Dostarczanie CRISPR za pośrednictwem wirusa za pośrednictwem adenowirusa do edycji genów serca u myszy

Ogólnym celem tego protokołu edycji genów serca in vivo jest przywrócenie ekspresji dystrofiny w sercu myszy z dystrofią przy użyciu rekombinowanego wirusa związanego z adenowirusem rh. 74 z CRISPR SaCas9 i wektorami przewodnika RNA. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie dystrofii mięśniowej, takie jak to, czy edycja genów jest wiarygodną strategią terapeutyczną w leczeniu pierwotnej przyczyny kardiomiopatii związanej z dystrofią mięśniową Duchenne'a.

Główną zaletą tych technik jest to, że ekspresja skorygowanego genu dystrofiny znajduje się pod jego endogenną kontrolą regulacyjną, a ten efekt ratunkowy jest trwały. Implikacje tej techniki rozciągają się na leczenie innych chorób genetycznych, w których korektę zmutowanego genu można osiągnąć za pomocą technologii edycji genów CRISPR Cas9. Metoda ta nie tylko zapewnia wgląd w odbudowę dystrofiny w dystroficznym sercu, ale może być również wykorzystana do wyeliminowania interesującego genu do odwrotnych badań genetycznych.

Procedurę zademonstruje Yandi Gao, technik z naszego laboratorium. Właściwe zaprojektowanie przewodnikowych RNA lub gRNA ma kluczowe znaczenie dla powodzenia tego protokołu. Wybierz dwa gRNA ukierunkowane na intron dystrofiny 20 i intron 23 dla dziewiątego białka związanego z CRISPR Staphylococcus aureus.

Sekwencja motywu przylegającego do protospaceru dla każdego gRNA jest podkreślona i zapisana kursywą. Aby wyżarzać oligonukleotydy gRNA, należy przeprowadzić reakcję zawierającą 100 mikromoli na litr oligonukleotydów gRNA w 1x buforze do wyżarzania. Użyj następujących parametrów PCR: 95 stopni Celsjusza przez 10 minut, 90 cykli od 95 do 59 stopni Celsjusza ze spadkiem o 0,4 stopnia Celsjusza na cykl przez 20 sekund, 90 cykli od 59 do 32 stopni Celsjusza ze spadkiem o 0,3 stopnia Celsjusza na cykl przez 20 sekund i 20 cykli od 32 do 26 stopni Celsjusza ze spadkiem o 0,3 stopnia Celsjusza na cykl przez 20 sekund.

Następnie przygotuj się do ligacji wyżarzonych oligonukleotydów gRNA do wektora CRISP w jednej reakcji. Dodaj do probówki: jeden mikrolitr 50 nanogramów na mikrolitr wektora CRISPR, jeden mikrolitr wyżarzonych oligonukleotydów, 1,5 mikrolitra 10x buforu ligazy DNA T4, 0,5 mikrolitra ligazy DNA T4, jeden mikrolitr BSAL i 10 mikrolitrów podwójnie destylowanej wody. Przeprowadź następującą reakcję w termocyklerze: pięć cykli 37 stopni Celsjusza przez pięć minut i 16 stopni Celsjusza przez 10 minut, 37 stopni Celsjusza przez 20 minut i 80 stopni Celsjusza przez pięć minut.

Przekształć 15-mikrolitrowy produkt ligacji w 30 mikrolitrów kompetentnych komórek i umieść komórki na płytce agarowej zawierającej 100 mikrogramów na mililitr ampicyliny. Kultura w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Następnego dnia wybierz od pięciu do 10 kolonii z płytki agarowej i zahoduj w pożywce LB zawierającej 100 mikrogramów na mililitr ampicyliny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 250 obr./min przez trzy do czterech godzin.

Aby przebadać kolonie metodą PCR, przygotuj reakcje, z których każda zawiera 10 mikrolitrów głównej mieszanki PCR, osiem mikrolitrów podwójnie destylowanej wody, jeden mikrolitr kultury E. coli, jeden mikrolitr startera U6-forward i jeden mikrolitr startera odwrotnego i20 lub i23 gRNA. Użyj następujących parametrów cyklicznych PCR: 95 stopni Celsjusza przez pięć minut, a następnie 35 cykli po 95 stopni Celsjusza przez 30 sekund, 61 stopni Celsjusza przez 30 sekund i 72 stopnie Celsjusza przez 30 sekund. Po zidentyfikowaniu dodatnich klonów należy przygotować pięciomililitrową hodowlę każdego dodatniego klonu, dodając cztery mililitry świeżej pożywki LB zawierającej 100 mikrogramów na mililitr ampicyliny i hodując w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 250 obr./min przez noc.

Następnego dnia oczyść DNA plazmidu za pomocą odpowiedniego zestawu do ekstrakcji plazmidu. Plazmid jest następnie weryfikowany przez sekwencjonowanie Sangera ze starterem U6-forward. Aby przetestować skuteczność edycji genów plazmidów, hoduj komórki C2C12 w DMEM uzupełnione 10% FBS i 1% Pen-Strep, aż komórki osiągną około 70% konfluencji.

Elektroportować łącznie pięć mikrogramów mieszaniny plazmidu SaCas9/gRNA w stosunku molowym jeden do jednego do komórek C2C12 zgodnie z protokołem producenta. 48 godzin po transfekcji pobrać komórki C2C12 i wyekstrahować genomowe DNA zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Użyj genomowego DNA jako matrycy do przeprowadzenia PCR dla locus dystrofiny myszy.

Przygotuj reakcje zawierające starter do przodu, starter odwrotny, zieloną mieszankę główną PCR, wodę podwójnie destylowaną i 100 nanogramów genomowego DNA. Należy stosować te same warunki PCR, co w przypadku badań przesiewowych klonów z dodatnim wynikiem badania. Przed rozpoczęciem tej procedury należy przygotować rekombinowany wirus związany z adenowirusem lub rAAV, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Młode myszy mdx w trzecim dniu należy podawać ogólnoustrojowo z cząstkami wirusa we wstrzyknięciu dootrzewnowym. Pozwól myszom dojść do siebie i umieść je z powrotem w klatkach domowych. Po 10 tygodniach od podania rAAV należy pobrać tkanki od myszy.

Błyskawiczne zamrożenie tkanek w celu ekstrakcji genomowego DNA i RNA oraz użycie schłodzonego izopentanu w ciekłym azocie do zamrożenia tkanek za pomocą związku o optymalnej temperaturze cięcia do kriosekcji. Rozpocznij protokół barwienia immunofluorescencyjnego, utrwalając zamrożone skrawki tkanki za pomocą 4% paraformaldehydu w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Po 15 minutach umyj skrawki tkanki dwa razy PBS.

Inkubować z roztworem blokującym w temperaturze pokojowej przez godzinę. Następnie inkubuj z pierwotnym przeciwciałem anty-dystrofinowym w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego ranka przemyć szkiełka PBS, a następnie inkubować z fluorescencyjnymi przeciwciałami drugorzędowymi w temperaturze pokojowej przez godzinę.

Zamontuj szkiełka za pomocą medium montażowego z DAPI, a obraz za pomocą odwróconego mikroskopu konfokalnego. Skuteczność gRNA w indukowaniu delecji docelowego regionu genomowego DNA w hodowlach komórkowych oceniano metodą PCR. Produkt PCR składający się z około 500 par zasad wskazuje na pomyślną delecję docelowego genomowego DNA wynikającą z edycji genów, podczas gdy komórki kontrolne nie powinny dawać prążka.

Po potwierdzeniu skuteczności gRNA w hodowlach komórkowych, gRNA są pakowane w rAAV. Cząsteczki wirusa rAAV są oczyszczane, a czystość analizowana przez SDS-PAGE. Obecność tylko trzech prążków odpowiadających trzem białkom kapsydu wskazuje na wysoką czystość.

Te reprezentatywne obrazy immunofluorescencyjne wycinków serca myszy typu dzikiego, mdx i mdx leczonych gRNA AAV SaCas9 pokazują systemowo, że gRNA AAV SaCas9 przywraca ekspresję dystrofiny u myszy dystroficznych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak osiągnąć edycję genów serca in vivo u myszy po urodzeniu przy użyciu rAAV rh. 74-pośredniczące dostarczanie SaCas9 i gRNA.