Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji siatki beleczkowej o wysokiej czystości z oczu myszy do analizy ekspresji genów

Ogólnym celem tej procedury mikrodysekcji laserowej jest opracowanie solidnej i powtarzalnej metody izolacji wysoce wzbogaconej siatki beleczkowej z oczu myszy przy użyciu mikroskopii laserowej w celu późniejszej izolacji RNA i dalszej analizy ekspresji. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie okulistyki, takie jak ważne geny i szlaki sygnałowe, które w przypadku niewłaściwej regulacji mogą prowadzić do chorób oczu. Główną zaletą tej techniki jest to, że wysokiej jakości RNA z siatki beleczkowej oczu myszy można odtwarzalnie wyizolować w celu analizy ekspresji genów.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności, ponieważ mikrodysekcja laserowa jest potężną techniką, która obejmuje różne etapy rozwiązywania problemów w całym protokole. Rozpocznij tę procedurę od optymalnego pobrania tkanek do mikrodysekcji laserowej, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Rozpyl roztwór odkażający RNase na szczotkę, kleszcze, słoiki sprzęgające i uchwyt montażowy.

Po dokładnym wytarciu wypłucz aparat wodą bez nukleaz i wysusz. Przetrzyj kriostat 100% etanolem, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego. Wyciśnij niewielką ilość OCT na uchwyt montażowy, a następnie wyjmij blok tkanki z formy i ostrożnie umieść blok na uchwycie montażowym.

Gdy blok tkanki na uchwycie montażowym zostanie zamrożony na stałe, włóż do uchwytu próbki kriostatu. Następnie wyreguluj kriostat, aby przeciąć ośmiomikronowe odcinki i ostrożnie przeciąć blok OCT, aby dotrzeć do próbki tkanki. Po zaobserwowaniu tkanki przerwij cięcie.

Przytnij zamrożone bloki ze wszystkich stron za pomocą czystej żyletki i pozostaw trzy do czterech milimetrów OCT otaczających tkankę, aby umożliwić obsługę pędzlem. Przekrój przez oko, pracując szybko. Plamić co trzecią sekcję, zalewając zjeżdżalnię szybką, jednoetapową plamą H&E przez 60 sekund.

Opłucz sekcję wodą z kranu i wysusz na powietrzu. Po oczyszczeniu przekroju środkiem czyszczącym, zamontuj przekrój na naładowanym szkiełku z szkiełkiem nakrywkowym, przejrzyj pod mikroskopem. Kontynuuj cięcie, aż TM stanie się widoczna w poplamionych sekcjach.

Gdy TM zacznie się pojawiać, wytnij dwie sekcje i zamontuj je na naładowanym szkiełku w celu rutynowego barwienia H&E, aby utworzyć mapę do cięcia za pomocą mikrodysekcji laserowej. Po pierwszym szkiełku mapowym H&E wytnij i wyrównaj sześć szeregowych odcinków o grubości ośmiu mikronów w kriostacie i jednocześnie zamontuj je na szkiełku z membraną PET. Przyklej tkankę, krótko przesuwając kciuk w rękawicy wzdłuż tylnej części membrany.

Po zamontowaniu należy natychmiast umieścić szkiełko z membraną PET w pudełku na suwak na suchym lodzie. Kontynuuj dzielenie oka. Po każdych dwóch szkiełkach z membraną PET z sześcioma sekcjami każdy, zbierz dwie sekcje na naładowanym szkiełku szkiełkowym, aby utworzyć kolejny szkiełko mapowe do barwienia H&E.

Kontynuuj cięcie około 100 szeregowych odcinków o grubości ośmiu mikronów, aż TM przestanie być widoczna. Potwierdź brak TM, szybko zabarwiając jeden fragment na naładowanym szkiełku. Po wykonaniu barwienia szkiełek z mapą H&E zgodnie z opisem w protokole tekstowym, należy przejrzeć szkiełka H&E wizualnie za pomocą mikroskopu.

Zidentyfikuj slajdy mapy z TM wyraźnie widoczne i dostępne do cięcia. Użyj szkiełek z membraną PET między tymi szkiełkami mapy dla LCM. Wyjmij pudełko ze szkiełkami zawierającymi zamrożone skrawki tkanek z zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza i umieść je na suchym lodzie.

Przetwarzaj slajdy pojedynczo. Zamocuj sekcje, umieszczając szkiełko natychmiast w zimnym 75% etanolu zawierającym inhibitory RNazy na 30 sekund. Delikatnie zanurz szkiełko w wodzie wolnej od nukleaz na 10 do 15 sekund, aby rozpuścić OCT bez ingerencji w sekcje tkanki.

Ostrożnie odpipetować 300 mikrolitrów 1,5% roztworu octanu fioletu krezylowego bezpośrednio na sekcje i inkubować przez 45 sekund w temperaturze pokojowej. Następnie umyj sekcje jeden raz, umieszczając je w kąpieli z 75% etanolem na 30 sekund. Odpipetować 200 mikrolitrów roztworu Eozyny Y na skrawki i inkubować przez trzy do pięciu sekund.

Odwodnić tkankę, umieszczając szkiełka następnie w 75% etanolu, 95% etanolu, a na koniec w kąpieli 100% etanolu na 30 sekund każda. Osusz koniec szkiełka chusteczką chusteczką między każdym krokiem, aby usunąć nadmiar płynu. Pozostaw zjeżdżalnię do całkowitego wyschnięcia pod maską na pięć minut.

Po wyschnięciu natychmiast po wyschnięciu wykonaj LCM. Unikaj stosowania ksylenu na ostatnim etapie oczyszczania. Leczenie ksylenem spowoduje, że wycinek tkanki nie będzie odpowiednio przylegał do szkiełka membranowego.

Ksylen zmniejszy również skuteczność wychwytywania tkanek przez LCM. Umieść szkiełko z membraną PET stroną z wybarwioną tkanką skierowaną w dół bezpośrednio na wierzchu nowego szkiełka podstawowego, które zostało załadowane na stolik mikroskopu. Upewnij się, że membrana i szkiełko są ściśle sparowane na stoliku mikroskopu.

Rozpocznij LCM, najpierw ustawiając limity suwaka. Wybierz najmniejsze powiększenie 4X w panelu Obiektyw, a następnie zdefiniuj obszar roboczy szkiełka membranowego, przesuwając stolik XY mikroskopu, aż lewy górny róg, w którym spotykają się metal i membrana, będzie widoczny w strumieniu wideo na żywo. W tym momencie naciśnij przycisk Limit 1, a na mapie drogowej pojawi się czerwony prostokąt.

Następnie przesuń stolik XY do przeciwległego rogu i naciśnij przycisk Limit 2. Naciśnij przycisk Skanuj, aby utworzyć obraz mapy drogowej błony i tkanek między ustawionymi limitami. Kliknij dwukrotnie w pobliżu znacznika nawigacyjnego jednej z sekcji oka na mapie drogowej.

TM może znajdować się w pobliżu wierzchołka kąta tęczówkowo-rogówkowego. Po zidentyfikowaniu TM zwiększ powiększenie do 10X i ręcznie ustaw ostrość na TM. Powtórz tę czynność z obiektywami 20X i 40X. Gdy TM jest ostra na obiektywie 40X, przejdź do pustego obszaru, wybierz narzędzie do rysowania odręcznego i narysuj długą linię na pustym obszarze tkanki.

Ustaw parametry lasera tak, aby prędkość cięcia wynosiła 34%, ostrość wynosiła 58%, a moc 70%, a następnie naciśnij przycisk Wytnij. Dokonuj precyzyjnych regulacji parametrów lasera prędkości, ostrości i mocy, aż do uzyskania wyraźnej i cienkiej linii cięcia. Aby uzyskać precyzyjne cięcie, upewnij się, że cięcie przebiega zgodnie z narysowaną linią.

Następnie załaduj pokrywę rurki izolacyjnej do uchwytu nasadki i otwórz rurkę. Przymocuj uchwyt nasadki do podnośnika nasadki i upewnij się, że rurka jest odwrócona. Upewnij się również, że materiał nasadki samoprzylepnej wystaje poza końcówkę nasadki, aby zapewnić prawidłowe uchwycenie pożądanej tkanki.

Bardzo ważne jest, aby wizualnie upewnić się, że siatka beleczkowa jest podniesiona i przymocowana do nasadki izolacyjnej. Wybierz tryb ręcznego rozwarstwiania w panelu oprogramowania. Dokładnie sprawdź, czy TM znajduje się bezpośrednio pod rurką izolacyjną.

Ustaw balans bieli i dostosuj jasność, aby uzyskać optymalną jakość obrazu. Aby rozpocząć cięcie, ręcznie dostosuj ostrość i narysuj linię za pomocą narzędzia odręcznego. Upewnij się, że nasadka zbierająca pozostaje w górnej pozycji, nie dotykając jeszcze membrany.

Narysuj częściowe okręgi w pobliżu miejsca, w którym TM styka się z twardówką i naciśnij Wytnij. Po wykonaniu pierwszych cięć ustaw nasadkę w dolnej pozycji i ponownie wyreguluj ostrość, a następnie narysuj dwie linie w otwartej lub wolnej przestrzeni, aby połączyć dwa częściowe okręgi, kończąc okrąg wokół TM. Następnie naciśnij Wytnij i zbierz tkankę z sekcji. Upewnij się, że TM została podniesiona przez nasadkę do mikrodysekcji.

Umieść nasadkę z powrotem w pozycji górnej i powtórz na pozostałych sekcjach. Nieznacznie wyreguluj pozycję nasadki, tak aby wszystkie wyizolowane próbki pasowały do nasadki i nie zachodziły na siebie. W przypadku następnej membrany PET włóż nową rurkę izolacyjną i powtórz tę sekcję.

Aby przeprowadzić lizę mikrowypreparowanej tkanki TM, ostrożnie odpipetuj 10 mikrolitrów buforu do lizy na pokrywę probówki zbiorczej, upewniając się, że bufor do lizy całkowicie zakrywa mikrowypreparowaną TM. Delikatnie zamknij nasadkę samoprzylepną i inkubuj probówkę do góry nogami w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Po inkubacji odwirować przy 800 g przez dwie minuty i umieścić lizat na suchym lodzie. Przechowuj lizaty w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do późniejszego oczyszczenia i analizy.

Szybko degradujące się RNA może mieć wpływ na dalszą analizę RNA. Jakość RNA powinna być mierzona i określana ilościowo za pomocą platformy opartej na mikrofluidyce. Przedstawiono reprezentatywne wyniki analizy ekspresji genów wysokiej jakości całkowitego RNA oczyszczonego z siatki beleczkowej.

Cyfrowy żel do pozostałego całkowitego RNA z tkanki oka po mikrodysekcji laserowej wykazuje wysoką liczbę integralności RNA, która jest potrzebna do późniejszej analizy RNA. Po wyekstrahowaniu wysokiej jakości RNA z tkanki można przeprowadzić dalszą analizę, taką jak mikromacierz, RNA-Seq i qPCR. W tym przypadku zastosowano ilościową cyfrową analizę PCR do analizy ekspresji genów związanych z siatką beleczkową, miocyliny i ACTA2 z RNA pobranego z LCM.

Mapa cieplna wygenerowana na podstawie danych uzyskanych z analizy mikromacierzy ilustruje, że technika ta może być wykorzystana do zrozumienia zmian ekspresji genów w siatce beleczkowej myszy typu dzikiego i myszy z nokautem o podwyższonym fenotypie IOP. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu zaledwie jednego dnia na zwierzę biologiczne, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Wizualna demonstracja tej metody jest niezbędna, ponieważ etapy mikrodysekcji laserowej są trudne do nauczenia się ze względu na trudność wizualizacji interesujących komórek i brak standardów dla tych unikalnych próbek.

Poleganie na wykwalifikowanym operatorze ma kluczowe znaczenie. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że RNA w małych ilościach tkanki może ulec szybkiej degradacji. Należy podjąć środki ostrożności, takie jak odkażanie sprzętu z RNazy, minimalizowanie ekspozycji na powietrze i utrzymywanie zimnych tkanek.

Chociaż metoda ta może dostarczyć wglądu w wpływ zwiększonego ciśnienia wewnątrzgałkowego na ekspresję genów specyficzną dla siatki beleczkowej, można ją również zastosować do innych systemów, takich jak ocena zmian w ekspresji genów w siatkówce spowodowanych zwiększonym ciśnieniem wewnątrzgałkowym. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak RNA-Seq lub mikromacierz, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, jakie szlaki sygnałowe są zmienione w siatce beleczkowej myszy z podwyższonym ciśnieniem wewnątrzgałkowym. Po jej opracowaniu technika ta utorowała naukowcom drogę do skuteczniejszego badania zmian ekspresji genów w siatce beleczkowej w modelach mysich.