrednio ze skóry. Technika podnoszenia SB za pomocą próżni jest dobrze znanym narzędziem w dziedzinie dermatologii używanym do badania immunologii skóry w zdrowiu i chorobie1,2,3,4,5,6,7,8. Niniejszy raport pokazuje, w jaki sposób technika SB w połączeniu ze skórnym przypominaniem antygenowym (metoda przypominania skórnego SB) może zapewnić bezpośredni wgląd w adaptacyjne odpowiedzi immunologiczne in vivo.
Zasada stojąca za indukcją SB jest prosta: lekka próżnia jest stosowana na małym obszarze skóry. Podciśnienie ostatecznie zmusi naskórek do oddzielenia się od skóry właściwej, tworząc miejscowy pęcherz wypełniony płynem i komórkami1,2,9. Płyn z pęcherzy można pobrać za pomocą aspiracji cienkoigłowej, a jego zawartość można wykorzystać do dalszych badań in vitro.
W ostatnich latach obserwuje się rosnące zainteresowanie metodą SB do badania in vivo odpowiedzi immunologicznych innych niż choroby ograniczone do skóry10,11. Badania nad odpornością nabytą u ludzi są ograniczone przez fakt, że interesujące nas komórki i cytokiny są pobierane z krwi obwodowej, ponieważ inwazyjne pobieranie próbek z węzła chłonnego lub tkanki błony śluzowej przewodu pokarmowego może być niedopuszczalne i nieetyczne. Przykładem jest badanie długowiecznych odpowiedzi limfocytów T ludzkiej pamięci po szczepieniu12. W takich badaniach pobieranie próbek odpowiednich limfocytów T może być dużym wyzwaniem, ponieważ odpowiednia populacja komórek pośredniczących w odporności znajduje się w tkance limfatycznej, a tylko bardzo ograniczona liczba specyficznych limfocytów T krąży we krwi obwodowej.
Technika SB oferuje unikalną okazję do badania limfocytów T pamięci i innych specyficznych populacji komórek. Po skórnym zaszczepieniu antygenu, limfocyty T specyficzne dla antygenu są rekrutowane z ich kryjówek limfatycznych do skóry i można je łatwo pobrać z SB. Metodologia i zastosowania badawcze tego skórnego modelu przypominania zostały opisane przez Akbara i wsp. w 20132. Powszechnie stosowanym antygenem do przywoływania skóry jest dostępna na rynku oczyszczona pochodna białkowa (PPD) prątków używana do przeprowadzania tuberkulinowego testu skórnego (TST)13, gdzie PPD jest wstrzykiwany do warstwy skórnej skóry. U osób z istniejącą pamięcią immunologiczną w kierunku PPD [np. osoby z zakażeniem Mycobacterium tuberculosis (Mtb) lub wcześniejszym szczepieniem przeciwko Bacillus Calmette-Guérin (BCG)], depozycja antygenu powoduje reakcję przywoławczą z migracją do skóry i klonalną ekspansją in vivo limfocytów T CD4+ specyficznych dla PPD2,11,14,15. W rezultacie, w skórze gromadzą się wysokie frakcje polifunkcyjnych limfocytów T CD4+ specyficznych dla PPD, gotowych do pobrania próbki SB. Limfocyty T pobrane tą metodą okazały się wytrzymałe i są wystarczająco liczne, aby można je było scharakteryzować za pomocą szeregu testów immunologicznych i długoterminowej hodowli in vitro15. W związku z tym model przypominania skórnego i indukcja SB mogą okazać się cenną metodą badania odpowiedzi limfocytów T in vivo za pomocą analiz ex vivo, a zwiększona wiedza na temat tego podejścia może przynieść korzyści naukowcom zainteresowanym immunologią komórkową i wakcynologią.
Ten raport zawiera pierwszy krok po kroku, jak wywołać pęcherze ssące ludzkiej skóry w skórze wstrzykniętej PPD. Model przypominania antygenu skórnego zademonstrowano przy użyciu TST u ochotników zaszczepionych BCG. Na koniec przedstawiono odpowiednią analizę ex vivo komórek i cytokin wyizolowanych przez SB. Fenotypowe i funkcjonalne cechy limfocytów T specyficznych dla PPD uzyskanych metodą SB są dokładnie opisane w innym miejscu2,10,11,16,17,18,19. Niniejszy raport ma na celu omówienie praktycznych i immunologicznych aspektów metodologii, aby ułatwić stosowanie tej techniki przez inne grupy badawcze.

<table><tbody><tr><td>Rękawice do użytku laboratoryjnego</td><td>Imtex, Dania</td><td>1013</td><td></td></tr><tr><td>Spray do dezynfekcji&nbsp;</td><td>Apotek, Dania</td><td></td><td>82% alkohol, z gliceryną, do ludzkiej skóry&nbsp;</td></tr><tr><td>Swapy alkoholowe</td><td>Mediq, Dania</td><td>1131892</td><td></td></tr><tr><td>PPD RT 23 "SSI" (2 T.U./0,1ml)</td><td>AJ Vaccines</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Strzykawka Myjector ze stałą igłą&nbsp;</td><td>Terumo</td><td>A236</td><td>1 ml/29G/12mm</td></tr><tr><td>Linijka&nbsp;</td><td>Nie dotyczy</td><td></td><td>&nbsp; do oceny reakcji skórnej</td></tr><tr><td>Długopis</td><td>nie dotyczy</td><td></td><td>&nbsp; do oceny reakcji skórnych</td></tr><tr><td>Przenośne urządzenie do odsysania płuc</td><td>Laerdal Medical, Dania</td><td>78000011</td><td>UWAGA.&nbsp; Zmodyfikowany dla zakresów poniżej -40kPa i dostarczany z manometrem&nbsp; (ref. 1031107) przez Dział Techniczny</td></tr>, <tr><td>Zespół komory podciśnieniowej szpitala Hvidovre, nieogrzewany z rurkami łączącymi</td><td>Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kryza, 47 mm, 10 mm Otwór</td><td>Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw uszczelek przyrządu podciśnieniowego</td><td>Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pasek do komory podciśnieniowej&nbsp;</td><td>Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA</td><td></td><td>12-calowa</td></tr><tr><td>taśma chirurgiczna Micropore</td><td>&nbsp; 3M</td><td>1533-1</td><td>2,5 cm x 9,1 m</td></tr><tr><td>Nakrętka z plastikowej tubki 15 ml</td><td>Sarstedt, Niemcy</td><td>62,547,254</td><td></td></tr><tr><td>Bandaż Tubigrip</td><td>M&ouml; lnlycke Health Care, Szwecja</td><td>1443</td><td></td></tr><tr><td>Cosmopor sterylny opatrunek samoprzylepny</td><td>Hartmann</td><td>9008337</td><td>7,2 x 5 cm</td></tr><tr><td>2ml Strzykawka Koncentryczny Luer Slip&nbsp;</td><td>Becton Dickinson&nbsp;</td><td></td><td></td>300185</tr><tr><td>Igła Microlance 23G/30mm</td> Probówki do mikrowirówek <td>Becton Dickinson</td><td>300700</td><td></td></tr><tr><td>Safe-Lock (autoklawowane)</td><td>Eppendorf</td><td>&nbsp; 0030120086</td><td>Autoklawizowana</td></tr><tr><td>wirówka Minispin plus</td><td>Eppendorf</td><td>5453000011</td><td></td></tr><tr><td>Gibco AIM V Medium</td><td>Life Technologies</td><td>12055-091</td><td></td></tr></tbody></table>

protokół blistra ssącego do badania reakcji przywołania ludzkich limfocytów t in vivo

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Skórne modele przypominania antygenu pozwalają na badanie reakcji ludzkiej pamięci in vivo. W połączeniu z indukcją pęcherzy ssących przez skórę (SB), model ten zapewnia dostęp do rzadkich populacji limfocytów T specyficznych dla antygenu reprezentatywnych dla odpowiedzi pamięci komórkowej, a także mikrośrodowiska cytokin in situ.
Ten raport opisuje praktyczną procedurę pobierania komórek T od skóry, indukcji SB i pobierania limfocytów T specyficznych dla antygenu. Aby zilustrować tę metodę, tuberkulinową próbę skórną stosuje się do przypominania antygenowego u osób, które przed tym badaniem przeszły szczepienie Bacillus Calmette-Guérin przeciwko zakażeniu Mycobacterium tuberculosis. Na koniec przedstawiono przykłady analiz multipleksowych i cytometrycznych przepływowych próbek SB, ilustrujące wysokie frakcje wielofunkcyjnych limfocytów T CD4 + specyficznych dla antygenu dostępnych tą metodą pobierania próbek w porównaniu z komórkami wyizolowanymi z krwi.
Opisana tutaj metoda jest bezpieczna i minimalnie inwazyjna, daje unikalną okazję do badania zarówno wrodzonych, jak i adaptacyjnych odpowiedzi immunologicznych in vivo, i może być korzystna dla szerokiej społeczności badaczy zajmujących się odpornością komórkową i reakcjami ludzkiej pamięci, w kontekście opracowywania szczepionek.

W badaniu wzięło udział ośmiu zdrowych dorosłych ochotników (mediana wieku: 30 lat, zakres: 26 – 43 lata) z udokumentowanym wcześniejszym szczepieniem BCG (mediana czasu od szczepienia BCG: 5,5 roku, zakres: 1 – 30 lat). U uczestników przeprowadzono próbę w skórze przedramienia z użyciem 2 TU PPD, a następnie w 3. dniu wykonano ocenę TST. Pęcherze ssawne (SB) wywołano w 7. dniu i pobrano w 8. dniu; wszystkie pęcherze uzyskano za pomocą komór do ssania z otworami o średnicy 10 mm. Siedmiu osób poddano dwóm oddzielnym inokulacjom PPD jednocześnie w tym samym ramieniu, po których przeprowadzono dwie równoległe indukcje SB (należy odnieść się do uwagi dotyczącej wielokrotnego wprowadzania PPD poniżej kroku 1.4 w sekcji Protokół). W 7. dniu pobrano krew obwodową w celu uzyskania osocza oraz izolacji PBMC metodą wirowania w gradiencie gęstości. Osocze oraz nadsączeki z płynu z SB przechowywano w temperaturze -20 °C. Świeże komórki z pęcherzy (SBC) policzono przy użyciu barwienia nigroziną i mikroskopii.
Kliniczne reakcje na TST oraz wydajność SBC przedstawiono na Ryc. 1. Mediana wielkości nacieków TST wynosiła 10,25 mm (zakres: 0 - 20 mm), a mediana liczby komórek na pęcherz wynosiła 50 000 (zakres: 15 000 - 210 000 komórek, liczba pęcherzy: 15). U dwóch ochotników nie wystąpiła reakcja kliniczna w żadnym z 2 TST, co wiązało się z odpowiednio niską całkowitą wydajnością komórek wynoszącą 15 000 komórek/pęcherz. Wydajność komórek była skorelowana ze średnią reakcją kliniczną TST (współczynnik r Spearmana = 0,643, p = 0,094).
<img alt="Liczenie kolonii na płytce agarowej oraz wykres rozrzutu średniej liczby komórek w stosunku do średniej induracji TST." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57554/57554fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Wydajność komórek z pęcherzy ssawnych. (a) Ten panel przedstawia reprezentatywny obraz mikroskopowy komórek barwionych nigrozyną, wyizolowanych z pęcherzy ssawnych (SB) powstałych 7 dni po TST. (b) Ten panel przedstawia zależności między średnią induracją TST (mm) a średnią wydajnością komórek (n/pęcherz) u 8 ochotników zaszczepionych BCG (liczba pęcherzy = 15). Kropki reprezentują poszczególne pomiary średnie. Należy zauważyć, że 2 kropki nakładają się na siebie, ponieważ u 2 ochotników induracja TST wynosiła 0 mm, a wydajność komórek 15 000. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57554/57554fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Aby zademonstrować charakterystykę SB za pomocą cytometrii przepływowej, SBC pobrano od 43-letniego ochotnika, który został zaszczepiony BCG 30 lat wcześniej i nie miał znanej ekspozycji na Mtb. SBC wyizolowano po indukcji pojedynczego pęcherza (induracja: 1,4 mm/100 000 SBC). Rysunek 2 przedstawia reprezentatywne wykresy barwienia wewnątrzkomórkowego cytokin w SBC versus PBMC.
U tego ochotnika odsetek komórek SBC CD3+CD4+CD8- wzrósł z 67% w komórkach niepobudzonych do &gt; 90% po restymulacji PPD in vitro, podczas gdy odsetek komórek PBMC CD3+CD4+CD8- pozostał stały (~ 51%, Rysunek 2). Ponad 92% komórek SBC CD3+CD4+CD8- pobudzonych PPD in vitro, jak i niepobudzonych, należało do typu pamięci efektorowej (CCR7-CD45RA-, dane nie pokazane). Całkowite odsetki specyficznych komórek CD3+CD4+CD8- indukowanych stymulacją PPD były wyższe w komórkach SBC w porównaniu do PBMC (33,1 vs. 0,2%, po odjęciu próbek niepobudzonych). W komórkach PBMC odsetki polifunkcyjnych komórek CD3+CD4+CD8- specyficznych dla PPD wynosiły we wszystkich przypadkach &lt; 0,05%.
<img alt="Wykresy cytometrii przepływowej dla PBMC i komórek z pęcherzy ssawnych. Analiza efektów stymulacji CD3+." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57554/57554fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Reprezentatywne wykresy cytometrii przepływowej SBCs w stosunku do PBMC. Panele a i b przedstawiają reprezentatywne wykresy gęstości populacji CD8+ i CD4+ w (a) niestymulowanych vs. stymulowanych PPD PBMC oraz (c) SBCs. Panele b i d przedstawiają wykresy wewnątrzkomórkowego barwienia cytokin w stymulowanych PPD komórkach CD3+CD4+CD8- dla (b) PBMC i (d) SBCs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57554/57554fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Zgodnie z oczekiwaniami, komórki SBC CD3+CD4+CD8- uległy aktywacji in vivo, co ilustruje wysoki odsetek komórek wykazujących ekspresję cytokin o zwiększonej regulacji (12%), przy czym dominującymi cytokinami były TNF-α i IFN-γ. Jednakże po stymulacji PPD komórki wydzielające cytokiny przesunęły się w stronę profilu potrójnie lub podwójnie dodatniego IFN-γ+TNF-α+IL-2+ (17%) oraz IFN-γ+TNF-α+ (15%) (Rycina 3b, do porównania dołączono profile PBMC od tego samego dawcy w Rycina 3a). Profile ekspresji cytokin dla stymulowanych PPD podzbiorów efektorowych komórek T pamięci CD4+ (CD3+CD4+CD8-CCR7-CD45RA-) były porównywalne z populacją CD3+CD4+CD8- przedstawioną na rysunkach 2 i 3 (dane niepokazane).
<img alt="Wykres słupkowy odpowiedzi cytokinowej PBMC oraz komórek z pęcherza ssącego; IFN-γ, IL-2, TNF-α; analiza immunologiczna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57554/57554fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rysunek 3Profile cytokin dla stymulowanych PPD i niestymulowanych komórek SBC CD4+ w porównaniu z PBMC. Panele te przedstawiają indywidualne profile produkcji cytokin (a) komórki PBMC CD3+CD4+CD8- oraz (b) Komórki SBC CD3+CD4+CD8-. Słupki reprezentują frakcje profili cytokin specyficznych dla antygenu w komórkach niestymulowanych (białe słupki) oraz po stymulacji in vitro stymulacja za pomocą PPD (kolorowe słupki). 
Aby zbadać płyn z pęcherzyków (SB) jako źródło informacji na temat mikrośrodowiska cytokinowego w miejscu próby skórnej, zmierzono poziomy cytokin w płynie pobranym z pęcherzyków indukowanych 7 dni po wykonaniu TST (Rycina 4a). Mediany poziomów IFN-γ, TNF-α i IL-2 wynosiły odpowiednio 339 pg/mL, 19 pg/mL i 1 pg/mL (n = 6). Poziomy w osoczu były ogólnie bardzo niskie. Komórki wyizolowane z SBs produkowały wysokie poziomy cytokin prozapalnych ex vivo (Rysunek 4b). Miareczkowania komórek SBC pochodzących od jednego ochotnika hodowano przez 4 dni w obecności zjadliwego M. tuberculosis ± autologiczne PBMC. Poziomy IFN-γ były &gt; 30-krotnie wyższy w kulturach zawierających SBC, niezależnie od obecności PBMC.
<img alt="Stężenia cytokin, poziomów IFN-γ i IL; wykresy słupkowe porównujące analizy osocza, płynu SB oraz PBMC + SBC." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57554/57554fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Poziomy cytokin w płynie SB, osoczu oraz w nadnadkulturach zainfekowanych Mtb. (a) Ten panel przedstawia poziomy cytokin w nadnadkulturach płynu SB oraz w osoczu 6 ochotników zaszczepionych BCG. Słupki reprezentują mediany poziomów cytokin; słupki błędów reprezentują zakres. (b) Ten panel przedstawia poziomy cytokin w nadnadkulturach z 4 równoległych, 4-dniowych kultur ex vivo o objętości 600 µl zawierających 1 x 106 PBMC (czarne słupki), 1,75 x 105 SBC (białe słupki) oraz 1 x 106 PBMC z dodatkiem 0,5 lub 1,75 x 105 SBC (szare słupki) zainfekowanych Mtb. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57554/57554fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Tutaj prezentujemy demonstrację modelu przywołania pęcherza ssącego na skórę. Model ten umożliwia prosty dostęp do badania in vivo adaptacyjnych odpowiedzi immunologicznych u ludzi, na przykład w kontekście opracowywania szczepionek.

Protokół blistra ssącego do badania reakcji przywołania ludzkich limfocytów T in vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

Ogólnym celem tego filmu jest zademonstrowanie metody przywoływania na skórę pęcherzy ssących, która pozwala nam zbierać limfocyty T i cytokiny specyficzne dla antygenu reprezentatywne dla adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej in vivo. Metoda ta może być stosowana do badania odpowiedzi komórkowych i odporności adaptacyjnej u ludzi. Główną zaletą tej technologii jest to, że pozwala nam na pobranie limfocytów T specyficznych dla antygenu bezpośrednio z miejsca reakcji immunologicznej przy użyciu stosunkowo nieinwazyjnej i bezpiecznej metody.Podstawową zasadą przywołania skórnego jest zdeponowanie antygenu w warstwie skórnej skóry. U osób z istniejącą pamięcią immunologiczną antygenu limfocyty T będą migrować do miejsca reakcji i indukować lokalną odpowiedź immunologiczną, w której określone limfocyty T są klonalnie rozszerzane i różnicowane in situ. Indukcja pęcherzy ssących w wyniku tej reakcji pozwala nam na pobranie tych specyficznych limfocytów T, a także cytokin wytwarzanych in vivo.W tej demonstracji wideo używamy PPD jako antygenu przypominającego. PPD jest powszechnie stosowany w diagnostyce zakażenia prątkami gruźlicy. Ale wywołuje również reakcje skórne u osób wcześniej zaszczepionych szczepionką BCG, jak zobaczysz w tym filmie.Materiały do tuberkulinowej próby skórnej obejmują waciki nasączone alkoholem, jednomililitrową strzykawkę z krótką igłą o rozmiarze od 27 do 30 oraz roztwór PPD zatwierdzony do stosowania u ludzi. Użyj roztworu PPD o stężeniu 20 jednostek tuberkuliny na mililitr. Zdezynfekować fiolkę za pomocą wacika nasączonego alkoholem.Należy pamiętać, że skład może się różnić w zależności od producenta. Następnie zlokalizuj miejsce wstrzyknięcia po brzusznej stronie przedramienia ochotnika i zdezynfekuj ten obszar za pomocą wacika nasączonego alkoholem. Użyj sterylnej strzykawki o średnicy jednego mililitra z igłą stałą o rozmiarze 29 i średnicy 12 milimetrów.Delikatnie wymieszaj i zaaspiruj 0,1 mililitra roztworu PPD. Upewnij się, że nie ma widocznych bąbelków. Napręż skórę i skieruj igłę pod kątem od pięciu do piętnastu stopni, ze skosem skierowanym do góry.Włóż końcówkę igły w warstwę skórną skóry i upewnij się, że końcówka jest prawie widoczna przez naskórek. Powoli wstrzyknąć 0,1 mililitra roztworu PPD. Przy prawidłowym podaniu natychmiast pojawi się grudka o długości od sześciu do dziesięciu milimetrów.Grudka znika po około dziesięciu minutach. Wielokrotne składanie PPD jest możliwe, ale może wymagać dodatkowej zgody etycznej. W przypadku podania dwóch wstrzyknięć, należy dążyć do maksymalnej separacji, zachowując odpowiednią odległość od okolicy łokcia i nadgarstka.Kliniczna reakcja skórna pojawia się w ciągu pierwszych 24 godzin i towarzyszy jej uczucie swędzenia. Zmierz wielkość reakcji skórnej od 48 do 72 godzin po wstrzyknięciu. Oceniając odpowiedź, ważne jest, aby mierzyć stwardnienie, a nie rumień.Zbadaj palpacyjnie obrzęk kapelusza palcem. Następnie zaznacz krawędzie stwardnienia za pomocą długopisu. Na koniec użyj miękkiej linijki, aby zmierzyć średnicę stwardnienia i zanotuj wyniki w milimetrach.Po siedmiu dniach nadszedł czas na wywołanie pęcherza ssącego. Do indukcji blistra ssącego skórę należy użyć pompy próżniowej z dołączoną komorą ssącą. Użyj urządzenia dostępnego na rynku lub dostosowanego do jego potrzeb.Co ważne, pompa musi być regulowana w zakresie od minus 20 do minus 40 kilopaskali i zapewniać stałe i niezawodne podciśnienie. Dolna część komory ssącej składa się z płytki z małym otworem, który styka się ze skórą. Płytki mogą mieć jeden lub wiele otworów i mogą być stosowane różne rozmiary w celu dopasowania do reakcji skórnej.Górna część komory powinna umożliwiać wizualne monitorowanie blistra. Przed indukcją należy zdezynfekować skórę i płytkę komory. Upewnij się, że ramię wygodnie odpoczywa.Przymocuj i zabezpiecz komorę, tutaj za pomocą regulowanych pasków. Środek reakcji skórnej powinien być widoczny przez otwór w dolnej płytce. Włącz urządzenie ssące i ustaw podciśnienie na minus 20 kilopaskalów.Po trzydziestu minutach zwiększ ciśnienie do minus 25 kilopaskala. Po 60 minutach jeszcze bardziej zwiększ ciśnienie do minus 30 kilopaskal. I utrzymuj ciśnienie tutaj, aż pojedynczy pęcherz zostanie w pełni uformowany.Faza indukcji blistrów trwa zwykle około jednej do trzech godzin. Rzeczywiste tworzenie pęcherzy następuje stopniowo w ciągu ostatnich 30 minut, jak pokazano tutaj z dużą prędkością. Jeśli pojawią się oznaki pęknięcia pęcherza lub krwotoku, zaleca się powolne zmniejszanie ciśnienia i wczesne przerwanie indukcji.Pęcherze mogą wyglądać jak pojedyncze lub wielokrotne łączące się pęcherze. Proces ten często wiąże się z uczuciem swędzenia. Po całkowitym uformowaniu blistra zwolnić ciśnienie i ostrożnie wyjąć komorę ssącą.W prawidłowo wywołanych pęcherzach warstwa naskórka jest całkowicie oddzielona od warstwy skórnej skóry, pozostawiając jamę wypełnioną płynem. Chroń blister, nakładając miękki opatrunek na otaczający obszar skóry i umieszczając twardą nakrętkę na blistrze , tutaj z 15-mililitrowej plastikowej tubki. Zabezpiecz nakrętkę niealergiczną taśmą, a następnie miękkim, rozciągliwym bandażem.Poinstruuj ochotnika, aby trzymał opatrunek ochronny przez noc. Następnego dnia ostrożnie zdejmij opatrunek i zdezynfekuj obszar pęcherza za pomocą sprayu. Użyj sterylnej strzykawki o pojemności 2 mililitrów z igłą o rozmiarze 23, aby zebrać zawartość blistra.Wbić igłę w górną boczną stronę dachu blistra i powoli zasysać płyn. Unikaj dotykania dna jamy, ale upewnij się, że zebrałeś cały płyn, ponieważ objętość blistrów może być niska, jak w tym przykładzie. Zapadnięty pęcherz zagoi się bez blizn.Nałóż opatrunek ochronny na blister. Następnie przenieś płyn z blistra do sterylnej probówki. Wirować przez cztery minuty w temperaturze 600 G za pomocą wirówki stołowej.Następnie zbierz supernatant i ponownie zawieś osad komórkowy w 500 mikrolitrach pożywki komórkowej. Świeże komórki są teraz gotowe do zliczania i dalszej analizy. Ssące komórki pęcherzowe mogą być wykorzystywane do analizy in vitro, takiej jak cytometria przepływowa.W tym eksperymencie z ochotnikami zaszczepionymi BCG wydajność komórek wahała się od 15 000 do ponad 200 000 komórek na blister. Tutaj wyizolowaliśmy komórki z pojedynczego blistra ssącego i stymulowaliśmy komórki za pomocą PPD in vitro, a następnie barwienia i cytometrii przepływowej. Dla porównania, przeprowadziliśmy równoległą analizę PBMC od tego samego ochotnika zaszczepionego PCG.W panelach widać populacje limfocytów T CD4-dodatnich wybarwionych pod kątem międzykomórkowej produkcji TNF-alfa, interferonu gamma i IL2. U tego ochotnika ponad 30% limfocytów T CD4-dodatnich wyizolowanych ze skóry było specyficznych dla antygenu. W PBMC frakcja ta wynosiła mniej niż 1%Ponadto indywidualne profile cytokin komórek pęcherzowych były reprezentatywne zarówno dla komórek T pamięci centralnej, jak i efektorowych komórek T, co ilustruje, w jaki sposób ta metoda pozwala nam badać długotrwałe odpowiedzi pamięciowe generowane in vivo.Tutaj rysunek A ilustruje, że płyn uzyskany z blistrów ssących może być analizowany pod kątem cytokin wytwarzanych in vivo. Na rysunku B hodowaliśmy komórki uzyskane z pęcherzy ssących przez cztery dni w obecności Mycobacterium tuberculosis, ilustrując, w jaki sposób ssące komórki pęcherzowe są zdolne do wytwarzania interferonu gamma i TNF alfa ex vivo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak indukować i zbierać komórki z pęcherzy ssących po osadzaniu się antygenu skórnego.W tej demonstracji użyliśmy antygenu o szczególnym znaczeniu w dziedzinie badań nad gruźlicą. Jednak podstawowe zasady tej metodologii mogą być przydatne w dziedzinie odporności adaptacyjnej lub w badaniach nad czynnikami ukierunkowanymi na limfocyty T. Pamiętaj również, że etyka i bezpieczeństwo są priorytetem podczas pracy z wolontariuszami.Pamiętaj również, że praca z próbkami ludzkimi może być niebezpieczna i że w laboratorium należy zawsze przestrzegać środków ostrożności.

a-suction-blister-protocol-to-study-human-t-cell-recall-responses

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Charakterystyka epitopów limfocytów T patogenów wywołujących infekcje miejscowe, takich jak wirus brodawczaka ludzkiego, stanowi wyzwanie ze względu na ograniczoną liczbę krążących limfocytów T. Opisano metodę, w której rzadkie limfocyty T zostały wyizolowane i scharakteryzowane, zaczynając od bardzo małej liczby komórek.

Wykorzystanie testu Enzyme-linked Immunospot (ELISpot) dla interferonu $\gamma$ do charakterystyki nowych epitopów limfocytów T wirusa papilomawirusa ludzkiego

Opisujemy wartościowy test diagnostyczny, który mógłby potencjalnie służyć do podejmowania decyzji o odstawieniu immunosupresji po transplantacji, bez zwiększania ryzyka odrzucenia przeszczepu. Test ten opiera się na zasadach nadwrażliwości opóźnionej i umożliwia dokładną ocenę zarówno efektorowych, jak i regulacyjnych odpowiedzi immunologicznych specyficznych dla dawcy, generowanych przez biorców.

Test opóźnionej nadwrażliwości trans-vivo w badaniu regulacji specyficznej dla antygenu

Ten film demonstruje technikę in vitro do badania tworzenia synaps immunologicznych między pierwotnymi ludzkimi limfocytami T a wspieranymi dwuwarstwami lipidowymi (SLB). Białka powierzchniowe limfocytów T oddziałują z odpowiednimi ligandami unieruchomionymi na SLB, tworząc synapsę immunologiczną, po której następuje ruch granulek litycznych w kierunku synapsy, co jest wizualizowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Technika in vitro do badania interakcji limfocytów T z obsługiwanymi płaskimi dwuwarstwami lipidowymi

Film demonstruje immunologiczną metodę monitorowania in vivo indukowanej adiuwantem produkcji cytotoksycznych limfocytów T lub CTL. Myszowi wstępnie wstrzykuje się genetycznie zmodyfikowane, proliferacyjne, barwione barwnikiem limfocyty T CD8 + dawcy. Podskórne wstrzyknięcie albuminy jaja kurzego z adiuwantami generuje cytotoksyczne limfocyty T CD8 +, które są identyfikowane po zbiorze za pomocą barwienia immunologicznego i cytometrii przepływowej.

Immunologiczna technika monitorowania wytwarzania cytotoksycznych limfocytów T za pośrednictwem adiuwantów

Możliwość szczegółowego monitorowania odpowiedzi limfocytów T in vivo jest ważna dla rozwoju naszego zrozumienia odpowiedzi immunologicznej. W tym miejscu opisujemy zastosowanie docelowych macierzy fluorescencyjnych (FTA) w teście in vivo limfocytów T, który ocenia &gt;250 parametrów jednocześnie za pomocą cytometrii przepływowej.

Zastosowanie fluorescencyjnych macierzy docelowych do oceny odpowiedzi limfocytów T in vivo

Celem tego protokołu jest umożliwienie wykrywania in vivo specyficznego dla antygenu zabijania komórki docelowej w modelu mysim.

In vivo (in vivo) Test do wykrywania swoistej dla antygenu funkcji cytolitycznej limfocytów T przy użyciu modelu szczepienia

Prezentujemy tutaj aplikację do standardowej techniki immunologicznej (proliferacja OT-I barwiona CFSE) przeznaczonej do szybkiego monitorowania wytwarzania cytotoksycznych limfocytów T (CTL) za pośrednictwem adiuwantów in vivo. To szybkie oszacowanie zdolności CTL jest przydatne do opracowywania szczepionek profilaktycznych przeciwko patogenom wewnątrzkomórkowym, a także terapeutycznych szczepionek przeciwnowotworowych.

Szybka ocena in vivo zdolności wytwarzania cytotoksycznych limfocytów T adiuwantu w celu opracowania szczepionki

Wprowadzony tutaj protokół pozwala na scharakteryzowanie zdolności naprowadzania płuc pierwotnych ludzkich limfocytów w warunkach zapalnych in vivo. Naciek płucny adoptywnie przeniesionych ludzkich komórek odpornościowych w mysim modelu alergicznego zapalenia można zobrazować i określić ilościowo za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej arkusza świetlnego chemicznie oczyszczonej tkanki płucnej.

Zaawansowane obrazowanie ludzkich limfocytów naprowadzających płuca w eksperymentalnym modelu zapalenia alergicznego in vivo opartym na mikroskopii arkuszowej światła

Opisujemy tutaj test zabijania in vivo oparty na cytometrii przepływowej, który umożliwia badanie dominacji immunologicznej w odpowiedziach cytotoksycznych limfocytów T (CTL) na modelowy antygen nowotworowy. Podajemy przykłady, w jaki sposób ten elegancki test może być wykorzystany do badań mechanistycznych i do testowania skuteczności leków.

Dostosowywanie testów cytotoksyczności in vivo do badania immunodominacji w odpowiedziach limfocytów T CD8 + specyficznych dla nowotworu

Tutaj prezentujemy protokół stopniowej rekonstytucji syntetycznych komórek prezentujących antygen za pomocą dwuwarstw lipidowych wspieranych przez koraliki i ich użycie do badania wyjścia synaptycznego z aktywowanych limfocytów T.

Przygotowanie dwuwarstw lipidowych wspieranych przez kulki w celu zbadania emisji cząstek stałych przez synapsy odpornościowe limfocytów T

Badanie pokazuje rolę skóry w modulacji odpowiedzi immunologicznych u myszy poprzez immunizację epikutanną (EC). Szczepienie EC antygenem białkowym może hamować odpowiedzi immunologiczne w przypadku nadwrażliwości kontaktowej lub odwracać supresję indukowaną przez skórę, gdy jest połączona z molekularnymi wzorcami związanymi z patogenem. Szczepienia EC wykazują obiecujące zastosowanie jako skuteczne, bezigłowe podejście do immunoterapii.

Model murinowy immunomodulacji indukowanej przez skórę

Poznaj metodę ssącego blistra skórnego do pobierania antygenspecyficznych limfocytów T i cytokin in vivo. Ta nieinwazyjna technika umożliwia badanie odpowiedzi immunologicznej człowieka w czasie rzeczywistym.

Protokół blistra ssącego do badania reakcji przywołania ludzkich limfocytów T in vivo

Przeglądaj więcej filmów