Rodzinny model myszy chimerycznej wątroby hipercholesterolemii przy użyciu indukowanych pluripotencjalnych hepatocytów pochodzących z komórek macierzystych
15 września 2018
Tutaj prezentujemy protokół generowania ludzkiego chimerycznego mysiego modelu hipercholesterolemii rodzinnej wątroby przy użyciu ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych hepatocytów. Jest to cenny model do testowania nowych terapii hipercholesterolemii.
Metoda ta pozwoliła odpowiedzieć na kluczowe pytania w tej dziedzinie, takie jak sposób generowania mysiego modelu chimerycznej wątroby ludzkiej, hipercholesterolemii rodzinnej. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia wykonywanie testów narkotykowych in vivo. Technika ta ma zastosowanie w leczeniu hipercholesterolemii rodzinnej.
Jako nowa terapia tej choroby może być testowana przy użyciu takich chimerycznych modeli zwierzęcych. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w hipercholesterolemię rodzinną, może być również stosowana do innych dziedzicznych chorób wątroby. 24 godziny przed wszczepieniem rozmrozić 40 mikrolitrów macierzy zewnątrzkomórkowej na mysz, umieszczając w zamrażalniku w chłodni.
Schłodź strzykawkę insulinową dla każdej myszy do wstrzyknięcia i pudełko z końcówkami o pojemności 200 mikrolitrów w lodówce o temperaturze czterech stopni Celsjusza. Na godzinę przed wszczepieniem ogrzej enzym dysocjacji komórek, uzupełniony 50 mikrogramami na mililitr DNAazy 1, do temperatury pokojowej i umieść na lodzie pożywkę RPMI 1640, uzupełnioną 20-procentową substytucją surowicy. Wykonaj obrazy iHeps z kontrastem fazowym, aby zarejestrować ich stan, w tym morfologię komórek, wzrost i gęstość komórek.
Następnie umyj każdą studzienkę iHeps dwukrotnie 2 mililitrami PBS wolnego od jonów wapnia i magnezu w temperaturze pokojowej, a następnie dodaj jeden mililitr wstępnie podgrzanego enzymu dysocjacji komórek do każdej studzienki. Umieść komórki z powrotem w inkubatorze na osiem do dziesięciu minut. Monitoruj morfologię komórek pod mikroskopem.
Gdy większość komórek stanie się okrągła, dodaj równą objętość zimnego podłoża do dołka, delikatnie odpipetuj komórki, aby oderwały się od płytki, i przenieś zawiesinę komórek do nowej 15-mililitrowej probówki. Ten krok ma kluczowe znaczenie dla niezawodności hepatocytów. Jeśli komórki są trudne do oderwania od płytki, niektóre z nich można pozostawić na płytce.
A jeśli komórki się odłączą, po odwirowaniu delikatnie pipetować, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową. Powtarzaj procedurę odłączania komórek dla każdej studzienki, aż zostaną zebrane prawie wszystkie przyłączone komórki. Następnie odwirować przy 200 g przez trzy minuty w czterech stopniach Celsjusza.
Po odwirowaniu usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki za pomocą dwóch mililitrów zimnego PBS w probówce o pojemności piętnastu mililitrów. Delikatnie odpipetować komórki, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową. Następnie przepuść komórki przez sitko o wielkości 40 mikronów, aby usunąć agregaty.
Zwykle po kilku latach można zebrać od jednego do dwóch milionów komórek. Następnie dodaj mikrolitry 0,4% roztworu błękitu trypanowego do 20 mikrolitrów zawiesiny komórek. Policz komórki i zapisz stężenie zawiesiny komórek jako C. Oblicz wymaganą objętość zawiesiny komórek, aby wstrzyknąć milion komórek na mysz.
Następnie przydzielić wymaganą objętość zawiesiny komórek do 15-mililitrowych probówek i odwirować przy 200 g przez trzy minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po usunięciu supernatantu ponownie zawiesić komórki w 27,5 mikrolitrach zimnego PBS na mysz. A następnie dodaj równą objętość macierzy zewnątrzkomórkowej, aby uzyskać końcową objętość 55 mikrolitrów na mysz.
Teraz umieść jedną z zimnych strzykawek insulinowych na lodzie. Odłączyć tłok, przenieść 55 mikrolitrów zawiesiny komórek do strzykawki, a następnie włożyć tłok z powrotem. Ostrożnie rozładuj bąbelki i umieść strzykawkę z powrotem na lodzie.
Upewnij się, że myszy LRG są odpowiednio znieczulone przed rozpoczęciem procedury wstrzykiwania. Nałóż maść weterynaryjną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas zabiegu znieczulenia. Gdy mysz straci odruch mięśniowy na stymulację, umieść ją w odpowiedniej, bocznej, odleżynowej pozycji.
Nałóż grubą warstwę kremu do depilacji na obszar nacięcia po lewej stronie i pozostaw na pięć do ośmiu minut. Usuń krem do depilacji i włosy, przecierając obszar gazikiem zwilżonym wodą. Trzykrotnie wyszoruj lewą flankę 70-procentowym etanolem.
Następnie zlokalizuj śledzionę, którą można zobaczyć na lewym boku. Następnie następuje końcowe namoczenie z betadyną w celu dezynfekcji. Po użyciu nożyczek do wykonania od 0,5 do jednego centymetrowego nacięcia w skórze i ścianie brzucha, użyj kleszczy, aby zewnętrzizować śledzionę, delikatnie ciągnąc otaczającą tkankę tłuszczową.
Delikatnie ustabilizuj śledzionę za pomocą wacika. Włóż igłę strzykawki insulinowej na trzy do czterech milimetrów do miąższu śledziony i delikatnie wstrzyknij około 50 mikrolitrów zawiesiny komórkowej. Wycofać igłę i umieścić bawełniany wacik nad wstrzyknięciem na jedną minutę, aby zapobiec krwawieniu i rozlaniu materiału.
Przywróć śledzionę do otrzewnej i zamknij ranę nylonowymi szwami o grubości pięciu ochów. Po zszyciu umieść mysz w czystej klatce z łatwym dostępem do jedzenia i wody. Zacznij od usunięcia narządów wewnętrznych od świeżo uśpionej myszy, tak aby widoczna była aorta zstępująca, równoległa do kręgosłupa.
Następnie wypreparuj sąsiednią tkankę i usuń serce. Użyj cienkich nożyczek, aby wypreparować aortę, umieszczając każdą z nich w zimnym, natlenionym roztworze Krebsa. Po pobraniu przenieść aortę w roztworze Krebsa na pokrytą silikonem szalkę Petriego.
Przypnij tkankę łączną, aby ustalić pozycję aorty bez jej rozciągania. Pod sterylnym mikroskopem użyj cienkich kleszczyków i nożyczek sprężynowych, aby wypreparować aortę z otaczającego tłuszczu i tkanki przybyszowej, nie uszkadzając ściany naczynia. Następnie pokrój każdą aortę na segmenty o długości od półtora do dwóch milimetrów.
Następnie wytnij dwucentymetrowy kawałek drutu ze stali nierdzewnej o grubości 40 mikronów i delikatnie włóż do światła aorty. Przytrzymaj drut, aby przenieść segment do komory miografu drutu, wypełnionej natlenionym roztworem Krebsa. Aby zmierzyć długość segmentów aorty podczas badania kurczliwości, umieść każdy segment prostopadle między szczękami i zapisz odczyt D1 na mikrometrze.
Następnie wyjmij segment i przesuń szczęki razem. Zapisz odczyt D0 i oblicz długość segmentu. Następnie zaciśnij drut i zabezpiecz go śrubokrętem, umieszczając nierozciągnięty segment między szczękami.
W celu normalizacji przed eksperymentem ustaw miograf na zero w pozycji nierozciągniętej. Następnie powoli rozsuń szczęki i obserwuj, jak zmienia się napięcie aorty, aż osiągnie trzy miliniutony. Po 15 minutach spuścić roztwór z komory miografu i zastąpić go świeżym roztworem Krebsa.
Po odczekaniu kolejnych 15 minut ponownie dostosuj napięcie do trzech miliniutonów. Następnie zmień standardowy roztwór Krebsa na roztwór Krebsa uzupełniony 60-milimolowym chlorkiem potasu, aby wywołać skurcz przez co najmniej piętnaście minut. Spłucz trzykrotnie świeżym roztworem Krebsa, a następnie dodaj zwiększające stężenie fenylefryny.
Na przykład od 10 nanomolowych do 100 mikromolowych. Następnie, po wypłukaniu standardowym roztworem Krebsa, dodaj pojedyncze stężenie fenylefryny, przy około 70 procentach maksymalnego skurczu. Gdy skurcz jest stabilny, dodawaj rosnące stężenie acetylocholiny w odstępach dwuminutowych.
Na przykład od jednego do trzech nanomolowców do dziesięciu do trzydziestu mikromolowców w celu wywołania rozszerzenia naczyń krwionośnych. Obraz ten przedstawia reprezentatywny zeskanowany obraz całego przekroju barwienia ludzkiej albuminy w wątrobie myszy ponownie wypełnionej iHeps z niedoborem receptora lipoprotein o niskiej gęstości. Strzałki wskazują skupiska ludzkich iHeps wszczepionych do wątroby myszy.
Skupiska wszczepionych ludzkich iHeps są widoczne bardziej szczegółowo tutaj. Ten wykres rozrzutu przedstawia procent ponownie zasiedlonych ludzkich komórek albuminowo-dodatnich odpowiadających obszarom zawierającym iHep w wątrobie myszy, z różnych komórek iPS dawcy. Jest to reprezentatywny obraz barwienia immunohistochemicznego jąder ludzkich w wątrobie myszy z wszczepioną rodzinną hipercholesterolemią iHeps.
Wykres słupkowy przedstawia odsetek ponownie zasiedlonych ludzkich jąder dodatnich iHeps z różnych dawców iPSC w wątrobach myszy LRG. Są to reprezentatywne obrazy barwienia ludzkiej albuminy i jąder ludzkich na dwóch kolejnych odcinkach wątroby myszy, ponownie zasiedlonych iHeps typu dzikiego. Wreszcie, obraz ten pokazuje zależne od śródbłonka rozszerzenie naczyń krwionośnych aorty u rodzinnych myszy chimerycznych wątroby z hipercholesterolemią, w odpowiedzi na rosnące stężenie acetylocholiny.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak generować ludzkie myszy chimeryczne wątroby przy użyciu ludzkich hepatocytów pochodzących z iPSC.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół generowania mysiego modelu chimerycznego wątroby ludzkiej w hipercholesterolemii rodzinnej z wykorzystaniem hepatocytów pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Model ten ma istotne znaczenie dla testowania nowych terapii ukierunkowanych na leczenie hipercholesterolemii.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia
- Genetyka
Wstęp
- Rodzinna hipercholesterolemia to zaburzenie genetyczne wpływające na metabolizm cholesterolu.
- Chimeryczne modele mysie stanowią platformę do testowania leków in vivo.
- Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste mogą być różnicowane w hepatocyty.
- To podejście może zostać zastosowane również w przypadku innych dziedzicznych chorób wątroby.
Cel badania
- Opracowanie wiarygodnego modelu do badania hipercholesterolemii rodzinnej.
- Ułatwienie testowania nowych strategii terapeutycznych.
- Zrozumienie mechanizmów dziedzicznych chorób wątroby.
Zastosowane metody
- Tworzenie chimerycznych modeli mysich z ludzką wątrobą.
- Wykorzystanie hepatocytów pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych.
- Badanie leków in vivo.
- Przygotowanie macierzy zewnątrzkomórkowej do przeszczepienia.
Główne wyniki
- Protokół pozwala na pomyślne wytworzenie chimerycznych modeli mysich.
- Możliwe jest przeprowadzenie testów lekowych w celu oceny nowych terapii.
- Model dostarcza cennych informacji na temat rodzinnej hipercholesterolemii.
- Odnotowano potencjalne zastosowania w przypadku innych dziedzicznych chorób wątroby.
Wnioski
- Metoda ta stanowi istotny postęp w modelowaniu rodzinnej hipercholesterolemii.
- Otwiera ona możliwości testowania nowych terapii w odpowiednim kontekście biologicznym.
- Przyszłe badania mogą rozszerzyć jej zastosowanie na inne schorzenia związane z wątrobą.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ten ludzko-mysi model chimeryczny wątroby wypełnia krytyczną lukę w przedklinicznych badaniach leków na rodzinną hipercholesterolemię, dostarczając systemu istotnego dla człowieka do oceny terapii obniżających poziom lipidów. Umożliwia on mechanistyczną weryfikację bezpieczeństwa i skuteczności nowych terapii, takich jak przeciwciała przeciwko PCSK9, poprzez wykazanie różnic w ich efektywności w porównaniu ze statynami w kontekście istotnym dla przebiegu choroby. Model ten wspiera walidację celów terapeutycznych oraz dopasowanie translacyjnych biomarkerów dla dziedzicznych chorób wątroby, zwiększając pewność prognostyczną w decyzjach podejmowanych na wczesnym etapie odkrywania leków.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie funkcji hepatocytów z niedoborem LDLR in vivo w celu walidacji celów terapeutycznych dla hipercholesterolemii rodzinnej.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalny system do oceny stopnia oddziaływania na cel oraz modulacji szlaków przez nowe leki obniżające poziom lipidów.
- Wartość strategiczna: Wspiera testowanie hipotez i ograniczanie ryzyka biologicznego przed przystąpieniem do kampanii optymalizacji wiodących związków.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Generowanie zwalidowanych populacji ludzkich hepatocytów reagujących na perturbacje farmakologiczne w celu przygotowania do analizy.
- Wartość operacyjna: Stworzenie ustandaryzowanej platformy chimerycznej wątroby z mierzalnym poziomem engraftmentu (5-10%) dla spójnych pomiarów odpowiedzi na leki.
- Wartość strategiczna: Ułatwienie przesiewowej analizy kandydatów terapeutycznych w ludzkim mikrośrodowisku wątrobowym w celu poprawy przewidywalności translacyjnej.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Odzwierciedla obserwacje kliniczne dotyczące zwiększonej skuteczności przeciwciał przeciwko PCSK9 w porównaniu ze statynami w systemach z niedoborem LDLR.
- Wartość operacyjna: Umożliwia podłużne monitorowanie przeżycia ludzkiej albuminy i jąder komórkowych w celu oceny stabilności modelu oraz odpowiedzi na lek.
- Wartość strategiczna: Wspiera decyzje o rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka, dostarczając przedklinicznych dowodów wyższości terapeutycznej w modelu istotnym dla danej jednostki chorobowej.
Integracja potoków i przepływów pracy
Model ten integruje proces odkrywania leków – od walidacji celu po ocenę przedkliniczną, umożliwiając płynne przejście od wglądu w mechanizmy chorobowe do testów terapeutycznych w przypadku dziedzicznych chorób wątroby.
- Biologia odkrywcza: Wspiera walidację funkcjonalną szlaków LDLR i PCSK9 w kontekście ludzkiej chimerycznej wątroby w celu wyjaśnienia mechanizmów chorobowych.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowych odczytów dotyczących zaprowadzenia przeszczepu oraz odpowiedzi na lek, co umożliwia porównanie kandydatów terapeutycznych w różnych warunkach.
- Analityka: Zapewnia mierzalne wyniki, w tym obszar z dodatnim wynikiem na ludzką albuminę oraz procent zaprowadzenia jąder komórkowych, aby ocenić wydajność chimeryczną i modulację farmakologiczną.
- Badania translacyjne: Łączy ustalenia z fazy odkryć z walidacją przedkliniczną poprzez modelowanie specyficznego dla ludzi metabolizmu lipidów i odpowiedzi terapeutycznej.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy adaptowalną platformę chimerycznej wątroby, która może być stosowana w wielu dziedzicznych chorobach wątroby poza hipercholesterolemią rodzinną.
Wpływ operacyjny i korporacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez redukcję rozbieżności gatunkowych w metabolizmie lipidów.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność dzięki standaryzacji protokołów przygotowania hepatocytów, wszczepiania i barwienia.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez wykazanie różnic w skuteczności leków w preklinicznym modelu istotnym dla ludzi.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację terapii obniżających poziom lipidów z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o dane mechanistyczne i skuteczności uzyskane z modeli chimerycznych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie różnicowania iPSC, hodowli hepatocytów oraz technik chirurgicznego przeszczepiania.
- Sukces repopulacji ludzkimi komórkami zależy od zastosowania szczepów myszy LRG z niedoborem odporności oraz odpowiedniego przygotowania macierzy pozakomórkowej.
- Niezbędne są ustandaryzowane protokoły międzyzespołowe w zakresie kwantyfikacji komórek, oceny żywotności oraz monitorowania przeszczepienia.
- Stosowanie modelu w przypadku innych dziedzicznych chorób wątroby o różnym podłożu genetycznym wymaga uwzględnienia konieczności adaptacji.
- Ograniczeniem jest częściowa repopulacja wątroby (5-10%), co może wpływać na skalowanie odczytów metabolicznych w zastosowaniach wysokoprzepustowych.
