Name: Elektrochemiczne wykrywanie wpływu kinetycznego izotopu deuteru na zewnątrzkomórkowy transport elektronów w Shewanella oneidensis MR-1 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Poznaj elektrochemiczną metodę badania kinetycznego efektu izotopowego deuteru w transporcie elektronów zewnątrzkomórkowym u Shewanella oneidensis MR-1. Protokół pozwala analizować rolę transportu protonów w procesach bioenergetycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została finansowo wsparta przez Grant-in-Aid dla specjalnie promowanych badań od Japońskiego Towarzystwa Promocji Nauki (JSPS) KAKENHI Grant numer 24000010, 17H04969, oraz JP17J02602, Globalnego Biura Badań Marynarki Wojennej USA (N62909-17-1-2038). Y.T. jest pracownikiem naukowym JSPS i wspieranym przez JSPS w ramach Programu dla Wiodących Szkół Podyplomowych (MERIT).

1. Tworzenie monowarstwowego biofilmu S. oneidensis MR-1 na elektrodzie ITO (<silna klasa="xfig">Rysunek 1)
UWAGA: Aby zapobiec zanieczyszczeniu reaktora elektrochemicznego innymi mikrobami, wszystkie media, narzędzia i komponenty reaktora elektrochemicznego powinny być wcześniej wysterylizowane. W przypadku stosowania ogniw MR-1 S. oneidensis i konstruowania reaktorów elektrochemicznych wszystkie procedury powinny być przeprowadzane na czystej ławce.
<ol>
	<li>Hodowla komórek S. oneidensis MR-1 
	UWAGA: Jednowarstwowy biofilm S. oneidensis MR-1 został utworzony na elektrodzie ITO zgodnie z warunkami opisanymi wcześniej4.
	<ol>
		<li>Aby wyhodować komórki S. oneidensis MR-1, dodaj jedną kolonię S. oneidensis MR-1 wyhodowaną na płytce agarowej zawierającej Luria-Bertani (LB) (20 g/L) i bakto agar (15 g/L) do 15 ml pożywki LB (20 g/L) w temperaturze 30 °C przez 24 godziny w warunkach tlenowych z wytrząsaniem przy 160 obr./min.</li>
		<li>Odwirować zawiesinę komórek w stężeniu 6 000 × g przez 10 minut i ponownie zawiesić otrzymany osad komórkowy w 15 ml określonego podłoża (pH 7,8) (DM: NaHCO3 [2,5 g/L], CaCl2·2H2O [0,08 g/L], NH4Cl [1,0 g/L], MgCl2·6H2O [0,2 g/L], NaCl [10 g/L], i kwas 2-[4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynylo]etanosulfonowy [HEPES; 7,2 g/L]), uzupełnione odpowiednio 10 mM mleczanem i 0,5 g/l ekstraktem drożdżowym jako źródłem węgla i pierwiastków śladowych dla S. oneidensis MR-1.</li>
		<li>Zawiesinę komórek należy dalej hodować tlenowo w temperaturze 30 °C przez 12 godzin z wytrząsaniem przy 160 obr./min i ponownie odwirować przy 6 000 × g przez 10 min. Przed doświadczeniem elektrochemicznym przepłukać otrzymany osad komórkowy dwukrotnie pożywką DM przez odwirowanie przez 10 minut w temperaturze 6 000 × g.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Budowa trójelektrodowego reaktora elektrochemicznego (<klasa silna="xfig">Rysunek 1)
	<ol>
		<li>Umieść podłoże ITO jako elektrodę roboczą na dnie reaktora.</li>
		<li>Następnie włóż szklany cylinder (średnica 2 cm) i osłonę z politetrafluoroetylenu (PTFE). Następnie włóż Ag/AgCl (nasycony KCl) i drut platynowy do reaktora jako odpowiednio elektrody odniesienia i przeciwwagi. 
		UWAGA: Aby zapobiec wyciekowi powietrza i roztworu, włóż arkusz kauczuku butylowego między każdy element.</li>
		<li>Dodać 4,0 ml s.m. uzupełnionego 10 mM mleczanu i 0,5 g/l ekstraktu drożdżowego do reaktora elektrochemicznego.</li>
		<li>Po upewnieniu się, że nie ma wycieku z reaktora elektrochemicznego, należy wprowadzić gazowy azot do reaktora elektrochemicznego przez 20 minut, aby utrzymać warunki beztlenowe wewnątrz reaktora elektrochemicznego. 
		UWAGA: Aby zapobiec zanieczyszczeniu innymi drobnoustrojami, gaz powinien zostać przefiltrowany przed wpłynięciem do reaktora elektrochemicznego.</li>
		<li>Podłączyć reaktor elektrochemiczny do potencjostatu i przyłożyć +0,4 V (w porównaniu ze standardową elektrodą wodorową, SHE) do elektrody ITO, utrzymując temperaturę reaktora elektrochemicznego na poziomie 30 °C za pomocą zewnętrznego systemu cyrkulacji wody. 
		UWAGA: Aby zapobiec wpływowi zewnętrznego pola elektrycznego, reaktor elektrochemiczny powinien być umieszczony w klatce Faradaya.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hodowla elektrochemiczna komórek MR-1 S. oneidensis (<silna klasa="xfig">Rysunek 1 i <silna klasa="xfig">Rysunek 2)
	<ol>
		<li>Dostosować gęstość komórek zawiesiny otrzymanej w kroku 1.1 do gęstości optycznej 1,43 przy 600 nm (OD600) z suchą masą uzupełnioną 10 mM mleczanem i 0,5 g/l ekstraktu drożdżowego. 
		UWAGA: Aby uzyskać prawidłowy OD600, nałóż zawiesinę komórek OD600 ≤ 0.8 na spektrometr UV-vis przed dostosowaniem OD600 do 1.43.</li>
		<li>Dodać 0,3 ml zawiesiny ogniw do reaktora elektrochemicznego przez port iniekcyjny za pomocą strzykawki: OD600 w reaktorze zmienia się na 0,1, 
		UWAGA: Dodanie 0,3 ml zawiesiny ogniw o OD600 = 1,43 do reaktora elektrochemicznego zawierającego 4,0 ml pożywki daje 4,3 ml roztworu o OD600 = 0,1. W przypadku stosowania innych reaktorów o różnych objętościach wymagane jest obliczenie gęstości komórek.</li>
		<li>Kontynuuj potencjalną aplikację przy napięciu +0,4 V (w porównaniu z SHE) do elektrody ITO przez 25 h. 
		UWAGA: W celu utworzenia monowarstwowego biofilmu na elektrodzie ITO, upewnij się, że wytworzony prąd wykazuje odchylenie mniejsze niż 50% od <silna klasa="xfig">Rysunek 2.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Zastąpienie supernatantu przez Fresh DM Medium z 10 mM Mleczanem (<silna klasa="xfig">Rysunek 3)
<ol>
	<li>Zatrzymaj aplikację potencjału i odłącz reaktor elektrochemiczny od potencjostatu i systemu cyrkulacji wody.</li>
	<li>Zastąpienie supernatantu świeżą pożywką DM z 10 mM mleczanem
	<ol>
		<li>Przelać gazowy azot do butelki zawierającej DM z 10 mM mleczanem przez 20 minut, aby usunąć tlen z pożywki.</li>
		<li>Powoli usuń cały supernatant z wnętrza reaktora elektrochemicznego za pomocą strzykawki, pod przepływającym azotem (<silna klasa="xfig">Rysunek 3a, b). 
		UWAGA: Aby uniknąć przerwania biofilmu na elektrodzie ITO przez gazowy azot, gaz powinien przepływać nad powierzchnią cieczy.</li>
		<li>Dodać 4,0 ml świeżego DM zawierającego 10 mM mleczanu za pomocą strzykawki (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3c). 
		UWAGA: Aby uniknąć przerwania biofilmu na elektrodzie ITO, należy powoli wstrzykiwać medium wzdłuż ściany reaktora elektrochemicznego. Aby biofilm był mokry, pożywkę należy dodać natychmiast po usunięciu supernatantu. Wstrzyknięcie pożywki do 1 minuty po usunięciu supernatantu nie wpływa na bieżącą produkcję z biofilmu S. oneidensis MR-1.</li>
		<li>Pochylić reaktor elektrochemiczny, aby usunąć cały supernatant przyczepiony do ściany reaktora elektrochemicznego.</li>
		<li>Powtórz kroki 2.2.2-2.2.4 w sumie trzy razy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zatrzymać przepływ gazu i ponownie podłączyć reaktor elektrochemiczny do potencjostatu, przykładając +0,4 V (w porównaniu z SHE) do elektrody ITO o temperaturze 303 K.</li>
</ol>
3. Dodawanie wody deuterowej do pomiaru KIE w procesie EET (<silna klasa="xfig">Rysunek 4)
<ol>
	<li>Upewnij się, że obecna produkcja z jednowarstwowego biofilmu S. oneidensis MR-1 jest stabilna i nie wzrasta gwałtownie. Jeśli prąd gwałtownie wzrasta, poczekaj, aż ustabilizuje się w granicach 5% wzrostu w ciągu 10 min. 
	UWAGA: Tworzenie się monowarstwowego biofilmu na elektrodzie ITO bez zanieczyszczenia innych szczepów drobnoustrojów zostało potwierdzone przez sekwencje rDNA i skaningowy obraz biofilmu pod mikroskopem elektronowym na elektrodzie ITO, jak zgłoszono wcześniej4. W celu potwierdzenia ograniczenia szybkości przez proces EET, należy monitorować wpływ dodania przemiennych mediatorów elektronów, takich jak 100 μM antrachinon-1-sulfonian (α-AQS). Więcej informacji można znaleźć w sekcji Reprezentatywne wyniki i reference15.</li>
	<li>Dodać 40 μl beztlenowego 50% (v/v) D2O do reaktora elektrochemicznego za pomocą strzykawki tak, aby stężenie w reaktorze wynosiło 0,5% (v/v) D2O. 
	UWAGA: Aby zapobiec uszkodzeniu biofilmu przez dodanie D2O, należy wstrzykiwać D2O kroplami.</li>
	<li>Poczekaj, aż prąd się ustabilizuje, a następnie dodaj D2O do 4,0% (v/v). 
	UWAGA: Aby uzyskać wartość KIE (stosunek bieżącej produkcji w obecnościD2OiH2O), należy sprawdzić wpływ tej samej objętości dodatkuH2Ona bieżącą produkcję.</li>
</ol>

<ol><li>Nealson, K. H., Saffarini, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+and+Manganese+in+Anaerobic+Respiration+-+Environmental+Significance%2C+Physiology%2C+and+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Iron and Manganese in Anaerobic Respiration - Environmental Significance, Physiology, and Regulation.</a> Annu. Rev. Microbiol. 48, 311-343 (1994).</li>
<li>Bretschger, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+production+and+metal+oxide+reduction+by+Shewanella+oneidensis+MR-1+wild+type+and+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microb%22%5BJournal%5D)">Current production and metal oxide reduction by Shewanella oneidensis MR-1 wild type and mutants.</a> Appl Environ Microb. 73 (21), 7003-7012 (2007).</li>
<li>Richter, H., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlehtml/2009/EE/B816647A">Cyclic voltammetry of biofilms of wild type and mutant Geobacter sulfurreducens on fuel cell anodes indicates possible roles of OmcB, OmcZ, type IV pili, and protons in extracellular electron transfer.</a> Energy Environ. Sci. 2 (5), 506-516 (2009).</li>
<li>Okamoto, A., Nakamura, R., Hashimoto, K. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0013468611004543">In-vivo identification of direct electron transfer from Shewanella oneidensis MR-1 to electrodes via outer-membrane OmcA-MtrCAB protein complexes.</a> Electrochim. Acta. 56 (16), 5526-5531 (2011).</li>
<li>Strycharz, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2011/ee/c0ee00260g">Application of cyclic voltammetry to investigate enhanced catalytic current generation by biofilm-modified anodes of Geobacter sulfurreducens strain DL1 vs. variant strain KN400.</a> Energy Environ. Sci. 4 (3), 896-913 (2011).</li>
<li>Lovley, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bug+juice%3A+harvesting+electricity+with+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bug juice: harvesting electricity with microorganisms.</a> Nat. Rev. Microbiol. 4 (7), 497-508 (2006).</li>
<li>Coursolle, D., Gralnick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+extracellular+respiratory+pathways+for+iron%28III%29+reduction+in+Shewanella+oneidensis+strain+MR-1%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of extracellular respiratory pathways for iron(III) reduction in Shewanella oneidensis strain MR-1.</a> Front. Microbiol. 3, (2012).</li>
<li>Franks, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/-/content/articlehtml/2009/ee/b816445b">Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm.</a> Energy Environ. Sci. 2 (1), 113-119 (2009).</li>
<li>McLean, J. S., Ona, O. N., Majors, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlated+biofilm+imaging%2C+transport+and+metabolism+measurements+via+combined+nuclear+magnetic+resonance+and+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Correlated biofilm imaging, transport and metabolism measurements via combined nuclear magnetic resonance and confocal microscopy.</a> ISME J. 2 (2), 121-131 (2008).</li>
<li>Busalmen, J. P., Esteve-Nunez, A., Berna, A., Feliu, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-type+cytochromes+wire+electricity-producing+bacteria+to+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">C-type cytochromes wire electricity-producing bacteria to electrodes.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 47 (26), 4874-4877 (2008).</li>
<li>Nakamura, R., Ishii, K., Hashimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electronic+Absorption+Spectra+and+Redox+Properties+of+C+Type+Cytochromes+in+Living+Microbes%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Electronic Absorption Spectra and Redox Properties of C Type Cytochromes in Living Microbes.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48 (9), 1606-1608 (2009).</li>
<li>Myers, C. R., Nealson, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiration-Linked+Proton+Translocation+Coupled+to+Anaerobic+Reduction+of+Manganese%28IV%29+and+Iron%28III%29+in+Shewanella+putrefaciens+MR-1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Respiration-Linked Proton Translocation Coupled to Anaerobic Reduction of Manganese(IV) and Iron(III) in Shewanella putrefaciens MR-1.</a> J. Bacteriol. 172 (11), 6232-6238 (1990).</li>
<li>Tokunou, Y., Hashimoto, K., Okamoto, A. <a target="_blank" href="http://www.light.t.u-tokyo.ac.jp/e/2015/12/10/sp2015-9/">Extracellular Electron Transport Scarcely Accumulates Proton Motive Force in Shewanella oneidensis MR-1.</a> Bull. Chem. Soc. Jpn. 88 (5), 690-692 (2015).</li>
<li>Okamoto, A., Tokunou, Y., Saito, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cation-limited+kinetic+model+for+microbial+extracellular+electron+transport+via+an+outer+membrane+cytochrome+C+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysics+and+physicobiology%22%5BJournal%5D)">Cation-limited kinetic model for microbial extracellular electron transport via an outer membrane cytochrome C complex.</a> Biophysics and physicobiology. 13, 71-76 (2016).</li>
<li>Okamoto, A., Tokunou, Y., Shafeer, K., Hashimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proton+Transport+in+the+Outer-Membrane+Flavocytochrome+Complex+Limits+the+Rate+of+Extracellular+Electron+Transport%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Proton Transport in the Outer-Membrane Flavocytochrome Complex Limits the Rate of Extracellular Electron Transport.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 56, 9082-9086 (2017).</li>
<li>Hammes-Schiffer, S., Stuchebrukhov, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theory+of+Coupled+Electron+and+Proton+Transfer+Reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Theory of Coupled Electron and Proton Transfer Reactions.</a> Chem. Rev. 110 (12), 6939-6960 (2010).</li>
<li>Cleland, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+isotope+effects+to+determine+enzyme+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The use of isotope effects to determine enzyme mechanisms.</a> J Biol. Chem. 278 (52), 51975-51984 (2003).</li>
<li>Kouzuma, A., Kasai, T., Hirose, A., Watanabe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catabolic+and+regulatory+systems+in+Shewanella+oneidensis+MR-1+involved+in+electricity+generation+in+microbial+fuel+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Catabolic and regulatory systems in Shewanella oneidensis MR-1 involved in electricity generation in microbial fuel cells.</a> Front. Microbiol. 6, (2015).</li>
<li>Kushner, D. J., Baker, A., Dunstall, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+uses+and+perspectives+of+heavy+water+and+deuterated+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J+Physiol.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Pharmacological uses and perspectives of heavy water and deuterated compounds.</a> Can. J Physiol. Pharm. 77 (2), 79-88 (1999).</li>
<li>Xie, X. S., Zubarev, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Low-Level+Deuterium+Enrichment+on+Bacterial+Growth%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Effects of Low-Level Deuterium Enrichment on Bacterial Growth.</a> Plos One. 9 (7), e102071(2014).</li>
<li>Okamoto, A., Hashimoto, K., Nealson, K. H., Nakamura, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rate+enhancement+of+bacterial+extracellular+electron+transport+involves+bound+flavin+semiquinones%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Rate enhancement of bacterial extracellular electron transport involves bound flavin semiquinones.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (19), 7856-7861 (2013).</li>
<li>Edwards, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+Linked+Flavin+Sites+in+Extracellular+Decaheme+Proteins+Involved+in+Microbe-Mineral+Electron+Transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Redox Linked Flavin Sites in Extracellular Decaheme Proteins Involved in Microbe-Mineral Electron Transfer.</a> Sci. Rep. 5, 11677(2015).</li>
<li>Saito, J., Hashimoto, K., Okamoto, A. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0013468616318898">Flavin as an Indicator of the Rate-Limiting Factor for Microbial Current Production in Shewanella oneidensis MR-1.</a> Electrochim. Acta. 216, 261-265 (2016).</li>
<li>Guo, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+Cr%28VI%29+by+Escherichia+coli+BL21+in+the+presence+of+redox+mediators%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresource+Technol%22%5BJournal%5D)">Reduction of Cr(VI) by Escherichia coli BL21 in the presence of redox mediators.</a> Bioresource Technol. 123, 713-716 (2012).</li>
<li>Nealson, K., Saffarini, D., Moser, D., Smith, M. J. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0167701294900051">A Spectrophotometric Method for Monitoring Tactic Responses of Bacteria under Anaerobic Conditions.</a> J Microbiol. Meth. 20 (3), 211-218 (1994).</li>
<li>Myers, C. R., Myers, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+exposure+of+the+outer+membrane+cytochromes+of+Shewanella+oneidensis+MR-1%5BTitle%5D)+AND+%22Lett.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cell surface exposure of the outer membrane cytochromes of Shewanella oneidensis MR-1.</a> Lett. Appl. Microbiol. 37 (3), 254-258 (2003).</li>
<li>Lower, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+Recognition+Force+Microscopy+Shows+that+Outer+Membrane+Cytochromes+OmcA+and+MtrC+Are+Expressed+on+the+Exterior+Surface+of+Shewanella+oneidensis+MR-1%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Antibody Recognition Force Microscopy Shows that Outer Membrane Cytochromes OmcA and MtrC Are Expressed on the Exterior Surface of Shewanella oneidensis MR-1.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75 (9), 2931-2935 (2009).</li>
<li>Chen, X. X., Ferrigno, R., Yang, J., Whitesides, G. A. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/la0204794">Redox properties of cytochrome c adsorbed on self-assembled monolayers: A probe for protein conformation and orientation.</a> Langmuir. 18 (18), 7009-7015 (2002).</li>
<li>McMillan, D. G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+enzyme+orientation+and+electrode+topology+on+the+catalytic+activity+of+adsorbed+redox+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Electrochim.+Acta%22%5BJournal%5D)">The impact of enzyme orientation and electrode topology on the catalytic activity of adsorbed redox enzymes.</a> Electrochim. Acta. 110, 79-85 (2013).</li>
<li>Dinh, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+corrosion+by+novel+anaerobic+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Iron corrosion by novel anaerobic microorganisms.</a> Nature. 427 (6977), 829-832 (2004).</li>
<li>McGlynn, S. E., Chadwick, G. L., Kempes, C. P., Orphan, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+activity+reveals+direct+electron+transfer+in+methanotrophic+consortia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single cell activity reveals direct electron transfer in methanotrophic consortia.</a> Nature. 526 (7574), 531-535 (2015).</li>
<li>Okamoto, A., Nakamura, R., Nealson, K. H., Hashimoto, K. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/celc.201402151/abstract">Bound Flavin Model Suggests Similar Electron-Transfer Mechanisms in Shewanella and Geobacter.</a> Chemelectrochem. 1 (11), 1808-1812 (2014).</li>
<li>Okamoto, A., Hashimoto, K., Nealson, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flavin+Redox+Bifurcation+as+a+Mechanism+for+Controlling+the+Direction+of+Electron+Flow+during+Extracellular+Electron+Transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Flavin Redox Bifurcation as a Mechanism for Controlling the Direction of Electron Flow during Extracellular Electron Transfer.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 53 (41), 10988-10991 (2014).</li>
<li>Tokunou, Y., Hashimoto, K., Okamoto, A. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acs.jpcc.6b00349">Acceleration of Extracellular Electron Transfer by Alternative Redox-Active Molecules to Riboflavin for Outer-Membrane Cytochrome c of Shewanella oneidensis MR-1.</a> J Phys. Chem. C. 120 (29), 16168-16173 (2016).</li>
<li>Rowe, A. R., et al. <a target="_blank" href="https://www.biorxiv.org/content/early/2017/03/14/116475">Tracking electron uptake from a cathode into Shewanella cells: implications for generating maintenance energy from solid substrates.</a> bioRxiv. , 116475(2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Nasz test elektrochemiczny całych komórek ma kilka zalet technicznych w porównaniu z elektrochemią białek. Podczas gdy oczyszczanie białek wymaga wieloetapowych, czasochłonnych procedur, nasza metoda obejmująca całe komórki zajmuje jeden dzień samoorganizującego się tworzenia biofilmu po hodowli komórkowej. Aby uzyskać stabilną interakcję między OM c-Cyts a elektrodą, potrzebujemy jedynie sterylizacji i oczyszczenia powierzchni elektrody; nie wymaga modyfikacji elektrody w celu uporządkowania orientacji białek<s...

Techniki elektrochemiczne do bezpośredniego charakteryzowania białka redoks w nienaruszonej komórce bakteryjnej pojawiły się ostatnio od czasu odkrycia szczepów mikrobiologicznych redukujących metale, takich jak S. oneidensis MR-1 lub Geobacter sulfurreducens PCA, które mają kompleksy cytochromowe typu c (OM c-Cyts) wystawione na działanie zewnętrznej powierzchni komórki1,2,3,4,5. C-Cyty OM pośredniczą w transporcie elektronów z łańcucha oddechowego do substratów stałych znajdujących się poza komórką. Transport ten jest określany jako zewnątrzkomórkowy transport elektronów (EET)1,6 i jest krytycznym procesem dla powstających biotechnologii, takich jak mikrobiologiczne ogniwa paliwowe6. Dlatego, aby zrozumieć podstawową kinetykę i mechanizmy EET oraz ich związek z fizjologią drobnoustrojów, OM c-Cyts zostały zbadane przy użyciu elektrochemii całych komórek4,7, w połączeniu z mikroskopią8,9, spektroskopia10,11 i biologia molekularna2,4. W przeciwieństwie do tego, metody badania wpływu transportu kationów związanych z EET, np. protonów, na kinetykę EET w żywych komórkach nie zostały jeszcze prawie ustalone, mimo że transport protonów przez błony bakteryjne odgrywa kluczową rolę w sygnalizacji, homeostazie i produkcji energii12,13,14. W niniejszym badaniu opisano technikę badania wpływu transportu protonów na kinetykę EET w komórce MR-1 S. oneidensis za pomocą pomiarów elektrochemicznych całego ogniwa, co wymaga identyfikacji kroku ograniczającego szybkość produkcji prądu mikrobiologicznego15.
Jednym z bezpośrednich sposobów oceny udziału transportu protonów w powiązanym EET jest efekt kinetyczny izotopu deuteru (KIE). KIE jest obserwowalny jako zmiana kinetyki transferu elektronów po zastąpieniu protonów jonami deuteru, co reprezentuje wpływ transportu protonów na kinetykę transferu elektronów16. Sama teoria KIE została dobrze ugruntowana przy użyciu pomiarów elektrochemicznych z oczyszczonymi enzymami17. Ponieważ jednak obecna produkcja S. oneidensis MR-1 wynika z wielu, zróżnicowanych i zmiennych procesów18, nie można po prostu zidentyfikować EET jako procesu ograniczającego szybkość. Aby zaobserwować KIE w procesach transportu protonów w połączeniu z EET, musimy potwierdzić, że produkcja prądu mikrobiologicznego jest ograniczona przez transport elektronów przez OM c-Cyts do elektrody. W tym celu zastąpiliśmy roztwór supernatantu świeżą pożywką zawierającą wysokie stężenie mleczanu jako donora elektronów w optymalnych warunkach pH i temperatury przed pomiarem KIE; ta zamiana pełniła dwie role: (1) zwiększała szybkość wcześniejszych procesów metabolicznych w porównaniu z EET oraz (2) pomijała pływające komórki w supernatancie uwolnionym z monowarstwowego biofilmu S. oneidensis MR-1 na elektrodzie roboczej (elektroda z tlenku indu domieszkowanego cyną (ITO)). Przedstawiony szczegółowy protokół ma na celu pomóc nowym praktykom w utrzymaniu i potwierdzeniu, że proces EET jest etapem określającym stawkę.

<table><tbody><tr><td>Szklany cylinder</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Wykonany na zamówienie, używany jako reaktor elektrochemiczny</td></tr><tr><td>Pokrywa i podstawa z PTFE</td><td>N/A</td> N<td>/A</td><td>Wykonany na zamówienie, używany jako pokrywa i fundament reaktora elektrochemicznego</td></tr><tr><td>Kauczuk butylowy</td><td>NIE</td><td>DOTYCZY</td><td>Wykonany na zamówienie, wkładany między każdy element reaktora elektrochemicznego</td></tr><tr><td>Septa</td><td>GL Science</td><td>3007-16101</td><td>Używany jako port iniekcyjny reaktora elektrodowego</td></tr> z <tr><td>tlenku indu i cyny (ITO)</td><td>GEOMATEC</td><td>No.0001</td><td>Używany jako elektroda robocza, 5&Omega;/</td></tr><tr><td>sq Ag/AgCl KCl elektroda nasycona</td><td>HOKUTO DENKO</td><td>HX-R5</td><td>Używany jako elektroda odniesienia, &Phi; </td></tr><tr><td>Drut platynowy</td> 0,30 mm <td>Nilaco Cooporation</td><td>PT-351325</td><td>Używany jako przeciwelektroda</td></tr><tr><td>Bulion Luria-Bertani (LB), Miller</td><td>Becton, Dichkinson and Company</td><td>244620</td><td>Pożywka do wstępnej uprawy S. oneidensis MR-1</td></tr><tr><td>Bacto agar</td><td>Becton, Dichkinson and Company</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Sulfonian antrachinonu (&alpha;-AQS)</td><td>TCI</td><td>A1428</td><td></td></tr><tr><td>Mononukleotyd flawinowy (FMN)</td><td>Wako</td><td>184-00831</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Wako</td><td>191-01305</td><td>Używany do zdefiniowanego podłoża (DM)</td></tr><tr><td>CaCl2 &middot; 2H2O</td><td>Wako</td><td>031-00435</td><td>Używany do DM</td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Wako</td><td>011-03015</td><td>Używany do DM</td></tr><tr><td>MgCl2 &middot; 6H2O</td><td>Wako</td><td>135-00165</td><td>Używany do DM</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Wako</td><td>191-01665</td><td>Używany do</td></tr><tr><td>DM Kwas 2-[4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynylo]etanosulfonowy (HEPES)</td><td>DOJINDO</td><td>346-08235</td><td>Używany do</td></tr><tr><td>roztworu mleczanu sodu</td> DM <td>Wako</td><td>195-02305</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt z drożdży Bacto</td><td>Becton, Dichkinson and Company</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Tlenek deuteru (D, 99,9%)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories, Inc.</td><td>DLM-4-PK</td><td>Dodatek do eksperymentów z kinetycznymi efektami izotopowymi</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>TOKYO RIKAKIKAI CO. LTD.</td><td>LTI-601SD</td><td>Używany do uprawy wstępnej</td></tr><tr><td>Wytrząsarka</td><td>TAITEC</td><td>NR-3</td><td>Używana do uprawy wstępnej</td></tr><tr><td>Autoklaw</td><td>TOMY SEIKO CO. LTD.</td><td>LSX-500</td><td>Służy do sterylizacji reaktora elektrochemicznego i pożywki</td></tr><tr><td>Czysta ławka</td><td>SANYO</td><td>MCV-91BNF</td><td>Służy do zapobiegania zanieczyszczeniu reaktora elektrochemicznego i pożywki innymi drobnoustrojami</td></tr><tr><td>Separator wirówkowy</td><td>Eppendorf</td><td>5430R</td><td>Prędkość obrotowa do 6000 i razy; g jest wymagane</td></tr><tr><td>: Generator azotu</td> gazowego, <td>Puequ CO., LTD.</td><td>PNTN-2</td><td>Butla z azotem może być również używana zamiast generatora gazu</td></tr><tr><td>Spektrometr UV-vis</td><td>SHIMADZU</td><td>UV-1800</td><td>Służy do optymalizacji gęstości komórek</td></tr><tr><td>Potencjostat</td><td>BioLogic</td><td>VMP3</td><td>Służy do tworzenia biofilmu i eksperymentów z kinetycznymi efektami izotopowymi</td></tr><tr><td>Cyrkulator wody termalnej</td><td>AS ONE</td><td>TR-1A</td><td>Służy do utrzymywania temperatury reaktora elektrochemicznego</td></tr><tr><td>Klatka Faradaya</td><td>HOKUTO DENKO</td><td>HS-201S</td><td>Używana do eksperymentów elektrochemicznych</td></tr></tbody></table>

elektrochemiczne wykrywanie wpływu kinetycznego izotopu deuteru na zewnątrzkomórkowy transport elektronów w shewanella oneidensis mr-1

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Bezpośrednie elektrochemiczne wykrywanie kompleksów cytochromowych typu c osadzonych w zewnętrznej błonie bakteryjnej (kompleksy cytochromów typu c z błoną zewnętrzną; OM c-Cyts) pojawiła się niedawno jako nowatorska metoda analityczna obejmująca całe komórki, mająca na celu scharakteryzowanie transportu elektronów bakterii z łańcucha oddechowego na zewnątrz komórki, określanego jako zewnątrzkomórkowy transport elektronów (EET). Chociaż szlak i kinetyka przepływu elektronów podczas reakcji EET zostały zbadane, nie ustalono jeszcze metody elektrochemicznej obejmującej całe komórki w celu zbadania wpływu transportu kationów związanego z EET. W niniejszej pracy opisano przykład techniki biochemicznej do badania efektu kinetycznego izotopu deuteru (KIE) na EET poprzez OM c-Cyts przy użyciu modelowego drobnoustroju, Shewanella oneidensis MR-1. KIE dla procesu EET można uzyskać, jeśli EET za pośrednictwem OM c-Cyts działa jako etap ograniczający szybkość w produkcji prądu mikrobiologicznego. W tym celu, przed dodaniemD2O, roztwór supernatantu zastąpiono świeżą pożywką zawierającą wystarczającą ilość donora elektronów, aby wspomóc szybkość wcześniejszych reakcji metabolicznych i usunąć komórki planktonowe z jednolitego monowarstwowego biofilmu na elektrodzie roboczej. Opisano również alternatywne metody potwierdzania etapu ograniczającego szybkość produkcji prądu mikrobiologicznego jako EET za pośrednictwem OM c-Cyts. Nasza technika testu elektrochemicznego całej komórki do badania kinetyki transportu protonów może być zastosowana do innych elektroaktywnych szczepów drobnoustrojów.

Po 25 godzinach potencjalnego nałożenia przy +0,4 V (względem SHE) na elektrodzie roboczej ze szkła ITO utworzyła się monowarstwowa biofilmowa warstwa, co wcześniej potwierdzono za pomocą mikroskopii elektronowej skaningowej lub mikroskopii konfokalnej4. Przedstawiono charakterystyczny przebieg czasowy produkcji prądu przez S. oneidensis MR-1 podczas tworzenia się monowarstwowej biofilmowej warstwy na Rysunku 2. Chociaż prąd z...

Tutaj prezentujemy protokół eksperymentów elektrochemicznych na całych komórkach, aby zbadać wpływ transportu protonów na szybkość pozakomórkowego transportu elektronów przez kompleks cytochromów błony zewnętrznej w Shewanella oneidensis MR-1.

Elektrochemiczne wykrywanie wpływu kinetycznego izotopu deuteru na zewnątrzkomórkowy transport elektronów w Shewanella oneidensis MR-1

Direct electrochemical detection of c-type cytochrome complexes embedded in the bacterial outer membrane (outer membrane c-type cytochrome complexes; OM ...

Ogólnym celem tego protokołu jest obserwacja udziału transportu protonów w szybkości bakteryjnego zewnątrzkomórkowego transportu elektronów poprzez wykrycie efektu kinetycznego izotopu deuteru. Nasza metoda ujawnia wpływ transportu protonów na kinetykę zewnątrzkomórkowego transportu elektronów lub EET z bakterii do elektrody za pośrednictwem cytochromów typu c błony zewnętrznej. Nasz test odzwierciedla natywne zarządzanie protonami w EET, ponieważ użyliśmy żywych bakterii, a nie oczyszczonego enzymu.Jednak naszym wyzwaniem było usunięcie szumów z innych procesów komórkowych. Efekt kinetyczny izotopu deuteru, określany jako KIE, jest jedną z najlepszych technik badania udziału transportu protonów w powiązanym procesie transportu elektronów. Aby wyhodować komórki Shewanella MR-1, przenieś jedną kolonię komórek wyhodowanych na płytce agarowej do 15 mililitrów pożywki LB.Hoduj komórki w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 24 godziny w warunkach tlenowych z wytrząsaniem z prędkością 160 obr./min. Odwirować zawiesinę komórek pod ciśnieniem 6 000 razy większym niż grawitacja przez 10 minut. Następnie ponownie zawieś powstałą osadkę komórkową w 15 mililitrach zdefiniowanego podłoża, uzu

electrochemical-detection-deuterium-kinetic-isotope-effect-on

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opisujemy metodę testową z wykorzystaniem czujnika elektrochemicznego do szybkiego wykrywania i identyfikacji bakterii. Badanie wykorzystuje macierz czujników z funkcjonalizowanymi sondami wychwytującymi w postaci oligonukleotydów DNA dla sekwencji specyficznych dla gatunku rybosomalnego RNA (rRNA). Hybrydyzacja typu kanapkowego docelowego rRNA z sondą wychwytującą oraz sondą detekcyjną w postaci oligonukleotydu DNA sprzężonego z peroksydazą chrzanową generuje mierzalny prąd amperometryczny.

Wykrywanie i identyfikacja bakterii z wykorzystaniem czujników elektrochemicznych

Źródło: Tokunou, Y. i wsp., Elektrochemiczne wykrywanie wpływu kinetycznego izotopu deuteru na zewnątrzkomórkowy transport elektronów w Shewanella oneidensis MR-1. J. Vis. Exp. (2018)Ten film przedstawia metodę elektrochemiczną obejmującą całe komórki, aby ocenić, w jaki sposób transfer protonów wpływa na zewnątrzkomórkowy transport elektronów (EET) u bakterii elektroaktywnych. Zastępując protony deuteronami za pomocą tlenku deuteru, metoda mierzy zmiany prądu, aby ujawnić kinetyczny efekt...

Pomiar kinetycznego wpływu izotopów na transport elektronów drobnoustrojów za pomocą tlenku deuteru

Źródło: Tokunou, Y . i in., Elektrochemiczne wykrywanie efektu izotopu kinetycznego deuteru na transport elektronów zewnątrzkomórkowych w Shewanella oneidensis MR-1. J. Vis. Exp. (2018)Ten film demonstruje montaż i działanie modelu reaktora elektrochemicznego zaprojektowanego do symulacji powstawania biofilmu na powierzchniach elektrod. Kontrolowana stymulacja elektrochemiczna sprzyja przyczepności mikroorganizmów, prowadząc do stopniowego powstawania bakteryjnego monowarstwowego biofilmu.

Opracowywanie bakteryjnego monowarstwowego biofilmu z użyciem reaktora elektrochemicznego

Egzosomy to mikropęcherzykowe struktury znajdujące się w biopłynach, które potencjalnie przenoszą ważne biomarkery dyskryminujące choroby. W tym przypadku zastosowano nowatorską metodę do specyficznej ekstrakcji egzosomów i szybkiego przetestowania ładunku egzosomalnego dla obu celów RNA/białka po rozerwaniu egzosomów za pomocą niejednorodnych elektrycznych cyklicznych fal prostokątnych.

Wykrywanie biomarkera egzosomalnego za pomocą uwalniania i pomiaru wywołanego polem elektrycznym (EFIRM)

Elastyczność konformacyjna odgrywa kluczową rolę w funkcjonowaniu białek. W tym artykule opisujemy zastosowanie czasowo-rozdzielczej spektrometrii mas z jonizacją elektronrozpylającą sprzężoną z wymianą wodorowo-deuterową do badania szybkich zmian strukturalnych, które napędzają funkcję w uporządkowanych i nieuporządkowanych białkach.

Spektrometria mas z jonizacją wodorowo-deuterową z jonizacją elektrorozpylającą do badania struktury i dynamiki białek

Ten artykuł przedstawia metodę hodowli biofilmu do spektrometrii mas jonów wtórnych in situ w czasie przelotu do mapowania chemicznego w stanie uwodnionym, możliwa dzięki reaktorowi mikroprzepływowemu, System do analizy na granicy faz ciekłej próżni. Jako model wykorzystano Shewanella oneidensis MR-1 z białkiem zielonej fluorescencji.

In Situ Charakterystyka biofilmów Shewanella oneidensis MR1 za pomocą SALVI i ToF-SIMS

Celem tego protokołu jest spektrofotometryczne monitorowanie transportu elektronów przez błonę transplazmatyczną za pomocą zewnątrzkomórkowych akceptorów elektronów i analiza oddziaływań enzymatycznych, które mogą wystąpić z tymi zewnątrzkomórkowymi akceptorami elektronów.

Pomiar transportu elektronów w błonie transplazmatycznej przez miorurki C2C12

Techniki wzbogacania mikroorganizmów na miejscu lub hodowli in situ mogą ułatwić izolację trudnych do hodowli taksonów mikroorganizmów, zwłaszcza z ekstremalnych środowisk o niskiej biomasie lub geochemicznie. W tym miejscu opisujemy układ elektrochemiczny bez użycia zewnętrznego źródła zasilania w celu wzbogacenia szczepów drobnoustrojów, które są zdolne do zewnątrzkomórkowego transportu elektronów (EET).

Wolnostojący zestaw elektrochemiczny do wzbogacania bakterii oddychających anodą na miejscu

Ten protokół przedstawia szybki test wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe (AST) w ciągu 2,5 godziny poprzez stymulowane pojedynczymi komórkami obrazowanie metabolizmu D2O. Metoda ta ma zastosowanie do bakterii w moczu lub środowisku krwi pełnej, które są transformujące dla szybkiego jednokomórkowego fenotypowego AspAT w klinice.

Szybkie badanie wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe za pomocą obrazowania stymulowanego rozpraszania Ramana indukcji deuteru w pojedynczej bakterii

Tutaj prezentujemy protokół charakteryzujący pozakomórkowy transfer elektronów za pośrednictwem (EET) u bakterii kwasu mlekowego za pomocą trzyelektrodowego, dwukomorowego systemu bioelektrochemicznego. Ilustrujemy tę metodę za pomocą Lactiplantibacillus plantarum i mediatora redoks kwasu 1,4-dihydroksy-2-naftoesowego i podajemy dokładny opis technik elektrochemicznych stosowanych do oceny EET, w którym pośredniczy.

Charakterystyka pośredniczonego zewnątrzkomórkowego transferu elektronów u bakterii kwasu mlekowego za pomocą trójelektrodowego, dwukomorowego układu bioelektrochemicznego

Tutaj prezentujemy protokół użycia organicznych tranzystorów elektrochemicznych (OECT) do translacji aktywności zewnątrzkomórkowego transferu elektronów (EET) w Shewanella oneidensis na sygnały elektryczne. Hybrydowy system OECT zapewnia zwiększoną solidność, czułość i potencjał do szybkich, wysokowydajnych testów, co czyni go skutecznym narzędziem do pomiarów EET.

Translacja zewnątrzkomórkowych działań związanych z przenoszeniem elektronów za pomocą organicznych tranzystorów elektrochemicznych

Poznaj elektrochemiczną metodę badania kinetycznego efektu izotopowego deuteru w transporcie elektronów zewnątrzkomórkowym u Shewanella oneidensis MR-1. Protokół pozwala analizować rolę transportu protonów w procesach bioenergetycznych.

Elektrochemiczne wykrywanie wpływu kinetycznego izotopu deuteru na zewnątrzkomórkowy transport elektronów w Shewanella oneidensis MR-1 (Wideo) | JoVE Journal

Elektrochemiczne wykrywanie wpływu kinetycznego izotopu deuteru na zewnątrzkomórkowy transport elektronów w Shewanella oneidensis MR-1

Przeglądaj więcej filmów