Izolacja zwojów korzenia grzbietowego i hodowla pierwotna w celu zbadania uwalniania neuroprzekaźników
October 6th, 2018
Hodowle pierwotne zwojów korzenia grzbietowego (DRG) są często używane do badania funkcji fizjologicznych lub zdarzeń związanych z patologią w neuronach czuciowych. W tym miejscu demonstrujemy zastosowanie lędźwiowych hodowli DRG do wykrywania uwalniania neuroprzekaźników po stymulacji neuropeptydowego receptora FF typu 2 selektywnym agonistą.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie badań sensorycznych, takie jak nocycepcja obwodowa. Główną zaletą tego technicznego rozwiązania jest to, że bada się mechanizm komórkowy neuronów czuciowych za pomocą modelu, który najbardziej symuluje stan fizjologiczny. Zbierz zwoje korzenia grzbietowego lędźwiowego z pnia dwu- lub trzytygodniowego szczura.
Zacznij od wykonania dwóch cięć wzdłuż boków kręgosłupa i jednego cięcia bocznego, aby zaznaczyć rostralny zasięg kręgosłupa lędźwiowego. Następnie użyj kleszczy do cięcia kości, aby usunąć mięśnie grzbietowe kręgosłupa. Następnie usuń grzbietową część kręgów i odsłoń rdzeń kręgowy.
Następnie użyj nożyczek preparacyjnych i kleszczy, aby usunąć rdzeń kręgowy. Zidentyfikuj DRG odcinka lędźwiowego, licząc kręgi od ostatniego żebra. Ten diagram pokazuje pozycje kręgów.
Użyj mikronożyczek, aby zebrać 12 obustronnych DRG odcinka lędźwiowego od L1 do L6. Usuń wszelkie przyczepione włókna neuronalne, aby poprawić czystość kultury. Przenieś każdy DRG lędźwiowy do 35-milimetrowej płytki hodowlanej zawierającej dwa mililitry lodowatej pożywki bez surowicy. Przenieś 35-milimetrowe naczynie zawierające DRG do okapu laminarnego i umyj DRG trzykrotnie pożywką bez surowicy za pomocą pipety.
Użyj sterylnej pęsety, aby przenieść DRG do nowej 35-milimetrowej płytki hodowlanej zawierającej dwa mililitry sterylnej kolagenazy typu 1A. Umieść tkankę w roztworze kolagenazy w inkubatorze do hodowli tkankowych o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 30 minut, aby rozpocząć dysocjację komórek. Po inkubacji usuń roztwór kolagenazy i umyj DRG trzy razy w dwóch mililitrach zbilansowanego roztworu soli Hanka.
Następnie dodaj dwa mililitry podgrzanej 0,05% trypsyny EDTA do naczynia i traw DRG w inkubatorze przez 30 minut, tak jak poprzednio. Po roztrawieniu użyj szklanej pipety, aby przenieść dwa mililitry roztworu zawierającego DRG do 15-mililitrowej probówki wirówkowej. DRG może przykleić się do szklanej pipety, dlatego ten krok należy wykonywać ostrożnie.
Rzeczywistych strat można uniknąć, trzymając roztwór zawierający DRG w stożkowym końcu szklanej pipety i przenosząc roztwór do probówki wirówkowej powoli, ale bez przerwy. Następnie odwiruj roztwór o sile 290 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odwirowaniu usunąć supernatant i dodać kolejne dwa mililitry pożywki bez surowicy w celu ponownego zawieszenia DRG.
Powtórzyć płukanie dwukrotnie, używając dwóch mililitrów wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej do ponownego zawieszenia tkanki po końcowym odwirowaniu. Za pomocą wcześniej przygotowanej sterylnej, polerowanej płomieniowo pipety ręcznie rozcierać DRG około 60 razy. Następnie wyjmij z inkubatora CO2 24-dołkową płytkę pokrytą poli-L-lizyną zawierającą jeden mililitr pożywki hodowlanej na studzienkę.
Odessać inkubowaną pożywkę hodowlaną z naczynia. Wysiej komórki DRG od jednego szczura do czterech studzienek. Daje to gęstość wysiewu około 500 000 komórek na studzienkę.
Następnego dnia zastąp pożywkę hodowlaną pożywką uzupełnioną 10 mikromolowym AraC i 100 nanogramami na mililitr NGF. Trzeciego dnia po posiewie komórek zmień pożywkę na 0,5 mililitra podgrzanej pożywki bez surowicy i inkubuj przez godzinę. Podczas inkubacji dodać 50 milimolowych siRNA w jednym mikrolitrze wody wolnej od RNaz do 12,5 mikrolitrów pożywki wolnej od surowicy na transfekcję.
Następnie odpipetować 2,5 mikrolitra odczynnika do transfekcji do 10 mikrolitrów podłoża bez surowicy dla każdej transfekcji. Wymieszać oba roztwory pipetą i inkubować ten mieszany roztwór transfekcji przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po 10 minutach dodać roztwór do transfekcji do studzienek 24-dołkowej płytki zawierającej DRG i wymieszać, delikatnie wstrząsając.
Po sześciogodzinnej inkubacji dodaj 0,5 mililitra pożywki hodowlanej z 20% FBS, 10 mikromolowymi AraC i 100 nanogramami na mililitr NGF do każdej studzienki komórek. Na koniec inkubuj DRG w inkubatorze CO2 o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez kolejne 66 godzin. Szóstego dnia po posiewie i 72 godziny po transfekcji siRNA zmień pożywkę hodowlaną na 200 mikrolitrów pożywki bez surowicy.
Po 30-minutowej inkubacji dodać jeden mikrolitr substancji chemicznej stymulującej i delikatnie wymieszać pipetując. Stosowany jest tutaj agonista NPFFR2, dNPA i odpowiadający mu nośnik. Po inkubacji przez wymagany okres należy zebrać pożywkę hodowlaną z naczynia hodowlanego i odwirować w temperaturze 5000 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby usunąć wszelkie zawieszone zanieczyszczenia.
Zebrać supernatant z wirówki i w razie potrzeby rozcieńczyć solą fizjologiczną buforowaną fosforanami. Oznacz poziomy neuroprzekaźników za pomocą dostępnych na rynku zestawów do testów immunoenzymatycznych. Pierwszego dnia ciało komórkowe pojedynczego neuronu wskazanego strzałką zostało przymocowane do dna naczynia.
Obecna jest również komórka glejowa oznaczona grotem strzałki. Komórki glejowe duplikowały i rozszerzały procesy, aby otoczyć ciało komórkowe neuronu czuciowego drugiego dnia, a proces ten był jeszcze bardziej widoczny w trzecim dniu. W innej kulturze białko CGRP zostało wybarwione w celu ujawnienia kształtu neuronów.
Barwienie białka CGRP pojawia się w cytoplazmie i aksonach neuronów czuciowych. Morfologie jądrowe neuronów i komórek glejowych są wyraźne po zabarwieniu DAPI. Neurony mają większe i bardziej zaokrąglone jądro niż komórki glejowe.
Dla porównania, jądra gleju mają bardziej owalny kształt. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w dwie i pół godziny, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak preparować i hodować zwój korzenia grzbietowego i używać go jako narzędzia do badania podstawowych funkcji fizjologicznych.
Nie zapominaj, że praca z komórkami pierwotnymi może być znacznie trudniejsza niż praca ze zwykłymi liniami komórkowymi, a bycie delikatnym jest zawsze najlepszym sposobem podczas wykonywania tej procedury.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie demonstruje wykorzystanie kultur pierwotnych nerwów czuciowych z klastrów rdzeni grzbietowych (DRG) do zbadania funkcji fizjologicznych i zdarzeń patologicznych w neuronach czuciowych. Badanie szczególnie koncentruje się na badaniu uwalniania neuroprzekaźników po stymulacji selektywnym agonistą receptora neuropeptydowego FF typu 2.
Kluczowe komponenty badania
Obszar nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Fizjologia
Tło
- Klastry rdzeni grzbietowych zawierają neurony czuciowe niezbędne do nocycepcji.
- Kultury pierwotne oferują wgląd w zachowanie neuronów w warunkach prawie fizjologicznych.
- Receptor neuropeptydowego FF typu 2 (NPFFR2) odgrywa rolę w przekazywaniu sygnałów przez neurony czuciowe.
- Zrozumienie uwalniania neuroprzekaźników może wyjaśnić mechanizmy przetwarzania sensorycznego.
Cel badania
- Opracowanie metodologii hodowania neuronów rdzeni czuciowych z klastrów lędźwiowych.
- Ocena uwalniania neuroprzekaźników w odpowiedzi na stymulację NPFFR2.
- Dostarczenie wglądu w peryferyjne mechanizmy nocycepcji.
Stosowane metody
- Pierwotne kultury klastrów rdzeni grzbietowych lędźwiowych przygotowano z szczurów młodocianych.
- Procedura obejmuje staranne sekcjonowanie, dysocjację enzymatyczną i sadzenie komórek.
- Klastry rdzeni grzbietowych były hodowane w medium zawierającym czynnik wzrostu nerwów.
- Neurony zostały przetransfekcjonowane siRNA przed stymulacją agonistą NPFFR2.
- Poziomy neuroprzekaźników były oceniane za pomocą enzymowych testów immunologicznych po stymulacji.
Główne wyniki
- Udało się odzyskać i wyhodować neurony czuciowe z klastrów rdzeni grzbietowych lędźwiowych.
- Uwalnianie neuroprzekaźników było wykrywalne po aktywacji NPFFR2.
- Metoda kultury pozwala na badanie odpowiedzi komórkowych w warunkach odzwierciedlających fizjologię in vivo.
- Morfologia i żywotność komórek były utrzymywane przez cały okres kultury.
Wnioski
- Badanie udowadnia wykonalny protokół izolowania i hodowania neuronów klastrów rdzeni grzbietowych lędźwiowych.
- Ustanawia model do badania reakcji neuronów czuciowych na różne bodźce.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia peryferyjnych mechanizmów dotyczących bólu i innych zaburzeń sensorycznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Primary dorsal root ganglia cultures provide a physiologically relevant model for studying sensory neuron function, enabling mechanistic investigation of nociception and neurotransmitter release. This approach supports target validation in pain research by offering a human-relevant system to assess compound effects on neuronal signaling pathways. The method aids in de-risking early-stage targets by linking receptor modulation to measurable neurotransmitter outputs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through direct measurement of neurotransmitter release from primary sensory neurons.
- Operational Value: Provides a reproducible system for assessing target engagement and pathway modulation in a near-physiological context.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by connecting receptor activation (e.g., NPFFR2) to functional outputs like CGRP and substance P release.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantifiable neurotransmitter release data compatible with enzyme immunoassay readouts for compound screening.
- Reproducibility: Standardized isolation and culture procedures yield consistent neuronal responses across replicates.
- Scalability Considerations: Limited by low yield per animal, restricting use in high-throughput applications but suitable for focused mechanistic studies.
Translational & Preclinical Research
- Translational Relevance: Cultured DRG neurons maintain phenotypic characteristics of native sensory neurons, supporting extrapolation to in vivo pain mechanisms.
- Preclinical Continuity: Enables longitudinal assessment of neuronal function from isolation through stimulation and readout.
- Biomarker Alignment: Measurable outputs like CGRP and substance P serve as translational biomarkers of neuronal activation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows, supporting target validation and lead identification by providing functional readouts of neuronal activity prior to preclinical commitment.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing of sensory targets by linking ligand stimulation to neurotransmitter release in primary neurons.
- Screening: Supports medium-throughput assay development where functional neurotransmitter readouts guide compound prioritization.
- Analytics: Enables quantitative assessment of peptide release (e.g., CGRP, substance P) as a proxy for neuronal activation and pathway modulation.
- Translational Research: Connects in vitro findings to in vivo sensory physiology through conserved neuronal properties and response profiles.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating multiple targets within sensory signaling pathways.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances target confidence by providing direct evidence of neurotransmitter release upon receptor modulation.
- Operational Value: Delivers a standardized, reproducible primary cell model reducing variability in mechanistic assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by increasing predictive confidence in target modulation efficacy.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of sensory targets based on functional validation in a disease-relevant system.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary tissue dissection and enzymatic dissociation techniques.
- Dependent on access to juvenile rats and sterile cell culture facilities.
- Necessitates standardized transfection and stimulation protocols for consistent results.
- Limited scalability due to low neuronal yield per animal, constraining use in large-scale screening.
- Demands careful handling to maintain cell viability and phenotypic integrity throughout culture.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:32
Isolation of Rat Lumbar DRG
1:40
Primary Culture of Rat DRG
4:22
Transfection of DRG Cells with NPFFR2 siRNA
5:44
Release of Neurotransmitters from Primary DRG Cells
6:42
Results: Stimulation-induced Release of Neurotransmitters from Cultured DRG Cells
7:36
Conclusion
