Name: Wytwarzanie bezrusztowaniowych, trójwymiarowych trzustek eksprymujących insulinę z mysich progenitorów trzustki in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Poznaj metodę wytwarzania trójwymiarowych trzustek eksprymujących insulinę z mysich progenitorów trzustki e10.5. Technika ta umożliwia badanie rozwoju komórek endokrynnych w obecności mezenchymy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Jolancie Chmielowiec za pomocną dyskusję na temat protokołu i rękopisu. Dziękujemy również Benjaminowi Arenkielowi za dostęp do mikroskopu konfokalnego. Praca ta była wspierana przez NIH (P30-DK079638 do M.B. i T32HL092332-13 do M.A.S. i M.B.), McNair Medical Foundation (do M.B.) oraz rdzeń konfokalny w Centrum Badań nad Niepełnosprawnością Intelektualną i Rozwojową BCM (NIH U54 HD083092 z Narodowego Instytutu Zdrowia Dziecka i Rozwoju Człowieka Eunice Kennedy Shriver).

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach opisane tą metodą zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Baylor College of Medicine.
1. Przygotowanie Dnia Embrionalnego Myszy 10.5 Przodkowie trzustki
Uwaga: Ten protokół nie musi być przestrzegany w sterylnych warunkach aż do kroku 2, jednak optymalne jest wysterylizowanie narzędzi do preparacji i spryskanie 70% etanolem przed użyciem.
<ol>
	<li>Aby przygotować się do sekcji, napełnij wiadro na lód i umieść w lodzie pojemnik z solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). Wyczyść dwa kleszcze z cienką końcówką i nożyczki preparacyjne 70% etanolem. Umieść w pobliżu obszaru sekcji, pojemnik z co najmniej trzema borokrzemianowymi rurkami kapilarnymi, pipetą doustną, zapalniczką i przefiltrowanymi końcówkami do pipet o pojemności 1 000 μl.
	<ol>
		<li>Przygotować co najmniej 1 ml zimnej dypasy o stężeniu 1,25 mg/ml rozcieńczonej w wysterylizowanej wodzie i umieścić w drugim dołku 12-dołkowej płytki na lodzie. Umieść PBS w pierwszym, trzecim i czwartym dołku płytki 12-dołkowej. Umieść 1 ml 0,05% trypsyny w probówce o pojemności 1,5 ml na lodzie. Podgrzej inkubator z wytrząsaniem do temperatury 37 oC.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Poddaj e10,5 myszy w ciąży zgodnie z wytycznymi IACUC. Spryskaj brzuch 70% etanolem, aby oczyścić obszar przed wykonaniem nacięcia w kształcie litery V w okolicy narządów płciowych myszy za pomocą nożyczek i kleszczy i kontynuuj go aż do przepony. 
	UWAGA: Pojawienie się czopa dopochwowego w tym protokole wskazuje na dzień 0,5. U 5-6-tygodniowych myszy przyrost masy ciała o ponad 2 g działa jako drugorzędna miara udanego zapłodnienia.
	<ol>
		<li>Ostrożnie wyciąć macicę, wykonując nacięcie w najwyższych bocznych częściach macicy, odciągając narząd w górę od myszy i podążając za tym nacięciem w dół do okolicy narządów płciowych, a następnie powtórz po przeciwnej stronie. Umieść go na 10 cm szalce Petriego z zimnym PBS. 
		UWAGA: Możliwe jest uzyskanie organoidów z komórek zdysocjowanych e11.5, jednak w przeciwieństwie do trzustek e10.5, organoidy te nie są jeszcze scharakteryzowane, a zatem mogą nie zachować zdolności do różnicowania się we wszystkie trzy główne linie trzustki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pod mikroskopem rozwarstwiającym pod światłem umieść szalkę Petriego i ostrożnie otwórz tkankę macicy, umieszczając dwa kleszcze między każdym zarodkiem i złuszczając tkankę z dala od woreczka żółtkowego. Przenieś zarodki, delikatnie chwytając woreczek żółtkowy kleszczami i umieść na 10-centymetrowej szalce Petriego ze świeżym, zimnym PBS. Umieść szalkę Petriego na lodzie. 
	UWAGA: Ważne jest, aby uważnie usuwać zarodki, najlepiej utrzymywane w woreczku żółtkowym, ponieważ usunięcie na siłę może pociągnąć pępowinę, rozrywając tkankę zarodka i naruszając integralność strukturalną.</li>
	<li>Umieść kilka kropli PBS na 10-centymetrowej pokrywie szalki Petriego. Użyj tych kropelek do przeniesienia zarodka podczas sekcji, gdy tkanki pozazarodkowe są usuwane, aby zapewnić widoczność. Przenieś zarodek do kropli PBS i delikatnie wyjmij z woreczka żółtkowego za pomocą kleszczy, podczas gdy pozostałe zarodki pozostają w PBS na lodzie (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A). Usuń głowę przed przeniesieniem zarodka do nowej kropli PBS, używając kleszczy, aby delikatnie zgarnąć zarodek, aby nie uszkodzić tkanki (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B). 
	UWAGA: Tkanka może wymagać częstszego przenoszenia do świeżych kropelek PBS niż opisano tutaj, w zależności od nieprzezroczystości płynu.
	<ol>
		<li>W nowym kropli PBS usuń pąki kończyn przednich za pomocą kleszczy (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B). Umieść kleszcze w otworze, w którym znajdował się pączek kończyny i delikatnie rozerwij tylko najbardziej zewnętrzną tkankę z przodu (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B). Obróć zarodek i powtórz w kierunku tylnym, zatrzymując się na zawiązku kończyny tylnej. W tym momencie przewód pokarmowy powinien być widoczny (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B).</li>
		<li>Tylny obszar przewodu pokarmowego ma lekkie wygięcie (<silna klasa="xfig">Rysunek 1F). Włóż kleszcze za tym zgięciem w otworze między przewodem pokarmowym a obszarem rdzeniowym ściany ciała. Odłącz przewód pokarmowy, pracując powoli w górę, aż do osiągnięcia najbardziej przedniego obszaru, w którym łączy się obszar serca (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B-E). 
		OPCJONALNIE: Usuń pierwotne serce i pąki wątroby z brzusznych obszarów przewodu pokarmowego, pozostawiając tylko ciągłą rurkę jelitową. Za pierwszym razem, gdy ten protokół jest wykonywany, może być łatwiej pozostawić serce i wątrobę jako brzuszne punkty orientacyjne, dopóki morfologia przewodu pokarmowego i pączka grzbietowego trzustki nie stanie się bardziej znana (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1C i D).</li>
		<li>Przenieś przewód pokarmowy do świeżej kropli PBS.</li>
		<li>Weź kleszcze i delikatnie uszczypnij tkankę pod wystającym pączkiem i jelitem, a następnie lekko unieś zewnętrzną tkankę (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D-F). 
		UWAGA: Grzbietowy pączek trzustki znajduje się między żołądkiem a jelitem (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1CG). Pączek trzustki pod spodem powinien wyglądać jak okrągła, guzowata struktura (<silna klasa="xfig">Ryc. 1G).</li>
		<li>Umieść kleszcze w miejscu, w którym pączek łączy się z jelitem i ściśnij w górę, aby poluzować pączek (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1G). Umyj jeden raz w nowej bańce PBS przed przeniesieniem pąka do pierwszego dołka 12-dołkowej płytki w zimnym PBS na lodzie. Powtarzać, aż wszystkie pąki zostaną zebrane z zarodków i umieszczone w pierwszym dołku płytki 12-dołkowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść 12-dołkową miskę pod mikroskopem do lekkiego wypreparowania. Policz liczbę pomyślnie wypreparowanych zawiązków trzustki, aby później obliczyć współczynnik podziału.
	<ol>
		<li>Umieść przefiltrowaną końcówkę pipety o pojemności 1 000 μl w pipecie doustnej z dołączoną rurką kapilarną. Wysterylizuj płomieniem rurkę kapilarną i utwórz zagięcie w probówce, aby ułatwić użycie. Użyj kapilary, aby przenieść pąki do drugiej studzienki zawierającej zimny roztwór dypazy przez 2 minuty przed przeniesieniem do trzeciej studzienki za pomocą czystego PBS (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1G). 
		UWAGA: Podczas przenoszenia pąków z dypazy do PBS należy unikać dotykania tkanki do końcówki rurki kapilarnej. Jeśli chusteczka utknie na końcu probówki, pipetuj w górę i w dół lub wstrząśnij czystym roztworem PBS, aż się poluzuje.</li>
		<li>Pipetuj pąki w górę iw dół i przenieś do czwartej studzienki z czystym PBS. Na koniec, za pomocą urządzenia kapilarnego, przenieś pąki do probówki o pojemności 1,5 ml z 0,05% trypsyny. Umieścić probówkę w rozgrzanym wytrząsarce o temperaturze 37 oC i wstrząsać z prędkością 1 500 obr./min przez 4 minuty.</li>
		<li>Wirować przez około 10 sekund, a następnie natychmiast umieścić probówkę w wirówce i wirować przez 5 minut w temperaturze 200 g. Ostrożnie usunąć wszystko, z wyjątkiem około 50 μl roztworu, aby nie naruszyć odwirowanych komórek (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1G).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Hodowla zdysocjowanych przodków w celu utworzenia trzustki
Uwaga: Następujące czynności powinny być wykonywane w sterylnej atmosferze w standardowym kapturze do hodowli tkankowej, przy użyciu standardowych sterylnych procedur.
<ol>
	<li>Na każdy zebrany pączek dodaj 400 μl pożywki organogenezy16,17 (Tabela 1) do odwirowanych komórek. Trzykrotnie przeprowadź wir pulsacyjny i umieść 100 μl na dołku 96-dołkowej płytki o niskim natężeniu, dzieląc pąki w stosunku 1:4 (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1G).</li>
	<li>Sprawdź pod mikroskopem, aby zwizualizować swobodnie unoszące się zdysocjowane komórki (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1H). Umieścić naczynie hodowlane w inkubatorze o temperaturze 37 oC z 5% CO2 na kołysku ze średnią prędkością.</li>
	<li>Codziennie monitoruj postęp trzustki. Wymieniaj na 100 μl świeżej pożywki co 3 dni, ostrożnie pipetując pożywkę pod mikroskopijną kontrolą w kapturze, aby usunąć, pozostawiając trzustkę w studzience. Alternatywnie, świeże 100 μl pożywki można dodać do nowego dołka i przenieść trzustkowo-trzustkową za pomocą borokrzemianowej rurki kapilarnej dołączonej do pipety doustnej i 1000 μl przefiltrowanej końcówki do pipety.</li>
</ol>
3. Przetwarzanie trzustki do obrazowania immunofluorescencyjnego
<ol>
	<li>Aby przetworzyć pankreatoidy do obrazów immunofluorescencyjnych, najpierw przygotuj 4% roztwór paraformaldehydu/PBS, pH 7,4 (PFA). Umieścić 50 μl 4% PFA w studzienkach z 96-dołkową płytką.
	<ol>
		<li>Używając borokrzemianowych probówek kapilarnych i pipety doustnej z filtrowaną końcówką pipety o pojemności 1 000 μl, przenieś trzustki z pożywki hodowlanej, pobierając jak najmniej pożywki, do świeżej studzienki z 4% PFA. Ustaw na bujaku w temperaturze pokojowej na 15 min.</li>
		<li>Przenieś pankretoidy z 4% PFA do studzienki ze 100 μl świeżego PBS, kołysz w temperaturze pokojowej przez 5 - 10 minut. Powtórz w sumie trzy świeże płukania PBS. 
		UWAGA: W tym miejscu można wstrzymać działanie protokołu, przy czym trzustki są przechowywane w 100 μl PBS w temperaturze 4 oC przez okres do jednego tygodnia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Do obrazowania całościowego (zalecane, jeśli przeciwciała są odpowiednie, alternatywne podejście w sekcji 3.3. i mikroskopia w 3.4.), przenieść z PBS do 50 μl 5% surowicy osła w 1x PBS z 0,1% detergentem niejonowym (PBST) w celu zablokowania. Kołysz przez noc w temperaturze 4 oC lub alternatywnie przez 4 godziny w temperaturze pokojowej.
	<ol>
		<li>Przenieś pankreatoidy do nowej studzienki zawierającej przeciwciała pierwszorzędowe rozcieńczone w 50 μl 5% surowicy osła w 1x PBST. Optymalnie bujać się przez 24 h w temperaturze 4 oC (co najmniej 12 h, ale do 36 h). 
		UWAGA: Przeciwciała wymienione w Tabeli materiałów przeciwko Chga (1:100), DBA (1:400), Vim (1:400) i Pdx1 (1:100) są odpowiednie do barwienia całościowego; Inne przeciwciała mogą wymagać optymalizacji.</li>
		<li>Przenieś trzustetki do studzienki zawierającej 100 μl świeżego PBST w celu umycia i rozdrobnienia przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Powtórz ten krok, aby uzyskać łącznie trzy świeże prania PBST.</li>
		<li>Przenieś trzustekosteroidy do nowej studzienki zawierającej przeciwciała drugorzędowe rozcieńczone w 50 μl 5% surowicy osła w 1x PBST. Chronić płytkę przed światłem i umieścić w temperaturze 4 oC, kołysząc się optymalnie przez 24 godziny (co najmniej 12 godzin, ale do 36 godzin). 
		UWAGA: Wszystkie przeciwciała drugorzędowe wymienione w Tabeli Materiałów i Przeciwbarwieniu jądrowym DAPI nadają się do barwienia całościowego.</li>
		<li>Przenieść trzustekoty do nowej studzienki zawierającej 100 μl 1x PBST i rozdrabniać w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Powtórzyć w sumie trzy płukania w 1x PBST. W trzecim i ostatnim praniu dodaj 300 nM DAPI.</li>
		<li>Na koniec umieścić w 100 μl czystego PBS i przechowywać w temperaturze 4 oC, chronić przed światłem przez okres do tygodnia przed obrazowaniem za pomocą mikroskopii konfokalnej, chociaż najlepsze wyniki uzyskuje się z obrazowania bezpośrednio po barwieniu. Aby zapobiec ruchowi trzustki podczas obrazowania, ale zapobiec wysuszeniu, należy umieścić każdą trzustkę w kropli PBS o objętości 20 μl. Jeśli trzustka nie pozostaje nieruchoma, zmniejsz objętość PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku skrawków mrożonych przenieść trzustki z PBS do 30% roztworu sacharozy przez noc w temperaturze 4 oC.
	<ol>
		<li>Dodaj pożywkę do zatapiania w bańce pod mikroskopem preparacyjnym. Używając kleszczy pod mikroskopijną kontrolą, namocz trzustki, delikatnie kilkakrotnie przepychając się przez podłoże do zatapiania, aby usunąć resztki sacharozy przed przeniesieniem do bloku tkankowego z zamrożonym podłożem do zatapiania.</li>
		<li>Umieścić blok tkanki na suchym lodzie do momentu zamrożenia i przeciąć na kriostacie w temperaturze 8 μm. 
		UWAGA: Skrawki mogą być przechowywane w temperaturze -80 oC lub natychmiast wybarwione immunologicznie.</li>
		<li>Pozostawić skrawki o temperaturze od -80 oC do rozmrożenia w temperaturze pokojowej przez około 5 minut, aż wyschną. Narysuj barierę hydrofobową za pomocą hydrofobowego pisaka papkowego wokół tkanki i bloku, używając 5% surowicy osła rozcieńczonej w 1x PBST przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Usunąć pożywkę i natychmiast zastąpić przeciwciałami pierwszorzędowymi rozcieńczonymi w 5% surowicy osła, rozcieńczonej w 1x PBST na noc w temperaturze 4 oC.</li>
		<li>Usuń roztwór pierwotny i przemyj chusteczki trzy razy 1x PBST przez 10 minut każda. Następnie dodać drugorzędowy roztwór przeciwciał rozcieńczony w 5% surowicy osła rozcieńczonej w 1x PBST przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i chronić szkiełka przed światłem.</li>
		<li>Usuń roztwór wtórny i umyj szkiełka trzy razy w 1x PBST przez 10 minut każda. W ostatnim praniu dodaj 300 nM DAPI.</li>
		<li>Wyjmij nośnik i dodaj nośnik montażowy oraz szkiełko nakrywkowe. Przechowywać szkiełka z dala od światła w temperaturze 4 oC, aż będą gotowe do obrazowania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Izolacja RNA z trzustki do analizy transkryptu
<ol>
	<li>Zebrać trzustki za pomocą kapilary borokrzemianowej podłączonej do pipety doustnej z przefiltrowaną końcówką pipety o pojemności 1 000 μl w celu zapewnienia sterylności i umieścić w 500 μl kwaśnego roztworu tiocyjanianu guanidyny, fenolu i chloroformu w probówce o pojemności 1,5 ml. Przechowywać w temperaturze -80 oC lub natychmiast przystąpić do izolacji RNA.</li>
	<li>W celu izolacji RNA w razie potrzeby rozmrozić próbki na lodzie i dodać 100 μl chloroformu. Dobrze odwirować i umieścić w temperaturze 4 oC na 15 min. Wstępnie schłodzić wirówkę do temperatury 4 oC.
	<ol>
		<li>Umieścić probówki w wirówce i wirować przez 20 minut w temperaturze 12 000 g w temperaturze 4 oC.</li>
		<li>Ostrożnie wyjmij rurki, aby nie zakłócać oddzielania warstw. Za pomocą pipety o pojemności 200 μl zebrać klarowny roztwór wodny i umieścić go w nowej probówce o pojemności 1,5 ml, pozostawiając niewielką ilość do buforowania z warstwy białka białego i warstwy DNA różowej. W tym procesie nie należy dotykać końcówki pipety do niczego i nie dotykać ścianek probówki o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Dodać 500 μl 100% izopropanolu do nowej probówki zawierającej warstwę wodną i wir. Pozostaw w temperaturze pokojowej na 20 minut, dłużej na lodzie lub dla maksymalnych opadów pozostaw na noc w temperaturze -20 oC.</li>
		<li>Wirować przy 12 000 g przez 15 minut w temperaturze 4 oC w celu osadzenia RNA. Usunąć izopropanol bez naruszania osadu. 
		UWAGA: Ponieważ trzustka jest mała, jest prawdopodobne, że osad nie będzie widoczny.</li>
		<li>Dodaj zimny, 75% etanol i kilkakrotnie odwróć rurkę. Umieścić w wirówce i wirować z prędkością 9.000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 oC. Usunąć etanol i wirować przez 2 minuty w temperaturze 9.000 x g.</li>
		<li>Użyj pipety o pojemności 200 μl, aby usunąć pozostały etanol z probówki, bez kontaktu z obszarem, w którym znajduje się granulka. Pozostaw otwartą nakrętkę na probówce na 5 - 10 minut w temperaturze pokojowej, aby zapewnić odparowanie resztkowego etanolu.</li>
		<li>Zawiesić osad przez wirowanie w 20 μl czystej, wolnej od nukleaz wody. 
		Opcjonalnie: Podgrzewać RNA w temperaturze 65 oC przez 3 minuty i natychmiast wrócić do lodu. RNA może być przechowywane w temperaturze -80 oC lub natychmiast wykorzystane do odwrotnej transkrypcji i qPCR.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Akkerman, N., Defize, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dawn+of+the+organoid+era%3A+3D+tissue+and+organ+cultures+revolutionize+the+study+of+development%2C+disease%2C+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Dawn of the organoid era: 3D tissue and organ cultures revolutionize the study of development, disease, and regeneration.</a> Bioessays. 39 (4), (2017).</li>
<li>Guo, T., Landsman, L., Li, N., Hebrok, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+expressed+by+murine+embryonic+pancreatic+mesenchyme+enhance+generation+of+insulin-producing+cells+from+hESCs%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Factors expressed by murine embryonic pancreatic mesenchyme enhance generation of insulin-producing cells from hESCs.</a> Diabetes. 62 (5), 1581-1592 (2013).</li>
<li>Landsman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+mesenchyme+regulates+epithelial+organogenesis+throughout+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Pancreatic mesenchyme regulates epithelial organogenesis throughout development.</a> PLoS Biology. 9 (9), 1001143(2011).</li>
<li>Lammert, E., Cleaver, O., Melton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pancreatic+differentiation+by+signals+from+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induction of pancreatic differentiation by signals from blood vessels.</a> Science. 294 (5542), 564-567 (2001).</li>
<li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5%28%2Bve%29+stem+cells+drive+self-renewal+in+the+stomach+and+build+long-lived+gastric+units+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro.</a> Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Spence, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+intestinal+tissue+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro.</a> Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).</li>
<li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).</li>
<li>Xia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+generation+of+kidney+organoids+by+differentiation+of+human+pluripotent+cells+to+ureteric+bud+progenitor-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The generation of kidney organoids by differentiation of human pluripotent cells to ureteric bud progenitor-like cells.</a> Nature Protocols. 9 (11), 2693-2704 (2014).</li>
<li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26444236">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).</li>
<li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23995685">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li>
<li>Loftus, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acinar+cell+apoptosis+in+Serpini2-deficient+mice+models+pancreatic+insufficiency%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Acinar cell apoptosis in Serpini2-deficient mice models pancreatic insufficiency.</a> PLoS Genetics. 1 (3), 38(2005).</li>
<li>Kleeff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+pancreatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Dis+Primers%22%5BJournal%5D)">Chronic pancreatitis.</a> Nat Rev Dis Primers. 3, 17060(2017).</li>
<li>Murtaugh, L. C., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes%2C+signals%2C+and+lineages+in+pancreas+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Genes, signals, and lineages in pancreas development.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 19, 71-89 (2003).</li>
<li>Greggio, C., De Franceschi, F., Figueiredo-Larsen, M., Grapin-Botton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+pancreas+organogenesis+from+dispersed+mouse+embryonic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In vitro pancreas organogenesis from dispersed mouse embryonic progenitors.</a> Journal of Visualized Experiments. (89), 51725(2014).</li>
<li>Greggio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+three-dimensional+niches+deconstruct+pancreas+development+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro.</a> Development. 140 (21), 4452-4462 (2013).</li>
<li>Sneddon, J. B., Borowiak, M., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-renewal+of+embryonic-stem-cell-derived+progenitors+by+organ-matched+mesenchyme%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-renewal of embryonic-stem-cell-derived progenitors by organ-matched mesenchyme.</a> Nature. 491 (7426), 765-768 (2012).</li>
<li>Scavuzzo, M. A., Yang, D., Borowiak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+pancreatoids+with+native+mesenchyme+develop+Insulin+producing+endocrine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Organotypic pancreatoids with native mesenchyme develop Insulin producing endocrine cells.</a> Scientific Reports. 7 (1), 10810(2017).</li>
<li>Murtaugh, L. C., Stanger, B. Z., Kwan, K. M., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+controls+multiple+steps+of+pancreatic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Notch signaling controls multiple steps of pancreatic differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (25), 14920-14925 (2003).</li>
<li>Nelson, S. B., Schaffer, A. E., Sander, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factors+Nkx6.1+and+Nkx6.2+possess+equivalent+activities+in+promoting+beta-cell+fate+specification+in+Pdx1%2B+pancreatic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The transcription factors Nkx6.1 and Nkx6.2 possess equivalent activities in promoting beta-cell fate specification in Pdx1+ pancreatic progenitor cells.</a> Development. 134 (13), 2491-2500 (2007).</li>
<li>Seymour, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX9+is+required+for+maintenance+of+the+pancreatic+progenitor+cell+pool%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">SOX9 is required for maintenance of the pancreatic progenitor cell pool.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (6), 1865-1870 (2007).</li>
<li>Kawaguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+transcriptional+regulator+Ptf1a+in+converting+intestinal+to+pancreatic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">The role of the transcriptional regulator Ptf1a in converting intestinal to pancreatic progenitors.</a> Nature Genetics. 32 (1), 128-134 (2002).</li>
<li>Hara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mice+with+green+fluorescent+protein-labeled+pancreatic+beta+-cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%3A+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells.</a> American Journal of Physiology: Endocrinology and Metabolism. 284 (1), 177-183 (2003).</li>
<li>Holthofer, H., Schulte, B. A., Spicer, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+binding+sites+for+Dolichos+biflorus+agglutinin+at+the+apical+aspect+of+collecting+duct+cells+in+rat+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Expression of binding sites for Dolichos biflorus agglutinin at the apical aspect of collecting duct cells in rat kidney.</a> Cell and Tissue Research. 249 (3), 481-485 (1987).</li>
<li>Reichert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture+and+genetic+manipulation+of+mouse+pancreatic+ductal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture and genetic manipulation of mouse pancreatic ductal cells.</a> Nature Protocols. 8 (7), 1354-1365 (2013).</li>
<li>Winkler, H., Fischer-Colbrie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chromogranins+A+and+B%3A+the+first+25+years+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The chromogranins A and B: the first 25 years and future perspectives.</a> Neuroscience. 49 (3), 497-528 (1992).</li>
<li>Burcelin, R., Knauf, C., Cani, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+alpha-cell+dysfunction+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Pancreatic alpha-cell dysfunction in diabetes.</a> Diabetes and Metabolism. 34, Suppl 2 49-55 (2008).</li>
<li>Del Prato, S., Marchetti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-+and+alpha-cell+dysfunction+in+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Hormone+and+Metabolic+Research%22%5BJournal%5D)">Beta- and alpha-cell dysfunction in type 2 diabetes.</a> Hormone and Metabolic Research. 36 (11-12), 775-781 (2004).</li>
<li>Piciucchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exocrine+pancreatic+insufficiency+in+diabetic+patients%3A+prevalence%2C+mechanisms%2C+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Exocrine pancreatic insufficiency in diabetic patients: prevalence, mechanisms, and treatment.</a> International Journal of Endocrinology. 2015, 595649(2015).</li>
<li>Campbell-Thompson, M., Rodriguez-Calvo, T., Battaglia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormalities+of+the+Exocrine+Pancreas+in+Type+1+Diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Diabetes+Reports%22%5BJournal%5D)">Abnormalities of the Exocrine Pancreas in Type 1 Diabetes.</a> Current Diabetes Reports. 15 (10), 79(2015).</li>
<li>Shivaprasad, C., Pulikkal, A. A., Kumar, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+exocrine+insufficiency+in+type+1+and+type+2+diabetics+of+Indian+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Pancreatology%22%5BJournal%5D)">Pancreatic exocrine insufficiency in type 1 and type 2 diabetics of Indian origin.</a> Pancreatology. 15 (6), 616-619 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Progresja modeli hodowli komórkowych ma kluczowe znaczenie dla prawidłowego rozwoju modelu, wytworzenia klinicznie istotnych typów komórek, przetestowania skuteczności leków, a nawet przeszczepu pacjentom. Jednak sztuczne rekapitulowanie rozwoju w potrawie jest trudne, ponieważ wciąż jesteśmy dalecy od zrozumienia mechanizmów organogenezy i fizjologii in vivo. W ten sposób komórki in vitro są generowane nieefektywnie, nie są w pełni funkcjonalne, nie są w stanie utrzymać się przez długi czas lub mają in...

Określenie mechanizmów normalnego rozwoju i fizjologii jest niezbędne do zrozumienia etiologii choroby i ostatecznie do opracowania metod leczenia. Hodowla i różnicowanie komórek macierzystych umożliwia szybką i wysokoprzepustową analizę rozwoju, jednak jest ograniczona przez istniejący zasób wiedzy na temat mechanizmów regulujących los komórek i sztucznie podsumowuje rozwój w stosunkowo jednorodnym, dwuwymiarowym stanie1,2. Na rozwój in vivo wpływają nie tylko wpływy zewnętrzne, przy czym różne typy komórek w niszy i środowisku dostarczają sygnałów parakrynnych i wsparcia organizacyjnego w kierowaniu organogenezą, ale funkcja tych komórek zależy również od ich otoczenia w celu uzyskania wskazówek3,4,5. Biorąc pod uwagę znaczenie tych zewnętrznych wskazówek, ograniczenia protokołów różnicowania i pracochłonną naturę modeli myszy in vivo, potrzebne są nowe systemy do eksperymentalnego badania podstawowych procesów rozwojowych i fizjologii.
Pojawienie się protokołów do generowania trójwymiarowych, złożonych organoidów dostarcza wygodnego i spójnego systemu do badania organogenezy, fizjologii, skuteczności leków, a nawet patogenezy. Ustalenie mysich organoidów dla różnych układów, takich jak żołądek6 i intestine7 poszerzyło naszą wiedzę na temat organogenezy, dostarczając narzędzia do badania złożoności rozwojowej z mniejszymi ograniczeniami niż modele in vivo i in vitro. Ze względu na te postępy w tworzeniu mysich organoidów i pojawienie się ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych, wyprodukowano organoidy Human intestinal8, retinal9, renal10,11, oraz cerebral12 organoidów, a ten repertuar jest ograniczony tylko przez istniejącą wiedzę na temat mechanizmów rozwoju.
Szczególnie interesujące jest generowanie organoidów trzustki, ponieważ niezliczone choroby nękają różne typy komórek trzustki, w tym komórki groniaste i przewody w zewnątrzwydzielniczej niewydolności trzustki13, komórki groniaste w zapaleniu trzustki14, oraz komórki beta w cukrzycy15. Zdobycie wiedzy na temat rozwoju tych różnych typów komórek może pomóc w zrozumieniu ich patologii, a także może służyć jako platforma do spersonalizowanych badań przesiewowych lub przeszczepów leków. Wcześniej Greggio i in. opracowali metodę tworzenia mysich organoidów trzustkowych, które podsumowują morfogenezę in vivo i rozwijają zorganizowane, trójwymiarowe, złożone struktury złożone ze wszystkich głównych typów komórek nabłonka trzustki16,17. Jest to duży krok naprzód w dziedzinie trzustki, zwłaszcza że tworzenie komórek in vitro może umożliwić biologiczne badanie rozwoju komórek beta. Jednak w tym protokole powstał niedobór komórek endokrynnych, chyba że organoidy zostały przeszczepione do tkanki, gdzie nisza mogła wchodzić w interakcje i dostarczać wskazówek instruktażowych17. Mezenchyma stanowi największą część niszy, silnie otaczając rozwijający się nabłonek od wczesnych etapów organogenezy do późniejszych etapów, w tym rozwarstwienia i różnicowania endokrynologicznego3,4,18. Interakcja mezenchymy z rozwijającą się trzustką jest kolejnym przykładem sygnalizacji zewnętrznej i znaczenia utrzymania złożoności komórkowej in vivo w badaniu organogenezy.
Tutaj opisujemy, jak wygenerować trójwymiarowe organoidy trzustkowe, zwane trzustkami, z dysocjowanych mysich progenitorów trzustki e10.5. Te trzustetki zachowują natywną mezenchymę, samoorganizują się w warunkach swobodnego pływania i generują wszystkie główne typy komórek trzustki, w tym dużą liczbę endokrynologicznych komórek beta19. Podejście to najlepiej nadaje się do analizy rozwoju układu hormonalnego, ponieważ poprzednie protokoły nie uwzględniały solidnego różnicowania endokrynologicznego. Jednak stosowanie protokołu dla organoidów trzustki, jak opisano przez Greggio i wsp., lepiej nadaje się do analizy rozgałęzień i morfogenezy nabłonka trzustki, ponieważ rozgałęzienia są bardziej ograniczone w trzustce.

<table><tbody><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Rurki aspiratora do kalibrowanych pipet mikrokapilarnych</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>BarnStead NanoPure Woda wolna od nukleaz</td><td>TermoFisher</td><td>D119</td><td></td></tr><tr><td>Borosilikarowe rurki kapilarne</td><td>Sutter Instruments</td><td>GB1007515</td><td>OD 1 mm, ID 0,75 mm, długość</td></tr> <tr><td>1,5 cmCaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>Odstraszająca komórki 96-dołkowa mikropłytka</td><td>Greiner Bio-One</td><td>650970</td><td>Wirówka z dnem w kształcie litery U</td></tr><tr><td>5424 R</td><td>Eppendorf</td><td>5401000013</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>233306</td><td></td></tr><tr><td>Chromogranina-A</td><td>Abcam</td><td>ab15160</td><td></td></tr><tr><td>Kompaktowy, modułowy mikroskop stereoskopowy M60</td><td></td> Automatyczny licznik komórek Leica <td></td><td></td></tr><tr><td>Countess</td><td>Invitrogen</td><td>C10310</td><td></td></tr><tr><td>Prowadnice licznika komórek Countess</td><td>Invitrogen</td><td>C10312</td><td></td></tr><tr><td>CryoStar NX70</td><td>ThermoFisher</td><td>957000L</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (dichlorowodorek 4',6-diamidyno-2'-fenyloindolu)</td><td>Roche</td><td>10 236 276 001</td><td>Proszek</td></tr><tr><td>Przeciwciało DBA</td><td>Vector Lab</td><td>RL-1032</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II, Proszek</td><td>Gibco</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES</td><td>Gibco</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Invitrogen</td><td>18068-015</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Kleszcze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td>0,05 x 0,02 mm; Tytan; Wskazówka biologiczna</td></tr><tr><td>EGF (naskórkowy czynnik wzrostu)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, 200 Proof</td><td>Decon Laboratories</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>Inkubatory CO2 Forma Steri Cycle</td><td>ThermoFisher</td><td>370</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>OB10001</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa heparyny z błony śluzowej jelit świń</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-10KU</td><td></td></tr><tr><td>INSM1 Przeciwciało</td><td>Santa Cruz BioTechnology</td><td>sc-271408</td><td>Poliklonalny mysi</td></tr><tr><td>izopropanol</td><td>IgG Fisher</td><td>a4164</td><td></td></tr><tr><td>Isothesia Isoflurane, USP</td><td>Henry Schein</td><td>11695-6776-2</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało insulinowe</td><td>Dako</td><td>A056401</td><td>Poliklonalna świnka morska</td></tr><tr><td>KAPA SYBR FAST Universal</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK4618</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>KaryoMax</td><td>10575090</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Zamiennik serum</td><td>Invitrogen</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SPE Wysoka rozdzielczość spektralna konfokalna</td><td>Mysz Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>442615</td><td></td></tr> Mysz <tr><td>z peptydem C ELISA</td><td>ALPCO</td><td>80-CPTMS-E01</td><td></td></tr><tr><td>Ultraczuła Insulina ELISA</td><td>ALPCO</td><td>80-INSMSU-E01</td><td></td></tr><tr><td>MX35 Ostrza mikrotomu</td><td>ThermoFisher</td><td>3052835</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3817</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica osła</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1X</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało Pdx1</td><td>DSHB</td><td>F6A11</td><td>Mysz monoklonalna MIgG1</td></tr><tr><td>Peel-A-Way Jednorazowe formy do zatapiania</td><td>VWR</td><td>15160-157</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór penicyliny i streptomycyny</td><td>Corning</td><td>MT30002CI</td><td></td></tr><tr><td>PMA (Phorbol 12-mirystynian 13- Octan)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>Białkowe probówki do mikrowirówek LoBind</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td>Pojemność 1,5 ml</td></tr><tr><td>Rekombinowane ludzkie białko FGF-10</td><td>R& D Systems</td><td>345-FG</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki FGF-kwasowy</td><td>Peprotech</td><td>100-17A</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowane ludzkie białko R-spondyny I R&</td><td> D Systems</td><td>4546-RS</td><td></td></tr><tr><td>BenchRocker</td><td>2D Benchmark</td><td>BR2000</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza 500g</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe SuperFrost Plus</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Super Pap Pen</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>71310</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer R</td><td>Eppendorf</td><td>05-412-401</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Tek O.C.T. Compound</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Odczynnik Invitrogen</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Invitrogen</td><td>12604039</td><td>(1x), bez Phenol Red</td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain</td><td>Invitrogen</td><td>15250061</td><td>Do szkiełek do liczenia komórek</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,05% )</td> <td>Corning</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,25%)</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td>Phenol Red</td></tr><tr><td>Ultra-Low Attachment 24-dołkowa płytka</td><td>Corning</td><td>3473</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Low Attachment Spheroid Plate 96-dołkowa</td><td>Corning</td><td>4520</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało Vimentin</td><td>EMD Millipore</td><td>AB5733</td><td>Poliklonalny kurczak IgY</td></tr><tr><td>Vortex Genie</td><td>BioExpres</td><td>S-7350-1</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 Dichlorowodorek</td><td>R& D Systems</td><td>1254</td><td>Znany również jako inhibitor ROCK</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny Zeiss 710</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wytwarzanie bezrusztowaniowych, trójwymiarowych trzustek eksprymujących insulinę z mysich progenitorów trzustki in vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Trzustka to złożony organ złożony z wielu różnych typów komórek, które współpracują ze sobą, aby regulować homeostazę i trawienie glukozy we krwi. Te typy komórek obejmują komórki groniaste wydzielające enzymy, arboryzowany system przewodowy odpowiedzialny za transport enzymów do jelit oraz komórki endokrynne wytwarzające hormony. 
Endokrynologiczne komórki beta to jedyny typ komórek w organizmie, który wytwarza insulinę obniżającą poziom glukozy we krwi. Cukrzyca, choroba charakteryzująca się utratą lub dysfunkcją komórek beta, osiąga rozmiary epidemii. W związku z tym konieczne jest ustanowienie protokołów do badania rozwoju komórek beta, które można wykorzystać do celów przesiewowych w celu uzyskania leku i terapii opartych na komórkach. Podczas gdy eksperymentalne badania rozwoju myszy są niezbędne, badania in vivo są pracochłonne i czasochłonne. Hodowane komórki stanowią wygodniejszą platformę do badań przesiewowych; Nie są jednak w stanie utrzymać różnorodności komórkowej, organizacji architektonicznej i interakcji komórkowych występujących in vivo. Dlatego konieczne jest opracowanie nowych narzędzi do badania organogenezy i fizjologii trzustki.
Komórki nabłonka trzustki rozwijają się w ścisłym związku z mezenchymą od początku organogenezy, gdy komórki organizują się i różnicują w złożony, fizjologicznie kompetentny organ dorosłego. Mezenchyma trzustki dostarcza ważnych sygnałów dla rozwoju układu hormonalnego, z których wiele nie jest jeszcze dobrze poznanych, a zatem trudnych do odtworzenia podczas hodowli in vitro. Tutaj opisujemy protokół hodowli trójwymiarowych, złożonych komórkowo organoidów myszy, które zatrzymują mezenchymę, zwaną trzustkami. Mysi pączek trzustki e10.5 jest preparowany, dysocjowany i hodowany w środowisku wolnym od rusztowań. Te pływające komórki samoorganizują się z mezenchymą otaczającą rozwijającą się trzustkę i dużą liczbą endokrynologicznych komórek beta rozwijających się wraz z komórkami groniastymi i przewodowymi. System ten może być używany do badania determinacji losu komórki, organizacji strukturalnej i morfogenezy, interakcji komórka-komórka podczas organogenezy lub do badania przesiewowego leku, małej cząsteczki lub genetyki.

Staranna dyssekcja zarodków myszy w stadium e10.5 z rogu macicy powinna pozwolić na uzyskanie nieuszkodzonych zarodków w PBS do dalszej dyssekcji (Rysunek 1A). Przewód pokarmowy można sprawnie usunąć z zarodka (Rysunek 1B), co umożliwia zidentyfikowanie grzbietowego pąka trzustki na połączeniu jelita i żołądka (Rysunek 1C-F). Pąk trzustki w stadium e...

Tutaj prezentujemy protokół generowania ekspresji insuliny 3D mysich trzustek z swobodnie pływających e10.5 dysocjowanych komórek progenitorowych trzustki i związanych z nimi mezenchymów.

Wytwarzanie bezrusztowaniowych, trójwymiarowych trzustek eksprymujących insulinę z mysich progenitorów trzustki in vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie trzustki, wykorzystując te trzustki do zrozumienia, w jaki sposób komórki endokrynne tworzą się w złożonym architektonicznie i komórkowo środowisku. Główną zaletą tej techniki jest to, że trzusteczki rozwijają komórki endokrynne w wyniku włączenia otaczającej mezenchymy. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały problemy, ponieważ trzustka jest bardzo mała przy e10,5.A rozwarstwienie ma kluczowe znaczenie dla tworzenia trzustki, aby uzyskać wystarczającą ilość niezanieczyszczającej tkanki. Aby przygotować się do sekcji, napełnij wiadro na lód i umieść w lodzie pojemnik z solą fizjologiczną buforowaną fosforanami. Wyczyść dwa kleszczyki z cienką końcówką i nożyczki preparacyjne 70% etanolem.W pobliżu obszaru rozwarstwiania ustaw pojemnik z co najmniej trzema borokrzemianowymi rurkami kapilarnymi, zapalniczką i przefiltrowanymi końcówkami do pipet o pojemności 1000 mikrolitrów. Następnie odpipetować co najmniej jeden mililitr 1,25 miligrama na mililitr zimnej dypazy rozcieńczonej w wysterylizowanej wodzie w drugiej studzience 12-dołkowej płytki na lodzie. Pipet PBS do pierwszego, trzeciego i czwartego dołka płytki 12-dołkowej.Odpipetuj również jeden mililitr 0,05% trypsyny do 1,5-mililitrowej tubki na lodzie. Po eutanazji ciężarnych myszy e10.5 zgodnie z wytycznymi IACUC, spryskaj brzuch 70% etanolem, aby oczyścić obszar. Następnie wykonaj nacięcie w kształcie litery V w okolicy narządów płciowych myszy za pomocą nożyczek i kleszczy i kontynuuj nacięcie aż do przepony.Ostrożnie wyciąć macicę, wykonując nacięcie w najwyższych bocznych częściach macicy, odciągając narząd w górę od myszy i podążając za tym nacięciem w dół do okolicy narządów płciowych, a następnie powtórz po przeciwnej stronie. Umieść wyciętą macicę na 10-centymetrowej szalce Petriego z zimnym PBS. Pod mikroskopem rozwarstwiającym pod światłem umieść szalkę Petriego i ostrożnie otwórz tkankę macicy, umieszczając dwa kleszcze między każdym zarodkiem i złuszczając tkankę z dala od woreczka żółtkowego.Przenieś zarodki, chwytając delikatnie woreczek żółtkowy kleszczami i umieszczając je na 10-centymetrowej szalce Petriego ze świeżym, zimnym PBS. Umieść szalkę Petriego na lodzie. Następnie umieść wiele kropli PBS na 10-centymetrowej pokrywie szalki Petriego.Użyj tych kropelek do przeniesienia zarodka podczas sekcji, gdy tkanki pozazarodkowe są usuwane, aby zapewnić widoczność. Przenieś zarodek do kropli PBS i delikatnie wyjmij go z woreczka żółtkowego za pomocą kleszczy, podczas gdy pozostałe zarodki pozostają w PBS na lodzie. Usuń głowę przed przeniesieniem zarodka do nowej kropli PBS za pomocą kleszczy, aby delikatnie zgarnąć zarodek bez uszkadzania tkanki.W nowej kropli PBS usuń cztery pąki kończyn za pomocą kleszczy. Umieść kleszcze w otworze, w którym znajdował się pączek kończyny i delikatnie rozerwij tylko najbardziej zewnętrzną tkankę z przodu. Obróć zarodek i powtórz w kierunku tylnym, zatrzymując się na zawiązku kończyny tylnej.W tym momencie przewód pokarmowy powinien być widoczny. Tylny obszar przewodu pokarmowego ma lekkie wygięcie; Włóż kleszcze za tym zgięciem w otworze między przewodem pokarmowym a obszarem kręgosłupa przy ścianie ciała. Odłącz przewód pokarmowy, pracując powoli w górę, aż do osiągnięcia najbardziej przedniego obszaru, w którym łączy się obszar serca.W kolejnych krokach bardzo ważne jest, aby unikać otaczającej tkanki w hodowli, aby nie zanieczyścić trzustki tkanką inną niż trzustka. Jeśli jednak nie złapiesz całego pączka trzustki, liczba i rozmiar trzustki ulegną pogorszeniu. Przenieś przewód pokarmowy do świeżej kropli PBS.Kontynuuj usuwanie zewnętrznej tkanki otaczającej przewód pokarmowy. Po usunięciu tej zewnętrznej tkanki pączek trzustki można uwidocznić za zawiązkami wątroby, między żołądkiem a jelitem. Następnie weź kleszcze i delikatnie uszczypnij tkankę pod wystającym pączkiem w jelicie i lekko unieś pączek trzustki.Po uszczypnięciu obszaru, w którym pączek łączy się z jelitem, pączek jest oddzielany. Umyj jeden raz w nowej bańce PBS przed przeniesieniem pąka do pierwszego dołka 12-dołkowej płytki i zimnym PBS na lodzie. Powtarzaj, aż wszystkie pąki zostaną zebrane z zarodków i umieszczone w pierwszym dołku 12-dołkowej płytki.Następnie umieść 12-dołkową miskę pod mikroskopem rozwarstwiającym. Policz liczbę pomyślnie wypreparowanych zawiązków trzustki, aby później obliczyć współczynnik podziału. Umieść przefiltrowaną końcówkę pipety o pojemności 1000 mikrolitrów w pipecie z dołączoną rurką kapilarną.Wysterylizuj płomieniem rurkę kapilarną i utwórz zagięcie w probówce, aby ułatwić użycie. Użyj kapilary, aby przenieść pąki do drugiej studzienki zawierającej zimny roztwór dypazy na dwie minuty przed przeniesieniem do trzeciej studzienki zawierającej czysty PBS. Pipetuj pąki w górę i w dół i przenieś je do czwartej studzienki zawierającej czysty PBS.Na koniec, za pomocą urządzenia kapilarnego, przenieś pąki do 1,5-mililitrowej rurki z 0,05% trypsyny. Umieść probówkę w rozgrzanym wytrząsarce o temperaturze 37 stopni Celsjusza i potrząsaj z prędkością 1 500 obr./min przez cztery do pięciu minut. Po wirowaniu przez około 10 sekund natychmiast umieść probówkę w wirówce i wiruj przez pięć minut z prędkością 200 g.Ostrożnie usuń wszystko, z wyjątkiem około 50 mikrolitrów roztworu, aby nie naruszyć odwirowanych komórek. Na każdy pączek zebrany w 400 mikrolitrach pożywki organogenezy do odwirowanych komórek, trzykrotnie wykonaj pulsacyjny wir i podaj 100 mikrolitrów na dołek 96-dołkowej płytki o niskim stopniu przylegania, dzieląc pąki w stosunku jeden do czterech. Sprawdź pod mikroskopem, aby zwizualizować zdysocjowane komórki swobodnie unoszące się w powietrzu.Następnie umieść naczynie hodowlane w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla na kołysce ze średnią prędkością. Staranna sekcja zarodków myszy w temperaturze e10,5 z rogu macicy powinna dać nieuszkodzone zarodki w PBS do dalszej sekcji. Przewód pokarmowy może być skutecznie usunięty z zarodka, co pozwala na rozpoznanie grzbietowego zawiązka trzustki na styku jelita i żołądka.W pożywkach organogenezy te swobodnie unoszące się komórki wolne od rusztowań samoorganizują się i organizują w trójwymiarowe trzustkosteroidy, które rosną i utrzymują się przez co najmniej 10 dni w hodowli. Zastosowanie aktywatora kinazy białkowej C w wysokich stężeniach zmienia morfologię rozwijających się trzustek, prowadząc do luźno powiązanych komórek nabłonkowych i zwiększonego rozgałęzienia. Dodatkowo, wykorzystanie zwierząt transgenicznych pozwala na wizualizację komórek w miarę ich różnicowania się w czasie rzeczywistym.Aby ocenić związek tkanki mezenchymy trzustki z komórkami nabłonka trzustki, można przeprowadzić barwienie immunologiczne dla markerów każdej tkanki. Barwienie immunologiczne markera przewodu za pomocą markera endokrynnego i jąder ujawnia tworzenie się wielu linii w trzustkach. Marker mezenchymiczny wybarwiony markerem progenitorowym trzustki pokazuje, że mezenchyma otacza trzustkę.Rozwój komórek beta ujawnia się poprzez barwienie markera nabłonkowego i markera komórek beta. Za pomocą ilościowej analizy PCR można ocenić transkrypty komórek progenitorowych i różnicujących się, takich jak geny progenitorowe i zróżnicowane markery. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w około godzinę, wliczając czas przygotowania, jeśli jest wykonywana prawidłowo.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić sekcję, aby uzyskać tkankę trzustki od 10,5 myszy w celu wygenerowania trzustki. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o ostrożnym usunięciu przewodu pokarmowego z zarodków, w przeciwnym razie bardzo trudno będzie znaleźć pączek trzustki. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak GSIS i ELISA, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak ilość insuliny lub peptydu C wytwarzanego po stymulacji glukozy.Po opracowaniu technika ta utorowała nam drogę do zbadania morfologicznych konsekwencji aktywacji PKC przy użyciu małych cząsteczek. Sposób na dalsze wdrożenie tego systemu do badania wpływu czynnika transkrypcyjnego ekspresji, a nawet do przeprowadzania ważnych eksperymentów epistazy.

generation-scaffold-free-three-dimensional-insulin-expressing

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opisano trójwymiarowy test kolonogenny, który pozwala progenitorom o fenotypie trzustkowym na różnicowanie się w kolonie wykazujące ekspresję insuliny. Metoda ta wykorzystuje półstałe podłoża zawierające metylocelulozę, Matrigel oraz czynniki wzrostu, w których pojedyncze komórki progenitorowe proliferują i różnicują się in vitro, co umożliwia ilościowe określenie liczby funkcjonalnych progenitorów w populacji.

Ilościowe oznaczenie progenitorów tworzących kolonie wykazujących ekspresję insuliny

W niniejszej pracy opisujemy metodę izolacji, hodowli i manipulacji embrionalną trzustką myszy. Stanowi ona doskonały system ex vivo do badania różnych aspektów rozwoju trzustki, w tym morfogenezy, różnicowania i wzrostu. Eksplanty pąka trzustki mogą być hodowane przez kilka dni i wykorzystywane w szerokim zakresie zastosowań, w tym w immunofluorescencji całych preparatów oraz obrazowaniu na żywo.

System do hodowli ex vivo trzustki embrionalnej

Metoda hodowli trójwymiarowej opisana w tym protokole podsumowuje rozwój trzustki z rozproszonych embrionalnych przodków trzustki myszy, włączając ich znaczną ekspansję, różnicowanie i morfogenezę do rozgałęzionego organu. Ta metoda jest podatna na obrazowanie, funkcjonalną ingerencję i manipulację niszą.

In vitro Organogeneza trzustki z rozproszonych przodków embrionalnych myszy

Testy kolonii in vitro do wykrywania samoodnawiania i różnicowania komórek progenitorowych wyizolowanych z dorosłej trzustki mysiej zostały opracowane. W tych testach komórki progenitorowe trzustki powodują powstawanie kolonii komórkowych w przestrzeni trójwymiarowej w półstałym podłożu zawierającym metylocelulozę. Opisano protokoły postępowania z pojedynczymi komórkami i charakterystyki poszczególnych kolonii.

In vitro Testy kolonijne do charakteryzowania trójpotencjałowych komórek progenitorowych wyizolowanych z dorosłej mysiej trzustki

Ten protokół demonstruje izolację mysich wysepek i zasiewanie ich na rusztowaniu zdecelularycznym. Wyspy trzustkowe wsparte na rusztowaniach przeszczepiono do poduszeczki tłuszczowej najądrza myszy z cukrzycą indukowaną streptozotocyną (STZ). Wyspy trzustkowe przetrwały w miejscu przeszczepu i odwróciły stan hiperglikemii.

Wspomagany rusztowaniem przeszczep wysp trzustkowych w poduszce tłuszczowej najądrza myszy z cukrzycą

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) w komórki białka homeobox 1+ trzustki/dwunastnicy (PDX1+) w celu wytworzenia linii trzustki w oparciu o jednowarstwowy wzrost pojedynczych komórek bez typu kolonijnego. Metoda ta jest odpowiednia do wytwarzania jednorodnych komórek pochodzących z hPSC, manipulacji genetycznych i badań przesiewowych.

Wydajne wytwarzanie białka homeobox trzustki/dwunastnicy 1+ w tylnym odcinku jelita przedniego/trzustki z hPSC w kulturach adhezyjnych

Obecny protokół opisuje ulepszoną metodę zwiększania koekspresji czynników transkrypcyjnych PDX1 i NKX6.1 w progenitorach trzustki pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) w płaskich monowarstwach. Osiąga się to poprzez uzupełnienie świeżej macierzy, manipulowanie gęstością komórek i dysocjację komórek endodermalnych.

Różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w prekursory komórek beta trzustki w systemie hodowli 2D

Różnicowanie komórek macierzystych w komórki wysp trzustkowych stanowi alternatywne rozwiązanie dla konwencjonalnego leczenia cukrzycy i modelowania chorób. Opisujemy szczegółowy protokół hodowli komórek macierzystych, który łączy komercyjny zestaw różnicujący z wcześniej zwalidowaną metodą, aby pomóc w wytwarzaniu wysp trzustkowych wydzielających insulinę pochodzących z komórek macierzystych w naczyniu.

Różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w klastry wysp trzustkowych wytwarzających insulinę

Ten artykuł przedstawia protokół ukierunkowanego różnicowania i analizy funkcjonalnej komórek podobnych do komórek β. Opisujemy optymalne warunki hodowli i pasażki dla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przed wytworzeniem komórek trzustki produkujących insulinę. Sześcioetapowe różnicowanie postępuje od ostatecznego tworzenia endodermy do funkcjonalnych komórek podobnych do komórek β wydzielających insulinę w odpowiedzi na glukozę.

Zoptymalizowany protokół generowania funkcjonalnych komórek wydzielających insulinę trzustkową z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Oferujemy minimalnie inwazyny protokół do domięśniowej transplantacji wyspików komórek macierzystych trzustki pochodzących z ludzkich komórek macierzystych do szczurów immunodeficytarnych w celu in vivo implantacji i dalszej analizy.

Przeszczep domięśniowy ludzkich pluripotentnych komórek macierzystych pochodzenia trzustkowego do szczurów

Poznaj metodę wytwarzania trójwymiarowych trzustek eksprymujących insulinę z mysich progenitorów trzustki e10.5. Technika ta umożliwia badanie rozwoju komórek endokrynnych w obecności mezenchymy.

Wytwarzanie bezrusztowaniowych, trójwymiarowych trzustek eksprymujących insulinę z mysich progenitorów trzustki in vitro

Przeglądaj więcej filmów