Name: Izolacja zwojów korzenia grzbietowego i hodowla pierwotna w celu zbadania uwalniania neuroprzekaźników (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Poznaj metodę izolacji zwojów korzenia grzbietowego i hodowli pierwotnej neuronów czuciowych szczura. Technika umożliwia badanie uwalniania neuroprzekaźników w warunkach zbliżonych do fizjologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Dr. M. Calkinsowi za angielską edycję. Prace te były wspierane przez Chang Gung Memorial Hospital (CMRPD1F0482), Uniwersytet Chang Gung, Centrum Badań nad Zdrowym Starzeniem się (EMRPD1G0171) oraz Ministerstwo Nauki i Technologii (105-2320-B-182-012-MY2).

Wszystkie opisane tutaj metody, które wykorzystują zwierzęta doświadczalne, zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Chang Gung (CGU 13-014).
1. Zbieraj DRG odcinka lędźwiowego od szczurów doświadczalnych
<ol>
	<li>Użyj 2 do 3 tygodniowych szczurów Sprague-Dawley (SD) do zbierania DRG w odcinku lędźwiowym. 
	UWAGA: Neurony DRG pobrane od szczurów w wieku powyżej 4 tygodni nie rosną dobrze w warunkach hodowli opisanych w niniejszym dokumencie.</li>
	<li>Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne w autoklawie.</li>
	<li>Znieczulić szczura mieszaniną tiletaminy i zolazepamu w stosunku 1:1 (20 mg/kg; wstrzyknięcie dootrzewnowe (IP)) i poczekać, aż zwierzę nie wykaże reakcji na wycofanie stopy w teście szczypania palców. 
	UWAGA: W tym protokole można z powodzeniem stosować różne strategie znieczulenia.</li>
	<li>Złóż szczura w ofierze przez ścięcie za pomocą komercyjnej gilotyny.</li>
	<li>Użyj gilotyny, aby odizolować tułów szczura między kończyną przednią a kością udową. Zobacz Rysunek 1A przedstawia diagram regionu, który ma zostać zebrany. 
	UWAGA: Linia cięcia ogonowego powinna być tylko rostralna do kości udowej. DRG lędźwiowy L6 zostanie wycięty, jeśli miejsce cięcia znajduje się zbyt wysoko w kręgosłupie.</li>
	<li>Przeciąć wzdłuż mostka i usunąć wszystkie narządy/tkanki za pomocą nożyczek preparacyjnych (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A-a).</li>
	<li>Przetnij wzdłuż boku tułowia, aby zebrać grzbietową część szczura i usunąć skórę. Zobacz Rysunek 1B dla zdjęcia rozciętego pnia grzbietowego.</li>
	<li>Przygotuj tkankę na lodzie przed pobraniem DRG. Oczyść futro i krew z rękawiczek i wysterylizuj je 75% etanolem przed przejściem do następnego kroku.</li>
	<li>Usuń mięśnie pokrywające odcinek lędźwiowy kręgosłupa. Najpierw wykonaj dwa nacięcia wzdłuż boków kręgosłupa (po lewej i prawej stronie) i jedno cięcie boczne, aby zaznaczyć rostralny zasięg kręgosłupa lędźwiowego. Następnie usuń mięśnie grzbietowe kręgosłupa za pomocą kleszczy do cięcia kości (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A-b).</li>
	<li>Usuń grzbietową część kręgów za pomocą kleszczy do cięcia kości i odsłoń rdzeń kręgowy.</li>
	<li>Usuń rdzeń kręgowy za pomocą nożyczek preparacyjnych (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A-c) i kleszczy (<silna klasa="xfig">Figura 2A-d).</li>
	<li>Zidentyfikuj DRG odcinka lędźwiowego, licząc kręgi od ostatniego żebra (kręg piersiowy 13). Zobacz Rysunek 1C dla diagramu pozycji kręgów.</li>
	<li>Zebrać obustronny DRG odcinka lędźwiowego (L1-L6) za pomocą mikronożyczek (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 2A-f) do 35-milimetrowego naczynia hodowlanego z 2 ml lodowatego podłoża bez surowicy. Usuń włókna neuronalne (jak wskazano w <silna klasa="xfig">Rysunek 1C) z połączenia DRG, a następnie przenieś je do naczynia hodowlanego, aby poprawić czystość kultur. 
	UWAGA: Zebrany DRG można przechowywać w podłożu na lodzie przez około 1 godzinę. Tymczasem wiele szczurów można poddać eutanazji, aby stworzyć większą pulę DRG.</li>
</ol>
2. Pierwotna kultura DRG z drewna szczurzego
UWAGA: Następujące kroki powinny być wykonywane w okapie z przepływem laminarnym.
<ol>
	<li>Przygotować pożywkę hodowlaną zawierającą 10% płodowej surowicy bydlęcej, 100 mM pirogronianu sodu i 1x penicylinę/streptomycynę w 1x DMEM-F12.</li>
	<li>Pokryj 24-dołkową płytkę poddaną działaniu hodowli komórkowej 200 μg/ml poli-L-lizyny przez 2 godziny, a następnie przemyj wysterylizowaną wodą.</li>
	<li>Przed użyciem należy wstępnie inkubować szalkę hodowlaną z 1 ml pożywki hodowlanej w inkubatorze CO2 o temperaturze 37 °C przez co najmniej 30 minut.</li>
	<li>Przenieś naczynie 35 mm zawierające DRG do okapu laminarnego i umyj DRG pożywką bez surowicy 3 razy za pomocą pipety. 
	UWAGA: Zewnętrzną część naczynia należy oczyścić 75% etanolem przed włożeniem do okapu. Czasza o średnicy 35 mm może zawierać DRG od wielu szczurów (będzie to zależało od wymagań projektu eksperymentalnego).</li>
	<li>Przenieś DRG (od pojedynczego szczura lub połączonego z wieloma szczurami) do nowej płytki hodowlanej o średnicy 35 mm, która zawiera 2 ml kolagenazy typu IA (1 mg / ml w pożywce bez surowicy) za pomocą sterylnej pęsety (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2A-e). 
	UWAGA: Roztwór kolagenazy należy wysterylizować, przepuszczając go przez filtr strzykawkowy 0,22 μm.</li>
	<li>Trawić DRG w roztworze kolagenazy w inkubatorze CO 2 o temperaturze 37 °Cprzez 30 minut.</li>
	<li>Usuń roztwór kolagenazy i umyj DRG 3 razy w 2 ml zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS). 
	UWAGA: Mogą istnieć resztki włókien lub tkanek, które przedostają się z DRG do roztworu. Usuń je pipetą z roztworem myjącym.</li>
	<li>Dodać 2 ml wstępnie podgrzanej 0,05% trypsyny-EDTA do naczynia o średnicy 35 mm zawierającego DRG i trawić DRG w inkubatorze CO2 o temperaturze 37 °C przez 30 minut.</li>
	<li>Przenieść 2 ml roztworu zawierającego DRG do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml za pomocą szklanej pipety. 
	UWAGA: DRG może przykleić się do szklanej pipety, dlatego ten krok należy wykonywać ostrożnie. Strat DRG można uniknąć, trzymając roztwór zawierający DRG w zwężającym się końcu szklanej pipety (około 0,5 ml) i przenosząc roztwór do probówki wirówkowej powoli, ale bez przerwy.</li>
	<li>Odwirować roztwór o stężeniu 290 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i dodać kolejne 2 ml pożywki pozbawionej surowicy w celu ponownego zawieszenia DRG.</li>
	<li>Powtórz krok 2.10 2 razy, ale ostatnim razem zmień pożywkę bez surowicy na wstępnie podgrzaną pożywkę hodowlaną.</li>
	<li>Ręcznie rozcierać DRG około 60 razy za pomocą polerowanej płomieniowo pipety Pasteura (długość 230 mm i średnica wewnętrzna główki końcówki 1 mm). Zobacz Rysunek 2B dla zdjęcia porównującego otwór pipety Pasteura polerowanej płomieniowo z pipetą niepolerowaną. 
	UWAGA: Średnica wewnętrzna polerowanej płomieniowo pipety Pasteura jest o około 10% mniejsza niż pipety kontrolnej, a wnętrze stożkowego końca powinno być gładsze. Uważaj, aby nie tworzyć bąbelków podczas rozcierania komórek.</li>
	<li>Wyjąć naczynie pokryte poli-L-lizyną z inkubatora CO2 . Odessać inkubowaną pożywkę hodowlaną z szalki i wysiać zdysocjowane komórki na pokrytą płytkę.</li>
	<li>Wysiewaj komórki DRG od jednego szczura (dwustronna kolekcja od L1-L6, dla całkowitej liczby 12 DRG) do czterech dołków 24-dołkowej płytki; w jednym dołku 24-dołkowej płytki znajduje się około 5 x 104 komórek. 
	UWAGA: Ta gęstość jest odpowiednia do wykrywania uwolnionego CGRP lub SP, a także nadaje się do barwienia immunologicznego. W przypadku ekstrakcji Western blot lub RNA, wysiewaj komórki DRG od jednego szczura (obustronne L1-L6) do jednego dołka na 6-dołkowej płytce.</li>
	<li>Następnego dnia zastąp pożywkę hodowlaną dodatkiem 10 μM cytarabiny (Ara-C) i 100 ng/ml NGF, a następnie odświeżaj pożywkę co dwa dni. 
	UWAGA: DRG klatki piersiowej można również hodować za pomocą tego protokołu, jeśli zostały one pobrane z odcinka piersiowego kręgosłupa.</li>
</ol>
3. Transfekcja siRNA NPFFR2 w komórkach DRG
<ol>
	<li>Wykonaj transfekcję siRNA NPFFR2 i kontroluj siRNA zgodnie z protokołem producenta. 
	UWAGA: Protokół będzie musiał zostać dostosowany, jeśli wybrany odczynnik do transfekcji różni się od tego, którego użyliśmy (patrz Tabela Materiałów).</li>
	<li>W dniu 3 po posiewie komórek zmienić pożywkę na 0,5 ml wstępnie ogrzanej pożywki bez surowicy i inkubować DRG w inkubatorze CO2 o temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Dodać 50 nM siRNA (w 1 μl wody wolnej od RNaz) do 12,5 μl pożywki bez surowicy.</li>
	<li>Dodać 2,5 μl odczynnika do transfekcji do 10 μl podłoża bez surowicy.</li>
	<li>Wymieszać roztwór z kroków 3.3 i 3.4 za pomocą pipety i inkubować ten mieszany roztwór do transfekcji przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodać roztwór do transfekcji do jednej 24-dołkowej płytki zawierającej DRG i wymieszać roztwór z pożywką, delikatnie wstrząsając. 
	UWAGA: W tym samym czasie, jeśli konieczne jest transfekowanie wielu studzienek, należy zastosować wiele roztworów transfekcyjnych.</li>
	<li>Inkubować DRG w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C przez 6 godzin.</li>
	<li>Dodać 0,5 ml / basenik pożywki hodowlanej zawierającej 20% płodowej surowicy bydlęcej, 100 mM pirogronianu sodu i 1x penicyliny/streptomycyny w 1x DMEM-F12, z dodatkiem 10 μM Ara-C i 100 ng/ml NGF, do płytki 24-dołkowej.</li>
	<li>Inkubować DRG w inkubatorze CO2 o temperaturze 37 °C przez kolejne 66 godzin (odświeżać pożywkę po 48 godzinach).</li>
</ol>
4. Uwalnianie neuroprzekaźników z pierwotnych komórek DRG
<ol>
	<li>W 6 dniu po posianiu komórek (72 godziny po transfekcji siRNA) zmienić pożywkę hodowlaną na pożywkę wolną od surowicy o pojemności 200 μl i inkubować komórki w inkubatorze CO 2 o temperaturze 37 °Cprzez 30 minut.</li>
	<li>Dodać 1 μl substancji chemicznej (substancji chemicznych) do stymulacji i delikatnie wymieszać pożywkę przez pipetowanie. Inkubować naczynie w inkubatorze o temperaturze 37 °CCO 2 przez wyznaczony czas. 
	UWAGA: W tym artykule hodowane komórki stymulowano agonistą NPFFR2, dNPA (D.Asn-Pro-(N-Me)Ala-Phe-Leu-Phe-Gln-Pro-Gln-Arg- Phe-NH2, 5 nmol) przez 1 godzinę.</li>
	<li>Zebrać pożywkę hodowlaną z szalki hodowlanej i odwirować przy 5 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia wszelkich zawieszonych zanieczyszczeń.</li>
	<li>Zebrać supernatant z wirówki i w razie potrzeby rozcieńczyć próbki solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). Oznaczanie poziomów neuroprzekaźników za pomocą zestawów do testów immunoenzymatycznych (EIA). 
	UWAGA: W tym przypadku supernatanty rozcieńczono w stosunku 1:100 przed analizą poziomu CGRP. Supernatant nie był rozcieńczany przed analizą poziomu SP.</li>
</ol>
5. CGRP i SP EIA
<ol>
	<li>Próbki należy natychmiast przeanalizować zgodnie z protokołem producenta zestawu CGRP lub SP EIA. 
	UWAGA: Protokół będzie się różnić w zależności od używanego zestawu.</li>
	<li>Przepłucz studzienki CGRP EIA 5 razy za pomocą bufora płuczącego dostarczonego w zestawie.</li>
	<li>Dodać 100 μl próbek ze 100 μl znacznikiem anty-CGRP acetylocholinoesterazy (AChE) do studzienek CGRP EIA i dodać 50 μl próbek, 50 μl znacznika anty-SP AChE i 50 μl anty-SP surowicy do dołków SP EIA.</li>
	<li>Uszczelnij studzienki CGRP i SP folią z tworzywa sztucznego, która jest dostarczana w zestawach.</li>
	<li>Inkubować studzienki przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Umyj studzienki 5 razy buforem płuczącym CGRP lub SP i usuń cały pozostały roztwór z dołków.</li>
	<li>Dodaj 200 μl odczynnika Ellmana do studzienek CGRP lub SP, które są dostarczane w odpowiednich zestawach EIA.</li>
	<li>Inkubować dołki CGRP przez 30 minut w temperaturze pokojowej i inkubować dołki SP przez 90 minut w temperaturze pokojowej. Chroń studnie przed światłem dla obu testów.</li>
	<li>Odczyt tabliczek przy długości fali 414 nm i obliczenie wyników zgodnie z odpowiednim instrumentem EIA. 
	UWAGA: Unikaj ciągłego dotykania dna studzienek ręcznie i oczyść plamy z wody z dna studni chusteczkami do czyszczenia soczewek przed dodaniem odczynnika Ellmana.</li>
</ol>

<ol><li>Bear, M. F., Connors, B. W., Paradiso, M. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBear%2C+MF+%22Neuroscience%3A+exploring+the+brain%22">Neuroscience: exploring the brain</a>. , 3 edn, Lippincott Williams & Wilkins. (2007).</li>
<li>Hunt, S. P., Mantyh, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+dynamics+of+pain+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The molecular dynamics of pain control.</a> Nat Rev Neurosci. 2 (2), 83-91 (2001).</li>
<li>Kandel, E. R., Schwartz, J. H., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKandel%2C+ER+%22Principles+of+neural+science%22">Principles of neural science</a>. , 3 edn, McGraw-Hill, Health Professions Division. (2000).</li>
<li>Julius, D., Basbaum, A. I. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11557989">Molecular mechanisms of nociception.</a> Nature. 413 (6852), 203-210 (2001).</li>
<li>Sah, D. W., Ossipo, M. H., Porreca, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophic+factors+as+novel+therapeutics+for+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Neurotrophic factors as novel therapeutics for neuropathic pain.</a> Nat Rev Drug Discov. 2 (6), 460-472 (2003).</li>
<li>Coutaux, A., Adam, F., Willer, J. C., Le Bars, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperalgesia+and+allodynia%3A+peripheral+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Joint+Bone+Spine%22%5BJournal%5D)">Hyperalgesia and allodynia: peripheral mechanisms.</a> Joint Bone Spine. 72 (5), 359-371 (2005).</li>
<li>Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+mechanisms+of+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular mechanisms of pain.</a> Cell. 139 (2), 267-284 (2009).</li>
<li>Marchand, F., Perretti, M., McMahon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+immune+system+in+chronic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Role of the immune system in chronic pain.</a> Nat Rev Neurosci. 6 (7), 521-532 (2005).</li>
<li>Hanani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+glial+cells+in+sensory+ganglia%3A+from+form+to+function%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Brain+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Satellite glial cells in sensory ganglia: from form to function.</a> Brain Res Brain Res Rev. 48 (3), 457-476 (2005).</li>
<li>Nascimento, R. S., Santiago, M. F., Marques, S. A., Allodi, S., Martinez, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+among+satellite+glial+cells+in+dorsal+root+ganglia+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Braz+J+Med+Biol+Res%22%5BJournal%5D)">Diversity among satellite glial cells in dorsal root ganglia of the rat.</a> Braz J Med Biol Res. 41 (11), 1011-1017 (2008).</li>
<li>Costa, F. A., Moreira Neto, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+glial+cells+in+sensory+ganglia%3A+its+role+in+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Bras+Anestesiol%22%5BJournal%5D)">Satellite glial cells in sensory ganglia: its role in pain.</a> Rev Bras Anestesiol. 65 (1), 73-81 (2015).</li>
<li>Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+dissociated+sensory+neuron+cultures+and+considerations+for+their+use+in+studying+neuronal+function+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity.</a> Nat Protoc. 2 (1), 152-160 (2007).</li>
<li>Lin, Y. T., Ro, L. S., Wang, H. L., Chen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Up-regulation+of+dorsal+root+ganglia+BDNF+and+trkB+receptor+in+inflammatory+pain%3A+an+in+vivo+and+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Up-regulation of dorsal root ganglia BDNF and trkB receptor in inflammatory pain: an in vivo and in vitro study.</a> J Neuroinflammation. 8, 126(2011).</li>
<li>Liem, L., van Dongen, E., Huygen, F. J., Staats, P., Kramer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Dorsal+Root+Ganglion+as+a+Therapeutic+Target+for+Chronic+Pain%5BTitle%5D)+AND+%22Reg+Anesth+Pain+Med%22%5BJournal%5D)">The Dorsal Root Ganglion as a Therapeutic Target for Chronic Pain.</a> Reg Anesth Pain Med. 41 (4), 511-519 (2016).</li>
<li>Lee, J. S., Han, J. S., Lee, K., Bang, J., Lee, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+peripheral+and+central+mechanisms+underlying+itch%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+Rep%22%5BJournal%5D)">The peripheral and central mechanisms underlying itch.</a> BMB Rep. 49 (9), 474-487 (2016).</li>
<li>Valtcheva, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+extraction+of+human+dorsal+root+ganglia+from+organ+donors+and+preparation+of+primary+sensory+neuron+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Surgical extraction of human dorsal root ganglia from organ donors and preparation of primary sensory neuron cultures.</a> Nat Protoc. 11 (10), 1877-1888 (2016).</li>
<li>Melli, G., Hoke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal+Root+Ganglia+Sensory+Neuronal+Cultures%3A+a+tool+for+drug+discovery+for+peripheral+neuropathies%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Dorsal Root Ganglia Sensory Neuronal Cultures: a tool for drug discovery for peripheral neuropathies.</a> Expert Opin Drug Discov. 4 (10), 1035-1045 (2009).</li>
<li>Yin, K., Baillie, G. J., Vetter, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+cell+lines+as+model+dorsal+root+ganglion+neurons%3A+A+transcriptomic+comparison%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pain%22%5BJournal%5D)">Neuronal cell lines as model dorsal root ganglion neurons: A transcriptomic comparison.</a> Mol Pain. 12, (2016).</li>
<li>Chen, W., Mi, R., Haughey, N., Oz, M., Hoke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalization+and+characterization+of+a+nociceptive+dorsal+root+ganglion+sensory+neuronal+line%5BTitle%5D)+AND+%22J+Peripher+Nerv+Syst%22%5BJournal%5D)">Immortalization and characterization of a nociceptive dorsal root ganglion sensory neuronal line.</a> J Peripher Nerv Syst. 12 (2), 121-130 (2007).</li>
<li>Doran, C., Chetrit, J., Holley, M. C., Grundy, D., Nassar, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+DRG+Cell+Line+with+Properties+of+Nociceptors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mouse DRG Cell Line with Properties of Nociceptors.</a> PLoS One. 10 (6), e0128670(2015).</li>
<li>Gouarderes, C., Roumy, M., Advokat, C., Jhamandas, K., Zajac, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+localization+of+neuropeptide+FF+receptors+in+the+rat+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22Synapse%22%5BJournal%5D)">Dual localization of neuropeptide FF receptors in the rat dorsal horn.</a> Synapse. 35 (1), 45-52 (2000).</li>
<li>Lin, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+NPFFR2+leads+to+hyperalgesia+through+the+spinal+inflammatory+mediator+CGRP+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Activation of NPFFR2 leads to hyperalgesia through the spinal inflammatory mediator CGRP in mice.</a> Exp Neurol. 291, 62-73 (2017).</li>
<li>Yang, H. Y., Tao, T., Iadarola, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulatory+role+of+neuropeptide+FF+system+in+nociception+and+opiate+analgesia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropeptides%22%5BJournal%5D)">Modulatory role of neuropeptide FF system in nociception and opiate analgesia.</a> Neuropeptides. 42 (1), 1-18 (2008).</li>
<li>Takeda, M., Takahashi, M., Matsumoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+the+activation+of+satellite+glia+in+sensory+ganglia+to+pathological+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Biobehav+Rev%22%5BJournal%5D)">Contribution of the activation of satellite glia in sensory ganglia to pathological pain.</a> Neurosci Biobehav Rev. 33 (6), 784-792 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W niniejszym artykule pokazujemy zbieranie, dysocjację enzymatyczną i hodowlę DRG odcinka lędźwiowego szczura. Dzięki neurotroficznemu wsparciu NGF aksony neuronów DRG rozszerzyły się w ciągu 3 dni po wysianiu komórek. Wydłużone aksony były wyraźnie widoczne po wybarwieniu komórek pod kątem białka CGRP, które jest syntetyzowane w somie komórki i transportowane wzdłuż włókien aksonów. Procesy zachodzące w komórkach satelitarnych również się rozszerzyły, dzięki czemu te dzielące się komórki glejowe mogły otoczyć neurony w ...

Ciała komórkowe neuronów czuciowych są zawarte w DRG. Neurony te są pseudojednobiegunowe i unerwiają zarówno tkanki obwodowe, jak i ośrodkowy układ nerwowy. Zakończenia nerwów obwodowych neuronów czuciowych znajdują się między innymi w mięśniach, skórze, narządach trzewnych i kościach. Przekazują one sygnały czucia obwodowego do zakończeń nerwowych w rdzeniowym rogu grzbietowym, a sygnały te są następnie przekazywane do mózgu różnymi wstępującymi ścieżkami czucia somatycznego1,2. Czucie somatyczne umożliwia ciału odczuwanie (tj. dotyku, bólu i doznań termicznych) oraz postrzeganie ruchu i orientacji przestrzennej (odczucia proprioceptywne)1,3. Istnieją cztery podklasy pierwotnych aksonów doprowadzających, w tym włókna grupy I (Aα), które reagują na propriocepcję mięśni szkieletowych, włókna grupy II (Aβ), które reagują na mechanoreceptory skóry oraz włókna grupy III (Aδ) i grupy V (C), które reagują na ból i temperaturę. Tylko włókna C są niezmielinizowane, podczas gdy reszta jest mielinizowana w różnym stopniu.
Nocyceptory są głównymi neuronami czuciowymi, które są aktywowane przez szkodliwe bodźce (stymulacja mechaniczna, termiczna i chemiczna), które niosą ze sobą potencjał do uszkodzenia tkanek. Neurony te składają się z mielinizowanych włókien Aδ i niezmielinizowanych włókien C1,4. Włókna Aδ wyrażają receptory czynnika wzrostu nerwów (NGF, receptor trkA), CGRP i SP. Włókna C są klasyfikowane jako peptydergiczne i niepeptydergiczne włókna C. Z drugiej strony, niepeptydergiczne włókna C wyrażają receptory dla czynnika neurotroficznego pochodzenia glejowego (receptory GDNF, RET i GFR), izolektyny IB4 i podtypu kanału jonowego bramkowanego ATP (P2X3)5,6,7. Nocyceptory można odróżnić po ekspresji kanałów jonowych i aktywować przez czynniki neurotroficzne, cytokiny, neuropeptydy, ATP lub inne związki chemiczne8. Po stymulacji neuroprzekaźniki, w tym CGRP, SP i glutaminian, mogą zostać uwolnione z zakończeń neuronów czuciowych w rogu grzbietowym rdzenia w celu przekazywania sygnałów nocyceptywnych2. DRG nie tylko składają się z neuronów, ale zawierają również satelitarne komórki glejowe. Komórki satelitarne otaczają neurony czuciowe i zapewniają mechaniczne i metaboliczne wsparcie9,10. Co ciekawe, istnieje coraz więcej dowodów wskazujących na to, że satelitarne komórki glejowe w DRG mogą być zaangażowane w regulację odczuwania bólu11.
Neurony czuciowe zostały uznane za najczęściej używane pierwotne komórki neuronalne12 i były wykorzystywane do badań nad elektrofizjologią, transdukcją sygnału i uwalnianiem neuroprzekaźników. Są one również powszechnie używane do badania komórkowych mechanizmów rozwoju neuronów, bólu zapalnego, bólu neuropatycznego, odczucia skórnego (takiego jak swędzenie) i wzrostu aksonów12,13,14,15. Kultury pierwotne DRG mogą być hodowane jako zdysocjowane neurony w celu oceny zmian biochemicznych w jednej lub wielu komórkach, co pozwala naukowcom na przeprowadzanie badań, których nie można przeprowadzić na obiektach eksperymentalnych. Ostatnio udało się wyhodować DRG od dawców ludzkich narządów, co może przynieść ogromne korzyści badaniom translacyjnym16. Z drugiej strony, neurony czuciowe mogą być również hodowane jako eksplantaty DRG. Eksplantaty DRG zachowują oryginalną architekturę tkankową neuronów, w tym komórek Schwanna i satelitarnych komórek glejowych, i są szczególnie przydatne do badania interakcji między komórkami neuronalnymi i nieneuronalnymi17. Kultury pierwotne DRG można łatwo przygotować w ciągu 2,5 godziny. Skład i właściwości komórek w dużym stopniu odzwierciedlają źródłowy DRG, w związku z czym specyficzny DRG (DRG lędźwiowy lub piersiowy) może być zbierany zgodnie z wymaganiami eksperymentalnymi. Hodowle embrionalnych i noworodkowych neuronów DRG wymagają NGF do przetrwania i indukowania wzrostu aksonów, ale kultury dorosłych neuronów nie wymagają dodawania czynników neurotroficznych do media12,17. Istnieją również komercyjnie dostępne linie komórkowe DRG-hybridoma, takie jak ND7/23 i F11, które nie wymagają użycia zwierząt doświadczalnych. Jednak brak ekspresji TRPV1 (TRPV1) podrodziny kanałów kationowych subrodziny kanałów kationowych receptora przejściowego (ważnego markera dla małych czuciowych neuronów nocyceptywnych) i niezgodne profile ekspresji genów ograniczają ich zastosowania18. Ostatnio unieśmiertelnione linie komórek neuronalnych DRG pochodzą od szczurów (50B11)19 i myszy (MED17.11)20, które nadają się do stosowania w wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych do badań ukierunkowanych na leki. Jednak profilowanie ekspresji genów dla tych linii komórkowych nie zostało jeszcze przeprowadzone. Tak więc eksperymenty walidacyjne porównujące te unieśmiertelnione komórki z neuronami czuciowymi wciąż trwają.
NPFFR2 jest syntetyzowany w DRG i przenoszony do czuciowych zakończeń nerwowych w rdzeniowym rogu grzbietowym21. W tym artykule przedstawiamy protokół hodowli komórek DRG odcinka lędźwiowego i traktowania ich agonistą NPFFR2 w celu wywołania uwalniania neuroprzekaźników, CGRP i SP. Zależność od NPFFR2 jest dalej testowana przy użyciu małego interferującego RNA NPFFR2 (siRNA), który może być transfekowany do hodowanych komórek DRG.

<table><tbody><tr><td>Mieszanina tiletaminy i zolazepamu (Zoletil)</td><td>Virbac</td><td>Zoletil 50</td><td>środek znieczulający</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Przemysł biologiczny</td><td>04-001-1</td><td>Pożywka</td></tr> hodowlana <tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Sigma</td><td>S8636</td><td>Pożywka hodowlana</td></tr><tr><td>penicylina/streptomycyna</td><td>Przemysł biologiczny</td><td>03-033-1</td><td>Pożywka hodowlana</td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Invitrogen</td><td>12400024</td><td>Pożywka</td></tr> hodowlana <tr><td>Poly-l-lizyna</td><td>Sigma</td><td>P9011</td><td>Naczynie do powlekania</td></tr><tr><td>Kolagenaza IA</td><td>Sigma</td><td>9001-12-1</td><td>Trawienie enzymatyczne</td></tr><tr><td>Zrównoważony roztwór soli</td><td>Hanka Invitrogen</td><td>14170-112</td><td>Pożywka hodowlana</td></tr><tr><td>Trypsyna EDTA</td><td>Biological Industries</td><td>03-051-5</td><td>Trawienie enzymatyczne</td></tr><tr><td>Pasteur pipeta</td><td>Hilgenberg</td><td>3150102</td><td>Tryturacja komórek</td></tr><tr><td>Cytarabina (Ara-C)</td><td>Sigma</td><td>C6645</td><td>Pożywka</td></tr> hodowlana <tr><td>NGF</td><td>Millipore</td><td>NC011</td><td>Pożywka</td></tr><tr><td>hodowlana NPFFR2 siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>L-099691-02-0005</td><td>Transfekcja</td></tr><tr><td>Nieukierunkowane siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>L-001810-10-05</td><td>Transfekcja</td></tr><tr><td>NeuroPORTER Odczynnik</td><td>Genlantis</td><td>T400150</td><td>Odczynnik do transfekcji</td></tr><tr><td>dNPA</td><td>Genemed Synthesis</td><td>N/A</td><td>Agonista NPFFR2</td></tr><tr><td>CGRP ELISA</td><td>Cayman</td><td>589001</td><td>EIA</td></tr><tr><td>SP ELISA</td><td>Cayman</td><td>583751</td><td>EIA</td></tr><tr><td>CGRP</td> przeciwciało <td>Calbiochem</td><td>PC205L</td><td>IHC</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Roche</td><td>10236276001</td><td>IHC</td></tr></tbody></table>

izolacja zwojów korzenia grzbietowego i hodowla pierwotna w celu zbadania uwalniania neuroprzekaźników

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

Zwoje korzenia grzbietowego (DRG) zawierają ciała komórkowe neuronów czuciowych. Ten typ neuronu jest pseudo-unipolarny, z dwoma aksonami, które unerwiają tkanki obwodowe, takie jak skóra, mięśnie i narządy trzewne, a także róg grzbietowy rdzenia ośrodkowego układu nerwowego. Neurony czuciowe przekazują odczucia somatyczne, w tym dotyk, ból, odczucia termiczne i proprioceptywne. Dlatego kultury pierwotne DRG są szeroko stosowane do badania komórkowych mechanizmów nocycepcji, fizjologicznych funkcji neuronów czuciowych i rozwoju neuronów. Wyhodowane neurony mogą być stosowane w badaniach obejmujących elektrofizjologię, transdukcję sygnału, uwalnianie neuroprzekaźników lub obrazowanie wapnia. Dzięki hodowlom pierwotnym DRG naukowcy mogą hodować zdysocjowane neurony DRG w celu monitorowania zmian biochemicznych w jednej lub wielu komórkach, pokonując wiele ograniczeń związanych z eksperymentami in vivo. W porównaniu z dostępnymi na rynku liniami komórkowymi DRG-hybridoma lub unieśmiertelnionymi liniami komórek neuronalnych DRG, skład i właściwości komórek pierwotnych są znacznie bardziej zbliżone do neuronów czuciowych w tkance. Jednak ze względu na ograniczoną liczbę hodowanych komórek pierwotnych DRG, które można wyizolować od pojedynczego zwierzęcia, trudno jest przeprowadzić wysokoprzepustowe badania przesiewowe w badaniach ukierunkowanych na leki. W niniejszym artykule opisano procedury pobierania i hodowli DRG. Ponadto demonstrujemy traktowanie hodowanych komórek DRG agonistą receptora neuropeptydu FF typu 2 (NPFFR2) w celu indukowania uwalniania neuroprzekaźników peptydowych (peptyd związany z genem kalcytoniny (CRGP) i substancja P (SP)).

Neurony z lędźwiowych gangliów korzeni tylnich szczura, hodowane w płytce 24-ściennej, rozwijały się w pożywce hodowlanej z dodatkiem Ara-C w celu zahamowania proliferacji komórek glejowych oraz NGF w celu wspierania wzrostu neuronów. Obserwowano morfologię żywych komórek z GGKT. Jak pokazano na Rysunku 3, ciało komórkowe pojedynczego neuronu przyczepiło się do dna płytki w dniu 1 i wybrano je do obserwacji. Wzrost aksonów monitorowano od dnia 1 do 3. Komórki...

Hodowle pierwotne zwojów korzenia grzbietowego (DRG) są często używane do badania funkcji fizjologicznych lub zdarzeń związanych z patologią w neuronach czuciowych. W tym miejscu demonstrujemy zastosowanie lędźwiowych hodowli DRG do wykrywania uwalniania neuroprzekaźników po stymulacji neuropeptydowego receptora FF typu 2 selektywnym agonistą.

Izolacja zwojów korzenia grzbietowego i hodowla pierwotna w celu zbadania uwalniania neuroprzekaźników

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie badań sensorycznych, takie jak nocycepcja obwodowa. Główną zaletą tego technicznego rozwiązania jest to, że bada się mechanizm komórkowy neuronów czuciowych za pomocą modelu, który najbardziej symuluje stan fizjologiczny. Zbierz zwoje korzenia grzbietowego lędźwiowego z pnia dwu- lub trzytygodniowego szczura.Zacznij od wykonania dwóch cięć wzdłuż boków kręgosłupa i jednego cięcia bocznego, aby zaznaczyć rostralny zasięg kręgosłupa lędźwiowego. Następnie użyj kleszczy do cięcia kości, aby usunąć mięśnie grzbietowe kręgosłupa. Następnie usuń grzbietową część kręgów i odsłoń rdzeń kręgowy.Następnie użyj nożyczek preparacyjnych i kleszczy, aby usunąć rdzeń kręgowy. Zidentyfikuj DRG odcinka lędźwiowego, licząc kręgi od ostatniego żebra. Ten diagram pokazuje pozycje kręgów.Użyj mikronożyczek, aby zebrać 12 obustronnych DRG odcinka lędźwiowego od L1 do L6. Usuń wszelkie przyczepione włókna neuronalne, aby poprawić czystość kultury. Przenieś każdy DRG lędźwiowy do 35-milimetrowej płytki hodowlanej zawierającej dwa mililitry lodowatej pożywki bez surowicy. Przenieś 35-milimetrowe naczynie zawierające DRG do okapu laminarnego

dorsal-root-ganglia-isolation-primary-culture-to-study

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W niniejszym opracowaniu opisujemy technikę przygotowywania i utrzymywania komór przedzielonych do hodowli neuronów sensorycznych z zwojów korzeni grzbietowych.

Przygotowanie i utrzymanie neuronów z zwojów korzeni grzbietowych w hodowlach przedzielonych

Opisano model in vitro do badań genetycznych nad regeneracją aksonów z wykorzystaniem hodowli neuronów z zwojów korzeni grzbietowych dorosłych myszy. Metoda obejmuje etap resuspensji i ponownego wysiewu, aby umożliwić ponowny wzrost aksonów z neuronów poddanych manipulacjom genetycznym. Podejście to jest szczególnie przydatne w badaniach nad utratą funkcji w procesie regeneracji aksonów z wykorzystaniem wyciszania ekspresji białek opartego na RNAi.

Genetyczne badanie regeneracji aksonów w hodowlach neuronów z dorosłych zwojów korzeni grzbietowych

Ten film demonstruje procedurę izolowania neuronów zwoju korzenia grzbietowego (DRG) od zarodków szczurów i współhodowli ich z prekursorami komórek Schwanna w celu wytworzenia dojrzałych komórek Schwanna. Wyizolowane DRG są przetwarzane w celu wyizolowania neuronów i komórek glejowych. Wyizolowane komórki są hodowane w celu oczyszczenia neuronów, które są następnie hodowane wspólnie z komórkami podobnymi do komórek Schwanna (SCLC) w pożywce do wspólnej hodowli. Interakcja z neuronami DRG...

Izolacja neuronów DRG i kokultura z prekursorami komórek Schwanna w celu wytworzenia komórek Schwanna

Ten film demonstruje metodę rozwoju zwojów korzenia grzbietowego lub hodowli eksplantatów DRG i modeli komórek zdysocjowanych DRG przy użyciu izolowanych tkanek DRG myszy. Modele te pomagają badać różne mechanizmy interakcji neuron-glej w kontrolowanym środowisku.

Generowanie eksplantatu zwoju korzenia grzbietowego i zdysocjowanej hodowli komórkowej

Ten film demonstruje metodę pobierania neuronów z grzbietowych zwojów korzeniowych (DRG). DRG z kręgosłupa szczura jest izolowany, traktowany enzymami, a następnie mechanicznie dysocjowany w celu uzyskania zawiesiny jednokomórkowej. Neurony są oddzielane od komórek glejowych za pomocą wirowania w gradiencie gęstości i hodowane w pożywce wzrostowej.

Technika zbierania i dysocjacji zwojów korzenia grzbietowego dla kultur neuronalnych

Ten film demonstruje technikę izolowania i hodowli komórek zwojów korzenia grzbietowego (DRG) z kręgosłupa szczura. DRG wycięte z kręgosłupa są traktowane enzymami i mechanicznie dysocjowane w celu uzyskania zawiesiny jednokomórkowej. Komórki są hodowane w pożywce zawierającej inhibitory i czynniki wzrostu, które odpowiednio ograniczają proliferację komórek glejowych i promują wzrost neuronów.

Ustanowienie pierwotnej hodowli komórek zwojów korzenia grzbietowego z kręgosłupa szczura

Ten film demonstruje wykorzystanie transfekowanych komórek zwojowych korzenia grzbietowego do badania uwalniania neuroprzekaźników poprzez stymulację ich agonistą receptora neuropeptydowego.

Stymulacja neuronów czuciowych zwoju korzenia grzbietowego za pomocą agonisty receptora neuropeptydowego

Ten protokół dostarcza techniki do zbierania i hodowli eksplantowanego zwoju korzenia grzbietowego (DRG) od dorosłych szczurów Sprague Dawley w urządzeniu wielokomorowym (MC).

Zbieranie, osadzanie i hodowla zwojów korzeni grzbietowych w urządzeniach wielokompartmentowych w celu zbadania cech neuronów obwodowych

Protokół ten opisuje metody tworzenia całych i zdysocjowanych kultur zwojów korzenia grzbietowego myszy (DRG) i ich zastosowanie do oceny interakcji guz-nerw.

Tworzenie modeli in vitro hodowli zwojów korzenia grzbietowego: uzupełniające podejścia do badania przesłuchów rak-nerw

Czubki korzeniowe grzbietowe (DRG) zawierają pierwotne ciała komórkowe neuronów czuciowych i przekazują obwodowe sygnały czuciowe do rdzenia kręgowego. Niniejszy protokół opisuje metodę rozpinania czupczyków korzeniowych grzbietowych u myszy, która wspiera standaryzowaną izolację strukturalnie nietkniętych czupczyków, identyfikację anatomiczną segmentów, intuicyjną instrukcję dla początkujących użytkowników oraz zmniejszone uszkodzenie tkanki podczas procedury.

Sekcja i odizolowanie klastrów czuciowych rdzenia kręgowego myszy

Poznaj metodę izolacji zwojów korzenia grzbietowego i hodowli pierwotnej neuronów czuciowych szczura. Technika umożliwia badanie uwalniania neuroprzekaźników w warunkach zbliżonych do fizjologicznych.

Izolacja zwojów korzenia grzbietowego i hodowla pierwotna w celu zbadania uwalniania neuroprzekaźników

Przeglądaj więcej filmów