Przygotowanie i ocena a11-dodatnich oligomerów β-amyloidowych za pomocą analizy igłowej

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neurofarmakologii. Główną zaletą tej techniki jest to, że tworzenie oligomeru beta-amyloidu jest proste, niezawodne i powtarzalne. Pokazujemy, że demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy przygotowania oligomeru beta są trudne do nauczenia.

Najpierw dostosuj stężenie roztworu monomeru A-beta do 0,25 miligrama na mililitr, dodając do probówki 900 mikrolitrów podwójnie destylowanej wody. Następnie kontynuuj odparowywanie roztworu monomeru z gazowym azotem o wysokiej czystości, aż objętość osiągnie około 850 mikrolitrów o stężeniu około 0,29 miligrama na mililitr. Obecność HR5P wpływa na powstawanie oligomeru A-beta.

Dlatego odparowanie w jak największym stopniu jest krytycznym etapem tej procedury. Następnie użyj podwójnie destylowanej wody, aby rozcieńczyć roztwór podstawowy kurkuminy, aby przygotować roztwór roboczy o stężeniu 0,2 i dwóch mikromolowych. Utrzymuj stosunek jeden do jednego i wymieszaj roztwór A-beta z kurkuminą, aby osiągnąć końcowe stężenie kurkuminy na poziomie 0,1 i jednego mikromola.

Następnie pozostaw roztwór na mieszadle magnetycznym. Przymocuj plastikową skrzynkę rozdzielającą do mieszadła magnetycznego. Umieść dwa mieszadła magnetyczne w dwóch rogach pudełka, a następnie umieść probówki z próbkami na środku pudełka.

Kontynuuj wytrząsanie pudełka w temperaturze pokojowej przez 48 godzin z prędkością 60 obrotów na minutę, a następnie odwiruj probówkę w temperaturze 18 000 razy G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odwirowaniu zebrać supernatant. Do analizy punktowej weź membranę nitrocelulozową i pokrój ją na paski o szerokości jednego centymetra, a następnie umieść dwa mikrolitry próbki równomiernie na paskach pierwszym i drugim w odstępie każdego punktu w odległości 0,5 centymetra.

Podczas wstrzykiwania próbki na membranę konieczne jest równomierne rozprowadzenie, a różne kropelki są kontrolowane tak, aby różne próbki nie były ze sobą połączone. Następnie inkubuj paski w temperaturze pokojowej przez pięć minut, aby kropelki wyschły. Po pięciu minutach inkubować paski z 5% albuminą surowicy bydlęcej przez 30 minut w temperaturze pokojowej.

Po zakończeniu inkubacji przemywać paski buforem TBST przez pięć minut. Po zakończeniu płukania odessać bufor, a następnie inkubować jeden pasek z przeciwciałem antyoligomerowym A11 i drugi z roztworem przeciwciała anty-A-beta 6E10 przez godzinę. Po godzinie przemyć paski TBST przez pięć minut każdy trzy razy, a następnie odessać bufor i inkubować paski z wtórnym roztworem przeciwciał przez 40 minut.

Po wtórnej inkubacji przeciwciał ponownie przemyj paski TBST przez pięć minut każdy trzy razy. Następnie dodaj około 300 mikrolitrów zmieszanego płynu ECL na powierzchnię wilgotnych pasków, a następnie naświetl paski w automatycznym systemie obrazowania chemiluminescencyjnego. Badania TEM wykazują brak jakichkolwiek widocznych agregatów w rozpuszczonym w HFIP roztworze monomeru A-beta, jednak po 48 godzinach inkubacji ten sam monomer tworzy oligomery, które są głównie agregatami kulistymi o średnicy od 10 do 80 nanometrów.

Po poddaniu próbek monomeru A-beta i próbek bogatych w oligomery analizie dot blot wykazano obecność A11-dodatnich oligomerów A-beta w próbkach bogatych w oligomery A-beta. Co ciekawe, A-beta 6E10 dodatnie peptydy A-beta są obecne zarówno w próbkach bogatych w monomer A-beta, jak i oligomery. Następnie przeprowadza się również analizę półilościową w celu wyrażenia swoistego monomeru A-beta dodatniego na obecność przeciwciał i próbek bogatych w oligomery jako procent kontroli.

Peptydy A-beta A11-dodatnie są znacznie wyższe w próbkach bogatych w oligomery A-beta w porównaniu z monomerami. Wręcz przeciwnie, A-beta dodatni peptyd A-beta 6E10 jest obecny zarówno w próbkach bogatych w monomery, jak i oligomery. W rzeczywistości oligomery A-beta są również inkubowane wspólnie z kurkuminą i inhibitorem oligomerów A-beta.

Kurkumina prowadzi do znacznego zmniejszenia względnej ilości oligomeru A-beta A11 dodatniego przy zmniejszonym barwieniu A11 w próbkach oligomerów A-beta inkubowanych przez kurkuminę. Jednak różne stężenia kurkuminy nie wpływają na liczbę peptydów A-beta w próbkach bogatych w monomery i oligomery 6E10 dodatnie w porównaniu z próbkami dodatnimi A11. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu kilku godzin, jeśli działa prawidłowo.

Po jej opracowaniu technika ta utorowała naukowcom drogę do zbadania kandydatów na leki na zaburzenia neurodegeneracyjne, takie jak choroba Alzheimera. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować oligomer A-beta i ocenić jego ilość.