Wytwarzanie bezrusztowaniowych, trójwymiarowych trzustek eksprymujących insulinę z mysich progenitorów trzustki in vitro

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie trzustki, wykorzystując te trzustki do zrozumienia, w jaki sposób komórki endokrynne tworzą się w złożonym architektonicznie i komórkowo środowisku. Główną zaletą tej techniki jest to, że trzusteczki rozwijają komórki endokrynne w wyniku włączenia otaczającej mezenchymy. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały problemy, ponieważ trzustka jest bardzo mała przy e10,5.

A rozwarstwienie ma kluczowe znaczenie dla tworzenia trzustki, aby uzyskać wystarczającą ilość niezanieczyszczającej tkanki. Aby przygotować się do sekcji, napełnij wiadro na lód i umieść w lodzie pojemnik z solą fizjologiczną buforowaną fosforanami. Wyczyść dwa kleszczyki z cienką końcówką i nożyczki preparacyjne 70% etanolem.

W pobliżu obszaru rozwarstwiania ustaw pojemnik z co najmniej trzema borokrzemianowymi rurkami kapilarnymi, zapalniczką i przefiltrowanymi końcówkami do pipet o pojemności 1000 mikrolitrów. Następnie odpipetować co najmniej jeden mililitr 1,25 miligrama na mililitr zimnej dypazy rozcieńczonej w wysterylizowanej wodzie w drugiej studzience 12-dołkowej płytki na lodzie. Pipet PBS do pierwszego, trzeciego i czwartego dołka płytki 12-dołkowej.

Odpipetuj również jeden mililitr 0,05% trypsyny do 1,5-mililitrowej tubki na lodzie. Po eutanazji ciężarnych myszy e10.5 zgodnie z wytycznymi IACUC, spryskaj brzuch 70% etanolem, aby oczyścić obszar. Następnie wykonaj nacięcie w kształcie litery V w okolicy narządów płciowych myszy za pomocą nożyczek i kleszczy i kontynuuj nacięcie aż do przepony.

Ostrożnie wyciąć macicę, wykonując nacięcie w najwyższych bocznych częściach macicy, odciągając narząd w górę od myszy i podążając za tym nacięciem w dół do okolicy narządów płciowych, a następnie powtórz po przeciwnej stronie. Umieść wyciętą macicę na 10-centymetrowej szalce Petriego z zimnym PBS. Pod mikroskopem rozwarstwiającym pod światłem umieść szalkę Petriego i ostrożnie otwórz tkankę macicy, umieszczając dwa kleszcze między każdym zarodkiem i złuszczając tkankę z dala od woreczka żółtkowego.

Przenieś zarodki, chwytając delikatnie woreczek żółtkowy kleszczami i umieszczając je na 10-centymetrowej szalce Petriego ze świeżym, zimnym PBS. Umieść szalkę Petriego na lodzie. Następnie umieść wiele kropli PBS na 10-centymetrowej pokrywie szalki Petriego.

Użyj tych kropelek do przeniesienia zarodka podczas sekcji, gdy tkanki pozazarodkowe są usuwane, aby zapewnić widoczność. Przenieś zarodek do kropli PBS i delikatnie wyjmij go z woreczka żółtkowego za pomocą kleszczy, podczas gdy pozostałe zarodki pozostają w PBS na lodzie. Usuń głowę przed przeniesieniem zarodka do nowej kropli PBS za pomocą kleszczy, aby delikatnie zgarnąć zarodek bez uszkadzania tkanki.

W nowej kropli PBS usuń cztery pąki kończyn za pomocą kleszczy. Umieść kleszcze w otworze, w którym znajdował się pączek kończyny i delikatnie rozerwij tylko najbardziej zewnętrzną tkankę z przodu. Obróć zarodek i powtórz w kierunku tylnym, zatrzymując się na zawiązku kończyny tylnej.

W tym momencie przewód pokarmowy powinien być widoczny. Tylny obszar przewodu pokarmowego ma lekkie wygięcie; Włóż kleszcze za tym zgięciem w otworze między przewodem pokarmowym a obszarem kręgosłupa przy ścianie ciała. Odłącz przewód pokarmowy, pracując powoli w górę, aż do osiągnięcia najbardziej przedniego obszaru, w którym łączy się obszar serca.

W kolejnych krokach bardzo ważne jest, aby unikać otaczającej tkanki w hodowli, aby nie zanieczyścić trzustki tkanką inną niż trzustka. Jeśli jednak nie złapiesz całego pączka trzustki, liczba i rozmiar trzustki ulegną pogorszeniu. Przenieś przewód pokarmowy do świeżej kropli PBS.

Kontynuuj usuwanie zewnętrznej tkanki otaczającej przewód pokarmowy. Po usunięciu tej zewnętrznej tkanki pączek trzustki można uwidocznić za zawiązkami wątroby, między żołądkiem a jelitem. Następnie weź kleszcze i delikatnie uszczypnij tkankę pod wystającym pączkiem w jelicie i lekko unieś pączek trzustki.

Po uszczypnięciu obszaru, w którym pączek łączy się z jelitem, pączek jest oddzielany. Umyj jeden raz w nowej bańce PBS przed przeniesieniem pąka do pierwszego dołka 12-dołkowej płytki i zimnym PBS na lodzie. Powtarzaj, aż wszystkie pąki zostaną zebrane z zarodków i umieszczone w pierwszym dołku 12-dołkowej płytki.

Następnie umieść 12-dołkową miskę pod mikroskopem rozwarstwiającym. Policz liczbę pomyślnie wypreparowanych zawiązków trzustki, aby później obliczyć współczynnik podziału. Umieść przefiltrowaną końcówkę pipety o pojemności 1000 mikrolitrów w pipecie z dołączoną rurką kapilarną.

Wysterylizuj płomieniem rurkę kapilarną i utwórz zagięcie w probówce, aby ułatwić użycie. Użyj kapilary, aby przenieść pąki do drugiej studzienki zawierającej zimny roztwór dypazy na dwie minuty przed przeniesieniem do trzeciej studzienki zawierającej czysty PBS. Pipetuj pąki w górę i w dół i przenieś je do czwartej studzienki zawierającej czysty PBS.

Na koniec, za pomocą urządzenia kapilarnego, przenieś pąki do 1,5-mililitrowej rurki z 0,05% trypsyny. Umieść probówkę w rozgrzanym wytrząsarce o temperaturze 37 stopni Celsjusza i potrząsaj z prędkością 1 500 obr./min przez cztery do pięciu minut. Po wirowaniu przez około 10 sekund natychmiast umieść probówkę w wirówce i wiruj przez pięć minut z prędkością 200 g.

Ostrożnie usuń wszystko, z wyjątkiem około 50 mikrolitrów roztworu, aby nie naruszyć odwirowanych komórek. Na każdy pączek zebrany w 400 mikrolitrach pożywki organogenezy do odwirowanych komórek, trzykrotnie wykonaj pulsacyjny wir i podaj 100 mikrolitrów na dołek 96-dołkowej płytki o niskim stopniu przylegania, dzieląc pąki w stosunku jeden do czterech. Sprawdź pod mikroskopem, aby zwizualizować zdysocjowane komórki swobodnie unoszące się w powietrzu.

Następnie umieść naczynie hodowlane w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla na kołysce ze średnią prędkością. Staranna sekcja zarodków myszy w temperaturze e10,5 z rogu macicy powinna dać nieuszkodzone zarodki w PBS do dalszej sekcji. Przewód pokarmowy może być skutecznie usunięty z zarodka, co pozwala na rozpoznanie grzbietowego zawiązka trzustki na styku jelita i żołądka.

W pożywkach organogenezy te swobodnie unoszące się komórki wolne od rusztowań samoorganizują się i organizują w trójwymiarowe trzustkosteroidy, które rosną i utrzymują się przez co najmniej 10 dni w hodowli. Zastosowanie aktywatora kinazy białkowej C w wysokich stężeniach zmienia morfologię rozwijających się trzustek, prowadząc do luźno powiązanych komórek nabłonkowych i zwiększonego rozgałęzienia. Dodatkowo, wykorzystanie zwierząt transgenicznych pozwala na wizualizację komórek w miarę ich różnicowania się w czasie rzeczywistym.

Aby ocenić związek tkanki mezenchymy trzustki z komórkami nabłonka trzustki, można przeprowadzić barwienie immunologiczne dla markerów każdej tkanki. Barwienie immunologiczne markera przewodu za pomocą markera endokrynnego i jąder ujawnia tworzenie się wielu linii w trzustkach. Marker mezenchymiczny wybarwiony markerem progenitorowym trzustki pokazuje, że mezenchyma otacza trzustkę.

Rozwój komórek beta ujawnia się poprzez barwienie markera nabłonkowego i markera komórek beta. Za pomocą ilościowej analizy PCR można ocenić transkrypty komórek progenitorowych i różnicujących się, takich jak geny progenitorowe i zróżnicowane markery. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w około godzinę, wliczając czas przygotowania, jeśli jest wykonywana prawidłowo.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić sekcję, aby uzyskać tkankę trzustki od 10,5 myszy w celu wygenerowania trzustki. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o ostrożnym usunięciu przewodu pokarmowego z zarodków, w przeciwnym razie bardzo trudno będzie znaleźć pączek trzustki. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak GSIS i ELISA, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak ilość insuliny lub peptydu C wytwarzanego po stymulacji glukozy.

Po opracowaniu technika ta utorowała nam drogę do zbadania morfologicznych konsekwencji aktywacji PKC przy użyciu małych cząsteczek. Sposób na dalsze wdrożenie tego systemu do badania wpływu czynnika transkrypcyjnego ekspresji, a nawet do przeprowadzania ważnych eksperymentów epistazy.