Name: Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji siatki beleczkowej o wysokiej czystości z oczu myszy do analizy ekspresji genów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: Poznaj metodę laserowej mikrodysekcji do izolacji siatki beleczkowej z oczu myszy w celu analizy ekspresji genów. Ta technika umożliwia uzyskanie wysokiej jakości RNA dla badań okulistycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami (ACUC) Narodowego Instytutu Nauk o Zdrowiu Środowiskowym (NIEHS) zatwierdził całą metodologię tego badania w ramach Propozycji Badań na Zwierzętach NIEHS IIDL 05-46.
1. Optymalna kolekcja tkanek do mikrodysekcji laserowej
<ol>
	<li>Uzyskaj 2 do 3 miesięcznych myszy, samca lub samicę C57BL/6. Poddać eutanazji za pomocą CO2 przez co najmniej 1 minutę lub do momentu ustania oddychania. Wyjmij zwierzę z klatki i zapewnij śmierć przez zwichnięcie szyjki macicy, dekapitację lub torakotomię.</li>
	<li>Przed sekcją upewnij się, że wszystkie narzędzia do preparowania są czyste i wysterylizowane. 
	UWAGA: Do usuwania oczu potrzebne będą zakrzywione nożyczki i kleszcze z ząbkowaną końcówką (preferowany rozmiar końcówki: 0,5 x 0,4 mm).</li>
	<li>Połóż mysz na płaskiej powierzchni na boku, tak aby oko było łatwo dostępne. Chwyć kleszczami za kant (kącik oka), aby ustabilizować mysz, a następnie za pomocą zakrzywionych nożyczek, skierowanych do krzywej od oka, przetnij wokół oka, używając oczodołu jako prowadnicy, aż gałka oczna będzie mogła być łatwo wyjęta z oczodołu (użyj krzywej, a nie końcówek nożyczek).</li>
	<li>Delikatnie pociągnij i za pomocą zakrzywionych nożyczek przetnij nerw wzrokowy, który uwalnia oko z oczodołu. Ostrożnie usuń tkankę nieoczną z oka i przepłucz 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). Powtórz 1,3 - 1,4 dla przeciwległego oka.</li>
	<li>Osusz oko chusteczką higieniczną, aby usunąć wilgoć przed osadzeniem. Umieść oko w formie próbki (25 x 20 x 5 mm3) tak, aby soczewka i nerw wzrokowy były równoległe do blatu stołu, aby uzyskać przekroje strzałkowe. Zanurz oczy w środku o optymalnej temperaturze cięcia (O.C.T.) i umieść na suchym lodzie do zamrożenia. Po zamrożeniu bloki należy przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
2. Przygotowanie zamrożonego przekroju do mikrodysekcji laserowej
<ol>
	<li>Przed użyciem inkubować szkiełka membranowe z politereftalanu etylenu (PET) w sieciowniku UV z maksymalną mocą przez 45 min.</li>
	<li>Rozpyl roztwór odkażający RNase na szczotkę, kleszcze, słoiki sprzęgające i uchwyt montażowy. Dokładnie wytrzyj. Spłucz wodą bez nukleaz i wysusz. Przetrzyj kriostat 100% etanolem, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego.</li>
	<li>Ustawić kriostat do -18 °C. Wyjąć po jednym zamrożonym bloku z zamrażarki o temperaturze -80 °C i dostarczyć do kriostatu wraz z suchym lodem. Pozostawić zamrożony blok do zrównoważenia z temperaturą kriostatu przez co najmniej 10 minut.</li>
	<li>Wyciśnij niewielką ilość O.C.T. na kawałek montażowy (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 1A) i wyjmij blok tkanki z formy i ostrożnie umieść blok na uchwycie montażowym (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1B). Gdy blok tkanki na uchwycie montażowym zostanie zamrożony na stałe, włóż do uchwytu próbki kriostatu (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2A).</li>
	<li>Wyreguluj kriostat, aby przeciąć odcinki o wielkości 8 μm i ostrożnie przeciąć blok OCT, aby dotrzeć do próbki tkanki. Po zaobserwowaniu tkanki przerwij cięcie, przytnij zamrożone bloki ze wszystkich stron za pomocą czystej żyletki i pozostaw 3 - 4 mm OCT otaczające tkankę, aby umożliwić obsługę pędzlem (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2B). Między każdą wymianą próbki należy używać nowego, czystego pędzla zamiast płytki rolkowej, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego próbki.</li>
	<li>Przekrój przez oko działa szybko. Zabarwić co trzeci odcinek, zalewając szkiełko szybkim, jednoetapowym barwnikiem hematoksyliny i eozyny (H&E) przez 60 s, spłukać wodą z kranu, wysuszyć na powietrzu, zaczyścić w środku czyszczącym i zamontować na naładowanym szkiełku z szkiełkiem nakrywkowym. View pod mikroskopem i kontynuuj cięcie, aż TM będzie widoczny w wyciętych sekcjach.</li>
	<li>Gdy TM zacznie się pojawiać, wytnij 2 sekcje i zamontuj na naładowanym szkiełku w celu rutynowego barwienia H&E, aby utworzyć mapę do cięcia za pomocą LCM. 
	UWAGA: Patrz rozdział 3, aby zapoznać się ze szczegółami mapy i barwienia.</li>
	<li>Po pierwszym szkiełku z mapą H&E wytnij i wyrównaj 6 szeregowych odcinków o grubości 8 μm w kriostacie i jednocześnie zamontuj na szkiełku z membraną PET (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 3A, B). Przyklej tkankę, krótko przesuwając kciuk w rękawicy wzdłuż tylnej części membrany. Po zamontowaniu należy natychmiast umieścić szkiełko z membraną PET w pudełku na suwak na suchym lodzie. 
	UWAGA: Można zamontować mniej sekcji, jednak zaleca się jednoczesne montowanie wielu sekcji na szkiełku w celu zmniejszenia degradacji RNA poprzez ograniczenie czasu, przez jaki każda sekcja jest wystawiona na działanie powietrza o temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Kontynuuj sekcję oka, po każdych dwóch szkiełkach z membraną PET po 6 sekcji każdy, zbierz dwie sekcje na naładowanym szkiełku, aby utworzyć kolejny szkiełko do barwienia H&E. Kontynuuj cięcie, około 100 szeregowych odcinków o grubości 8 μm, aż TM przestanie być widoczny. Potwierdzić, szybko zabarwiając jedną sekcję na naładowanym szkiełku podstawowym (patrz 2.6).</li>
	<li>Przechowuj wszystkie szkiełka z membraną PET w temperaturze -80 °C do późniejszego wykorzystania LCM.</li>
</ol>
3. Protokół barwienia szkiełek na mapie H&E i przegląd morfologiczny
<ol>
	<li>Aby zobrazować i przejrzeć szkiełka mapowe na naładowanych szkiełkach, utrwal tkankę, natychmiast przenosząc ją do słoika do barwienia wypełnionego 100 ml roztworu do szybkiego utrwalania przez 7 sekund. Przepłucz szkiełko, zanurzając je w wodzie destylowanej 10 - 20 razy, a następnie przenieś szkiełko do słoika sprzęgającego z czystą wodą destylowaną.</li>
	<li>Wyjmij szkiełko z wody i osusz suche krawędzie chusteczką higieniczną. Odpipetować 200 μl zmodyfikowanej przefiltrowanej hematoksyliny Harrisa na każdą sekcję i inkubować przez 30 s w temperaturze pokojowej. Ostrożnie opłucz szkiełko pod bieżącą wodą z kranu, aż woda będzie czysta. Osusz koniec szkiełka chusteczką chusteczką między każdym krokiem (osusz między każdym krokiem od 3,2 do 3,5), aby usunąć nadmiar płynu.</li>
	<li>Umieść szkiełko w 1x PBS w temperaturze pokojowej na 30 s. Następnie ostrożnie płucz szkiełko pod bieżącą wodą z kranu przez 30 sekund.</li>
	<li>Zanurz szkiełko 3 - 4 razy w kąpieli etanolowej 95%. Nałożyć wystarczającą ilość roztworu barwnika Eozyny Y, aby pokryć tkankę na szkiełku i inkubować przez 15 s w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Opłucz szkiełko w kąpieli z 95% etanolem dwa razy, z 10 - 20 szybkimi zanurzeniami każdy. Opłucz szkiełko w kąpieli 100% etanolowej dwa razy, z 10 - 20 szybkimi zanurzeniami każdy. Następnie spłucz szkiełko dwa razy w kąpieli ksylenowej (po 10 - 20 szybkich zanurzeń).</li>
	<li>Zamontuj, nakładając żywiczny środek montażowy na tkankę, ostrożnie dodaj szkiełko nakrywkowe, aby uniknąć pęcherzyków powietrza i pozostaw do wyschnięcia w kapturze na noc.</li>
	<li>Przeglądaj slajdy H&E wizualnie lub za pomocą cyfrowego skanera slajdów. Zidentyfikuj slajdy mapy z TM wyraźnie widoczne i dostępne do cięcia. Użyj szkiełek z membraną PET między tymi szkiełkami mapy dla LCM.</li>
</ol>
4. Protokół przetwarzania i barwienia szkiełek membranowych z politereftalanu etylenu (PET)
<ol>
	<li>Przed wyjęciem szkiełek PET z zamrażarki należy najpierw przygotować roztwór podstawowy fioletu krezylowego, rozpuszczając 0,3 g octanu fioletu krezylowego w 20 ml 75% etanolu i umieścić na wytrząsarce na 2 godziny. Przefiltrować roztwór za pomocą sterylnego filtra 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C nie dłużej niż 6 miesięcy.</li>
	<li>Przygotować alkoholowy roztwór eozyny Y ze świeżym 75% etanolem w stosunku 1:4. Przygotuj roztwory utrwalające (75% etanolu) i odwadniające (75%, 95% i 100% etanolu) w czystych, wolnych od nukleaz, stożkowych probówkach polipropylenowych o pojemności 50 ml na lodzie. Dodaj inhibitor RNazy do każdego roztworu.</li>
	<li>Wyjąć pudełko ze szkiełkami zawierającymi zamrożone skrawki tkanek z zamrażarki w temperaturze -80 °C i umieścić je na suchym lodzie. Przetwarzaj jeden slajd na raz. Napraw szkiełka, umieszczając je natychmiast w zimnym 75% etanolu na 30 s.</li>
	<li>Delikatnie zanurz szkiełko w wodzie wolnej od nukleaz na 10 - 15 sekund, aby rozpuścić O.C.T. bez ingerencji w skrawki tkanki.</li>
	<li>Ostrożnie odpipetować 300 μl 1,5% roztworu octanu fioletu krezylowego bezpośrednio na sekcje i inkubować przez 45 s w temperaturze pokojowej. Następnie umyj jeden raz, umieszczając go w kąpieli z 75% etanolem na 30 sekund. Odpipetować 200 μl roztworu eozyny Y na sekcje i inkubować przez 3 - 5 s.</li>
	<li>Odwodnić tkankę, umieszczając szkiełko w kąpieli 75% etanolu, 95% etanolu, a na koniec w 100% etanolu na 30 sekund każda. Osusz koniec szkiełka chusteczką chusteczką między każdym krokiem, aby usunąć nadmiar płynu. Pozostaw zjeżdżalnię do całkowitego wyschnięcia pod maską przez 5 minut. Po wyschnięciu natychmiast wykonaj LCM. 
	UWAGA: Zaleca się unikanie stosowania ksylenu na tym etapie, może to spowodować nieodpowiednie przyleganie skrawków tkanki do szkiełka membranowego i zmniejszyć skuteczność wychwytywania tkanek.</li>
</ol>
5. Mikrodysekcja laserowa za pomocą lasera UV
<ol>
	<li>Włącz komputer i pozwól na uruchomienie. Włącz zasilanie mikroskopu światłem białym. Włącz lasera UV, a zaświeci się żółta dioda LED. Uruchom oprogramowanie LCM, pozwól mu się w pełni załadować, a wyświetli się wideo na żywo. Naciśnij przycisk lasera na skrzynce sterownika, a zaświeci się zielona dioda LED.</li>
	<li>Załaduj nowe szkiełko podstawowe na stolik mikroskopu, a następnie umieść szkiełko z membraną PET stroną z zabarwionej tkanki skierowaną w dół bezpośrednio na górnej części szkiełka podstawowego. Upewnij się, że membrana i szkiełko są ściśle sparowane na stoliku mikroskopu.</li>
	<li>Rozpocznij LCM, najpierw ustawiając limity suwaka. Wybierz najmniejsze powiększenie 4X w panelu obiektywu (<silna klasa="xfig">Rysunek 4). Następnie zdefiniuj obszar roboczy szkiełka membranowego, przesuwając stolik xy mikroskopu, aż lewy górny róg, w którym spotykają się metal i membrana, będzie widoczny w strumieniu wideo na żywo, naciśnij przycisk "Limit 1", a na mapie drogowej pojawi się czerwony prostokąt. Następnie przejdź do stolika xy w przeciwległym rogu i naciśnij przycisk "limit 2". Naciśnij przycisk "skanuj", aby utworzyć obraz mapy drogowej błony i tkanek między ustawionymi limitami.</li>
	<li>Kliknij dwukrotnie w pobliżu TM jednej z sekcji oka na mapie drogowej, TM może znajdować się w pobliżu wierzchołka kąta tęczówkowo-rogówkowego (<silna klasa = "xfig">Rysunek 5A). Po zidentyfikowaniu TM zwiększ powiększenie do 10X i ręcznie ustaw ostrość na TM. Powtórz tę czynność z obiektywami 20X i 40X. Gdy TM jest ostra na obiektywie 40X (<silna klasa = "xfig">Rysunek 5B), przejdź do pustego obszaru w pobliżu (może być konieczne nieznaczne dostosowanie ostrości), wybierz "narzędzie do rysowania odręcznego" i narysuj długą linię na pustym obszarze tkanki.</li>
	<li>Ustaw parametry lasera tak, aby "prędkość cięcia" wynosiła 34%, "ostrość" wynosiła 58%, a "moc" wynosiła 70% (<silna klasa="xfig">Rysunek 4), a następnie naciśnij przycisk "cięcie". Dokonuj precyzyjnych regulacji parametrów lasera dotyczącego prędkości, ostrości i mocy, aż do uzyskania wyraźnej i cienkiej linii cięcia (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 5C). Aby uzyskać precyzyjne cięcie, upewnij się, że cięcie przebiega zgodnie z narysowaną linią.</li>
	<li>Załaduj pokrywę rurki izolacyjnej do uchwytu nasadki i otwórz rurkę. Przymocuj uchwyt nasadki do podnośnika nasadki i upewnij się, że rurka jest odwrócona. Upewnij się, że materiał nasadki samoprzylepnej wystaje poza końcówkę nasadki, aby zapewnić prawidłowe uchwycenie pożądanej tkanki.</li>
	<li>Wybierz "Ręczny" tryb preparowania w panelu oprogramowania. Dokładnie sprawdź, czy TM (<silna klasa="xfig">Rysunek 5B) znajduje się bezpośrednio pod rurką izolacyjną. Ustaw balans bieli i dostosuj jasność, aby uzyskać optymalną jakość obrazu (<silna klasa="xfig">Rysunek 4).</li>
	<li>Aby rozpocząć cięcie, ręcznie wyreguluj ostrość i narysuj linię za pomocą narzędzia odręcznego, upewnij się, że nasadka zbierająca pozostaje w górnej pozycji, nie dotykając jeszcze membrany. Narysuj częściowe okręgi w pobliżu miejsca, w którym TM styka się z twardówką (<silna klasa="xfig">Rysunek 5C), a następnie naciśnij "wytnij". Po wykonaniu pierwszych cięć ustaw nasadkę w dolnej pozycji i ponownie wyreguluj ostrość, a następnie narysuj dwie linie w otwartej lub wolnej przestrzeni, aby połączyć dwie częściowe okręgi kończące okrąg wokół TM, następnie naciśnij "wytnij" i zbierz tkankę z przekroju, upewnij się, że TM została podniesiona przez nasadkę do mikrodysekcji (<silna klasa = "xfig">Rysunek 5D-F).</li>
	<li>Umieść nasadkę z powrotem w górnej pozycji i powtórz (5.2 - 5.8) na pozostałych sekcjach. Nieznacznie dostosuj pozycję nasadki, tak aby wszystkie wyizolowane próbki zmieściły się na nasadce i nie nachodziły na siebie (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 5G). Aby zachować spójność, okno czasowe dla jednego slajdu wynosi 20 minut. Użyj mniejszej liczby sekcji na szkiełko PET, jeśli potrzeba więcej czasu na odizolowanie TM od wszystkich sekcji. W przypadku następnej membrany PET włóż nową rurkę izolacyjną i powtórz sekcję 5.</li>
</ol>
6. Liza mikrowypreparowanej tkanki TM
<ol>
	<li>Świeżo przygotowany bufor do lizy RNA do lizy izolowanej tkanki LCM. Dodać 10 μl β-merkaptoetanolu do każdego 1 ml buforu do lizy. Bufor do lizy z β-merkaptoetanolem należy przechowywać w temperaturze pokojowej nie dłużej niż 1 miesiąc.</li>
	<li>Wyjmij rurkę izolacyjną z uchwytu nakrętki w ciągu 20 minut od rozpoczęcia mikrodysekcji. Wizualizuj powierzchnię nasadki na oko, aby zapewnić uchwycenie TM.</li>
	<li>Ostrożnie odpipetować 10 μl buforu do lizy na pokrywę probówki zbiorczej, upewniając się, że bufor do lizy całkowicie zakrywa mikrowyciętą TM. Delikatnie zamknij samoprzylepną nasadkę i inkubuj probówkę zbiorczą do góry nogami w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Po inkubacji odwirować przy 800 x g przez 2 minuty i umieścić lizat na suchym lodzie. Przechowywać lizaty w temperaturze -80 °C w celu późniejszego oczyszczenia i analizy.</li>
</ol>
7. Izolacja RNA i analiza jakości
<ol>
	<li>Analizuj jakość RNA, rozmrażając próbki w temperaturze pokojowej. Zbierz wszystkie próbki wyizolowane od jednej myszy w jednej probówce do mikrofugi o pojemności 1,5 ml wolnej od RNaz. 
	UWAGA: Na przykład dla każdej kontrpróby biologicznej wygenerowano 10 - 12 probówek z mikrowyciętymi czapeczkami w 10 μl lizatu, a wszystkie lizaty przeniesiono do jednej probówki dla każdej kontrpróby biologicznej (100 - 120 μl lizatu).</li>
	<li>Dodaj jedną objętość świeżo przygotowanego 70% etanolu (wykonanego z wody wolnej od RNaz) do każdego roztworu lizatu. Następnie oczyść całkowite RNA zgodnie z wytycznymi użytkownika zestawu do izolacji RNA. Upewnij się, że usunięto genomowe DNA z każdej próbki RNA. 
	UWAGA: Genomowe DNA może zakłócać dalszą analizę RNA.</li>
	<li>Zmierz jakość RNA wyizolowanego z TM, łącząc próbki od każdej myszy i analizując integralność rybosomalnego RNA (<silna klasa="xfig">Rysunek 6A). 
	UWAGA: Ze względu na mały rozmiar TM, piki rybosomalnego RNA mogą nie być obserwowalne (<silna klasa="xfig">Figura 6B) w profilu jakości RNA (dwa piki obserwowane między 1,000 - 4,000 pz w <silna klasa="xfig">Rysunek 6A, C), który jest używany do obliczania liczby integralności RNA (RIN)47.
	<ol>
		<li>Uzyskaj dokładniejszą miarę integralności RNA, izolując RNA z obficiej występującej tkanki pozostałej na szkiełku błonowym. Aby uzyskać reprezentatywny RIN, należy wyizolować RNA z tkanki oka na szkiełku membranowym, pipetując 10 μl buforu do lizy na jeden fragment tkanki i przeprowadzić izolację RNA. Przeanalizuj jakość RNA i oblicz RIN (<silna klasa="xfig">Rysunek 6C).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku dalszych zastosowań RNA należy użyć zestawu RNA o niskim wkładzie do sekwencjonowania i generowania biblioteki cDNA, aby uzyskać powtarzalne wyniki z zaledwie 80 odcinków izolowanej TM LCM.</li>
</ol>
8. Analiza
<ol>
	<li>Aby sprawdzić, czy pobrana tkanka jest rzeczywiście wzbogacona w geny związane z TM, zbierz wiele dodatkowych RNA z mikrowypreparowanego całego oka, twardówki, tęczówki, siatkówki, rogówki i soczewki od 3 oddzielnych myszy. Użyj tego RNA w połączeniu z RNA zebranym LCM z izolowanej TM i ciałem rzęskowym pobranym od 4 oddzielnych myszy.</li>
	<li>Konwersja RNA z mikrowypreparowanych próbek polegała na przekształceniu w cDNA za pomocą zestawu do odwrotnej transkrypcji cDNA. Amplifikuj RNA z izolowanych próbek LCM i przekształć je w cDNA przy użyciu zestawu RNA do cDNA o niskim wchodzeniu.</li>
	<li>Przeanalizuj całe RNA pod kątem genów eksprymujących siatkę beleczkową, miocyliny (MYOC) i alfa-aktyny-2 (ACTA2) i znormalizuj za pomocą genu porządkowego HSP90a1 za pomocą cyfrowego PCR (<silna klasa = "xfig">Figura 7A-B).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

TM odgrywa istotną rolę w aktywnym utrzymaniu homeostatycznego ciśnienia wewnątrzgałkowego, a jego dysfunkcja jest powszechnie akceptowana jako główny czynnik wywołujący jaskrę nadciśnieniową 1,2,19. Szereg polimorfizmów pojedynczych nukleotydów w kilku genach zidentyfikowanych za pomocą analizy GWAS powiązano ze zwiększonym ryzykiem jaskry i zwiększoną odpornością na odpływ AH w TM; Jednak dokładne mechanizmy molekularne, które...

Jaskra to grupa chorób charakteryzujących się neuropatią nerwu wzrokowego i retinopatią, która ostatecznie prowadzi do nieodwracalnej ślepoty1,2. Szacuje się, że do 2020 roku ponad 70 milionów ludzi na całym świecie będzie żyło z jakąś formą choroby3,4,5,6,7. Jaskra pierwotnego otwartego kąta (POAG), najbardziej rozpowszechniony typ jaskry, charakteryzuje się zmniejszeniem odpływu cieczy wodnistej (AH), co prowadzi do wzrostu ciśnienia wewnątrzgałkowego (IOP)8,9,10,11,12,13,143,15,16,17,18. Nieleczone, przewlekle podwyższone ciśnienie wewnątrzgałkowe prowadzi do postępującego i nieodwracalnego uszkodzenia siatkówki i głowy nerwu wzrokowego, powodując ślepotę promieniową1,2,19. Wszystkie obecne metody spowalniania postępu jaskry koncentrują się na zmniejszeniu ciśnienia wewnątrzgałkowego, albo poprzez zmniejszenie tempa produkcji AH przez ciało rzęskowe, albo zwiększenie jego odpływu1,8,9,10,11,12,13,14. Siatka beleczkowa (TM) odgrywa istotną rolę w aktywnej regulacji pierwotnego szlaku odpływu AH, a jej niewłaściwa funkcja jest czynnikiem sprawczym jaskry nadciśnieniowej1,2,19. Jednak mechanizmy molekularne związane z dysfunkcją TM i sposób, w jaki reguluje ona drenaż AH, nie są jeszcze w pełni poznane i są obecnie głównym przedmiotem badań nad jaskrą1,2,19,20. Podczas gdy kilka badań asocjacyjnych całego genomu (GWAS) powiązało wiele genów z jaskrą i zwiększoną opornością na odpływ AH w TM, dokładne mechanizmy molekularne, które prowadzą do choroby, nie są jeszcze w pełni zrozumiałe21,22,23,24,25.
Modele zwierzęce znacznie poszerzyły naszą obecną wiedzę na temat postępu choroby w jaskrze (obszerne przegląd w3,15,16,26,27,28,29,30,31,32,33). Opracowano kilka pionierskich metod do badania klasy TM<sup="xref">34,35,36 i metody te są szeroko stosowane w celu pogłębienia naszej obecnej wiedzy na temat prawidłowych i chorych tkanek. Jednym z obszarów, który nie został dogłębnie zbadany, jest wykorzystanie genetycznie zmodyfikowanych modeli myszy do badania molekularnych mechanizmów niewydolności TM. Transgeniczne badania genów związanych z TM na myszach typu knock-in i knock-out, takie jak Myocilin (Myoc)37,38 i Cyp1b139, były podstawowymi narzędziami do badania molekularnych mechanizmów funkcji TM. Zrozumiałe jest, że mały rozmiar TM u myszy stanowi poważną przeszkodę, którą należy pokonać, aby rozpocząć badanie tej tkanki. Modele mysie stanowią potężne narzędzie do badania genetyki i molekularnych mechanizmów chorób, podczas gdy postępy w technologiach LCM dostarczają niezbędnych narzędzi do umożliwienia badania najmniejszych i najdelikatniejszych tkanek, w tym TM.
W tym raporcie opisano solidną i powtarzalną metodę dla LCM wysoce wzbogaconej TM z oczu myszy wraz z późniejszą izolacją RNA i amplifikacją do dalszej analizy ekspresji. Podobne metody zostały z powodzeniem zastosowane u myszy do izolacji innych typów tkanek oka40,41,42,43,44, opisana tutaj metodologia może być zastosowana do innych dyskretnych tkanek oka do badania RNA, mikroRNA, DNA i białek. Co ważne, technika ta umożliwia wykorzystanie genetycznie zmodyfikowanych myszy w celu lepszego zrozumienia molekularnej patogenezy upośledzenia TM w jaskrze i chorobach oczu3,15,16,17,18,26,31,45,46. Możliwość wyizolowania TM oczu myszy za pomocą LCM będzie przydatną techniką w uzyskaniu dalszych informacji na temat mechanizmów molekularnych kilku chorób oczu.

<table><tbody><tr><td>Podkłady ACTA2 ddPCR (dMmuCPE5117282)</td><td>BioRad</td><td>10031252</td><td></td></tr><tr><td>FAM Agilent 2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2946-90004</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Agilent RNA 6000 Pico</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>BioRad QX200 Kroplowy cyfrowy system PCR</td><td>Mały</td> pędzel <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>malarski BioRadSzkiełko mikroskopowe z naładowanym szkłem</td><td>Thermo scientific</td><td>4951PLUS-001</td><td></td></tr><tr><td>Octan fioletu krezylowego</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5042</td><td></td></tr><tr><td>Zakrzywione nożyczki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Barwnik Eosin Y</td><td>Thermo scientific</td><td>71204</td><td></td></tr><tr><td>Kleszczyki</td> do etanolu <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td> Zakrzywiona i ząbkowana końcówka (preferowany rozmiar końcówki: 0,5 x 0,4 mm)<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HemaCen</td><td>American MasterTech</td><td>STHEM30</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do odwrotnej transkrypcji cDNA o dużej pojemności</td><td>Applied Biosystems</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>Startery ddPCR Hsp90a (dMmuCPE5097465)</td><td>BioRad</td><td>10031255</td><td>VEX</td></tr><tr><td>Kriostat Leica CM1850 Jednostka</td> filtrująca <td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Millex-GS</td><td>EMD Millipore</td><td>SLGS033SB</td><td>0,22 i mikro; m</td></tr><tr><td>MMI CellCut UV Model do cięcia UV</td><td>Maszyny molekularne i Branże</td><td></td><td>Instalacje LCM</td></tr><tr><td>MMI CellTools Oprogramowanie</td><td>Maszyny molekularne i Branże</td><td>50202</td><td>Oprogramowanie LCM</td></tr><tr><td>Probówka na próbkę do mikrodyssekcji wychwytu laserowego</td><td>Produkty ASEE</td> Rurka z nasadką izolacyjną <td>ST-LMD-M-500</td><td>/ Wyprodukowana przez Microdissect GmBH w Niemczech i rozprowadzona przez ASEE</td></tr><tr><td>Products Probówka na próbkę do mikrodysekcji wychwytu laserowego (alternatywna)</td><td>Maszyny molekularne i Branże</td><td></td><td></td></tr><tr><td>zmodyfikowane Harris Hematoxylin</td><td>Thermo scientific</td><td>7211</td><td>FAM</td></tr><tr><td>MYOC ddPCR Primers (dMmuCPE5095712)</td><td>Szkiełka Memebrane BioRad</td><td>10031252</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, wolne od RNaz</td><td>Produkty ASEE</td><td>FS-LMD-M-50r</td><td>Membrana z politereftalanu etylenu (PET) / Wyprodukowane przez Microdissect GmBH w Niemczech i dystrybuowane przez Produkty ASEE</td></tr><tr><td>Szkiełka Memebrane, wolne od RNaz (alternatywne)</td><td>Maszyny molekularne i Branże</td><td>50102</td><td></td></tr><tr><td>Rapid Fix</td><td>Thermo 6764212 naukowy</td><td></td><td>H& Bufor</td></tr><tr>do lizy<td>RLT</td> do barwienia E <td>Qiagen</td><td>79216</td><td>stosowany do próbek LCM</td></tr><tr><td>RNAseZap</td><td>Sigma</td><td>R2020</td><td>Roztwór do dekontaminacji RNazy</td></tr><tr><td>Chroń inhibitor RNA RNAza</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R7397</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td>Zestaw do izolacji RNA</td></tr><tr><td>SMART-Seq v4 Zestaw RNA o bardzo niskim nakładzie wejściowym</td><td>Takara Clontech</td><td>634888</td><td>zestaw do pobierania RNA do cDNA o niskim wkładzie do próbek LCM</td></tr><tr><td>SuperMix (bez dUTP)</td><td>BioRad</td><td>1863023</td><td>cyfrowa mieszanka główna PCR</td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold (25mm x 20mm x5mm)</td><td>Sakura</td><td>4557</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Stratalinker UV Crosslinker</td><td>Stratagene</td><td>400075</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Macron</td><td>8668</td><td></td></tr></tbody></table>

laserowe wychwytywanie mikrodysekcji siatki beleczkowej o wysokiej czystości z oczu myszy do analizy ekspresji genów

Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis

Mikrodysekcja laserowa (LCM) pozwoliła na analizę ekspresji genów pojedynczych komórek i wzbogaconych populacji komórek w skrawkach tkanki. LCM jest doskonałym narzędziem do badania mechanizmów molekularnych leżących u podstaw różnicowania komórek oraz rozwoju i progresji różnych chorób, w tym jaskry. Jaskra, która obejmuje rodzinę postępujących neuropatii nerwu wzrokowego, jest najczęstszą przyczyną nieodwracalnej ślepoty na całym świecie. Zmiany strukturalne i uszkodzenia w obrębie siatki beleczkowej (TM) mogą powodować wzrost ciśnienia wewnątrzgałkowego (IOP), który jest głównym czynnikiem ryzyka rozwoju jaskry. Jednak dokładne mechanizmy molekularne związane z tym są nadal słabo poznane. Możliwość przeprowadzenia analizy ekspresji genów będzie miała kluczowe znaczenie dla uzyskania dalszych informacji na temat funkcji tych komórek i ich roli w regulacji IOP i rozwoju jaskry. Aby to osiągnąć, potrzebna jest powtarzalna metoda izolowania wysoce wzbogaconej TM z zamrożonych fragmentów oczu myszy oraz metoda dalszej analizy ekspresji genów, taka jak RT-qPCR i RNA-Seq. Opisana w niniejszym dokumencie metoda została opracowana w celu wyizolowania TM o wysokiej czystości z oczu myszy w celu przeprowadzenia dalszej cyfrowej analizy PCR i mikromacierzy. Ponadto technikę tę można łatwo dostosować do izolacji innych wysoce wzbogaconych komórek oka i przedziałów komórkowych, które były trudne do wyizolowania od oczu myszy. Połączenie analizy LCM i RNA może przyczynić się do bardziej wszechstronnego zrozumienia zdarzeń komórkowych leżących u podstaw jaskry.

RNA pobrane metodą LCM z TM i ciała rzęskowego od 4 różnych myszy zostało wyizolowane, aby umożliwić analizę ekspresji genów i porównanie jej z ekspresją w całym oku, twardówce, tęczówce, siatkówce, rogówce i soczewce wyizolowanych od trzech oddzielnych myszy. Geny eksponowane w TM, MYOC48 oraz ACTA249, zostały przeanalizowane we wszystkich pobranych tkankach, aby potwierdzić, że wyizolowane próbki TM były rzeczywiście siln...

Tutaj opisujemy protokół powtarzalnej mikrodysekcji laserowej (LCM) do izolowania siatki beleczkowej (TM) do dalszej analizy RNA. Możliwość analizowania zmian w ekspresji genów w TM pomoże w zrozumieniu mechanizmów molekularnych leżących u podstaw chorób oczu związanych z TM.

Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji siatki beleczkowej o wysokiej czystości z oczu myszy do analizy ekspresji genów

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great ...

Ogólnym celem tej procedury mikrodysekcji laserowej jest opracowanie solidnej i powtarzalnej metody izolacji wysoce wzbogaconej siatki beleczkowej z oczu myszy przy użyciu mikroskopii laserowej w celu późniejszej izolacji RNA i dalszej analizy ekspresji. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie okulistyki, takie jak ważne geny i szlaki sygnałowe, które w przypadku niewłaściwej regulacji mogą prowadzić do chorób oczu. Główną zaletą tej techniki jest to, że wysokiej jakości RNA z siatki beleczkowej oczu myszy można odtwarzalnie wyizolować w celu analizy ekspresji genów.Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności, ponieważ mikrodysekcja laserowa jest potężną techniką, która obejmuje różne etapy rozwiązywania problemów w całym protokole. Rozpocznij tę procedurę od optymalnego pobrania tkanek do mikrodysekcji laserowej, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Rozpyl roztwór odkażający RNase na szczotkę, kleszcze, słoiki sprzęgające i uchwyt montażowy.Po dokładnym wytarciu wypłucz aparat wodą bez nukleaz i wysusz. Przetrzyj kriostat 100% etanolem, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego. Wyciśnij niewielką il

laser-capture-microdissection-highly-pure-trabecular-meshwork-from

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Mikroskopia z przechwytywaniem laserowym, znana również jako laserowa mikrodysekcja (LMD), umożliwia użytkownikowi izolację niewielkiej liczby komórek lub tkanek z zamrożonych lub ...

Mikrorozcięcie laserowe z wychwytem (Laser Capture Microdissection) tkanek ssaków

Mikrosekcja laserowa została zastosowana do analizy profilu ekspresji genów w konkretnych przedziałach tarczki skrzydła Drosophila poddanych lokalnemu RNAi in vivo. RNA wyekstrahowany z równoważnych obszarów przedziałów wyciszonych i niewyciszonych przeanalizowano za pomocą ilościowej RT-PCR w celu określenia porównawczego profilu ekspresji genów w kontekście rodzimej mikroekologii tkanki.

Mikrosekcja laserowa zastosowana do profilowania ekspresji genów w podzbiorze komórek z dysku skrzydłowego Drosophila

Profilowanie ekspresji RNA w oddzielnych regionach mózgu myszy wymaga precyzyjnej i powtarzalnej strategii pobierania tkanek. W niniejszym opracowaniu opisano protokół wykorzystujący zarówno sekcjonowanie mózgu w płaszczyźnie czołowej, jak i mikrodysekcję wspomaganą wycinakiem do tkanek. Wydajność i jakość całkowitego RNA uzyskanego z otrzymanych próbek potwierdzają użyteczność przedstawionej metody.

Metoda mikroskopii bez użycia laserowej mikrodysekcji do mikrodysekcji dyskretnych obszarów mózgu myszy w celu izolacji całkowitego RNA oraz późniejszego sekwencjonowania następnej generacji i profilowania ekspresji genów

Opisujemy, jak korzystać z mikrodysekcji laserowej (LCM) w celu uzyskania wzbogaconych populacji neuronów hipokampa lub pojedynczych neuronów z zamrożonych fragmentów uszkodzonego mózgu szczura do późniejszej analizy ekspresji genów przy użyciu ilościowego PCR w czasie rzeczywistym i/lub mikromacierzy całego genomu.

Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji wzbogaconych populacji neuronów lub pojedynczych neuronów do analizy ekspresji genów po urazowym uszkodzeniu mózgu

W tym artykule opisujemy zasady projektowania i przeprowadzania wielokolorowego eksperymentu z wykorzystaniem myszy R26R-Confetti. Zapewniamy specjalny protokół śledzenia komórek nabłonka rogówki, który można modyfikować pod kątem innych interesujących tkanek.

Metoda śledzenia linii komórek rogówki przy użyciu wielokolorowych fluorescencyjnych myszy reporterowych

Protokół mikrodysekcji laserowej (LCM) został opracowany w celu uzyskania wystarczającej ilości wysokiej jakości RNA do analizy ekspresji genów w komórkach kostnych. Obecne badanie koncentruje się na mysich odcinkach kości udowej. Jednak opisany tutaj protokół LCM może być wykorzystany do badania ekspresji genów w komórkach dowolnej tkanki twardej.

Protokół mikrodysekcji z wychwytem laserowym, który zapewnia wysokiej jakości RNA ze świeżo zamrożonych kości myszy

Ten protokół opisuje mikrodysekcję laserową do izolacji chrząstki i kości ze świeżo zamrożonych fragmentów zarodka myszy. Chrząstka i kość mogą być szybko uwidocznione przez barwienie fioletem krezylo i precyzyjnie zebrane w celu uzyskania wysokiej jakości RNA do analizy transkryptomicznej.

Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji chrząstki embrionalnej i kości myszy w celu analizy ekspresji genów

Prezentowana tutaj jest wielofotonowa mikroskopijna platforma do obrazowania powierzchni oka myszy na żywo. Fluorescencyjna mysz transgeniczna umożliwia wizualizację jąder komórkowych, błon komórkowych, włókien nerwowych i naczyń włosowatych na powierzchni oka. Nieliniowe sygnały generujące drugą harmoniczną pochodzące ze struktur kolagenowych zapewniają obrazowanie bez znaczników dla architektur zrębowych.

Niestandardowa platforma mikroskopii wielofotonowej do obrazowania na żywo rogówki i spojówki myszy

Ten artykuł przedstawia protokół mikropreparacji oka u gryzoni. Proces ten polega na wyłuszczeniu gałki ocznej wraz z błoną naszywkową (tj. Trzecią powieką). Następnie następuje oddzielenie tylnej i przedniej części gałki ocznej.

Mikrodysekcja oka gryzonia

Protokół ten szczegółowo opisuje oddzielenie nabłonka soczewki oka myszy od masy masowej komórek włóknistych, a następnie izolację RNA i analizę qPCR. Metoda ta pozwala na oddzielenie przedziałów komórek soczewki w celu bardziej szczegółowej analizy transkryptomu i procesów biologicznych w komórkach nabłonkowych w porównaniu ze zróżnicowanymi komórkami włóknistymi.

Izolacja RNA z nabłonka soczewek ocznych myszy i mas masowych komórek włóknistych

Poznaj metodę laserowej mikrodysekcji do izolacji siatki beleczkowej z oczu myszy w celu analizy ekspresji genów. Ta technika umożliwia uzyskanie wysokiej jakości RNA dla badań okulistycznych.

Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji siatki beleczkowej o wysokiej czystości z oczu myszy do analizy ekspresji genów

Przeglądaj więcej filmów