Cienkowarstwowe kompozytowe elastomery krzemowe do hodowli komórkowych i zastosowań skórnych: produkcja i charakterystyka

Ogólnym celem tej procedury jest wytworzenie i scharakteryzowanie polimerowych cienkowarstwowych struktur kompozytowych do zaawansowanych badań kultur komórkowych lub jako kleje do skóry. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące tego, w jaki sposób można wykorzystać kompozyty elastomerowe do uzyskania optymalnego działania klejącego, nawet na nieregularnych powierzchniach. Główną zaletą tych technik jest to, że są proste i mają uniwersalne zastosowanie.

Pozwala to na produkcję na dużą skalę z bardzo dużą precyzją. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności, ponieważ pomiary przyczepności wymagają intensywnego szkolenia i praktyki, aby osiągnąć niezbędną precyzję. Procedury hodowli komórkowej i aplikacji osocza zademonstruje Angela Rutz, technik z naszego laboratorium.

Aby przygotować PDMS, wymieszaj i odgazuj 1,1 grama mieszaniny prepolimerów w mieszalniku prędkości 2350 obr./min w próżni przez trzy minuty. Aby przygotować warstwę podkładową PDMS, należy użyć automatycznie sterowanej maszyny do nakładania rakli. Umieść rakla na kawałku folii PET oczyszczonym w 100% izopropanolem i użyj mikropozycjonujących, aby wyregulować grubość warstwy nośnej.

Załaduj PDMS do jednorazowej strzykawki o pojemności 10 mililitrów. Napełnij zbiornik rakla polimerem i rozpocznij ruch rakla z prędkością około 2 milimetrów na sekundę. Gdy kawałek folii PET zostanie pokryty, przenieś folię do piekarnika o temperaturze 95 stopni Celsjusza na godzinę.

Aby przygotować wierzchnią warstwę folii kompozytowej, użyj ostrza, aby usunąć cienkie paski z dłuższych boków warstwy nośnej. Aby umożliwić nasunięcie rakla po folii PET, nałóż drugą warstwę PDMS zgodnie z wcześniejszym opisem. Następnie włóż folię do piekarnika.

Aby przygotować próbki do pomiarów przyczepności, użyj żyletki, aby pociąć folie na folii PET na cztery centymetry kwadratowe i użyj kleju UV, aby przymocować kawałki do szkiełka podstawowego. Oświetl kawałki światłem UV przez trzy minuty i umieść pierwszą próbkę polimerową na uchwycie próbki. Użyj goniometru, aby wyregulować kąt nachylenia, aż podłoże zetknie się z folią polimerową przy całkowicie równoległym ustawieniu obu powierzchni, jak pokazano na obrazach z kamery.

Optyczne wyrównanie podłoża do próbki ma duże znaczenie dla interpretacji wyników pomiarów. Dlatego regulacja kąta nachylenia musi być wykonana tak precyzyjnie, jak to możliwe za pomocą inklinometru. Przesuń wyrównane podłoże na powierzchnię folii polimerowej, aż do uzyskania naprężenia obciążenia wstępnego wynoszącego 13 plus minus pięć kilopaskali i uruchom niestandardowy pakiet oprogramowania napisanego w LabView.

Następnie ustaw wymagane parametry pomiarowe, aby zmierzyć właściwości adhezyjne trzech niezależnie wyprodukowanych próbek w sześciu różnych miejscach na każdej powierzchni folii. Aby przygotować filmy do mikroskopii optycznej, za pomocą żyletki pokrój próbkę polimerową na kawałki o powierzchni 0,25 centymetra kwadratowego i przymocuj kawałki do krawędzi szkiełka. Następnie umieść szkiełko w orientacji pionowej pod mikroskopem pionowym i zmierz grubość przekroju folii.

Aby przygotować eksperyment z hodowlą komórkową, najpierw użyj skalpela, aby wyciąć około pięciu na pięć milimetrowych kawałków z warstwy nośnej PET i użyj pęsety, aby przenieść kawałki na pojedyncze 12-milimetrowe szklane szkiełka nakrywkowe. Przenieś szkiełka pokrywy do wnętrza komory reakcyjnej urządzenia plazmowego i zamknij pokrywę urządzenia. Opróżnij komorę, aż zostanie osiągnięte ciśnienie 1,6 razy 10 do minus sekundy milibara i traktuj folie plazmą przez trzy minuty.

Następnie przewietrzyć komorę reakcyjną i przenieść próbki do indywidualnych dołków 24-dołkowej płytki. Następnie myj 70 do 80% zlewającą się hodowlę komórkową L929 z DPBS bez wapnia i magnezu przez 30 sekund w komorze laminarnej. Następnie następuje pięciominutowa inkubacja z dwoma mililitrami odpowiedniego roztworu proteolitycznego i kolagenolitycznego w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2.

Gdy komórki się odłączą, dodaj osiem mililitrów pożywki uzupełnionej surowicą i przenieś komórki do 15-mililitrowej stożkowej probówki. Następnie, po policzeniu, wysiewaj 60 000 komórek na mililitr pożywki na dołek 24-dołkowej płytki zawierającej próbki polimerowe i umieść płytkę w inkubatorze hodowli komórkowej na trzy dni przed przechwyceniem i utrwaleniem obrazu z kontrastem fazowym. W zależności od grubości warstwy wierzchniej, wraz ze wzrostem grubości folii obserwuje się spadek naprężeń zrywających, niezależnie od tekstury powierzchni podłoża.

Praca separacji jest jednak na ogół nieco niższa w przypadku szorstkich powierzchni podłoża w porównaniu z gładkimi. Kiedy rejestrowany jest mechanizm odklejania, na najcieńszych warstwach obserwuje się niewielką kawitację, podczas gdy na grubszych warstwach można zaobserwować pojawienie się pęknięć przypominających palce. Eksperymenty z hodowlami komórkowymi ujawniają, że komórki wysiane na nieskazitelnych polimerach wykazują słabe zachowanie przyczepiania i rozprzestrzeniania się komórkowego, podczas gdy zlewającą się monowarstwę obserwuje się w komórkach hodowanych na powierzchniach poddanych działaniu plazmy.

Ogólnie rzecz biorąc, poziomy dehydrogiazy mleczanu są porównywalne dla komórek hodowanych na obu materiałach polimerowych, z cytotoksycznością poniżej 5%. Po opanowaniu produkcja kompozytów polimerowych może zostać zakończona w ciągu około trzech godzin. Chociaż późniejsza analiza za pomocą normalnego testu przyczepności wymaga szkolenia, jest to bardzo potężne narzędzie do badania właściwości adhezyjnych folii.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wytwarzać cienkie polimerowe folie kompozytowe i analizować je za pomocą specjalnych testów przyczepności i narzędzi biologicznych komórek. Nie zapominaj, że praca z chemikaliami i materiałami biologicznymi może być bardzo niebezpieczna. Dlatego należy podjąć odpowiednie środki ostrożności, takie jak przestrzeganie obowiązkowych procedur bezpieczeństwa, noszenie środków ochrony osobistej i obchodzenie się z tymi materiałami w szafie bezpieczeństwa.