Name: Dostarczanie CRISPR za pośrednictwem wirusa za pośrednictwem adenowirusa do edycji genów serca u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Poznaj metodę edycji genów serca u myszy za pomocą wirusa AAV i CRISPR, która przywraca ekspresję dystrofiny. Ta technika oferuje trwałą strategię terapeutyczną dla kardiomiopatii związanej z dystrofią mięśniową Duchenne'a.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

R.H. jest wspierany przez granty amerykańskich Narodowych Instytutów Zdrowia (R01HL116546 i R01 AR064241).

Zwierzęta użyte w tym protokole były utrzymywane w Laboratorium Zasobów Zwierzęcych Uniwersytetu Stanowego Ohio zgodnie z wytycznymi dotyczącymi użytkowania zwierząt. Wszystkie badania na zwierzętach zostały autoryzowane przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki, Użytkowania i Przeglądu Zwierząt Uniwersytetu Stanowego Ohio.
1. Projektowanie i klonowanie gRNA do wektora CRISPR
<ol>
	<li>Wybierz 2 gRNA ukierunkowane na dystrofinę intron 20 i intron 23 (i20 i i23) dla SaCas9: i20: 5'-GGGCGTTGAAATTCTCATTAC CAGAGT i i23: 5'-CACCGATGAGAGGGAAAGGTC CTGAAT (sekwencja PAM jest podkreślona i zapisana kursywą). 
	UWAGA: Miejsca docelowe dla i20 i i23 są oddalone o około 23 kilo pary zasad (kbp). Aby zakłócić gen kodujący, zaleca się umieszczenie dwóch gRNA celujących w wspólne egzony z sekwencją NNGRRT PAM dla SaCas9 (najlepiej NNGAAT, NNGGGT i NNGAGT) i odległością w granicach 20 kbp.</li>
	<li>Do wyżarzania oligonukleotydów gRNA (100 μmol/L) należy użyć następujących parametrów PCR w 1x buforze do wyżarzania (5x zapas buforowy do wyżarzania zawiera 0,5 mol/L K-octanu, 150 mmol/L HEPES-KOH, 10 mmol/L Mg-octanu, pH 7,4): 95 °C 10 min, 90 cykli od 95 do 59 °C ze spadkiem o 0,4 °C na cykl przez 20 s, 90 cykli po 59 do 32 °C ze spadkiem o 0,3 °C na cykl przez 20 s, 20 cykli po 32 do 26 °C ze spadkiem o 0,3 °C na cykl przez 20 s.</li>
	<li>Zligować wyżarzone oligonukleotydy gRNA do pX601-CMV-SaCas9-mPA-U6-gRNA przy użyciu ligazy DNA BsaI i T4 w jednej reakcji (1 μL 50 ng/μL pX601-CMV-SaCas9-mPA-U6-gRNA, 1 μL wyżarzonych oligonukleotydów, 1,5 μL 10x bufor ligazy DNA T4, 0,5 μl ligazy DNA T4, 1 μL BsaI, 10 μL ddH2O), w następujących warunkach reakcji w cyklerze PCR: 5 cykli [37 °C 5 min i 16 °C 10 min]; 37 °C 20 min; 80 °C 5 min.</li>
	<li>Przekształć 15 μl produktu ligacji w 30 μl kompetentnych komórek, pokryć komórki na płytce agarowej 100 μg/ml ampicyliny i hodować w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.</li>
	<li>Zebrać 5-10 kolonii i wyhodować je w pożywce LB zawierającej 100 μg/ml ampicyliny w temperaturze 37 °C, 250 obr./min w inkubatorze z wytrząsarką przez 3-4 godziny.</li>
	<li>Przesiewać kolonie metodą PCR: 10 μL 2x PCR master mix, 8 μL ddH2O, 1 μL kultury E. Coli, 1 μL 10 μmol/L U6-forward starter, 1 μL i20 lub i23 gRNA reverse starter. Parametry cykliczne PCR: 95 °C 5 min, 35 cykli 95 °C 30 s, 61 °C 30 s, 72 °C 30 s.</li>
	<li>Przygotować 5 ml kultury dodatnich klonów, dodając 4 ml świeżej pożywki LB zawierającej 100 μg/ml ampicyliny i hodować przez noc w temperaturze 37 °C, 250 obr./min.</li>
	<li>Oczyść DNA plazmidu za pomocą odpowiedniego zestawu do ekstrakcji plazmidu i zweryfikuj plazmid przez sekwencjonowanie Sangera ze starterem U6-forward.</li>
	<li>Hodowla komórek C2C12 w DMEM uzupełniona 10% FBS i 1% Pen-Strep aż do osiągnięcia ~70% konfluencji w celu zbadania skuteczności edycji genów plazmidów.</li>
	<li>Elektroportować łącznie 5 μg mieszaniny plazmidów SaCas9/gRNA w stosunku molowym 1:1 do 1 x 106 komórek C2C12 zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Po 48 godzinach od transfekcji zbierz komórki C2C12 i wyekstrahuj genomowe DNA.</li>
	<li>Użyj 100 ng genomowego DNA jako matrycy do przeprowadzenia reakcji PCR dla locus dystrofiny myszy: starter do przodu 5'-GGCCAAAGCAAACTCTGGTA (1 μL 10 μmol/L), starter odwrotny 5'-TTTAATCCCACGTCATGCAA (1 μL 10 μmol/L), 10 μL 2x zielona mieszanka główna PCR, 7 μL ddH2O, 1 μL genomowego DNA (100 ng). Stosować warunki cykliczne PCR jako 95 °C 5 min, 35 cykli [95 °C 30 s, 61 °C 30 s, 72 °C 30 s], 72 °C 2 min.</li>
</ol>
2. Produkcja rAAV
<ol>
	<li>Aby wyhodować komórki, wysiewaj komórki AD293 na 20 do 40 15-centymetrowych szalkach i utrzymuj w DMEM uzupełnionym 10% FBS i 1% Pen-Strep, aż osiągniesz ~ 90% konfluencji w celu transfekcji.</li>
	<li>Rozcieńczyć 3 plazmidy 200 μl zredukowanej pożywki surowicy (na miskę): 1)10 μg pHelper; 2) 5 μg pXR (rh.74 lub inne serotypy) oraz 3) łącznie 5 μg mieszaniny pX601-i20 i pX601-i23 (stosunek 1:1). Przeprowadzić transfekcję polietyleneniminy (PEI) mieszając z 80 μl PEI i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Dodać mieszaninę do kultur komórkowych AD293 kroplami.</li>
	<li>W przypadku produkcji wirusa AAV, po 72 godzinach od transfekcji, należy użyć skrobaka do komórek, aby zebrać zarówno pożywkę, jak i granulki komórek AD293 przez odwirowanie przy 1100 x g przez 10 minut.</li>
	<li>Zawiesić osady komórkowe w 15 ml buforu do lizy rAAV (50 mmol/l Tris Base, 150 mmol/L NaCl, pH 8,5), a następnie wykonać 3 cykle zamrażania i rozmrażania z naprzemienną inkubacją w ciekłym azocie i łaźni wodnej o temperaturze 42 °C. Przechowywać lizaty komórkowe w temperaturze -80 °C do przyszłego przetwarzania, jeśli nie są one przetwarzane natychmiast.</li>
	<li>Przefiltrować pożywkę hodowlaną za pomocą filtra 0,45 μm i dodać 40% PEG8000 w 2,5 mol/L NaCl do końcowego stężenia 8%. Inkubować mieszaninę w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę i odwirowywać przy 1100 x g przez 15 minut.</li>
	<li>Zawiesić osady w buforze do lizy rAAV i połączyć z lizatami komórkowymi z kroku 2.3, a następnie poddać działaniu benzonazy (50 U/ml) w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Odwirować mieszaninę 1100 x g zawierającą rAAV poddaną działaniu benzonazy przez 15 minut w temperaturze 4 °C i zachować supernatant (surowy preparat rAAV).</li>
</ol>
3. Oczyszczanie i zagęszczanie rAAV
<ol>
	<li>Załaduj surowy preparat rAAV na gradient jodiksanolu w probówce ultrawirówkowej w następującej kolejności od góry do dołu: surowy lizat AAV (~15 ml), 8 ml 15% jodiksanolu, 6 ml 25% jodiksanolu, 5 ml 40% jodiksanolu, 5 ml 58% jodiksanolu. Napełnij pozostałą pustą objętość probówki do góry za pomocą 1x DPBS.</li>
	<li>Odwirować próbki o masie 230 000 x g w wirniku ultrawirówki przez 120 minut w temperaturze 10 °C i zebrać 3 - 4 ml frakcji o 40% gradiencie zawierającej cząstki rAAV za pomocą igły 18 G.</li>
	<li>Rozcieńczyć cząstki rAAV za pomocą 1x DPBS i odwirować za pomocą odśrodkowego zespołu filtrującego (MWCO 100 kDa). Powtórz ten krok 3-5 razy i na koniec zagęścić preparat rAAV do 300-500 μL.</li>
</ol>
4. Mianowanie rAAV
<ol>
	<li>Wyekstrahować genomowe DNA z 2 μl stężonego rAAV, wytrącić 3 M NaOAc w etanolu i ponownie zawiesić w 20 μl ddH2O.</li>
	<li>Otrzymać krzywą wzorcową do oznaczania ilościowego rAAV przez szeregowe rozcieńczanie plazmidu pX601: 1 x 109, 1 x 108, 1 x 107, 1 x 106, 1 x 105 kopii w każdych 10 μL ddH2O. Rozcieńczyć próbki rAAV poddane działaniu DNAazy w stosunku 1:10, 1:50, 1:100 i 1:1000.</li>
	<li>Oznaczyć miano rAAV metodą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (qPCR) przy użyciu zestawu qPCR zgodnie z instrukcją producenta w systemie Real-Time PCR: 1 μL 10 μmol/L każdego startera (5'-GGATTTCCAAGTCTCCACCC i 5'-TCCCACCGT ACACGCCTAC), 5 μL 2x PCR master mix, 1 μL rozcieńczone próbki rAAV i 2 μL ddH2O. Przeprowadzić reakcję z następującymi parametrami cyklicznymi: 95 °C 3 min, 45 cykli [95 °C 5 s i 61 °C 20 sek].</li>
</ol>
5. Dożylne i dootrzewnowe wstrzyknięcie rAAVrh.74-CRISPR do noworodków mdx/utropin+/- myszy
<ol>
	<li>Unieruchomić młode myszy mdx/utrofiny+/- (dzień 3), umieszczając je na lodzie na 1 minutę, a następnie podawać z 1 x 1012 cząstkami wirusa w 50 μl na mysz ogólnoustrojowo przez dostęp zadoczodołowy lub wstrzyknięcie dootrzewnowe.</li>
	<li>Pozwól myszom dojść do siebie i umieść je z powrotem w klatkach domowych. Po dziesięciu tygodniach od podania rAAV należy poddać myszy eutanazji przez ekspozycję na CO2 w celu pobrania tkanek.</li>
	<li>Błyskawiczne zamrażanie tkanek w celu ekstrakcji genomowego DNA i RNA oraz stosowanie chłodzącego izopentanu w ciekłym azocie do zamrażania tkanek za pomocą związku o optymalnej temperaturze cięcia do kriosekcji.</li>
</ol>
6. Analiza wyników edycji genów docelowych
<ol>
	<li>Analiza genomowego DNA PCR
	<ol>
		<li>Wyizoluj całkowite genomowe DNA z tkanek serca myszy mdx/utropin+/- leczonych rAAV lub bez.</li>
		<li>Użyj tego samego protokołu w kroku 1.12 do analizy PCR.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza RT-PCR ekspresji dystrofiny
	<ol>
		<li>Wyodrębnij całkowite RNA z tkanek serca za pomocą zestawu do ekstrakcji RNA zgodnie z instrukcją producenta.</li>
		<li>Aby przeprowadzić odwrotną transkrypcję, należy wstępnie potraktować całkowity RNA DNazą wolną od RNaz i użyć 5 μg potraktowanego RNA jako matrycy do syntezy pierwszej nici cDNA za pomocą zestawu do odwrotnej transkrypcji.</li>
		<li>Użyj produktu do odwrotnej transkrypcji do analizy RT-PCR ekspresji dystrofiny za pomocą starterów cDNA dystrofiny: 5'-GGCTAGAGTATCAAACCAACATCAT i 5'- TGGAGGCTTACGGTTTTATCC.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oszacowanie skuteczności edycji genów za pomocą analizy qPCR
	<ol>
		<li>Oszacuj skuteczność edycji genów za pomocą ilościowego RT-PCR w celu wykrycia redukcji transkryptów zawierających ekson 22 za pomocą startera do przodu (ekson 21): 5'-TTGTCAGCTCTTCAGCCTCAAAA i startera odwrotnego (ekson 23): 5'-AAACTCTCCTTCACAGTGTCACT. Użyj Gapdh jako genu referencyjnego ze starterem do przodu: 5'- AGGTTGTCTCCTGCGACTTC i starterem odwrotnym: 5'- GGTGGTCCAGGGTTTCTTACT.</li>
		<li>Przeprowadzić ilościowy PCR w czasie rzeczywistym (qPCR) za pomocą zestawu qPCR zgodnie z instrukcją producenta w systemie Real-Time PCR i 2-etapowymi warunkami reakcji: 95 °C 3 min, 45 cykli 95 °C 5 s i 61 °C 30 sek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie immunofluorescencyjne w celu analizy ekspresji dystrofiny
	<ol>
		<li>Zamrożone tkanki pociąć za pomocą kriostatu o grubości 10 μm. Zamrożone skrawki utrwalić 4% paraformaldehydem w temperaturze pokojowej przez 15 minut.</li>
		<li>Przemyć 2x PBS i inkubować z roztworem blokującym (10% surowicy końskiej) przez 1 godzinę.</li>
		<li>Inkubować pierwszorzędowe przeciwciało antydystrofiny w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
		<li>Przemyć szkiełka PBS 3 x 5 min i inkubować z fluorescencyjnymi przeciwciałami drugorzędowymi (1:500) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
		<li>Zamontuj szkiełka za pomocą medium montażowego z DAPI i obrazowania za pomocą odwróconego mikroskopu konfokalnego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Analiza off-target za pomocą testu T7E1
<ol>
	<li>Przewiduj potencjalne witryny niedocelowe, korzystając z internetowych narzędzi do projektowania CRISPR, takich jak <http://crispr.mit.edu>.</li>
	<li>Amplifikować regiony genomu obejmujące 5-10 górnych potencjalnych miejsc poza celem za pomocą PCR: genomowe DNA 200 ng, 1 μl polimerazy DNA o wysokiej wierności, 5 μl 10x mieszanina buforowa PCR, 1,5 μl 10 μmol/L specyficznych dla miejsca starterów do przodu i do tyłu, dostosowując całkowitą objętość do 50 μl z ddH2O.</li>
	<li>Uruchom produkty PCR za pomocą elektroforezy, wyekstrahuj i oczyść DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu. Zmierzyć stężenie za pomocą spektrofotometrów.</li>
	<li>Promuj tworzenie heterodupleksu poprzez denaturację i ponowne wyżarzanie oczyszczonych amplikonów powoli w buforze 2.1 przy użyciu cyklera PCR. Stosuj te same warunki jazdy na rowerze, jak opisano w kroku 1.2.</li>
	<li>Ponownie wyżarzone produkty trawić przez 30 minut w temperaturze 37 °C za pomocą 0,5 μl enzymu T7E1 i analizować reakcję za pomocą elektroforezy przy użyciu 1-2% żelu agarozowego. 
	UWAGA: Amplikony mogą być również analizowane za pomocą ukierunkowanego głębokiego sekwencjonowania.</li>
</ol>

<ol><li>Makarova, K. S., Koonin, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Annotation+and+Classification+of+CRISPR-Cas+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Annotation and Classification of CRISPR-Cas Systems.</a> Methods Mol Biol. 1311, 47-75 (2015).</li>
<li>Zetsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cpf1+is+a+single+RNA-guided+endonuclease+of+a+class+2+CRISPR-Cas+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system.</a> Cell. 163, 759-771 (2015).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339, 819-823 (2013).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339, 823-826 (2013).</li>
<li>Lieber, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+double-strand+DNA+break+repair+by+the+nonhomologous+DNA+end-joining+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+biochemistry%22%5BJournal%5D)">The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway.</a> Annual review of biochemistry. 79, 181-211 (2010).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature protocols. 8, 2281-2308 (2013).</li>
<li>Zhang, X., Wang, J., Cheng, Q., Zheng, X., Zhao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+gene+regulation+by+CRISPR-ddCpf1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+discovery%22%5BJournal%5D)">Multiplex gene regulation by CRISPR-ddCpf1.</a> Cell discovery. 3, 17018(2017).</li>
<li>Zhang, X. H., Tee, L. Y., Wang, X. G., Huang, Q. S., Yang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Off-target+Effects+in+CRISPR%2FCas9-mediated+Genome+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+therapy.+Nucleic+acids%22%5BJournal%5D)">Off-target Effects in CRISPR/Cas9-mediated Genome Engineering.</a> Molecular therapy. Nucleic acids. 4, e264(2015).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-mediated+genome+editing+restores+dystrophin+expression+and+function+in+mdx+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">CRISPR-mediated genome editing restores dystrophin expression and function in mdx mice.</a> Mol Ther. 24, 564-569 (2015).</li>
<li>Long, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+genome+editing+partially+restores+dystrophin+expression+in+a+mouse+model+of+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Postnatal genome editing partially restores dystrophin expression in a mouse model of muscular dystrophy.</a> Science. 351, 400-403 (2016).</li>
<li>Long, C. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+muscular+dystrophy+in+mice+by+CRISPR%2FCas9-mediated+editing+of+germline+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Prevention of muscular dystrophy in mice by CRISPR/Cas9-mediated editing of germline DNA.</a> Science. 345, 1184-1188 (2014).</li>
<li>Nelson, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome+editing+improves+muscle+function+in+a+mouse+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Science. 351, 403-407 (2016).</li>
<li>Ousterout, D. G. K., Thakore, A. M., Majoros, P. I., Reddy, T. E. W. H., Gersbach, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+CRISPR%2FCas9-based+genome+editing+for+correction+of+dystrophin+mutations+that+cause+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause Duchenne muscular dystrophy.</a> Nat Commun. 6, 6244(2015).</li>
<li>Tabebordbar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+editing+in+dystrophic+mouse+muscle+and+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells.</a> Science. 351, 407-411 (2016).</li>
<li>Bengtsson, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle-specific+CRISPR%2FCas9+dystrophin+gene+editing+ameliorates+pathophysiology+in+a+mouse+model+for+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Muscle-specific CRISPR/Cas9 dystrophin gene editing ameliorates pathophysiology in a mouse model for Duchenne muscular dystrophy.</a> Nat Commun. 8, 14454(2017).</li>
<li>Hoffman, E. P., Brown, R. H., Kunkel, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophin%3A+the+protein+product+of+the+Duchenne+muscular+dystrophy+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus.</a> Cell. 51, 919-928 (1987).</li>
<li>Nowak, K. J., Davies, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duchenne+muscular+dystrophy+and+dystrophin%3A+pathogenesis+and+opportunities+for+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+reports%22%5BJournal%5D)">Duchenne muscular dystrophy and dystrophin: pathogenesis and opportunities for treatment.</a> EMBO reports. 5, 872-876 (2004).</li>
<li>Mendell, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence-based+path+to+newborn+screening+for+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+neurology%22%5BJournal%5D)">Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy.</a> Annals of neurology. 71, 304-313 (2012).</li>
<li>Mendell, J. R., Lloyd-Puryear, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Report+of+MDA+muscle+disease+symposium+on+newborn+screening+for+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Report of MDA muscle disease symposium on newborn screening for Duchenne muscular dystrophy.</a> Muscle Nerve. 48, 21-26 (2013).</li>
<li>Spurney, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyopathy+of+Duchenne+muscular+dystrophy%3A+current+understanding+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Cardiomyopathy of Duchenne muscular dystrophy: current understanding and future directions.</a> Muscle Nerve. 44, 8-19 (2011).</li>
<li>Moriuchi, T., Kagawa, N., Mukoyama, M., Hizawa, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8211986">Autopsy analyses of the muscular dystrophies.</a> Tokushima J Exp Med. 40, 83-93 (1993).</li>
<li>McNally, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+approaches+in+the+therapy+of+cardiomyopathy+in+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+medicine%22%5BJournal%5D)">New approaches in the therapy of cardiomyopathy in muscular dystrophy.</a> Annual review of medicine. 58, 75-88 (2007).</li>
<li>Baker, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approvals%2C+Submission%2C+and+Important+Labeling+Changes+for+US+Marketed+Pharmaceuticals%5BTitle%5D)+AND+%22Hosp+Pharm%22%5BJournal%5D)">Approvals, Submission, and Important Labeling Changes for US Marketed Pharmaceuticals.</a> Hosp Pharm. 52, 306-307 (2013).</li>
<li>Baker, D. E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28515510">Eteplirsen.</a> Hosp Pharm. 52, 302-305 (2017).</li>
<li>Sicinski, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+of+muscular+dystrophy+in+the+mdx+mouse%3A+a+point+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The molecular basis of muscular dystrophy in the mdx mouse: a point mutation.</a> Science. 244, 1578-1580 (1989).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-mediated+Genome+Editing+Restores+Dystrophin+Expression+and+Function+in+mdx+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+therapy+%3A+the+journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">CRISPR-mediated Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Function in mdx Mice.</a> Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 24, 564-569 (2016).</li>
<li>El Refaey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Genome+Editing+Restores+Dystrophin+Expression+and+Cardiac+Function+in+Dystrophic+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">In Vivo Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Cardiac Function in Dystrophic Mice.</a> Circ Res. 121, 923-929 (2017).</li>
<li>Tabebordbar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+editing+in+dystrophic+mouse+muscle+and+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells.</a> Science. 351, 407-411 (2016).</li>
<li>Pozsgai, E. R., Griffin, D. A., Heller, K. N., Mendell, J. R., Rodino-Klapac, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Sarcoglycan+gene+transfer+decreases+fibrosis+and+restores+force+in+LGMD2E+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+therapy%22%5BJournal%5D)">beta-Sarcoglycan gene transfer decreases fibrosis and restores force in LGMD2E mice.</a> Gene therapy. 23, 57-66 (2016).</li>
<li>Chicoine, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmapheresis+eliminates+the+negative+impact+of+AAV+antibodies+on+microdystrophin+gene+expression+following+vascular+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Plasmapheresis eliminates the negative impact of AAV antibodies on microdystrophin gene expression following vascular delivery.</a> Mol Ther. 22, 338-347 (2014).</li>
<li>Chicoine, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+delivery+of+rAAVrh74.MCK.GALGT2+to+the+gastrocnemius+muscle+of+the+rhesus+macaque+stimulates+the+expression+of+dystrophin+and+laminin+alpha2+surrogates%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Vascular delivery of rAAVrh74.MCK.GALGT2 to the gastrocnemius muscle of the rhesus macaque stimulates the expression of dystrophin and laminin alpha2 surrogates.</a> Mol Ther. 22, 713-724 (2014).</li>
<li>Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+T7E1+and+surveyor+mismatch+cleavage+assays+to+detect+mutations+triggered+by+engineered+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases.</a> G3. 5, 407-415 (2015).</li>
<li>Tsai, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GUIDE-seq+enables+genome-wide+profiling+of+off-target+cleavage+by+CRISPR-Cas+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases.</a> Nat Biotechnol. 33, 187-197 (2015).</li>
</ol>

Nie występuje konflikt interesów.

W tym protokole szczegółowo opisujemy wszystkie kroki niezbędne do osiągnięcia edycji genów serca in vivo u myszy po urodzeniu przy użyciu dostarczania SaCas9 i dwóch gRNA za pośrednictwem rAAVrh.74. Jak wcześniej wspomniano, podejście to można wykorzystać do przywrócenia ekspresji dystrofiny u myszy z dystrofią, jak opisano w naszej pracy27, ale może również umożliwić szybkie badania genetyki odwrotnej genów związanych z sercem u myszy bez długiego procesu tradycyjnego podejścia do nokau...

Technologia CRISPR (ang. clustered, regularly interspace, short palindromic repeats) stanowi najnowszy postęp w inżynierii genomu i zrewolucjonizowała obecną praktykę genetyki w komórkach i organizmach. Edycja genomu oparta na CRISPR wykorzystuje pojedynczy przewodnik RNA (gRNA) do kierowania endonukleazy związanej z CRISPR, takiej jak białko 9 (Cas9) i Cpf1 związane z CRISPR, do celu genomowego DNA, który jest komplementarny w sekwencji do protospaceru kodowanego przez gRNA ze specyficznym motywem sąsiadującym z protospacerem (PAM)1,2. PAM różni się w zależności od gatunku bakterii genu Cas9 lub Cpf1. Najczęściej stosowana nukleaza Cas9 pochodząca ze Streptococcus pyogenes (SpCas9) rozpoznaje sekwencję PAM NGG, która znajduje się bezpośrednio za sekwencją docelową w genomowym DNA, na nici niedocelowej. W miejscu docelowym białka Cas9 i Cpf1 generują pęknięcie dwuniciowe (DSB), które jest następnie naprawiane przez wewnętrzne mechanizmy naprawy DNA komórkowego, w tym niehomologiczne szlaki łączenia końców (NHEJ) i naprawy ukierunkowanej na homologię (HDR)3,4. W przypadku braku matrycy DNA do rekombinacji homologicznej, DSB jest przede wszystkim naprawiany przez podatny na błędy szlak NHEJ, co może powodować insercje lub delecje (indele) nukleotydów powodujące mutacje przesunięcia ramki odczytu, jeśli DSB zostały utworzone w regionie kodującym genu 5,6. W związku z tym system CRISPR jest szeroko stosowany do inżynierii mutacji powodujących utratę funkcji w różnych modelach komórkowych i całych organizmach w celu zbadania funkcji genu. Co więcej, katalitycznie nieaktywne Cas9 i Cpf1 zostały opracowane w celu transkrypcyjnego i epigenetycznego modulowania ekspresji docelowych genów7,8.
Niedawno, zarówno SpCas9, jak i SaCas9 (pochodzące od Staphylococcus aureus) zostały zapakowane w rekombinowane wektory wirusa związanego z adenowirusem (rAAV) w celu poporodowej korekty genów w zwierzęcym modelu chorób ludzkich, w szczególności dystrofii mięśniowej Duchenne'a (DMD)9,10,11,12,13,14,15. DMD jest śmiertelną chorobą recesywną sprzężoną z chromosomem X, spowodowaną mutacjami w genie DMD, który koduje białko dystrofiny16,17, dotykającą około jednego na 3500 urodzeń płci męskiej według badań przesiewowych noworodków18,19. Charakteryzuje się postępującym osłabieniem i zanikiem mięśni. Pacjenci z DMD zwykle tracą zdolność chodzenia między 10 a 12 rokiem życia i umierają z powodu niewydolności oddechowej i/lub serca w wieku 20-30 lat20. Warto zauważyć, że kardiomiopatia rozwija się u >90% pacjentów z DMD i stanowi główną przyczynę zgonów u pacjentów z DMD21,22. Chociaż Deflazacort (lek przeciwzapalny) i Eteplirsen (lek na pomijanie eksonów do pomijania eksonu 51) zostały niedawno zatwierdzone do leczenia DMD przez Agencję ds. Żywności i Leków (FDA)23,24, żadna z tych metod leczenia nie koryguje wady genetycznej na poziomie genomowego DNA. Mysz mdx, która jest nosicielem mutacji punktowej w eksonie 23 genu dystrofiny, była szeroko stosowana jako model DMD25. Ponadto wcześniej wykazaliśmy, że funkcjonalna ekspresja dystrofiny została przywrócona przez delecję w ramce genomowego DNA obejmującego eksony 21, 22 i 23 w mięśniach szkieletowych myszy mdx przy użyciu domięśniowego dostarczania Ad-SpCas9 / gRNA9, oraz w mięśniu sercowym myszy mdx / utrophin +/- przy użyciu dożylnego i dootrzewnowego dostarczania rAAVrh.74-SaCas9 / gRNA26.
W tym protokole szczegółowo opisujemy każdy krok w poporodowej edycji genów serca w celu przywrócenia dystrofiny u myszy mdx/utropin+/- za pomocą wektorów rAAVrh.74-SaCas9/gRNA, od projektowania gRNA do analizy dystrofiny w sekcjach mięśnia sercowego.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 555 kozia anty-królicza IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21428</td><td></td></tr><tr><td>Nukleaza benzonazowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1014</td><td></td></tr><tr><td>Szafy bezpieczeństwa biologicznego</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1347</td><td>1300 Seria A2 Klasa II, typ A2</td></tr><tr><td>BsaI</td><td>New England BioLabs Inc</td><td>RO535S</td><td></td></tr><tr><td>Kompetentne komórki</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td>200314</tr><tr><td>Szalki do hodowli komórkowych, 150 mm</td><td>Nest Scientific USA</td><td>715001</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td>Leica CM3050S</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MT10017CV</td><td>Corning cellgro</td></tr><tr><td>Przeciwciało dystrofiny</td><td>Spring Bioscience</td><td>E2660</td><td></td></tr><tr><td>Fast-Ion Midi Plasmdi Zestawy</td><td>IBI Scientific</td><td>IB47111</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26-140-079</td><td></td></tr><tr><td>Jednostka filtrująca, 0,45&mu; m</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>166-0045</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Master Mixes</td><td>Promega</td><td>M7122</td><td></td></tr><tr><td>Szybki mini zestaw plazmidowy</td><td>IBI Scientific</td><td>IB47102</td><td></td></tr><tr><td>Serum dla koni</td><td>Abcam</td><td>ab139501</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp 2239 Kąpiel wodna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15-460-11Q</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp Blok ciepła</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11-718</td><td></td></tr><tr><td>Odwrócony mikroskop konfokalny</td><td>Carl Zeiss Microscopy, LLC</td><td></td><td>LSM 780</td></tr><tr><td>LightCycler 480 instrument</td><td>Roche</td><td>5015243001</td><td>LightCycler 480 Instrument II</td></tr><tr><td>Wirówka o dużej pojemności</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>46-910</td><td>Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus</td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75002445</td><td>Spektrofotometry Sorvall Legend Micro 21R</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND2000CLAPTOP</td><td>NanoDrop&trade; 2000/2000c</td></tr><tr><td>Oligos for i20-F</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>CACCgGGCGT TGAAATTCTCATTAC</td></tr><tr><td>Oligos for i20-R</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>AAAC GTAATGAGAATTTCAACGCCc;</td></tr><tr><td>Oligosy dla i23-F</td><td>Zintegrowane technologie</td><td></td> DNA <td>CACCgCACCGATGAGAGGG AAAGGTC</td></tr><tr><td>Olikleotydaże dla i23-R</td><td>Zintegrowane technologie</td><td></td> DNA <td>GACCTTTCCCTCTCTCATCGGTGc</td></tr><tr><td>Oligos</td><td>Zintegrowane technologie</td><td></td><td></td>DNA</tr><tr><td>OptiPrep Gradient gęstości</td><td>Medium Sigma-Aldrich</td><td>D1556-250ML</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>31985070</tr><tr><td>PEG8000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89510-1kg-F</td><td></td></tr><tr><td>Polietyleninomina</td><td>Polysciences</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2308</td><td></td></tr><tr><td>Probówka wirówkowa Quick-Seal</td><td>Beckman Coulter Inc</td><td>342414</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji żelu QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Zestawy Radiant SYBR Green Hi-ROX qPCR</td><td>Alkali Scientific</td><td>QS2005</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do odwrotnej transkrypcji RevertAid RT</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K1691</td><td></td></tr><tr><td>Rotor</td><td>Beckman Coulter Inc Ligaza</td> DNA <td>337922</td><td>Type 70Ti</td></tr><tr><td>T4</td><td>New England BioLabs Inc</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Termocykler</td><td>Bio-rad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Odczynnik</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka</td><td>Beckman Coulter Inc</td><td>8043-30-1192</td><td>Optima le-80k</td></tr><tr><td>Ultra odśrodkowa jednostka filtrująca</td><td>MilliporeSigma</td><td>UFC510096</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Medium montażowe z DAPI</td><td>Vector Laboratories, Inc</td><td>H-1200</td><td></td></tr></tbody></table>

dostarczanie crispr za pośrednictwem wirusa za pośrednictwem adenowirusa do edycji genów serca u myszy

Adeno-Associated Virus-Mediated Delivery of CRISPR for Cardiac Gene Editing in Mice

Grupowany, regularnie rozmieszczony, krótki, palindromiczny system powtórzeń (CRISPR) znacznie ułatwił inżynierię genomu zarówno w hodowanych komórkach, jak i żywych organizmach z wielu różnych gatunków. Technologia CRISPR była również badana jako nowatorskie metody leczenia wielu chorób u ludzi. Dane potwierdzające słuszność koncepcji są bardzo zachęcające, czego przykładem są ostatnie badania, które wykazują wykonalność i skuteczność podejścia terapeutycznego opartego na edycji genów w dystrofii mięśniowej Duchenne'a (DMD) przy użyciu modelu mysiego. W szczególności dożylne i dootrzewnowe wstrzyknięcie rekombinowanego wirusa związanego z adenowirusem (rAAV) serotypu rh.74 (rAAVrh.74) umożliwiło skuteczne dostarczanie do serca białka 9 związanego z CRISPR Staphylococcus aureus (SaCas9) i dwóch przewodnikowych RNA (gRNA) w celu usunięcia regionu genomowego ze zmutowanym kodonem w eksonie 23 mysiego Dmd gen. To samo podejście można również wykorzystać do wyeliminowania interesującego genu i zbadania ich funkcji serca u myszy po urodzeniu, gdy gRNA jest zaprojektowane tak, aby celować w region kodujący gen. W tym protokole pokazujemy szczegółowo, jak zaprojektować wektor rAAVrh.74-CRISPR i jak osiągnąć wysoce wydajne dostarczanie serca u nowonarodzonych myszy.

Skuteczność gRNA w indukowaniu delecji docelowego regionu genomowego DNA powinna zostać oceniona w hodowlach komórkowych przed pakowaniem do rAAV w celu przeprowadzenia badań in vivo. W tym celu gRNA oraz konstrukty wykazujące ekspresję SaCas9 wprowadzono do komórek C2C12 drogą elektroporacji, a następnie przeanalizowano genomowe DNA za pomocą PCR z użyciem starterów flankujących miejsca docelowe (Rysunek 1). Produkt PCR o wielkości ~50 bp wskazuje na udaną d...

Tutaj udostępniamy szczegółowy protokół do przeprowadzenia in vivo edycji genów serca u myszy przy użyciu rekombinowanego wirusa związanego z adenowirusem (rAAV) za pośrednictwem CRISPR. Protokół ten oferuje obiecującą strategię terapeutyczną w leczeniu kardiomiopatii dystroficznej w dystrofii mięśniowej Duchenne'a i może być stosowany do generowania specyficznego dla serca nokautu u myszy po urodzeniu.

Dostarczanie CRISPR za pośrednictwem wirusa za pośrednictwem adenowirusa do edycji genów serca u myszy

The clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system has greatly facilitated genome engineering in both cultured cells and ...

Ogólnym celem tego protokołu edycji genów serca in vivo jest przywrócenie ekspresji dystrofiny w sercu myszy z dystrofią przy użyciu rekombinowanego wirusa związanego z adenowirusem rh. 74 z CRISPR SaCas9 i wektorami przewodnika RNA. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie dystrofii mięśniowej, takie jak to, czy edycja genów jest wiarygodną strategią terapeutyczną w leczeniu pierwotnej przyczyny kardiomiopatii związanej z dystrofią mięśniową Duchenne'a.Główną zaletą tych technik jest to, że ekspresja skorygowanego genu dystrofiny znajduje się pod jego endogenną kontrolą regulacyjną, a ten efekt ratunkowy jest trwały. Implikacje tej techniki rozciągają się na leczenie innych chorób genetycznych, w których korektę zmutowanego genu można osiągnąć za pomocą technologii edycji genów CRISPR Cas9. Metoda ta nie tylko zapewnia wgląd w odbudowę dystrofiny w dystroficznym sercu, ale może być również wykorzystana do wyeliminowania interesującego genu do odwrotnych badań genetycznych.Procedurę zademonstruje Yandi Gao, technik z naszego laboratorium. Właściwe zaprojektowanie przewodnikowych RNA lub gRNA ma kluczowe znaczenie dla powodzenia tego protokołu. Wybierz dwa gRNA ukierunkowane na intron dystrofiny 20 i intron 23 dla dziewiątego białka związanego z CRISPR Staphylococcus aureus.Sekwencja motywu przylegającego do protospaceru dla każdego gRNA jest podkreślona i zapisana kursywą. Aby wyżarzać oligonukleotydy gRNA, należy przeprowadzić reakcję zawierającą 100 mikromoli na litr oligonukleotydów gRNA w 1x buforze do wyżarzania. Użyj następujących parametrów PCR: 95 stopni Celsjusza przez 10 minut, 90 cykli od 95 do 59 stopni Celsjusza ze spadkiem o 0,4 stopnia Celsjusza na cykl przez 20 sekund, 90 cykli od 59 do 32 stopni Celsjusza ze spadkiem o 0,3 stopnia Celsjusza na cykl przez 20 sekund i 20 cykli od 32 do 26 stopni Celsjusza ze spadkiem o 0,3 stopnia Celsjusza na cykl przez 20 sekund.Następnie przygotuj się do ligacji wyżarzonych oligonukleotydów gRNA do wektora CRISP w jednej reakcji. Dodaj do probówki: jeden mikrolitr 50 nanogramów na mikrolitr wektora CRISPR, jeden mikrolitr wyżarzonych oligonukleotydów, 1,5 mikrolitra 10x buforu ligazy DNA T4, 0,5 mikrolitra ligazy DNA T4, jeden mikrolitr BSAL i 10 mikrolitrów podwójnie destylowanej wody. Przeprowadź następującą reakcję w termocyklerze: pięć cykli 37 stopni Celsjusza przez pięć minut i 16 stopni Celsjusza przez 10 minut, 37 stopni Celsjusza przez 20 minut i 80 stopni Celsjusza przez pięć minut.Przekształć 15-mikrolitrowy produkt ligacji w 30 mikrolitrów kompetentnych komórek i umieść komórki na płytce agarowej zawierającej 100 mikrogramów na mililitr ampicyliny. Kultura w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Następnego dnia wybierz od pięciu do 10 kolonii z płytki agarowej i zahoduj w pożywce LB zawierającej 100 mikrogramów na mililitr ampicyliny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 250 obr./min przez trzy do czterech godzin.Aby przebadać kolonie metodą PCR, przygotuj reakcje, z których każda zawiera 10 mikrolitrów głównej mieszanki PCR, osiem mikrolitrów podwójnie destylowanej wody, jeden mikrolitr kultury E. coli, jeden mikrolitr startera U6-forward i jeden mikrolitr startera odwrotnego i20 lub i23 gRNA. Użyj następujących parametrów cyklicznych PCR: 95 stopni Celsjusza przez pięć minut, a następnie 35 cykli po 95 stopni Celsjusza przez 30 sekund, 61 stopni Celsjusza przez 30 sekund i 72 stopnie Celsjusza przez 30 sekund. Po zidentyfikowaniu dodatnich klonów należy przygotować pięciomililitrową hodowlę każdego dodatniego klonu, dodając cztery mililitry świeżej pożywki LB zawierającej 100 mikrogramów na mililitr ampicyliny i hodując w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 250 obr./min przez noc.Następnego dnia oczyść DNA plazmidu za pomocą odpowiedniego zestawu do ekstrakcji plazmidu. Plazmid jest następnie weryfikowany przez sekwencjonowanie Sangera ze starterem U6-forward. Aby przetestować skuteczność edycji genów plazmidów, hoduj komórki C2C12 w DMEM uzupełnione 10% FBS i 1% Pen-Strep, aż komórki osiągną około 70% konfluencji.Elektroportować łącznie pięć mikrogramów mieszaniny plazmidu SaCas9/gRNA w stosunku molowym jeden do jednego do komórek C2C12 zgodnie z protokołem producenta. 48 godzin po transfekcji pobrać komórki C2C12 i wyekstrahować genomowe DNA zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Użyj genomowego DNA jako matrycy do przeprowadzenia PCR dla locus dystrofiny myszy.Przygotuj reakcje zawierające starter do przodu, starter odwrotny, zieloną mieszankę główną PCR, wodę podwójnie destylowaną i 100 nanogramów genomowego DNA. Należy stosować te same warunki PCR, co w przypadku badań przesiewowych klonów z dodatnim wynikiem badania. Przed rozpoczęciem tej procedury należy przygotować rekombinowany wirus związany z adenowirusem lub rAAV, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Młode myszy mdx w trzecim dniu należy podawać ogólnoustrojowo z cząstkami wirusa we wstrzyknięciu dootrzewnowym. Pozwól myszom dojść do siebie i umieść je z powrotem w klatkach domowych. Po 10 tygodniach od podania rAAV należy pobrać tkanki od myszy.Błyskawiczne zamrożenie tkanek w celu ekstrakcji genomowego DNA i RNA oraz użycie schłodzonego izopentanu w ciekłym azocie do zamrożenia tkanek za pomocą związku o optymalnej temperaturze cięcia do kriosekcji. Rozpocznij protokół barwienia immunofluorescencyjnego, utrwalając zamrożone skrawki tkanki za pomocą 4% paraformaldehydu w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Po 15 minutach umyj skrawki tkanki dwa razy PBS.Inkubować z roztworem blokującym w temperaturze pokojowej przez godzinę. Następnie inkubuj z pierwotnym przeciwciałem anty-dystrofinowym w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego ranka przemyć szkiełka PBS, a następnie inkubować z fluorescencyjnymi przeciwciałami drugorzędowymi w temperaturze pokojowej przez godzinę.Zamontuj szkiełka za pomocą medium montażowego z DAPI, a obraz za pomocą odwróconego mikroskopu konfokalnego. Skuteczność gRNA w indukowaniu delecji docelowego regionu genomowego DNA w hodowlach komórkowych oceniano metodą PCR. Produkt PCR składający się z około 500 par zasad wskazuje na pomyślną delecję docelowego genomowego DNA wynikającą z edycji genów, podczas gdy komórki kontrolne nie powinny dawać prążka.Po potwierdzeniu skuteczności gRNA w hodowlach komórkowych, gRNA są pakowane w rAAV. Cząsteczki wirusa rAAV są oczyszczane, a czystość analizowana przez SDS-PAGE. Obecność tylko trzech prążków odpowiadających trzem białkom kapsydu wskazuje na wysoką czystość.Te reprezentatywne obrazy immunofluorescencyjne wycinków serca myszy typu dzikiego, mdx i mdx leczonych gRNA AAV SaCas9 pokazują systemowo, że gRNA AAV SaCas9 przywraca ekspresję dystrofiny u myszy dystroficznych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak osiągnąć edycję genów serca in vivo u myszy po urodzeniu przy użyciu rAAV rh. 74-pośredniczące dostarczanie SaCas9 i gRNA.

adeno-associated-virus-mediated-delivery-crispr-for-cardiac-gene

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

W tym filmie pokazujemy dostarczanie rekombinowanego genu związanego z adeno na bazie wirusa u szczeniaka myszy. Metoda ta pomaga w badaniu ekspresji genów w docelowych komórkach.

Dostarczanie genów na podstawie rekombinowanego wirusa związanego z adenowirusem: technika dostarczania transgenu i ekspresji specyficznej dla serca w modelu gryzoni

System CRISPR/Cas9 oferuje potencjał, aby uczynić ukierunkowaną edycję genomu dostępną i przystępną cenowo dla społeczności naukowej. Protokół ten ma na celu zademonstrowanie, jak tworzyć wirusy, które znokautują interesujący nas gen za pomocą systemu CRISPR/Cas9, a następnie wstrzykną je stereotaktycznie do mózgu dorosłej myszy.

Projektowanie, pakowanie i dostarczanie wysokomianowych CRISPR Retro i lentiwirusów poprzez iniekcję stereotaktyczną

W tym manuskrypcie opisana jest metoda przygotowania rekombinowanych wektorów wirusa 9 (rAAV9) do manipulowania ekspresją genów w sercu myszy.

Przygotowanie rAAV9 do nadekspresji lub knockdown genów w sercach myszy

Zgrupowany, regularnie rozmieszczony, krótki powtórzeń palindromicznych/system białka związanego z CRISPR 9 (CRISPR/Cas9) stanowi obiecujące narzędzie dla inżynierii genetycznej i otwiera możliwość celowej integracji transgenów. Opisujemy strategię opartą na łączeniu końców za pośrednictwem homologii (HMEJ) dla efektywnej ukierunkowanej integracji DNA in vivo i celowanych terapii genowych przy użyciu CRISPR/Cas9.

Ukierunkowana integracja in vivo za pośrednictwem CRISPR/Cas9 przy użyciu strategii opartej na łączeniu końcowym za pośrednictwem homologii

Tutaj prezentujemy protokół manipulacji genami specyficznymi dla serca u myszy. W znieczuleniu serca myszy zostały uzewnętrznione przez czwartą przestrzeń międzyżebrową. Następnie adenowirusy kodujące określone geny wstrzyknięto za pomocą strzykawki do mięśnia sercowego, a następnie dokonano pomiaru ekspresji białka za pomocą obrazowania in vivo i analizy Western blot.

Prosta i skuteczna metoda manipulacji genami in vivo specyficznymi dla serca poprzez wstrzyknięcie do mięśnia sercowego u myszy

Opisane są protokoły wysoce efektywnej edycji genomu mysich hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) przez system CRISPR/Cas9 w celu szybkiego rozwoju mysich systemów modelowych z modyfikacjami genów specyficznymi dla układu krwiotwórczego.

Edycja genomu za pośrednictwem lentiwirusowego CRISPR/Cas9 w celu badania komórek krwiotwórczych w modelach chorobowych

Rozwój modeli mysich z specyficznymi genami zmutowanymi u pacjentów z rakiem głowy i szyi jest niezbędny do zrozumienia nowotworów. W tym miejscu przedstawiamy protokół transformacji in vitro pierwotnych komórek języka myszy przy użyciu systemu Cas9 związanego z adenowirusem do generowania mysich linii komórkowych HNC ze specyficznymi zmianami genomowymi.

Ustanowienie in vitro genetycznie zmodyfikowanej linii komórkowej mysiego raka głowy i szyi przy użyciu systemu Cas9 związanego z adenowirusem

W tym protokole opisujemy procedury techniczne do generowania myszy z nokautem specyficznym dla brązowej tkanki tłuszczowej (BAT), wykorzystując połączony system Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 i systemu jednoprowadnicowego RNA (sgRNA) związanego z adenowirusem (AAV). Opisane etapy obejmują projektowanie sgRNA, przygotowanie cząstek AAV-sgRNA oraz mikroiniekcję AAV do płatów BAT.

Generowanie myszy z nokautem specyficznych dla brązowego tłuszczu przy użyciu połączonego systemu Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 i jednoprzewodnikowego systemu RNA wirusa związanego z adenowirusem

Ten protokół przedstawia zoptymalizowane podejście do produkcji genetycznie modyfikowanych modeli szczurów. Wirus związany z adenowirusem (AAV) służy do dostarczania matrycy naprawy DNA, a elektroporacja służy do dostarczania odczynników CRISPR-Cas9 w celu zakończenia procesu edycji genomu w zarodku 2-komórkowym.

CRISPR-Cas9 Edycja genomu zarodków szczurów przy użyciu wirusa związanego z adenowirusem (AAV) i elektroporacją zarodków 2-komórkowych

Ten raport szczegółowo opisuje zlokalizowany sposób wstrzyknięcia wektorów AAV za pośrednictwem miednicy nerkowej w celu skutecznego i bezpiecznego przeniesienia genu do nerki myszy.

Skuteczne i bezpieczne dostarczenie genów do nerki myszy poprzez powolne wstrzyknięcie wsteczne do miedniczki nerkowej wektorów adeno-stowarzyszonych wirusów

Poznaj metodę edycji genów serca u myszy za pomocą wirusa AAV i CRISPR, która przywraca ekspresję dystrofiny. Ta technika oferuje trwałą strategię terapeutyczną dla kardiomiopatii związanej z dystrofią mięśniową Duchenne'a.

Dostarczanie CRISPR za pośrednictwem wirusa za pośrednictwem adenowirusa do edycji genów serca u myszy

Przeglądaj więcej filmów