Przygotowanie i ocena a11-dodatnich oligomerów β-amyloidowych za pomocą analizy igłowej
22 maja 2018
Ten protokół opisuje, jak przygotować oligomery Aβ z syntetycznego peptydu in vitro i ocenić względne ilości oligomeru Aβ za pomocą analizy punktowej.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neurofarmakologii. Główną zaletą tej techniki jest to, że tworzenie oligomeru beta-amyloidu jest proste, niezawodne i powtarzalne. Pokazujemy, że demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy przygotowania oligomeru beta są trudne do nauczenia.
Najpierw dostosuj stężenie roztworu monomeru A-beta do 0,25 miligrama na mililitr, dodając do probówki 900 mikrolitrów podwójnie destylowanej wody. Następnie kontynuuj odparowywanie roztworu monomeru z gazowym azotem o wysokiej czystości, aż objętość osiągnie około 850 mikrolitrów o stężeniu około 0,29 miligrama na mililitr. Obecność HR5P wpływa na powstawanie oligomeru A-beta.
Dlatego odparowanie w jak największym stopniu jest krytycznym etapem tej procedury. Następnie użyj podwójnie destylowanej wody, aby rozcieńczyć roztwór podstawowy kurkuminy, aby przygotować roztwór roboczy o stężeniu 0,2 i dwóch mikromolowych. Utrzymuj stosunek jeden do jednego i wymieszaj roztwór A-beta z kurkuminą, aby osiągnąć końcowe stężenie kurkuminy na poziomie 0,1 i jednego mikromola.
Następnie pozostaw roztwór na mieszadle magnetycznym. Przymocuj plastikową skrzynkę rozdzielającą do mieszadła magnetycznego. Umieść dwa mieszadła magnetyczne w dwóch rogach pudełka, a następnie umieść probówki z próbkami na środku pudełka.
Kontynuuj wytrząsanie pudełka w temperaturze pokojowej przez 48 godzin z prędkością 60 obrotów na minutę, a następnie odwiruj probówkę w temperaturze 18 000 razy G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odwirowaniu zebrać supernatant. Do analizy punktowej weź membranę nitrocelulozową i pokrój ją na paski o szerokości jednego centymetra, a następnie umieść dwa mikrolitry próbki równomiernie na paskach pierwszym i drugim w odstępie każdego punktu w odległości 0,5 centymetra.
Podczas wstrzykiwania próbki na membranę konieczne jest równomierne rozprowadzenie, a różne kropelki są kontrolowane tak, aby różne próbki nie były ze sobą połączone. Następnie inkubuj paski w temperaturze pokojowej przez pięć minut, aby kropelki wyschły. Po pięciu minutach inkubować paski z 5% albuminą surowicy bydlęcej przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
Po zakończeniu inkubacji przemywać paski buforem TBST przez pięć minut. Po zakończeniu płukania odessać bufor, a następnie inkubować jeden pasek z przeciwciałem antyoligomerowym A11 i drugi z roztworem przeciwciała anty-A-beta 6E10 przez godzinę. Po godzinie przemyć paski TBST przez pięć minut każdy trzy razy, a następnie odessać bufor i inkubować paski z wtórnym roztworem przeciwciał przez 40 minut.
Po wtórnej inkubacji przeciwciał ponownie przemyj paski TBST przez pięć minut każdy trzy razy. Następnie dodaj około 300 mikrolitrów zmieszanego płynu ECL na powierzchnię wilgotnych pasków, a następnie naświetl paski w automatycznym systemie obrazowania chemiluminescencyjnego. Badania TEM wykazują brak jakichkolwiek widocznych agregatów w rozpuszczonym w HFIP roztworze monomeru A-beta, jednak po 48 godzinach inkubacji ten sam monomer tworzy oligomery, które są głównie agregatami kulistymi o średnicy od 10 do 80 nanometrów.
Po poddaniu próbek monomeru A-beta i próbek bogatych w oligomery analizie dot blot wykazano obecność A11-dodatnich oligomerów A-beta w próbkach bogatych w oligomery A-beta. Co ciekawe, A-beta 6E10 dodatnie peptydy A-beta są obecne zarówno w próbkach bogatych w monomer A-beta, jak i oligomery. Następnie przeprowadza się również analizę półilościową w celu wyrażenia swoistego monomeru A-beta dodatniego na obecność przeciwciał i próbek bogatych w oligomery jako procent kontroli.
Peptydy A-beta A11-dodatnie są znacznie wyższe w próbkach bogatych w oligomery A-beta w porównaniu z monomerami. Wręcz przeciwnie, A-beta dodatni peptyd A-beta 6E10 jest obecny zarówno w próbkach bogatych w monomery, jak i oligomery. W rzeczywistości oligomery A-beta są również inkubowane wspólnie z kurkuminą i inhibitorem oligomerów A-beta.
Kurkumina prowadzi do znacznego zmniejszenia względnej ilości oligomeru A-beta A11 dodatniego przy zmniejszonym barwieniu A11 w próbkach oligomerów A-beta inkubowanych przez kurkuminę. Jednak różne stężenia kurkuminy nie wpływają na liczbę peptydów A-beta w próbkach bogatych w monomery i oligomery 6E10 dodatnie w porównaniu z próbkami dodatnimi A11. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu kilku godzin, jeśli działa prawidłowo.
Po jej opracowaniu technika ta utorowała naukowcom drogę do zbadania kandydatów na leki na zaburzenia neurodegeneracyjne, takie jak choroba Alzheimera. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować oligomer A-beta i ocenić jego ilość.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje przygotowanie oligomerów Aβ z syntetycznego peptydydu in vitro oraz ocenę ich ilości względnych za pomocą analizy dot blotting. Metoda ta jest prosta, niezawodna i powtarzalna, co czyni ją kluczową w badaniach neurofarmakologicznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Neurofarmakologia
- Biochemia
Wstęp
- Oligomery Aβ są zaangażowane w choroby neurodegeneracyjne.
- Zrozumienie procesu ich powstawania ma kluczowe znaczenie dla opracowania metod terapeutycznych.
- Obecne metody przygotowywania tych oligomerów mogą być skomplikowane.
- Niniejszy protokół ma na celu uproszczenie tego procesu dla badaczy.
Cel badania
- Aby zapewnić niezawodną metodę przygotowywania oligomerów Aβ.
- Aby ułatwić ocenę stężeń oligomerów.
- Aby zwiększyć powtarzalność eksperymentów neurofarmakologicznych.
Zastosowane Metody
- Dostosowanie stężenia monomeru A-beta do 0,25 mg/mL.
- Odparowanie roztworu za pomocą azotowego gazu o wysokiej czystości.
- Monitorowanie wpływu HR5P na tworzenie się oligomerów.
- Wykorzystanie analizy dot blotting do oceny.
Główne wyniki
- Metoda ta pozwala na pomyślne otrzymanie oligomerów Aβ.
- Analiza dot blotting skutecznie określa ilość oligomerów.
- Obecność HR5P znacząco wpływa na tworzenie się oligomerów.
- Protokół wykazuje wysoką niezawodność i powtarzalność.
Wnioski
- Niniejszy protokół upraszcza przygotowanie oligomerów Aβ.
- Stanowi on wartościowe narzędzie dla badań neurofarmakologicznych.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tej niezawodnej metodzie.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niezawodne przygotowanie i ilościowe oznaczenie oligomerów β-amyloidu wykazujących pozytywny wynik z przeciwciałem A11 są kluczowe dla walidacji celów na wczesnych etapach neurodegeneracji oraz przesiewu inhibitorów w badaniach nad chorobą Alzheimera. Niniejszy protokół umożliwia odtwarzalne generowanie i półilościową ocenę toksycznych form oligomerycznych, co wspiera pewność prognostyczną w testowaniu hipotez terapeutycznych. Metoda ta bezpośrednio odnosi się do kluczowego punktu zwrotnego w ograniczaniu ryzyka mechanistycznego i segregacji projektów w badaniach i rozwoju neurofarmakologicznym.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie tworzenia się oligomerów β-amyloidu jako mechanistycznego czynnika patologii choroby Alzheimera.
- Wspiera funkcjonalną walidację gatunków neurotoksycznych z wykorzystaniem specyficzności przeciwciała A11.
- Ułatwia weryfikację hipotez terapeutycznych ukierunkowanych na hamowanie tworzenia oligomerów.
- Zapewnia powtarzalny schemat postępowania dla analizy porównawczej potencjalnych inhibitorów.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Przygotowuje zwalidowane próbki bogate w oligomery do późniejszych kampanii przesiewowych inhibitorów.
- Zapewnia półilościowe wyniki analizy dot blot dla ustandaryzowanych odczytów testów.
- Umożliwia powtarzalną detekcję oligomerów A11-dodatnich do oceny związków.
- Wspiera skalowalność i ponowne wykorzystanie platformy w procesach przesiewowych w chorobach neurodegeneracyjnych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia powiązanie charakterystyki oligomerów in vitro z neurotoksycznymi gatunkami istotnymi dla przebiegu choroby.
- Zapewnia ciągłość od etapu walidacji w fazie odkrywania do przedklinicznej oceny inhibitorów.
- Umożliwia postęp w badaniach nad cząsteczkami kandydackimi w oparciu o dowody mechanistyczne z uwzględnieniem analizy ryzyka.
- Wspiera rozwój translacyjnych biomarkerów dla interwencji ukierunkowanych na oligomery.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół integruje etapy wczesnego odkrywania oraz identyfikacji wiodących związków, umożliwiając rzetelną weryfikację hipotez oraz rozwój analiz w ramach portfeli badawczych nad chorobami neurodegeneracyjnymi.
- Biologia odkrywcza: Wspiera walidację mechanistyczną toksyczności oligomerów β-amyloidu oraz efektów działania inhibitorów.
- Przesiewanie: Zapewnia zestandaryzowane, półilościowe wyniki analizy dot blot dla procesów przesiewania związków.
- Analityka: Umożliwia porównawkową kwantyfikację gatunków pozytywnych dla A11 i 6E10 w celu podejmowania decyzji w oparciu o dane.
- Badania translacyjne: Łączy ocenę oligomerów in vitro z modelami neurotoksyczności istotnymi dla przebiegu choroby.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustala odtwarzalny i skalowalny protokół dla bieżących inicjatyw badawczych nad neurodegeneracją.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów oraz w ograniczaniu ryzyka mechanistycznego w przypadku choroby Alzheimera.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ustandaryzowane, powtarzalne i skalowalne przygotowanie oraz ilościowe oznaczenie oligomerów.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywność kapitałową dzięki umożliwieniu wiarygodnego screeningu inhibitorów.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację kandydatów na leki w chorobach neurodegeneracyjnych z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w pracy z peptydami oraz w technikach immunodetekcji.
- Wymaga dostępu do aparatury do dot blottingu oraz systemów obrazowania chemiluminescencyjnego.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w celu zapewnienia powtarzalności przygotowania i analizy próbek.
- Metoda jest możliwa do adaptacji dla różnych kandydatów na inhibitory oraz oligomerycznych układów peptydowych.
- Wyniki są zależne od specyficzności przeciwciał oraz ograniczeń analizy półilościowej.
