Elektrochemiczne wykrywanie wpływu kinetycznego izotopu deuteru na zewnątrzkomórkowy transport elektronów w Shewanella oneidensis MR-1

Ogólnym celem tego protokołu jest obserwacja udziału transportu protonów w szybkości bakteryjnego zewnątrzkomórkowego transportu elektronów poprzez wykrycie efektu kinetycznego izotopu deuteru. Nasza metoda ujawnia wpływ transportu protonów na kinetykę zewnątrzkomórkowego transportu elektronów lub EET z bakterii do elektrody za pośrednictwem cytochromów typu c błony zewnętrznej. Nasz test odzwierciedla natywne zarządzanie protonami w EET, ponieważ użyliśmy żywych bakterii, a nie oczyszczonego enzymu.

Jednak naszym wyzwaniem było usunięcie szumów z innych procesów komórkowych. Efekt kinetyczny izotopu deuteru, określany jako KIE, jest jedną z najlepszych technik badania udziału transportu protonów w powiązanym procesie transportu elektronów. Aby wyhodować komórki Shewanella MR-1, przenieś jedną kolonię komórek wyhodowanych na płytce agarowej do 15 mililitrów pożywki LB.

Hoduj komórki w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 24 godziny w warunkach tlenowych z wytrząsaniem z prędkością 160 obr./min. Odwirować zawiesinę komórek pod ciśnieniem 6 000 razy większym niż grawitacja przez 10 minut. Następnie ponownie zawieś powstałą osadkę komórkową w 15 mililitrach zdefiniowanego podłoża, uzupełnionego 10 milimolowym mleczanem jako źródłem węgla i 0,5 grama na litr ekstraktu drożdżowego jako pierwiastkami śladowymi dla komórek.

Po dalszym tlenowym hodowaniu zawiesiny komórkowej w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 12 godzin z wytrząsaniem przy 160 obr./min, ponownie odwirować pod ciśnieniem 6 000 razy grawitacji przez 10 minut. Przepłukać otrzymany osad komórkowy dwukrotnie pożywką DM przez odwirowanie przez 10 minut przy 6 000 razy grawitacji przed eksperymentem elektrochemicznym. Aby zbudować trójelektrodowe reaktor elektrochemiczny, należy umieścić substrat ITO jako elektrodę roboczą na dnie reaktora.

Następnie włóż szklany cylinder i osłonę z politetrafluoroetylenu, a następnie włóż drut platynowy jako przeciwelektrodę. Następnie włóż elektrodę chlorku srebra do reaktora jako elektrodę odniesienia. Następnie dodaj cztery mililitry s.m. uzupełnione 10 milimolowym mleczanem i 0,5 grama na litr ekstraktu drożdżowego do reaktora elektrochemicznego.

Po upewnieniu się, że nie ma wycieku z reaktora elektrochemicznego, należy wprowadzić gazowy azot do reaktora elektrochemicznego w ciągu 20 minut, aby utrzymać warunki beztlenowe wewnątrz reaktora elektrochemicznego. Podłącz reaktor elektrochemiczny do potencjostatu i przyłóż dodatnie napięcie 0,4 V do elektrody ITO, utrzymując temperaturę reaktora elektrochemicznego na poziomie 30 stopni Celsjusza za pomocą zewnętrznego systemu cyrkulacji wody. Aby przeprowadzić hodowlę elektrochemiczną, najpierw dostosuj gęstość komórek zawiesiny do gęstości optycznej 1,43 przy 600 nanometrach z DM uzupełnionym 10 milimolowym mleczanem i 0,5 grama na litr ekstraktu drożdżowego.

Dodać 0,3 mililitra zawiesiny ogniw do reaktora elektrochemicznego przez port iniekcyjny za pomocą strzykawki. OD 600 w reaktorze zmienia się na 0,1. Kontynuuj potencjalną aplikację przy dodatnim napięciu 0,4 V do elektrody ITO przez 25 godzin.

Zatrzymaj aplikację potencjału i odłącz reaktor elektrochemiczny od potencjostatu i systemu cyrkulacji wody. Przepływać gazowy azot do butelki zawierającej DM z 10 milimolowym mleczanem przez 20 minut, aby usunąć tlen z pożywki. Teraz, bardzo powoli i delikatnie, usuń cały supernatant z wnętrza reaktora elektrochemicznego za pomocą strzykawki pod przepływającym azotem.

Następnie dodaj cztery mililitry świeżego DM zawierającego 10 milimolowych mleczanów za pomocą strzykawki. Pochylić reaktor elektrochemiczny, aby usunąć cały supernatant ze ściany reaktora. Powtórz te kroki w sumie trzy razy.

Zatrzymaj przepływ gazu i ponownie podłącz reaktor elektrochemiczny do potencjostatu, przykładając dodatnie 0,4 V do elektrody ITO o temperaturze 303 kelwinów. Upewnij się, że obecna produkcja z jednowarstwowego biofilmu Shewanella MR-1 jest stabilna i nie wzrasta gwałtownie. Jeśli prąd gwałtownie wzrasta, poczekaj, aż prąd ustabilizuje się z 5% wzrostem w ciągu 10 minut.

Bardzo powoli i delikatnie dodaj 40 mikrolitrów beztlenowego 50 procent objętościowego D2O do reaktora elektrochemicznego za pomocą strzykawki tak, aby stężenie w reaktorze wynosiło 0,5 procenta objętościowego D2O. Aby zapobiec uszkodzeniu biofilmu przez dodanie D20, należy wstrzykiwać D2O kroplami. Poczekaj, aż prąd się ustabilizuje, a następnie dodaj D2O do 4,4 procenta objętościowego, aby uzyskać wartość KIE, która jest stosunkiem bieżącej produkcji i obecności D2O i H2O.

Sprawdź wpływ tej samej objętości dodatku H2O na bieżącą produkcję. W tym przypadku linia ciągła jest reprezentatywnym wynikiem dla zmiany prądu mikrobiologicznego wywołanej addycją D2O. Dodanie D2O gwałtownie zmniejszyło prąd mikrobiologiczny w ciągu 10 sekund, podczas gdy H20 prawie nie miał spadku prądu, jak pokazano linią przerywaną.

Aby potwierdzić, że obserwowany spadek prądu przez D2O można przypisać transportowi elektronów przez cytochromy błony zewnętrznej, zastosowano dyfuzyjny mediator elektronowy. W tym przypadku dodanie 100 mikromolowych alfa-AQS zwiększyło obecną produkcję ponad pięciokrotnie, a obecna produkcja pozostała nienaruszona przez dodatek D2O. Wyniki te wskazują, że kinetyka reakcji metabolicznych jest na tyle szybka, że proces zewnątrzkomórkowego przenoszenia elektronów jest ograniczający szybkość.

Alternatywną metodą oceny tego zjawiska jest dodanie cząsteczki flawiny do reaktora elektrochemicznego. Natychmiastowy wzrost prądu anodowego przez dodatek flawiny wskazuje na ograniczenie szybkości przez proces transportu elektronów przez cytochromy błony zewnętrznej. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak badać wpływ izotopów kinetycznych na proces zewnątrzkomórkowego transportu elektronów.

Najbardziej krytycznym punktem dla pomyślnego uzyskania efektu izotopu kinetycznego jest wyjaśnienie i potwierdzenie stanu, w którym transport elektronów przez cytochromy błony zewnętrznej ogranicza tempo produkcji prądu. W tym filmie przedstawiliśmy dwie metody potwierdzania tego stanu: obserwację zmian prądu przez dodanie flawiny i dodanie dyfuzyjnego dodatkowego mediatora, takiego jak alfa-AQS. Po potwierdzeniu ograniczenia szybkości, system ten może być wykorzystany nie tylko do eksperymentu z deuterem, ale także do biochemicznej charakterystyki cytochromów błony zewnętrznej.

Co więcej, protokół ten może mieć zastosowanie do badania innych mikroorganizmów elektroaktywnych, o ile proces zewnątrzkomórkowego transportu elektronów jest ograniczony szybkością. Nasza metodologia zapewnia podstawową i ogólną technikę badania procesu zewnątrzkomórkowego transportu elektronów przez cytochromy błony zewnętrznej in vivo.