Model in vitro do badania wpływu terapii fotodynamicznej za pośrednictwem kwasu 5-aminolulinowego na biofilm Staphylococcus aureus
16 kwietnia 2018
Ten manuskrypt opisuje protokół do badania przeciwbakteryjnego wpływu terapii fotodynamicznej za pośrednictwem kwasu 5-aminolewulinowego (ALA-PDT) na biofilm Staphylococcus aureus. Protokół ten może zostać wykorzystany do opracowania modelu in vitro w celu zbadania leczenia biofilmów bakteryjnych za pomocą PDT w przyszłości.
Ogólnym celem tego eksperymentu jest ocena przeciwdrobnoustrojowego wpływu kwasu pięcioaminolewulinowego lub terapii fotodynamicznej za pośrednictwem ALA na biofilm gronkowca złocistego. Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biofilmu bakteryjnego, dotyczące tego, w jaki sposób fotodynamiczna naprawa komórek może być stosowana jako alternatywne leczenie w celu kontrolowania infekcji biofilmem. Zaletą tej procedury jest to, że może być stosowana w przypadku innych bakterii przy minimalnym dostosowaniu.
Aby wytworzyć biofilm na 96-dołkowej płytce, najpierw zaszczepij jeden minus 80 stopni Celsjusza ThOD Staphylococcus aureus USA trzysta w trzech biofilmach, tworząc kliniczne kultury szczepów w indywidualnych 14-mililitrowych probówkach okrągłodennych zawierających pięć mililitrów bulionu sojowego tryptonu lub TSB, pożywki, w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem przez noc. Gdy kultury osiągną fazę stacjonarną, odwiruj komórki bakteryjne i ponownie zawiesij granulki i PBS do dwukrotnie 10 do dziewiątej jednostki tworzącej kolonię na mililitr stężenia. Rozcieńczyć te zawiesiny bakteryjne w stosunku jeden do 200 i pożywkę TSB uzupełnioną punktem zerowym pięć procent glukozy i wysiać 200 mikrolitrów komórek bakteryjnych na studzienkę do trzech dołków na szczep na grupę eksperymentalną w kulturze polistyrenowej traktowanej mikropłytką 96-dołkową przez 24 godziny inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza z tlenem, bez drżenia.
Następnego dnia delikatnie umyj studzienki trzykrotnie PBS, nie naruszając biofilmów. Następnie dodaj 200 mikrolitrów świeżo przygotowanego ALA do odpowiednich dołków doświadczalnych i umieść płytkę w temperaturze 25 stopni Celsjusza na godzinę chronioną przed światłem. Następnie naświetlaj płytkę diodą elektroluminescencyjną o natężeniu światła 100 miliwatów na centymetr kwadratowy przez godzinę.
Aby policzyć liczbę żywotnych bakterii w grupie pod koniec zabiegu fototerapii, delikatnie umyj każdą studzienkę trzy razy PBS, aby usunąć wszelkie nieprzylegające komórki. Następnie użyj końcówki pipety, aby zeskrobać przylegające bakterie z dna każdej studzienki. Pobrać komórki z każdej grupy do jednej probówki eppendorfa na warunki doświadczalne i osadzać komórki przez odwirowanie.
Ponownie zawiesić granulki w jednym mililitrze 0,25% enzymu pankreatyny i PBS na 90-minutową inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie kolejne odwirowanie. Ponownie zawiesić granulki w 200 mikrolitrach PBS i wykonać od jednego do 10 seryjnych rozcieńczeń każdej grupy, dodając pięć mikrolitrów seryjnie rozcieńczonej próbki na indywidualne płytki agarowe sojowo-tryptonowe. Następnie inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 16 godzin i policz liczbę kolonii bakteryjnych w grupie.
Aby ocenić biofilmy za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej, należy wygenerować i napromieniować biofilmy, jak pokazano. Przemyć napromieniowane biofilmy PBS i wybarwić żywe i martwe komórki odpowiednio jednym mililitrem zielonego fluorescencyjnego barwnika przepuszczalnego dla błony komórkowej jądrowej i chromosomowej prokariotycznej oraz jednym mililitrem jednego mikromolowego jodku propidyny. Po 20 minutach usuń nadmiar plamy i zobrazuj biofilmy za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej pod 63-krotnym zanurzeniem w oleju 1,4 NA.
Żywotność bakterii biofilmu zmniejsza się po podwójnym leczeniu fototerapią ALA w porównaniu z żywotnością bakterii biofilmu w grupie kontrolnej pojedynczej lub nieleczonej i wszystkich czterech badanych szczepów. Wizualizacja biofilmów za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej potwierdza to odkrycie, przy czym większość komórek z dodatnim wynikiem jodku propidyny obserwowano w grupie podwójnej terapii fototerapią ALA. Podejmując tę procedurę, należy pamiętać, że cała manipulacja bakteriami traktowanymi ALA powinna być wykonywana w ciemnościach, a z biofilmem materiału należy obchodzić się delikatnie, aby nie naruszyć powstałego biofilmu.
Wiadomość ta może być wykorzystana do zbadania przeciwdrobnoustrojowego wpływu terapii fotodynamicznej na biofilm bakteryjny in vitro przez naukowców zajmujących się infekcjami bakteryjnymi.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsza publikacja opisuje protokół badania przeciwdrobnoustrojowego działania terapii fotodynamicznej indukowanej kwasem 5-aminolewulinowym (ALA-PDT) w odniesieniu do biofilmu Staphylococcus aureus. Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biofilmu bakteryjnego dotyczące alternatywnych metod kontroli infekcji biofilmu.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Terapia fotodynamiczna
- Badania nad biofilmem
Wstęp
- Staphylococcus aureus jest powszechnym patogenem związanym z infekcjami biofilmovemi.
- Terapia fotodynamiczna (PDT) jest metodą leczenia wykorzystującą związki aktywowane światłem do zwalczania bakterii.
- Kwas 5-aminolewulinowy (ALA) jest prekursorem w syntezie fotouczulaczy stosowanych w PDT.
- Celem niniejszego badania jest opracowanie modelu in vitro do testowania ALA-PDT na biofilmach bakteryjnych.
Cel badania
- Ocena przeciwdrobnowego działania PDT zapśredniczonej przez ALA na biofilmy Staphylococcus aureus.
- Zbadanie potencjału PDT jako alternatywnej metody leczenia infekcji biofilmoveych.
- Opracowanie protokołu, który można dostosować do innych szczepów bakteryjnych.
Zastosowane metody
- Inokulacja Staphylococcus aureus w bulionie trypton-soja (TSB) w celu utworzenia biofilmu.
- Inkubacja kultur w temperaturze 37°C do osiągnięcia fazy stacjonarnej.
- Wirowanie i resuspensja komórek bakteryjnych w PBS.
- Wysiew komórek bakteryjnych na mikropłytkę 96-dołkową do terapii PDT.
Główne wyniki
- Protokół skutecznie generuje biofilmy odpowiednie do testowania ALA-PDT.
- ALA-PDT wykazało potencjalne działanie przeciwdrobnoustrojowe przeciwko biofilmom Staphylococcus aureus.
- Metodę można dostosować do innych szczepów bakteryjnych przy minimalnych modyfikacjach.
- Konieczne są dalsze badania w celu optymalizacji warunków leczenia.
Wnioski
- ALA-PDT jest obiecującym podejściem w leczeniu bakteryjnych biofilmów.
- Niniejsze badanie stanowi podstawę dla przyszłych badań nad terapią fotodynamiczną.
- Zrozumienie mechanizmów PDT może prowadzić do opracowania lepszych strategii leczenia infekcji związanych z biofilmami.
Najczęściej zadawane pytania
Zastosowanie w przemyśle
Ten model in vitro umożliwia ocenę mechanistyczną terapii fotodynamicznej (PDT) w przypadku infekcji związanych z biofilmem, co stanowi rosnące wyzwanie w opracowywaniu środków przeciwdrobnoustrojowych. Dzięki kwantyfikacji jednostek tworzących kolonie oraz wizualizacji żywotności za pomocą mikroskopii konfokalnej, test zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki, które pozwalają na wczesne ograniczenie ryzyka związanego z kandydatami na PDT na etapie odkrywania. Platforma ta wspiera walidację celów oraz identyfikację wiodących związków w strategiach przeciwbiofilmowych, co jest szczególnie istotne w przypadku Staphylococcus aureus oraz innych patogenów tworzących biofilmy.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikuje hipotezę terapeutyczną dotyczącą skuteczności ALA-PDT przeciwko biofilmom S. aureus poprzez redukcję CFU i barwienie żywotności.
- Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację celu poprzez powiązanie aktywacji fotouczulacza z mechanizmami niszczenia bakterii w kontrolowanym modelu biofilmu.
- Wartość prognostyczna: Wspiera przedkliniczne decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez wykazanie zależnych od dawki i czasu efektów przeciwdrobnoustrojowych w standaryzowanych warunkach.
Przesiewy i opracowanie testu
- Gotowość analizy: Generuje dojrzałe, powtarzalne biofilmy S. aureus w formacie 96-dołkowym, odpowiednim do wysokoprzepustowego przesiewu związków PDT.
- Wyniki ilościowe: Dostarcza liczb CFU oraz danych z mikroskopii konfokalnej jako ortogonalne odczyty do oceny aktywności związków i penetracji biofilmu.
- Ponowne wykorzystanie platformy: Możliwość adaptacji do innych szczepów bakteryjnych i fotosensybilizatorów przy minimalnych modyfikacjach protokołu, co umożliwia szerokie zastosowania w przesiewach przeciwbakteryjnych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie kliniczne: Modeluje klinicznie istotne infekcje biofilmem S. aureus, łącząc wyniki uzyskane in vitro z przedkliniczną walidacją środków przeciwdrobnoustrojowych opartych na PDT.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Wyjaśnia mechanizm PDT za pomocą barwienia żywe/martwe, zmniejszając niejednoznaczność w zakresie szlaków eliminacji biofilmu.
- Ciągłość translacyjna: Wspiera decyzje dotyczące dalszego rozwoju, dostarczając powtarzalnych danych o hamowaniu biofilmu w wielu szczepach i powtórzeniach doświadczalnych.
Integracja rurociągów i przepływów pracy
Test ten wpisuje się w kontinuum odkrywania leków przeciwbakteryjnych, obejmujące etapy od walidacji celu, poprzez optymalizację związku wiodącego, aż po przedkliniczne badanie skuteczności, w szczególności w przypadku metod ukierunkowanych na biofilm.
- Biologia odkrywcza: Testowanie hipotez mechanistycznych dotyczących indukowanego PDT rozbicia biofilmu i utraty żywotności bakterii w modelu istotnym fizjologicznie.
- Przesiewanie: Umożliwia standaryzowaną ocenę fotouczulaczy i parametrów dawki światła pod kątem aktywności przeciwbiofilmowej.
- Analityka: Dostarcza wskaźników redukcji CFU oraz żywotności opartych na fluorescencji w celu porównania warunków zabiegu i wyznaczenia zależności struktura-aktywność.
- Badania translacyjne: Łączy hamowanie biofilmu in vitro z modelami skuteczności przedklinicznej poprzez mierzalne i powtarzalne punkty końcowe.
- Zastosowania w przedsiębiorstwach: Ustanawia modułową platformę PDT dla biofilmu, stosowalną w przypadku wielu patogenów i chemotypów fotouczulaczy.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w interakcjach PDT-biofilm poprzez bezpośrednią wizualizację i kwantyfikację eliminacji bakterii.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ustandaryzowany, chroniony przed światłem przepływ pracy z określonymi etapami inkubacji, naświetlania i odczytu, co umożliwia powtarzalność wyników między laboratoriami.
- Wartość strategiczna: Zwiększa pewność w podejmowaniu decyzji o kontynuacji (go/no-go) w przypadku kandydatów do PDT poprzez dostarczenie wczesnych danych o skuteczności w klinicznie istotnym modelu biofilmu.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację programów PDT z uwzględnieniem ryzyka poprzez identyfikację związków wykazujących udowodnioną zdolność penetracji biofilmu oraz aktywność przeciwdrobnoustrojową.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w technikach mikrobiologicznych, hodowli biofilmów oraz protokołach bezpieczeństwa fotobiologicznego.
- Zależne od sprzętu do kontrolowanej ekspozycji na światło (np. miernika natężenia promieniowania LED) oraz mikroskopii fluorescencyjnej lub czytnika płytek do odczytów CFU i obrazowania.
- Wymaga standaryzacji przygotowania ALA, czasu inkubacji oraz dostarczania światła we wszystkich grupach eksperymentalnych w celu zapewnienia powtarzalności.
- Adaptacja do innych szczepów bakteryjnych może wymagać optymalizacji warunków tworzenia biofilmu i wydajności pobierania fotouczulacza.
- Ograniczenie praktyczne: podatność biofilmu może różnić się w zależności od fazy wzrostu i składu macierzy, co wymaga zastosowania dokładnych kontroli w badaniach porównawczych.
