Model in vitro do badania wpływu terapii fotodynamicznej za pośrednictwem kwasu 5-aminolulinowego na biofilm Staphylococcus aureus

Ogólnym celem tego eksperymentu jest ocena przeciwdrobnoustrojowego wpływu kwasu pięcioaminolewulinowego lub terapii fotodynamicznej za pośrednictwem ALA na biofilm gronkowca złocistego. Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biofilmu bakteryjnego, dotyczące tego, w jaki sposób fotodynamiczna naprawa komórek może być stosowana jako alternatywne leczenie w celu kontrolowania infekcji biofilmem. Zaletą tej procedury jest to, że może być stosowana w przypadku innych bakterii przy minimalnym dostosowaniu.

Aby wytworzyć biofilm na 96-dołkowej płytce, najpierw zaszczepij jeden minus 80 stopni Celsjusza ThOD Staphylococcus aureus USA trzysta w trzech biofilmach, tworząc kliniczne kultury szczepów w indywidualnych 14-mililitrowych probówkach okrągłodennych zawierających pięć mililitrów bulionu sojowego tryptonu lub TSB, pożywki, w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem przez noc. Gdy kultury osiągną fazę stacjonarną, odwiruj komórki bakteryjne i ponownie zawiesij granulki i PBS do dwukrotnie 10 do dziewiątej jednostki tworzącej kolonię na mililitr stężenia. Rozcieńczyć te zawiesiny bakteryjne w stosunku jeden do 200 i pożywkę TSB uzupełnioną punktem zerowym pięć procent glukozy i wysiać 200 mikrolitrów komórek bakteryjnych na studzienkę do trzech dołków na szczep na grupę eksperymentalną w kulturze polistyrenowej traktowanej mikropłytką 96-dołkową przez 24 godziny inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza z tlenem, bez drżenia.

Następnego dnia delikatnie umyj studzienki trzykrotnie PBS, nie naruszając biofilmów. Następnie dodaj 200 mikrolitrów świeżo przygotowanego ALA do odpowiednich dołków doświadczalnych i umieść płytkę w temperaturze 25 stopni Celsjusza na godzinę chronioną przed światłem. Następnie naświetlaj płytkę diodą elektroluminescencyjną o natężeniu światła 100 miliwatów na centymetr kwadratowy przez godzinę.

Aby policzyć liczbę żywotnych bakterii w grupie pod koniec zabiegu fototerapii, delikatnie umyj każdą studzienkę trzy razy PBS, aby usunąć wszelkie nieprzylegające komórki. Następnie użyj końcówki pipety, aby zeskrobać przylegające bakterie z dna każdej studzienki. Pobrać komórki z każdej grupy do jednej probówki eppendorfa na warunki doświadczalne i osadzać komórki przez odwirowanie.

Ponownie zawiesić granulki w jednym mililitrze 0,25% enzymu pankreatyny i PBS na 90-minutową inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie kolejne odwirowanie. Ponownie zawiesić granulki w 200 mikrolitrach PBS i wykonać od jednego do 10 seryjnych rozcieńczeń każdej grupy, dodając pięć mikrolitrów seryjnie rozcieńczonej próbki na indywidualne płytki agarowe sojowo-tryptonowe. Następnie inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 16 godzin i policz liczbę kolonii bakteryjnych w grupie.

Aby ocenić biofilmy za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej, należy wygenerować i napromieniować biofilmy, jak pokazano. Przemyć napromieniowane biofilmy PBS i wybarwić żywe i martwe komórki odpowiednio jednym mililitrem zielonego fluorescencyjnego barwnika przepuszczalnego dla błony komórkowej jądrowej i chromosomowej prokariotycznej oraz jednym mililitrem jednego mikromolowego jodku propidyny. Po 20 minutach usuń nadmiar plamy i zobrazuj biofilmy za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej pod 63-krotnym zanurzeniem w oleju 1,4 NA.

Żywotność bakterii biofilmu zmniejsza się po podwójnym leczeniu fototerapią ALA w porównaniu z żywotnością bakterii biofilmu w grupie kontrolnej pojedynczej lub nieleczonej i wszystkich czterech badanych szczepów. Wizualizacja biofilmów za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej potwierdza to odkrycie, przy czym większość komórek z dodatnim wynikiem jodku propidyny obserwowano w grupie podwójnej terapii fototerapią ALA. Podejmując tę procedurę, należy pamiętać, że cała manipulacja bakteriami traktowanymi ALA powinna być wykonywana w ciemnościach, a z biofilmem materiału należy obchodzić się delikatnie, aby nie naruszyć powstałego biofilmu.

Wiadomość ta może być wykorzystana do zbadania przeciwdrobnoustrojowego wpływu terapii fotodynamicznej na biofilm bakteryjny in vitro przez naukowców zajmujących się infekcjami bakteryjnymi.