Name: Przygotowanie i ocena a11-dodatnich oligomerów β-amyloidowych za pomocą analizy igłowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-22T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Poznaj metodę przygotowania oligomerów β-amyloidowych z użyciem analizy igłowej. Protokół ten jest niezawodny i powtarzalny, co czyni go cennym narzędziem w badaniach neurofarmakologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (U1503223, 81673407, 21475131), Projektu Badań Stosowanych nad Technologią Nonprofit w Prowincji Zhejiang (2016C37110), Międzynarodowego Projektu Współpracy Naukowej i Technologicznej Ningbo (2014D10019), Zespołu Innowacji Miejskich Ningbo ds. Nauk Przyrodniczych i Zdrowia (2015C110026), Ningbo Sci & Tech Project for Common Wealth (2017C50042), Li Dak Sum Yip Yio Chin Kenneth Li Marine Biopharmaceutical Development Fund oraz K. C. Wong Magna Fund na Uniwersytecie Ningbo.

1. Przygotowanie roztworu
UWAGA: Zobacz Tabelę materiałów, aby zapoznać się ze źródłami odczynników.
<ol>
	<li>Przygotować 5% roztwór albuminy surowicy bydlęcej (BSA), dodając 5 g BSA do 100 ml podwójnie destylowanej wody. Wymieszaj je całkowicie, wirując je. Przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.</li>
	<li>Przygotować roztwór przeciwciała antyoligomerowego A11 (1:1 000), dodając 10 μl roztworu podstawowego przeciwciała do 10 ml 5% roztworu BSA. Wymieszaj je całkowicie, wirując je. Przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.</li>
	<li>Przygotować roztwór przeciwciała anty-Aβ 6E10 (1:1 000), dodając 10 μl roztworu podstawowego przeciwciała do 10 ml 5% roztworu BSA. Wymieszaj je całkowicie przez wirowanie. Przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.</li>
	<li>Przygotować roztwór OC przeciwciała oligomerowego antyfibrylarnego (1:1 000), dodając 10 μl podstawowego roztworu przeciwciała do 10 ml 5% roztworu BSA. Wymieszaj je całkowicie przez wirowanie. Przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.</li>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy soli fizjologicznej buforowanej Tris (TBS), dodając 24 g zasady Tris i 88 g NaCl do 1,000 ml podwójnie destylowanej wody. Dostosować pH do 7,4. Roztwór należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 3 miesięcy.</li>
	<li>Przygotuj roztwór soli fizjologicznej i Tween-20 (TBST) z buforem Tris, dodając 1 ml Tween-20 do 100 ml roztworu podstawowego TBS i 900 ml podwójnie destylowanej wody.</li>
	<li>Przygotować drugorzędowy roztwór przeciwciała, dodając 10 μl peroksydazy chrzanowej (HRP) Koziej anty-króliczej IgG (H + L) do 10 ml roztworu TBST. Wymieszaj je całkowicie, wirując je. Przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.</li>
	<li>Rozpuść 3,68 g kurkuminy w 1 ml dimetylosulfotlenku (DMSO), aby utworzyć 10-milimetrowy roztwór podstawowy kurkuminy.</li>
	<li>Rozpuścić 5 mg syntetycznego Aβ1-42 w 2 ml 1,1,1,3,3,3-heksafluoro-2-propanolu (HFIP) do uzyskania roztworu monomeru Aβ o stężeniu 2,5 mg/mL. Umieść go w temperaturze pokojowej (25 °C) na 20 minut. Przygotować 100 μl porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 6 miesięcy. 
	UWAGA: Ta procedura powinna być uruchamiana tak szybko, jak to możliwe. Końcówki pipet należy odciąć, aby zapewnić dokładne pipetowanie.</li>
	<li>Przygotować płyn elektrochemiluminescencyjny (ECL), mieszając płyn ECL A i B w stosunku objętościowym 1:1. Roztwór ten należy przygotować tuż przed użyciem.</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbki
UWAGA: Przygotuj próbkę 2 dni przed analizą punktową.
<ol>
	<li>Dodać 900 μl podwójnie destylowanej wody do probówki z roztworem monomeru Aβ1-42; stężenie Aβ1-42 wyniesie 0,25 mg/ml. Umieść mieszaninę w temperaturze pokojowej na 20 minut.</li>
	<li>Odparować roztwór z gazowym azotem o wysokiej czystości, aż jego objętość wyniesie około 850 μl. Stężenie roztworu Aβ1-42 wyniesie około 0,29 mg/mL. 
	UWAGA: Roztwór należy od czasu do czasu wstrząsać, aby upewnić się, że HFIP został całkowicie odparowany. Zwykle po 30 minutach odparowania objętość pozostałego roztworu wynosi około 850 μL.</li>
	<li>Rozcieńczyć roztwór podstawowy kurkuminy do roztworu roboczego kurkuminy (0,2 i 2 μM) wodą podwójnie destylowaną. Wymieszaj roztwór Aβ1-42i roztwór roboczy kurkuminy w stosunku objętościowym 1:1. Końcowe stężenia kurkuminy wynoszą 0,1 i 1 μM. 
	UWAGA: Potencjalne inhibitory oligomerów można w razie potrzeby mieszać z roztworem Aβ1-42 w dowolnym stosunku.</li>
	<li>Wstrząsać roztworem w sposób ciągły w mieszadle magnetycznym (patrz Tabela materiałów).
	<ol>
		<li>Przymocuj plastikową przegrodę do mieszadła magnetycznego. Umieść 2 magnetyczne pręty mieszające w 2 rogach pudełka i umieść probówki z próbkami na środku pudełka.</li>
		<li>Wstrząśnij pudełkiem w temperaturze pokojowej (25 °C) przez 48 h. 
		UWAGA: Prędkość obrotowa mieszadła magnetycznego wynosi około 60 obr./min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odwirować probówki przez 15 minut w temperaturze 4 °C i 18 000 x g. Zebrać supernatant.</li>
</ol>
3. Analiza plam punktowych
UWAGA: Wszystkie inkubacje są wykonywane na wytrząsarce poziomej.
<ol>
	<li>Pokrój membranę nitrocelulozową na paski o szerokości 1 cm. 
	UWAGA: Szerokość membrany nitrocelulozowej można regulować w zależności od potrzeb eksperymentalnych.</li>
	<li>Próbki o objętości 2 μl należy umieścić równomiernie na 2 paskach (pasek 1 i 2) w odstępie co 0,5 cm.</li>
	<li>Umieść paski w temperaturze pokojowej na 5 minut, aż kropla na opasce wyschnie.</li>
	<li>Inkubować paski z 5% roztworem BSA przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Płucz paski roztworem TBST przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odessać roztwór TBST. Przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej inkubować pasek 1 z roztworem przeciwciała antyoligomerowego A11, a pasek 2 z roztworem przeciwciała anty-Aβ 6E10.</li>
	<li>Opłucz paski roztworem TBST trzy razy, za każdym razem przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odessać roztwór TBST. Inkubować paski z wtórnym roztworem przeciwciał przez 40 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Opłucz paski roztworem TBST trzy razy, za każdym razem przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Równomiernie nanieść zmieszany płyn ECL na powierzchnię pasków. Naświetlić paski w automatycznym systemie obrazowania chemiluminescencyjnego (patrz Tabela materiałów). 
	UWAGA: Zwykle 300 μl płynu ECL wystarcza na jedną membranę. Membrana musi być wilgotna podczas ekspozycji. Czas naświetlania jest automatycznie obliczany przez system obrazowania.</li>
	<li>Wykonaj analizę w skali szarości za pomocą ImageJ (National Institutes of Health) lub innego oprogramowania do przetwarzania obrazu, aby uzyskać wyniki półilościowe.</li>
</ol>

<ol><li>Lauren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+prion+protein+as+a+therapeutic+target+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Alzheimer%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Cellular prion protein as a therapeutic target in Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 38 (2), 227-244 (2014).</li>
<li>De Maio, A., Rivera, I., Cauvi, D. M., Arispe, N. <a target="_blank" href="http://www.cell.com/biophysj/comments/S0006-3495(16)33411-7">Modulation of amyloid peptide oligomerization and toxicity by extracellular Hsp70.</a> Biophysical Journal. 112 (3), 444(2017).</li>
<li>Di Scala, C., Chahinian, H., Yahi, N., Garmy, N., Fantini, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+Alzheimer%27s+beta-amyloid+peptides+with+cholesterol%3A+mechanistic+insights+into+amyloid+pore+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Interaction of Alzheimer's beta-amyloid peptides with cholesterol: mechanistic insights into amyloid pore formation.</a> Biochemistry. 53 (28), 4489-4502 (2014).</li>
<li>Xiang, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fucoxanthin+inhibits+beta-amyloid+assembly+and+attenuates+beta-amyloid+oligomer-induced+cognitive+impairments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Fucoxanthin inhibits beta-amyloid assembly and attenuates beta-amyloid oligomer-induced cognitive impairments.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (20), 4092-4102 (2017).</li>
<li>Chang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+against+beta-amyloid-induced+synaptic+and+memory+impairments+via+altering+beta-amyloid+assembly+by+bis%28heptyl%29-cognitin%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Protection against beta-amyloid-induced synaptic and memory impairments via altering beta-amyloid assembly by bis(heptyl)-cognitin.</a> Scientific Reports. 5, 10256(2015).</li>
<li>Yam, G. H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+amyloid+aggregate+forming+ability+of+TGFBI+mutants+that+cause+corneal+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">In vitro amyloid aggregate forming ability of TGFBI mutants that cause corneal dystrophies.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (9), 5890-5898 (2012).</li>
<li>Tomaselli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+alpha-to-beta+conformational+transition+of+Alzheimer%27s+A+beta-%281-42%29+peptide+in+aqueous+media+is+reversible%3A+A+step+by+step+conformational+analysis+suggests+the+location+of+beta+conformation+seeding%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">The alpha-to-beta conformational transition of Alzheimer's A beta-(1-42) peptide in aqueous media is reversible: A step by step conformational analysis suggests the location of beta conformation seeding.</a> ChemBioChem. 7 (2), 257-267 (2006).</li>
<li>Shigemitsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+magnetic+resonance+evidence+for+the+dimer+formation+of+beta+amyloid+peptide+1-42+in+1%2C1%2C1%2C3%2C3%2C3-hexafluoro-2-propanol%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Nuclear magnetic resonance evidence for the dimer formation of beta amyloid peptide 1-42 in 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol.</a> Analytical Biochemistry. 498, 59-67 (2016).</li>
<li>Khan, M. V., Rabbani, G., Ahmad, E., Khan, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluoroalcohols-induced+modulation+and+amyloid+formation+in+conalbumin%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Fluoroalcohols-induced modulation and amyloid formation in conalbumin.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 70, 606-614 (2014).</li>
<li>Fang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-hydroxycyclopenicillone%2C+a+new+beta-amyloid+fibrillization+inhibitor+from+a+sponge-derived+fungus+trichoderma+sp+HPQJ-34%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Drugs%22%5BJournal%5D)">5-hydroxycyclopenicillone, a new beta-amyloid fibrillization inhibitor from a sponge-derived fungus trichoderma sp HPQJ-34.</a> Marine Drugs. 15 (8), 260(2017).</li>
<li>Shiao, Y. J., Su, M. H., Lin, H. C., Wu, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Echinacoside+ameliorates+the+memory+impairment+and+cholinergic+deficit+induced+by+amyloid+beta+peptides+via+the+inhibition+of+amyloid+deposition+and+toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Food+%26+Function%22%5BJournal%5D)">Echinacoside ameliorates the memory impairment and cholinergic deficit induced by amyloid beta peptides via the inhibition of amyloid deposition and toxicology.</a> Food & Function. 8 (6), 2283-2294 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym protokole opisaliśmy metodę przygotowania próbek zawierających oligomer Aβ1-42 oraz analizy ilości oligomeru A11-dodatniego Aβ1-42 za pomocą analizy punktowej. Chociaż nasze metody przygotowania próbek bogatych w oligomery Aβ1-42 są dość proste, niezawodne i powtarzalne, nadal należy zwrócić uwagę na kilka punktów. Po pierwsze, HFIP służy do rozpuszczania syntetycznego peptydu Aβ1-42 . Zagregowany peptyd Aβ1-42 może rozpadać się na monomer w roztworze HFIP. Jed...

Choroba Alzheimera (AD) jest jedną z najważniejszych chorób neurodegeneracyjnych dotykających osoby starsze na całym świecie1. Powszechnie przyjmuje się, że nieprawidłowa agregacja β-amyloidu (Aβ) może być głównym czynnikiem patologicznym choroby Alzheimera. Agregaty Aβ są głównymi składnikami blaszek starczych, jednego z markerów biologicznych w mózgach pacjentów z chorobą Alzheimera. Co więcej, agregaty Aβ, w tym w szczególności oligomery, wytwarzają silną neurotoksyczność, która może być przyczyną śmierci neuronów w miarę postępu choroby Alzheimera. W związku z tym hamowanie tworzenia oligomerów Aβ może zapobiegać neurodegeneracji, a inhibitory oligomerów Aβ mogą być opracowywane jako terapie modyfikujące przebieg choroby Alzheimera. W wielu badaniach wykorzystano syntetyczny peptyd Aβ do tworzenia oligomerów in vitro, badania morfologii i struktur sztucznych oligomerów Aβ oraz badania inhibitorów oligomeru Aβ przy użyciu modeli in vitro2,3,4. Jednak różne protokoły tworzenia oligomeru Aβ in vitro mogą prowadzić do powstania oligomeru o różnych cechach morfologicznych, co może skutkować nieporównywalnymi wynikami między różnymi grupami badawczymi. Dlatego pilnie potrzebny jest standardowy protokół tworzenia oligomeru Aβ.
Do tej pory nie opisano wielu metod bezpośredniego wykrywania oligomerów Aβ. Transmisyjna mikroskopia elektroniczna (TEM), elektroforeza żelowa bez denaturacji, test immunoenzymatyczny (ELISA) i analiza punktowa mogą być wykorzystane do zbadania ilości i/lub morfologii oligomeru Aβ in vitro5,6. Na przykład morfologię i strukturę oligomeru Aβ można zaobserwować w TEM. Względne ilości i wielkość cząsteczkową agregacji Aβ można zmierzyć za pomocą elektroforezy żelowej bez denaturacji. Test ELISA może być używany do oznaczania oligomeru Aβ w surowicy, osoczu i ekstraktach z tkanki mózgowej. Wreszcie, analiza punktowa, technika stosowana do wykrywania, analizowania i identyfikacji białek, może być stosowana do oceny względnego stężenia oligomeru Aβ w różnych próbkach za pomocą przeciwciał specyficznych dla oligomerów i swoistych dla Aβ. Co więcej, test igłowy zapewnia znaczną oszczędność czasu, ponieważ elektroforeza żelowa i procedury blottingu dla żeli nie są wymagane. Dlatego test ten jest zwykle stosowany do badań przesiewowych potencjalnych inhibitorów oligomerów Aβ. Ogólnym celem tego protokołu jest opisanie stosunkowo prostej, niezawodnej i powtarzalnej metody przygotowania próbki bogatej w oligomery Aβ1-42, analizy ilości oligomeru Aβ1-42 za pomocą analizy punktowej oraz badania przesiewowego inhibitorów oligomerów Aβ przy użyciu półilościowych wyników eksperymentalnych.

<table><tbody><tr><td>A11 (ab126892 Rb pAb do oligomerów amyloidowych)</td><td>Abcam</td><td>GR91739-58</td><td></td></tr><tr><td>6E10 (beta-amyloid królik Ab)</td><td>Komórka&nbsp; Technologia sygnalizacji</td><td>2454S</td> OC (przeciwciało OC przeciwko fibrylom antyamyloidowym<td></td></tr><tr><td>)</td><td>Millipore</td><td>AB2286</td><td></td></tr><tr><td>Peroksydaza chrzanowa (HRP) Marker Koza anty królik IgG (H + L)&nbsp;</td><td>Beyotime</td><td>A0208</td><td></td></tr><tr><td>A&beta; 1-42</td><td>GL Biochem</td><td>52487</td><td></td></tr><tr><td>1,1,1,3,3,3-Hexafiuoro-2-propanol</td><td>Aladyn</td><td>I1523078</td><td></td></tr><tr><td>Kurkumina</td><td>Sigma</td><td>C1386</td><td></td></tr><tr><td>Albumina bydlęca V</td><td>Solarbio</td><td>A8020</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sangon Biotech</td><td>D920BA0003</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu</td><td>SCR</td><td>30166428</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Solarbio</td><td>T8060</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Solarbio</td><td>G8200</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Dimetylosulfotlenek</td><td>Solarbio</td><td>D8370</td><td></td></tr><tr><td>5 i razy; żel niedenaturujący PAGE Marker białkowy</td><td>Beyotime</td><td>P0016</td><td></td></tr><tr><td>Genshare CFAS anyKD PAGE</td><td>Genshare</td><td>JC-PE022</td><td></td></tr><tr><td>Czysta membrana nitrocelulozowa</td><td>Pall Corporation</td><td>T50189</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>SCR</td><td>10014118</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>SCR</td><td>10009218</td><td></td></tr><tr><td>Super niski zakres&nbsp; Marker białkowy</td><td>Solarbio</td><td>PR1300</td><td></td></tr><tr><td>Membrany transferowe</td><td>Immobilon-PSQ</td><td>ISEQ00010</td><td></td></tr><tr><td>BeyoECL Star</td><td>Beyotime</td><td>P0018A</td><td></td></tr><tr><td>Commassie Blue Szybkie rozwiązanie do barwienia</td><td>Beyotime</td><td>P0017</td><td></td></tr><tr><td>All - automatyczny system obrazowania chemiluminescencyjnego</td><td>Tanon</td><td>Tanon 5200</td><td></td></tr><tr><td>Image J</td><td>National Instytuty Zdrowia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do przetwarzania obrazów</td><td>Adobe</td><td>Photoshop CS6</td><td></td></tr><tr><td>Mieszadło magnetyczne</td><td>Shanghai Huxi</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie i ocena a11-dodatnich oligomerów β-amyloidowych za pomocą analizy igłowej

A11-positive &#946;-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis

β-amyloid (Aβ) jest hydrofobowym peptydem z wewnętrzną tendencją do samoorganizacji w agregaty. Spośród różnych agregatów oligomer Aβ jest powszechnie uznawany za wiodącą neurotoksynę w postępie choroby Alzheimera (AD) i jest uważany za kluczowe zdarzenie w patogenezie AD. W związku z tym inhibitory oligomerów Aβ mogą zapobiegać neurodegeneracji i mają potencjał do opracowania jako terapie modyfikujące przebieg choroby Alzheimera. Jednak różne protokoły tworzenia oligomeru Aβ mogą prowadzić do powstania oligomerów o różnych cechach. Co więcej, nie ma wielu metod skutecznego badania przesiewowego inhibitorów oligomerów Aβ1-42. Przeciwciało A11 może reagować z podzbiorem toksycznego oligomeru Aβ1-42 o antyrównoległych strukturach β-arkuszowych. W tym protokole opisujemy, jak przygotować A11-dodatnią próbkę bogatą w oligomery Aβ1-42 z syntetycznego peptydu Aβ1-42 in vitro i ocenić względne ilości A11-dodatniego oligomeru Aβ1-42 w próbkach za pomocą analizy kropkowej przy użyciu przeciwciał 6E10 swoistych dla A11 i Aβ1-42. Korzystając z tego protokołu, inhibitory A11-dodatniego oligomeru Aβ1-42 mogą być również badane przesiewowo na podstawie półilościowych wyników eksperymentalnych.

W celu zbadania, czy monomer Aβ1-42 może po przygotowaniu utworzyć oligomer Aβ1-42, zastosowano analizę TEM. W próbce monomeru Aβ1-42 rozpuszczonego w HFIP nie zaobserwowano widocznych agregatów (Rysunek 1A). Ponadto, w próbce Aβ1-42 po 48 h wytrząsania zaobserwowano głównie agregaty globularne o średnicy około 10 - 80 nm, co sugeruje, że Aβ1-42 po przygotowaniu tworzy oligomery (<strong ...

Ten protokół opisuje, jak przygotować oligomery Aβ z syntetycznego peptydu in vitro i ocenić względne ilości oligomeru Aβ za pomocą analizy punktowej.

Przygotowanie i ocena a11-dodatnich oligomerów β-amyloidowych za pomocą analizy igłowej

&#946;-amyloid (A&#946;) is a hydrophobic peptide with an intrinsic tendency to self-assemble into aggregates. Among various aggregates, A&#946; oligomer ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neurofarmakologii. Główną zaletą tej techniki jest to, że tworzenie oligomeru beta-amyloidu jest proste, niezawodne i powtarzalne. Pokazujemy, że demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy przygotowania oligomeru beta są trudne do nauczenia.Najpierw dostosuj stężenie roztworu monomeru A-beta do 0,25 miligrama na mililitr, dodając do probówki 900 mikrolitrów podwójnie destylowanej wody. Następnie kontynuuj odparowywanie roztworu monomeru z gazowym azotem o wysokiej czystości, aż objętość osiągnie około 850 mikrolitrów o stężeniu około 0,29 miligrama na mililitr. Obecność HR5P wpływa na powstawanie oligomeru A-beta.Dlatego odparowanie w jak największym stopniu jest krytycznym etapem tej procedury. Następnie użyj podwójnie destylowanej wody, aby rozcieńczyć roztwór podstawowy kurkuminy, aby przygotować roztwór roboczy o stężeniu 0,2 i dwóch mikromolowych. Utrzymuj stosunek jeden do jednego i wymieszaj roztwór A-beta z kurkuminą, aby osiągnąć końcowe stężenie kurkuminy na poziomie 0,1 i jednego mikromola.Następnie pozostaw roztwór na mieszadle magnetycznym. Przymocuj plastikową skrzynkę rozdzielającą do mieszadła magnetycznego. Umieść dwa mieszadła magnetyczne w dwóch rogach pudełka, a następnie umieść probówki z próbkami na środku pudełka.Kontynuuj wytrząsanie pudełka w temperaturze pokojowej przez 48 godzin z prędkością 60 obrotów na minutę, a następnie odwiruj probówkę w temperaturze 18 000 razy G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odwirowaniu zebrać supernatant. Do analizy punktowej weź membranę nitrocelulozową i pokrój ją na paski o szerokości jednego centymetra, a następnie umieść dwa mikrolitry próbki równomiernie na paskach pierwszym i drugim w odstępie każdego punktu w odległości 0,5 centymetra.Podczas wstrzykiwania próbki na membranę konieczne jest równomierne rozprowadzenie, a różne kropelki są kontrolowane tak, aby różne próbki nie były ze sobą połączone. Następnie inkubuj paski w temperaturze pokojowej przez pięć minut, aby kropelki wyschły. Po pięciu minutach inkubować paski z 5% albuminą surowicy bydlęcej przez 30 minut w temperaturze pokojowej.Po zakończeniu inkubacji przemywać paski buforem TBST przez pięć minut. Po zakończeniu płukania odessać bufor, a następnie inkubować jeden pasek z przeciwciałem antyoligomerowym A11 i drugi z roztworem przeciwciała anty-A-beta 6E10 przez godzinę. Po godzinie przemyć paski TBST przez pięć minut każdy trzy razy, a następnie odessać bufor i inkubować paski z wtórnym roztworem przeciwciał przez 40 minut.Po wtórnej inkubacji przeciwciał ponownie przemyj paski TBST przez pięć minut każdy trzy razy. Następnie dodaj około 300 mikrolitrów zmieszanego płynu ECL na powierzchnię wilgotnych pasków, a następnie naświetl paski w automatycznym systemie obrazowania chemiluminescencyjnego. Badania TEM wykazują brak jakichkolwiek widocznych agregatów w rozpuszczonym w HFIP roztworze monomeru A-beta, jednak po 48 godzinach inkubacji ten sam monomer tworzy oligomery, które są głównie agregatami kulistymi o średnicy od 10 do 80 nanometrów.Po poddaniu próbek monomeru A-beta i próbek bogatych w oligomery analizie dot blot wykazano obecność A11-dodatnich oligomerów A-beta w próbkach bogatych w oligomery A-beta. Co ciekawe, A-beta 6E10 dodatnie peptydy A-beta są obecne zarówno w próbkach bogatych w monomer A-beta, jak i oligomery. Następnie przeprowadza się również analizę półilościową w celu wyrażenia swoistego monomeru A-beta dodatniego na obecność przeciwciał i próbek bogatych w oligomery jako procent kontroli.Peptydy A-beta A11-dodatnie są znacznie wyższe w próbkach bogatych w oligomery A-beta w porównaniu z monomerami. Wręcz przeciwnie, A-beta dodatni peptyd A-beta 6E10 jest obecny zarówno w próbkach bogatych w monomery, jak i oligomery. W rzeczywistości oligomery A-beta są również inkubowane wspólnie z kurkuminą i inhibitorem oligomerów A-beta.Kurkumina prowadzi do znacznego zmniejszenia względnej ilości oligomeru A-beta A11 dodatniego przy zmniejszonym barwieniu A11 w próbkach oligomerów A-beta inkubowanych przez kurkuminę. Jednak różne stężenia kurkuminy nie wpływają na liczbę peptydów A-beta w próbkach bogatych w monomery i oligomery 6E10 dodatnie w porównaniu z próbkami dodatnimi A11. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu kilku godzin, jeśli działa prawidłowo.Po jej opracowaniu technika ta utorowała naukowcom drogę do zbadania kandydatów na leki na zaburzenia neurodegeneracyjne, takie jak choroba Alzheimera. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować oligomer A-beta i ocenić jego ilość.

a11-positive-amyloid-oligomer-preparation-assessment-using-dot

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

SDD-AGE jest użyteczną techniką wykrywania i charakteryzacji polimerów amyloidopodobnych w komórkach. Przedstawiamy tutaj adaptację, która sprawia, że technika ta nadaje się do zastosowań na szeroką skalę.

Przesiewowe badanie agregacji amyloidu metodą półdenaturującej elektroforezy w żelu agarozowym z detergentem

Opisujemy technikę przygotowania klarownych homogenatów kory mózgu człowieka, rozdziału białek metodą SDS-PAGE, odsłaniania antygenów oraz immunoblottingu z użyciem przeciwciała przeciwko peptydowi Aβ. Stosując ten protokół, konsekwentnie wykrywamy monomeryczne i multimeryczne Aβ w tkance korowej pobranej od ludzi z patologią choroby Alzheimera.

Detekcja multimerów A&beta; w homogenatach tkanki kory mózgowej człowieka za pomocą SDS-PAGE/immunoblottingu z zastosowaniem odzyskiwania epitopu antygenu

Aptamery to krótkie oligonukleotydy rybo- lub deoksyrybonukleinowe, wyselekcjonowane metodami ewolucji in-vitro na podstawie powinowactwa do konkretnego celu. Aptamery są narzędziami rozpoznawania molekularnego o wszechstronnych zastosowaniach terapeutycznych, diagnostycznych i badawczych. Prezentujemy metody selekcji aptamerów przeciwko białku amyloid β, czynnikowi sprawczemu choroby Alzheimera.

Wybór aptamerów dla białka amyloid $\beta$, czynnika sprawczego choroby Alzheimera

Ten film demonstruje dwuwymiarową, częściowo denaturującą separację włókien amyloidowych za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym detergentu. Technika ta polega na oddzieleniu polimorficznych agregatów amyloidowych na podstawie ich niejednorodnego rozmiaru.

Dwuwymiarowa elektroforeza w żelu agarozowym częściowo denaturującym: technika rozdzielania polimorficznych włókien amyloidowych na podstawie niejednorodności wielkości

Białka mogą albo przyjąć natywną strukturę, albo nieprawidłowo sfałdować się w nierozpuszczalny amyloid. Warunki, które sprzyjają szlakowi nieprawidłowego fałdowania, prowadzą do powstawania różnych typów włókienek amyloidowych. Opisane tu metody pozwalają na szybką konwersję natywnych białek do amyloidu in vitro.

Szybkie wytwarzanie amyloidu z białek natywnych in vitro

Korzystając z mikroskopii sił atomowych w połączeniu z technologią biopanoramowania, stworzyliśmy negatywny i pozytywny system biopanowania, aby uzyskać przeciwciała przeciwko specyficznym dla choroby wariantom białek obecnym w dowolnym materiale biologicznym, nawet w niskich stężeniach.  Udało nam się uzyskać przeciwciała przeciwko wariantom białka TDP-43 zaangażowanym w stwardnienie zanikowe boczne.

Nowatorski biopanning oparty na mikroskopii sił atomowych do izolacji odczynników specyficznych dla morfologii przeciwko wariantom TDP-43 w stwardnieniu zanikowym bocznym

Opisano proste metody demonstrowania produkcji cytotoksycznych amyloidów po zakażeniu śródbłonka płuc przez Pseudomonas aeruginosa.

Metody wykrywania cytotoksycznych amyloidów po zakażeniu komórek śródbłonka płuc przez Pseudomonas aeruginosa

Opisano szczegółowy protokół oczyszczania i późniejszej analizy przeciwciała monoklonalnego z pobranego płynu do hodowli komórek (HCCF) zautomatyzowanych mikrobioreaktorów. Przedstawiono również wykorzystanie analiz do określenia krytycznych atrybutów jakości (CQA) i maksymalizacji ograniczonej objętości próbki w celu wyodrębnienia istotnych informacji.

Oczyszczanie i analiza przeciwciała monoklonalnego z komórek jajnika chomika chińskiego przy użyciu zautomatyzowanego systemu mikrobioreaktora

Ta metoda biochemicznego oczyszczania z analizą proteomiczną opartą na spektrometrii mas ułatwia solidną charakterystykę rdzeni włókienkowych amyloidu, co może przyspieszyć identyfikację celów zapobiegania chorobie Alzheimera.

Biochemiczne oczyszczanie i charakterystyka proteomiczna rdzeni fibryli amyloidowych z mózgu

Przedstawiamy tutaj protokół półilościowej oceny globalnych poziomów M⁶A za pomocą punktowego blotu. Całkowite RNA jest ekstrahowane, denaturowane, naznaczane na nylonowej membranie, badane przeciwciałem przeciw m⁶A i wizualizowane za pomocą chemiluminescencji. Intensywność sygnału, zmierzona za pomocą analizy szarości ImageJ, odzwierciedla względną obfitość metylacji, zapewniając powtarzalny przepływ pracy w badaniach.

Test punktowy do wykrywania globalnych poziomów modyfikacji N 6-metyladenozyny RNA

Poznaj metodę przygotowania oligomerów β-amyloidowych z użyciem analizy igłowej. Protokół ten jest niezawodny i powtarzalny, co czyni go cennym narzędziem w badaniach neurofarmakologicznych.

Przygotowanie i ocena a11-dodatnich oligomerów β-amyloidowych za pomocą analizy igłowej

Przeglądaj więcej filmów