Name: Interakcja roślina-mikroorganizm: odpowiedź transkrypcyjna Bacillus mycoides na wysięki z korzeni ziemniaka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Poznaj metodę analizy transkryptomicznej odpowiedzi Bacillus mycoides na wysięki z korzeni ziemniaka. Protokół pozwala identyfikować kluczowe geny bakteryjne zaangażowane w interakcje roślina-mikroorganizm, z zastosowaniem do różnych endofitów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Jakobowi Vielowi za jego pomocne komentarze i sugestie. Dziękujemy również Anne de Jong za pomoc w analizie bioinformatycznej. Yanglei Yi i Zhibo Li są wspierani przez Chińską Radę Stypendialną (CSC). Dziękujemy NWO-TTW Perspectief Programma Back2Roots (TKI-AF-15510) za wsparcie finansowe dla OPK.

1. Kiełkujący ziemniak w warunkach sterylizacji
<ol>
	<li>Opłucz powierzchnię ziemniaka sterylną wodą. Kąpać ziemniaki w 70% etanolu, a następnie w 3% podchlorynie sodu, przez 5 minut każde. Spłucz go ponownie sterylną wodą, aby usunąć pozostały podchloryn sodu.</li>
	<li>Przygotuj materiały potrzebne do kiełkowania i uprawy bulw ziemniaka; wysterylizuj plastikowe doniczki, kosze do szczepienia, wermikulit i wodę, sterylizując je w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 20 min. 
	UWAGA: Upewnij się, że wszystkie użyte materiały nadają się do sterylizacji w autoklawie. W przeciwnym razie użyj innych metod sterylizacji.</li>
	<li>Włóż wysterylizowanego powierzchniowo ziemniaka do kosza do szczepienia i umieść go w autoklawowanym doniczce zawierającej mokry wermikulit.</li>
	<li>Przechowywać garnek w komorze klimatycznej w temperaturze 24 °C przez trzy tygodnie. Ustaw go na cykle 16 godzin światła (120 μmol m-2 s-1) i 8 godzin ciemności. Aby uniknąć zanieczyszczeń mikrobiologicznych, użyj dużego pudełka z włókna szklanego do przykrycia doniczki.</li>
</ol>
2. Zbieranie wysięków z korzenia ziemniaka
<ol>
	<li>Gdy pędy wykiełkują, przenieś kosz z całym ziemniakiem do wysterylizowanej zlewki wypełnionej 150 ml autoklawowanej wody dejonizowanej, z bulwami ziemniaka umieszczonymi tuż nad powierzchnią wody i korzeniami zanurzonymi w wodzie (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1). Trzymaj sadzonkę w komorze klimatycznej i używaj tych samych ustawień co poprzednio [24 °C; cykle po 16 godzin światła (120 μmol m-2 s-1), 8 godzin ciemności].</li>
	<li>Od drugiego dnia należy zbierać wodę zawierającą wysięk i ponownie napełniać zlewkę sterylną wodą dejonizowaną. Pobieranie próbek należy wykonywać codziennie do siódmego dnia po przeniesieniu sadzonki.</li>
	<li>Każdą próbkę należy przechowywać oddzielnie w temperaturze 4 °C. Dla każdej próbki rozprowadź 100 μl na płytce agarowej Luria-Bertani (LB; 1% trypton, 0,5% ekstrakt drożdżowy, 0,5% NaCl), aby sprawdzić, czy nie ma zanieczyszczeń mikrobiologicznych. Wyrzucić zanieczyszczone próbki.</li>
	<li>Połączyć pobrane próbki z jednej sadzonki i zagęścić je poprzez liofilizację w temperaturze -40 °C do końcowej objętości 150 ml.</li>
</ol>
3. Rozwój bakterii
<ol>
	<li>Szczep B. mycoides należy przesiać z bulionu glicerolu o temperaturze -80 °C na płytkę agarową LB i inkubować płytkę w temperaturze 30 °C przez noc.</li>
	<li>Zaszczepić płynną pożywkę LB pojedynczą kolonią z płytki i hodować kulturę w inkubatorze z wytrząsaniem z prędkością 200 obr./min przez noc w temperaturze 30 °C.</li>
</ol>
4. Leczenie i pobieranie próbek bakterii
<ol>
	<li>Aby porównać krzywą wzrostu bakterii traktowanych wysiękami korzeniowymi z kontrolą ujemną, należy przygotować serię kolb zawierających 50 ml płynnego podłoża LB. Dodać 0,5 ml nocnej kultury bakteryjnej do wszystkich kolb i dodać odpowiednio 0%, 5%, 10% lub 15% (v/v) wysięk z korzeni lub sterylną wodę dejonizowaną do pożywki.</li>
	<li>Użyj kultury z wodą dejonizowaną zamiast wysięków korzeniowych jako kontroli. Następnie mierzyć gęstość optyczną przy 600 nm (OD600) co 1 godzinę. Wygeneruj krzywą wzrostu, wykreślając wartości OD600 w funkcji czasu. 
	UWAGA: Zaobserwowaliśmy, że 10% wysięków korzeniowych nie wpłynęło na wzrost B. mycoides (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 2); stosunek ten został wykorzystany w eksperymentach z sekwencją RNA.</li>
	<li>Rozcieńczyć nocną kulturę B. mycoides 90 ml wstępnie podgrzanej pożywki LB do początkowej OD600 ~ 0,05 w kolbie o pojemności 300 ml. Dodać 10 ml wysięku korzeniowego do kultury i inkubować w temperaturze 30 °C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Użyj 10 ml sterylnej wody dejonizowanej jako kontroli. Zebrać komórki z hodowli przez odwirowanie w temperaturze 9 000 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i natychmiast zamrozić osad w ciekłym azocie, a następnie przechowywać go w temperaturze -80 °C do momentu użycia.</li>
</ol>
5. Izolacja RNA
UWAGA: Przed rozpoczęciem izolacji, przygotuj stół warsztatowy, stojaki i pipety, czyszcząc je roztworem do dekontaminacji RNazy (zobacz Tabelę Materiałów). Przez cały czas noś rękawiczki i upewnij się, że wszystkie rurki, końcówki i roztwory są wolne od RNaz. Jeśli to możliwe, próbki należy zawsze przechowywać na lodzie.
<ol>
	<li>Dodaj 0,1% (v/v) pirowęglanu dietylu (DEPC) do ultraczystej wody (100 μl DEPC na 100 ml roztworu), dobrze wymieszaj i przechowuj w temperaturze pokojowej przez noc. Mieszaninę należy sterylizować w autoklawie, aby dezaktywować DEPC po całonocnym leczeniu. Użyj tej ultraczystej wody uzdatnionej DEPC do przygotowania buforu TE [10 mM Tris-HCl (pH = 8); 1 mM EDTA] i 10% roztworu SDS (w/v).</li>
	<li>Rozmrozić granulki komórek na lodzie i zawiesić je w 400 μl buforu TE (DEPC). Przenieść zawiesiny do probówek z nakrętką o pojemności 2 ml.</li>
	<li>Zmieszać 300 μl alkoholu chloroformowo-izoamylowego (24:1 v/v) i 300 μl fenolu (fenol kwasowy, klasa RNA) i odstawić mieszaninę na 5 minut. Weź 500 μl górnej fazy organicznej, aby dodać ją do zawieszonych komórek. Następnie do probówki dodaj 50 μl 10% SDS i 0,5 g kulek szklanych (0,5 μm).</li>
	<li>Mocno zamknij nakrętkę i umieść probówkę w homogenizatorze z młynkiem perełkowym (patrz Tabela materiałów). Wykonaj homogenizację impulsową trwającą 3× 45 s z 1-minutowym odstępem na lodzie.</li>
	<li>Odwirować próbki przez 10 minut w temperaturze 11 000 x g (4 °C) i przenieść górną fazę do nowej probówki.</li>
	<li>Dodać 500 μl alkoholu chloroformowo-izoamylowego (24:1) do górnej fazy z kroku 5.5 i odwirować mieszaninę przez 5 minut w temperaturze 11 000 x g (4 °C). 
	UWAGA: Poniższe kroki zostały zmodyfikowane na podstawie instrukcji producenta komercyjnego zestawu do izolacji RNA na bazie filtra z włókna szklanego (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Przenieść 500 μl górnej fazy do świeżej probówki, dodać 2 objętości (1 ml) buforu do lizy/wiązania i wymieszać pipetując w górę i w dół.</li>
	<li>Połączyć probówki filtrujące i zbiorcze (z zestawu do izolacji RNA) i odpipetować mieszaninę z kroku 5.7 do probówki filtrującej. Odwirować probówki przez 15 s przy 8 000 x g i odrzucić przepływ.</li>
	<li>Przygotować probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml ze 100 μl buforu DNazy, 10 μl DNazy I i 5 μl inhibitora RNazy (patrz tabela materiałów). Dodać przygotowaną mieszaninę roztworu na filtr rurki filtracyjnej i inkubować przez 20 - 30 minut w temperaturze 15-25 °C.</li>
	<li>Czynności prania należy wykonywać zgodnie z instrukcją producenta. Użyj 50 μl buforu elucyjnego do elucji RNA.</li>
	<li>Zachowaj eluowany RNA w temperaturze -80 °C i umieść wokół niego plastikową folię parafinową. W tym samym czasie przenieś kilka mikrolitrów próbki do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml w celu przeprowadzenia kontroli jakości.</li>
</ol>
6. Kontrola jakości RNA i sekwencjonowanie
<ol>
	<li>Sprawdź RNA za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego. 
	UWAGA: Współczynniki absorbancji przy 260/280 powinny być powyżej 1,8, a proporcje przy 260/230 powinny być wyższe niż co najmniej 1,8, najlepiej powyżej 2,0.</li>
	<li>Uruchom oczyszczony RNA w automatycznym przyrządzie do elektroforezy, korzystając z zalecanego zestawu do analizy RNA (patrz Tabela materiałów); liczba integralności RNA (RIN) musi być co najmniej wyższa niż 7, aby kontynuować.</li>
	<li>Użyj całkowitej ilości 3 μg RNA na próbkę, aby wygenerować biblioteki z zestawem do przygotowania biblioteki RNA-Seq (patrz Tabela materiałów) zgodnie z zaleceniami producenta. 
	UWAGA: Przygotowania biblioteki zostały zsekwencjonowane na platformie sekwencjonowania o wysokiej przepustowości i wygenerowano odczyty sparowanych końców.</li>
</ol>
7. Analiza danych za pomocą internetowego potoku T-REx
<ol>
	<li>Wykonaj filtrowanie jakości za pomocą FASTX-Toolkit w wersji 0.0.13 (wyniki jakości Phred > 20). Przytnij surowe odczyty RNA-Seq z sekwencji adaptera za pomocą narzędzia Trimmomatic. 
	UWAGA: Wszystkie dalsze analizy opierały się na czystych danych o wysokiej jakości.</li>
	<li>Pobierz bazę danych genomu NCBI B. mycoides ATCC 6462 (numer dostępu do NCBI: CP009692.1) i użyj jej jako genomu referencyjnego do mapowania czystych odczytów za pomocą Bowtie2/2.2.3.</li>
	<li>Użyj HTSeq v0.6.1, aby policzyć liczby odczytów zmapowanych do każdego genu oraz odczyty na kilobazę transkryptu na milion zmapowanych odczytów (RPKM) każdego genu na podstawie długości genu i liczby odczytów zmapowanych na ten gen</li>.
	<li>Do analizy danych za pomocą potoku T-REx należy użyć tabeli RPKM jako danych wejściowych, a także trzech plików opisowych: (i) pliku czynników do opisania eksperymentu w czynnikach, (ii) pliku kontrastów do określenia, które czynniki będą porównywane pod kątem różnicowej ekspresji genów oraz (iii) pliku klas do opisania grup genów będących przedmiotem zainteresowania. 
	UWAGA: Pliki opisowe są in.txt formatu. Przykłady można znaleźć na stronie internetowej T-REx (http://genome2d.molgenrug.nl/). Szczegółową instrukcję analizy danych za pomocą T-REx można znaleźć w poprzedniej publikacji de Jong i wsp.14.</li>
</ol>

<ol><li>Haichar, F. eZ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+host+habitat+and+root+exudates+shape+soil+bacterial+community+structure%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%3A+Multidisciplinary+Journal+of+Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Plant host habitat and root exudates shape soil bacterial community structure.</a> The ISME Journal: Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 2 (12), 1221-1230 (2008).</li>
<li>Badri, D. V., Vivanco, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+function+of+root+exudates%5BTitle%5D)+AND+%22Plant%2C+Cell+%26+Environment%22%5BJournal%5D)">Regulation and function of root exudates.</a> Plant, Cell & Environment. 32 (6), 666-681 (2009).</li>
<li>Rohrbacher, F., St-Arnaud, M. <a target="_blank" href="http://www.mdpi.com/2073-4395/6/1/19">Root exudation: the ecological driver of hydrocarbon rhizoremediation.</a> Agronomy Journal. 6 (1), 19(2016).</li>
<li>Mark, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+profiling+of+bacterial+responses+to+root+exudates+identifies+genes+involved+in+microbe-plant+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transcriptome profiling of bacterial responses to root exudates identifies genes involved in microbe-plant interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (48), 17454-17459 (2005).</li>
<li>Fan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+profiling+of+Bacillus+amyloliquefaciens+FZB42+in+response+to+maize+root+exudates%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic profiling of Bacillus amyloliquefaciens FZB42 in response to maize root exudates.</a> BMC Microbiology. 12 (1), 116(2012).</li>
<li>Yoshitomi, K. J., Shann, J. R. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S003807170100102X">Corn (Zea mays L.) root exudates and their impact on 14C-pyrene mineralization.</a> Soil Biology and Biochemistry. 33 (12), 1769-1776 (2001).</li>
<li>Lambert, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clover+root+exudate+produces+male-biased+sex+ratios+and+accelerates+male+metamorphic+timing+in+wood+frogs%5BTitle%5D)+AND+%22Royal+Society+Open+Science%22%5BJournal%5D)">Clover root exudate produces male-biased sex ratios and accelerates male metamorphic timing in wood frogs.</a> Royal Society Open Science. 2 (12), (2015).</li>
<li>Tuason, M. M. S., Arocena, J. M. <a target="_blank" href="http://www.nrcresearchpress.com/doi/abs/10.4141/CJSS08021">Root organic acid exudates and properties of rhizosphere soils of white spruce (Picea glauca) and subalpine fir (Abies lasiocarpa).</a> Canadian Journal of Soil Science. 89 (3), 287-300 (2009).</li>
<li>Grayston, S. J., Vaughan, D., Jones, D. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0929139396001266">Rhizosphere carbon flow in trees, in comparison with annual plants: the importance of root exudation and its impact on microbial activity and nutrient availability.</a> Applied Soil Ecology. 5 (1), 29-56 (1997).</li>
<li>Rovira, A. D. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF02859887">Plant root exudates.</a> Botanical Review. 35 (1), 35-57 (1969).</li>
<li>Bargabus, R. L., Zidack, N. K., Sherwood, J. E., Jacobsen, B. J. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0885576503904437">Characterisation of systemic resistance in sugar beet elicited by a non-pathogenic, phyllosphere-colonizing Bacillus mycoides, biological control agent.</a> Physiological and Molecular Plant Pathology. 61 (5), 289-298 (2002).</li>
<li>Peng, Y. -H., et al. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s41348-017-0110-z">Inhibition of cucumber Pythium damping-off pathogen with zoosporicidal biosurfactants produced by Bacillus mycoides.</a> Journal of Plant Diseases and Protection. 124 (5), 481-491 (2017).</li>
<li>Ambrosini, A., et al. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/aab.12245/abstract">Diazotrophic bacilli isolated from the sunflower rhizosphere and the potential of Bacillus mycoides B38V as biofertiliser.</a> Annals of Applied Biology. 168 (1), 93-110 (2016).</li>
<li>de Jong, A., van der Meulen, S., Kuipers, O. P., Kok, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-REx%3A+transcriptome+analysis+webserver+for+RNA-seq+expression+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">T-REx: transcriptome analysis webserver for RNA-seq expression data.</a> BMC Genomics. 16 (1), 663(2015).</li>
<li>Yi, Y., de Jong, A., Frenzel, E., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+transcriptomics+of+Bacillus+mycoides+strains+in+response+to+potato-root+exudates+reveals+different+genetic+adaptation+of+endophytic+and+soil+isolates%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Comparative transcriptomics of Bacillus mycoides strains in response to potato-root exudates reveals different genetic adaptation of endophytic and soil isolates.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1487(2017).</li>
<li>Nwokeoji, A. O., Kilby, P. M., Portwood, D. E., Dickman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNASwift%3A+a+rapid%2C+versatile+RNA+extraction+method+free+from+phenol+and+chloroform%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">RNASwift: a rapid, versatile RNA extraction method free from phenol and chloroform.</a> Analytical Biochemistry. 512, 36-46 (2016).</li>
<li>Ramirez-Gonzalez, R. H., Bonnal, R., Caccamo, M., MacLean, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-samtools%3A+Ruby+bindings+for+SAMtools%2C+a+library+for+accessing+BAM+files+containing+high-throughput+sequence+alignments%5BTitle%5D)+AND+%22Source+Code+for+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Bio-samtools: Ruby bindings for SAMtools, a library for accessing BAM files containing high-throughput sequence alignments.</a> Source Code for Biology and Medicine. 7 (1), 6(2012).</li>
<li>Quinlan, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BEDTools%3A+the+Swiss-army+tool+for+genome+feature+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BEDTools: the Swiss-army tool for genome feature analysis.</a> Current Protocols in Bioinformatics. , (2014).</li>
<li>Boria, I., Boatti, L., Pesole, G., Mignone, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NGS-trex%3A+next+generation+sequencing+transcriptome+profile+explorer%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">NGS-trex: next generation sequencing transcriptome profile explorer.</a> BMC Bioinformatics. 14 (7), S10(2013).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Przypuszcza się, że interakcje między roślinami a mikroorganizmami są determinowane przez precyzyjnie dostrojoną równowagę między bakteriami a roślinami. Takie interakcje są bardzo złożone i trudne do zbadania w naturalnym systemie, który obejmuje różne gatunki drobnoustrojów, potencjalnie działające jako konsorcja. W artykule opisano uproszczony protokół badania odpowiedzi bakterii na wysięki korzeniowe w dobrze kontrolowanych warunkach. Profil transkryptomu ryzobakterii, po ekspozycji na wysięki korzeniowe, dostarcza s...

Rośliny mogą wydzielać do 20% węgla związanego podczas fotosyntezy przez korzenie do ryzosfery1, tj. wąska strefa gleby w pobliżu korzeni. Ze względu na większą dostępność składników odżywczych ryzosfera jest odpowiednim siedliskiem dla różnych mikroorganizmów, w tym bakterii wspomagających wzrost roślin. Wysięki korzeniowe zawierają szereg związków nieorganicznych, takich jak jony, kwasy nieorganiczne, tlen i woda. Jednak większość wysięków korzeniowych jest tworzona przez materiały organiczne, które można podzielić na związki o niskiej masie cząsteczkowej i związki o dużej masie cząsteczkowej. Związki o niskiej masie cząsteczkowej obejmują aminokwasy, kwasy organiczne, cukry, związki fenolowe, kwasy tłuszczowe i szereg metabolitów wtórnych. Związki o dużej masie cząsteczkowej składają się ze śluzu i białek2,3. Mikroorganizmy ryzosfery mogą wykorzystywać niektóre z tych związków jako źródło energii do wzrostu i rozwoju. Wysięki korzeniowe odgrywają ważną rolę w kształtowaniu społeczności ryzobakterii, ponieważ związki wytwarzane przez rośliny w wysiękach mogą wpływać na zachowanie bakterii związanych z ryzosferą, wpływając na ekspresję określonych genów.
Zrozumienie reakcji bakterii na wysięki korzeniowe jest kluczowym krokiem w rozszyfrowaniu mechanizmów interakcji roślina-mikroorganizm. Ponieważ odpowiedź bakterii na interakcje roślina-mikroorganizm jest produktem zróżnicowanej ekspresji genów, można ją badać za pomocą analizy transkryptomu. Korzystając z tej metody, wcześniejsze badania zidentyfikowały kilka ważnych genów zaangażowanych w interakcje między roślinami a mikroorganizmami. U Pseudomonas aeruginosa wykazano, że geny zaangażowane w metabolizm, chemotaksję i wydzielanie typu II reagują na wysięki z korzenia buraka cukrowego4. Fan i wsp. 5 badał profilowanie transkryptomiczne B. amyloliquefaciens FZB42 w odpowiedzi na wysięki z korzeni kukurydzy. Ich wyniki pokazują, że spośród genów silnie indukowanych przez wysięki korzeniowe, kilka grup jest zaangażowanych w szlaki metaboliczne związane z wykorzystaniem składników odżywczych, chemotaksją, ruchliwością i nierybosomalną syntezą peptydów przeciwdrobnoustrojowych i poliketydów.
Dokładność tych badań zależy od zbioru wysięków korzeniowych. Chociaż kilka metod opisało zbieranie wysięków korzeniowych do różnych celów, albo wymagają one wyrafinowanych instrumentów, albo nie są wykonywane w dobrze kontrolowanych warunkach6,7,8. Co więcej, mikroorganizmy hamujące ryzosferę mogą wpływać na skład wysięku korzeniowego, wpływając na przepuszczalność błony komórkowej roślin i uszkadzając tkanki korzeniowe, szczególnie w przypadku konsorcjów mikroorganizmów9. Badając reakcję mikrobiologiczną na wysięki korzeniowe, ważne jest, aby używać dobrze zdefiniowanych warunków, aby uniknąć zmiany związków przez inne mikroorganizmy10. Ponadto do badań transkryptomu opartych na sekwencji RNA wymagana jest wysokiej jakości RNA. Jednak w przypadku szczepów niebędących modelami bakteryjnymi, standardowe protokoły lub zestawy komercyjne zwykle mają niską skuteczność ze względu na nieznane czynniki lub specjalne właściwości wzrostu.
Opisany tutaj protokół został zweryfikowany przy użyciu B. mycoides, który jest Gram-dodatnim, tworzącym przetrwalniki bakterią z gromady Firmicute. Jest wszechobecny w ryzosferze różnych gatunków roślin. Dla tego gatunku opisano kilka właściwości wspomagających wzrost roślin, w tym indukcję systematycznej odporności (ISR) u buraka cukrowego11, hamowanie patogenu Pythium dla ogórka12, a także wiązanie azotu w ryzosferze słonecznika13. Jednak mechanizmy molekularne jego interakcji z rośliną żywicielską nie są dobrze zbadane.
Celem prezentowanych tutaj eksperymentów jest zbadanie transkryptomicznej odpowiedzi izolowanych przez endosferę B. mycoides na wysięki z korzeni ziemniaka. Krótko mówiąc, protokół składa się z następujących kroków: najpierw zbierz wysięki z korzeni ziemniaków w sterylnych warunkach. Następnie wyekstrahuj wysokiej jakości RNA z komórek bakteryjnych potraktowanych wysiękami korzeniowymi. Ostatnim krokiem jest analiza danych przy użyciu internetowego potoku T-REx14. Protokół ten został wykorzystany do identyfikacji genów B. mycoides, które wykazują zmianę poziomów ekspresji w kontakcie z wysiękami korzeniowymi, a tym samym mogą odgrywać ważną rolę w interakcjach między roślinami a mikroorganizmami.

<table><tbody><tr><td>podchloryn sodu</td><td>Sigma</td><td>&nbsp; CAS: 7681-52-9&nbsp;</td><td>10-15%&nbsp; aktywny chlor</td></tr><tr>Inkubator bulionowy <td></td><td></td><td></td><td>Luria-Bertani (LB)</td></tr><tr><td></td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Innova 4000</td><td></td></tr><tr><td>spektrofotometr</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Genesys 20</td><td></td></tr><tr><td>kulki szklane z ciekłego azotu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>G8893</td><td>0,5 i mikro; </td></tr><tr><td>m Probówka 2,0 ml z nakrętką</td><td></td><td></td> Bez <td>RNaz</td></tr><tr><td>1,5 ml i 2,0 ml probówka</td><td></td><td></td> eppendorf <td>bez RNaz</td></tr><tr><td>Homogenizator młynka kulkowego</td><td>Wirówka do</td><td>Mini_beadbeater</td>BioSpec <td>607</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5430</td><td></td></tr><tr><td>Pirowęglan dietylu (DEPC)</td><td>sigma</td><td>CAS: 1609-47-8</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu (SDS)</td><td>sigma</td><td>CAS: 151-21-3&nbsp;</td><td>10% roztwór przygotowany z wodą MQ uzdatnioną DEPC</td></tr><tr><td>Bufor</td><td></td><td></td> TE <td>10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH = 8</td></tr><tr><td>fenol</td><td>Sigma</td><td></td><td>RNA klasy</td></tr><tr><td>chloroform-izoamyl alkohol&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Przygotuj 24:1 chloroformu: alkohol izoamylowy, przechowywać w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji RNA o wysokiej czystości Roche</td><td></td><td>11828665001</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do dekontaminacji RNazy</td><td>Invitrogen</td><td>AM9780</td><td>RNaza-Zap</td></tr><tr><td>Automatyczny przyrząd do elektroforezy</td><td>Bioanalizator Agilent</td><td>2100</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr mikroobjętościowy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td>Zestaw do analizy jakości RNA <td>Nanodrop ND-1000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Zestaw Agilent</td><td>RNA 6000 Nano&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor RNazy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>RiboLock</td><td></td></tr><tr><td>Biblioteka kierunkowego RNA Zestaw przygotowawczy</td><td>NEB</td><td>Ultra</td><td>Dla Illumina</td></tr></tbody></table>

interakcja roślina-mikroorganizm: odpowiedź transkrypcyjna bacillus mycoides na wysięki z korzeni ziemniaka

Plant-Microbe Interaction: Transcriptional Response of Bacillus Mycoides to Potato Root Exudates

Pożyteczne bakterie związane z roślinami odgrywają ważną rolę w promowaniu wzrostu i zapobieganiu chorobom roślin. Stosowanie ryzobakterii wspomagających wzrost roślin (PGPR) jako bionawozów lub środków kontroli biologicznej stało się skuteczną alternatywą dla stosowania konwencjonalnych nawozów i może zwiększyć wydajność upraw przy niskich kosztach. Interakcje między roślinami a mikroorganizmami zależą od sygnałów wydzielanych przez roślinę gospodarza i reakcji zachodzącej w tym procesie przez powiązane z nimi bakterie. Jednak mechanizmy molekularne, w jaki sposób pożyteczne bakterie reagują na związane z nimi sygnały pochodzenia roślinnego, nie są w pełni poznane. Ocena odpowiedzi transkryptomicznej bakterii na wysięki korzeniowe jest skutecznym podejściem do określania ekspresji i regulacji genów bakteryjnych w warunkach ryzosfery. Taka wiedza jest niezbędna do zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw interakcji między roślinami a mikroorganizmami. W artykule opisano szczegółowy protokół badania odpowiedzi transkryptomicznej szczepu B. mycoides EC18, wyizolowanego z endosfery ziemniaka, na wysięki z korzeni ziemniaka. Dzięki najnowszej technologii sekwencjonowania o wysokiej przepustowości protokół ten może być wykonany w ciągu kilku tygodni i generować ogromne zbiory danych. Najpierw zbieramy wysięki korzeniowe w sterylnych warunkach, po czym dodaje się je do kultur B. mycoides. RNA z tych kultur jest izolowane metodą fenol/chloroform w połączeniu z komercyjnym zestawem i poddawane kontroli jakości za pomocą automatycznego przyrządu do elektroforezy. Po sekwencjonowaniu przeprowadzana jest analiza danych za pomocą internetowego potoku T-REx i identyfikowana jest grupa genów o zróżnicowanej ekspresji. Metoda ta jest użytecznym narzędziem ułatwiającym nowe odkrycia dotyczące genów bakteryjnych zaangażowanych w interakcje między roślinami a mikroorganizmami.

Mikroorganizmy stowarzyszone z roślinami mogą pozytywnie wpływać na ich wzrost i zdrowie. Jednak mechanizmy złożonych interakcji między roślinami a ich symbiontami mikrobiologicznymi nie są w pełni zrozumiałe. Eksudaty korzeniowe odgrywają istotną rolę w regulacji aktywności i zachowania bakterii ryzosferowych; powszechnie zakłada się, że kolonizacja korzeni przez mikroby rozpoczyna się od ich przyciągania przez eksudaty. Celem niniejszej pracy było zbadanie odpowiedzi transkrypcyjnej bak...

Celem przedstawionego tutaj protokołu jest zbadanie transkryptomicznej odpowiedzi izolowanych endosferą Bacillus mycoides na wysięki z korzenia ziemniaka. Metoda ta ułatwia identyfikację ważnych genów bakteryjnych zaangażowanych w interakcje roślina-mikroorganizm i zasadniczo ma zastosowanie do innych endofitów i roślin, z niewielkimi dostosowaniami.

Interakcja roślina-mikroorganizm: odpowiedź transkrypcyjna Bacillus mycoides na wysięki z korzeni ziemniaka

Beneficial plant-associated bacteria play an important role in promoting growth and preventing disease in plants. The application of plant ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie interakcji roślina-mikroorganizm. Można na przykład zidentyfikować ważne geny ze szczepów bakteryjnych, które zostały wyizolowane z endosfery lub ryzosfery podczas interakcji bakterii z rośliną. Jest to wszechstronna metoda, którą można również wykorzystać do badań nad innymi bakteriami z roślinami.Główną zaletą tej techniki jest to, że w stosunkowo krótkim czasie można zidentyfikować dużą liczbę genów bakterii, które są ważne podczas interakcji roślina-mikroorganizm. Aby rozpocząć tę procedurę, spłucz powierzchnię ziemniaka sterylną wodą. Kąp ziemniaka w 70% etanolu przez pięć minut, a następnie w 3% podchlorynie sodu przez kolejne pięć minut.Następnie spłucz go ponownie sterylną wodą, aby usunąć pozostały podchloryn sodu. Następnie przygotuj materiały potrzebne do kiełkowania i uprawy bulw ziemniaka. Wysterylizuj plastikowe doniczki, kosze do wszczepiania, wermikulit i wodę, sterylizując je w autoklawie w temperaturze 121 stopni Celsjusza przez 20 minut.Następnie włóż wysterylizowanego powierzchniowo ziemniaka do kosza do szczepienia i umieść go w autoklawowanym doniczce zawierającej mokry wermikulit. Użyj dużego pudełka z włókna szklanego, aby przykryć garnek, aby uniknąć zanieczyszczeń mikrobiologicznych. Trzymaj garnek w komorze klimatycznej w temperaturze 24 stopni Celsjusza przez trzy tygodnie i ustaw go na cykle 16 godzin światła i 8 godzin ciemności.Aby zebrać wysięki z korzeni ziemniaka, gdy pędy wykiełkują, przenieś kosz z całym ziemniakiem do wysterylizowanej zlewki wypełnionej 150 mililitrami autoklawowanej wody dejonizowanej z bulwami ziemniaka umieszczonymi tuż nad powierzchnią wody i korzeniami zanurzonymi w wodzie. Trzymaj sadzonkę w komorze klimatycznej i używaj tych samych ustawień, co poprzednio. Od drugiego dnia należy zebrać wodę zawierającą wysięk i ponownie napełnić zlewkę sterylną, dejonizowaną wodą.Następnie przechowuj każdą próbkę oddzielnie w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Dla każdej próbki rozprowadź 100 mikrolitrów na płytce agarowej Luria-Bertani, aby sprawdzić, czy nie ma zanieczyszczeń mikrobiologicznych. Wyrzucić zanieczyszczone próbki.Połącz zebrane próbki jednej sadzonki. Następnie przenieś połączone wysięki korzeniowe do 50-mililitrowych probówek. Zamrozić probówki zawierające wysięki korzeniowe w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.Skoncentruj je przez liofilizację w temperaturze minus 40 stopni Celsjusza do końcowej objętości 150 mililitrów. Aby wyhodować bakterie, należy przerzucić szczep B.mycoides z bulionu glicerolu o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na płytkę agarową LB i inkubować płytkę w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez noc. Następnie zaszczepij płynną pożywkę LB pojedynczą kolonią z płytki i hoduj kulturę w inkubatorze z wytrząsaniem z prędkością 200 obr./min przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza.Aby poddać je działaniu i pobrać próbki, należy rozcieńczyć nocną kulturę B.mycoides 90 mililitrami wstępnie podgrzanej pożywki LB do początkowego OD600 punktu zerowego zero pięć w kolbie o pojemności 300 mililitrów. Następnie dodaj 10 mililitrów wysięku korzeniowego do kultury i użyj 10 mililitrów sterylnej, dejonizowanej wody jako kontroli. Następnie inkubuj je w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez godzinę.Po godzinie przenieś kulturę do 50-mililitrowych probówek wirówkowych. Zebrać komórki z hodowli przez odwirowanie w temperaturze 9 000 razy G przez dwie minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie wyrzuć supernatent i natychmiast zamroź osad w ciekłym azocie.Następnie przechowuj go w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu użycia. Aby wyizolować RNA, rozmrozić granulki komórek na lodzie i zawiesić każdą z nich w 400 mikrolitrach buforu TE. Następnie przenieś zawiesiny do dwóch mililitrowych rurek z nakrętką.Dodaj do probówki pięć gramów szklanych koralików w punkcie zerowym. Następnie mocno zamknij nakrętki i umieść probówki w homogenizatorze młynka perełkowego. Wykonaj 45-sekundową homogenizację impulsową trzy razy, z jednominutową przerwą na lodzie.Następnie odwirować próbki przez 10 minut w temperaturze 11 000 razy G i przenieść górną fazę każdej próbki do nowej probówki. Dodaj 500 mikrolitrów chloroformu: alkoholu izoamylowego do górnej fazy i odwiruj mieszaninę przez pięć minut w temperaturze 11 000 razy G. Następnie przenieś 500 mikrolitrów górnej fazy do świeżej probówki. Dodać jeden mililitr buforu wiążącego lizę i wymieszać go, pipetując w górę iw dół.Następnie przygotuj jednopunktowe pięciomililitrowe mikroprobówki wirówkowe ze 100 mikrolitrami buforu DNazy, 10 mikrolitrami DNazy I i pięcioma mikrolitrami inhibitora RNazy. Dodaj przygotowaną mieszaninę roztworów na filtr rurek filtracyjnych i inkubuj je przez 20 do 30 minut w temperaturze od 15 do 25 stopni Celsjusza. Następnie wykonaj kroki mycia zgodnie z instrukcją producenta i dodaj 50 mikrolitrów buforu elucji do probówki.Po odwirowaniu wymyj RNA. Przenieś kilka mikrolitrów próbki do jednopunktowej pięciomililitrowej probówki wirówkowej w celu przeprowadzenia kontroli jakości. Na koniec przykryj wymykające się RNA plastikową folią parafinową i utrzymuj ją w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.Po pobraniu wysięki korzeniowe dodano do kultury B.mycoides w stosunku 10%, a całkowite RNA bakterii wyizolowano. RNA zostało następnie poddane kontroli jakości za pomocą automatycznego przyrządu do elektroforezy. Wykresy te reprezentują RNA wyizolowane z B. mycoides traktowane wysiękami korzeniowymi, a te wykresy reprezentują RNA wyizolowane z grupy kontrolnej.Wszystkie próbki uzyskały wartość RIN powyżej dziewięciu, z dwoma wyraźnymi prążkami odpowiadającymi podjednostkom RNA 16S i 23S, co pokazuje, że za pomocą tego protokołu uzyskano wysokiej jakości RNA. Po przygotowaniu biblioteki uzyskano odczyty na końcu pary za pomocą wysokoprzepustowej platformy sekwencjonowania. Surowe odczyty sekwencyjne RNA zostały wycięte z sekwencji adaptorowych i zmapowane względem referencyjnej sekwencji genomu.Analizę domowego chromosomu transkryptu przeprowadzono za pomocą potoku T-REx, a wykres intensywności stosunku wszystkich genów o zróżnicowanej ekspresji przedstawiono tutaj. Po zidentyfikowaniu potencjalnie ważnego genu można przeprowadzić inne metody in vivo, takie jak fuzja promotora GFP, cue-pews-air i fluorescencyjna hybrydyzacja in situ, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak czas zarezerwowanej ekspresji niektórych genów podczas interakcji z rośliną żywicielską.

plant-microbe-interaction-transcriptional-response-bacillus-mycoides

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Źródło: Yi, Y., et al. Interakcja roślina-mikroorganizm: odpowiedź transkrypcyjna Bacillus mycoides na wysięki z korzeni ziemniaka. J. Vis. Exp. (2018)Ten film przedstawia przygotowanie i leczenie kultur Bacillus mycoides w celu zbadania interakcji między roślinami a mikroorganizmami. Przedstawia kroki od smugowania kultury podstawowej i inkubacji jej w płynnym podłożu do wystawienia bakterii na wysięk z korzeni roślin pod wpływem mieszania. Punktem kulminacyjnym procesu jest zebranie i...

Leczenie bakterii wysiękami z korzeni roślin w celu naśladowania interakcji roślina-mikroorganizm in vitro

Agroinfiltracja i agroinfekcja PVX to rutynowe testy funkcjonalne dla przejściowej ektopowej ekspresji genów w roślinach. Metody te są skutecznymi testami w strategiach efektoromicznych (szybkie odkrywanie genów oporności i wirulencji) i mają kluczowe znaczenie dla nowoczesnych badań w zakresie molekularnej patologii roślin. Spełniają one zapotrzebowanie na solidną, wysokowydajną analizę funkcjonalną w zakładach.

Agroinfiltracja i agroinfekcja PVX u ziemniaka i Nicotiana benthamiana

Opisany system kouprawy hydroponicznej wspiera nienaruszone rośliny za pomocą metalowych siatek i współhoduje je z bakteriami. Tkanki roślinne, bakterie i wydzielane cząsteczki mogą być następnie oddzielnie zbierane do dalszych analiz, co jednocześnie pozwala na zbadanie odpowiedzi molekularnych zarówno gospodarzy roślinnych, jak i oddziałujących na siebie mikroorganizmów lub mikrobiomów.

Hydroponiczny system wspólnej uprawy do jednoczesnej i systematycznej analizy interakcji molekularnych między roślinami a mikroorganizmami oraz sygnalizacji

Tutaj prezentujemy dwa protokoły przekształcania roślin ziemniaka. Transformacja Agrobacterium tumefaciens prowadzi do kompletnej rośliny transgenicznej, podczas gdy Agrobacterium rhizogenes wytwarza transgeniczne owłosione korzenie w pędach typu dzikiego, które mogą się samodzielnie rozmnażać. Następnie wykrywamy aktywność promotora poprzez barwienie GUS w przekształconych korzeniach.

Przemiana ziemniaka w ziemniaku za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens i Agrobacterium rhizogenes oraz aktywność promotorowa genu suberyny przez barwienie GUS

Przedstawiona metoda tworzy naturalną tkankę roślinną uszkodzoną przez roślinożerców poprzez zastosowanie larw Manduca sexta do oderwanych liści ziemniaka. Tkanka roślinna jest badana pod kątem ekspresji sześciu homologów czynników transkrypcyjnych biorących udział we wczesnych reakcjach na roślinożerność owadów.

Testy oderwanych liści w celu uproszczenia badań ekspresji genów u ziemniaków podczas porażenia owadem żującym Manduca sexta

Przedstawiamy szczegółowy protokół dla systemu wyciszania mikroRNA (VbMS) opartego na wirusie ziemniaka X (PVX), aby funkcjonalnie scharakteryzować endogenne mikroRNA (miRNA) u ziemniaka. Docelowe cząsteczki mimiczne (TM) interesującego nas miRNA są integrowane z wektorem PVX i przejściowo ulegają ekspresji w ziemniakach w celu wyciszenia docelowego miRNA lub rodziny miRNA.

Wyciszanie mikroRNA na bazie wirusa ziemniaka (VbMS) w ziemniakach.

Ten protokół przedstawia szczegółowe podsumowanie strategii inokulacji korzeni roślin mikrobami przenoszonymi przez glebę. Na przykładzie grzybów Verticillium longisporum i Verticillium dahliae opisano trzy różne systemy infekcji korzeni. Przedstawiono potencjalne zastosowania i możliwe dalsze analizy, a także omówiono zalety i wady każdego systemu.

Strategie inokulacji w celu infekowania korzeni roślin mikroorganizmami przenoszonymi przez glebę

Ze względu na nieprzezroczystość gleby, interakcje między jej składowymi mikroorganizmami nie mogą być łatwo zobrazowane za pomocą rozdzielczości komórkowej. Zaprezentowano tu dwa narzędzia mikroprzepływowe, które dają nowe możliwości badania interakcji grzybowo-mikrobiologicznych. Urządzenia są wszechstronne i proste w użyciu, umożliwiając wysoką kontrolę czasoprzestrzenną i obrazowanie w wysokiej rozdzielczości na poziomie komórkowym.

Narzędzia mikroprzepływowe do badania interakcji grzybowo-mikrobiologicznych na poziomie komórkowym

Przedstawiamy protokół dla opartego na szkle, półhydroponicznego systemu eksperymentalnego, wspierającego wzrost różnych filogenetycznie odrębnych roślin z mikrobami lub bez. System jest kompatybilny z różnymi podłożami wzrostowymi i umożliwia nieniszczące pobieranie próbek wysięku korzeniowego do dalszej analizy.

Wszechstronny system szklanych słoików do półhydroponicznego profilowania wysięku korzeniowego

Protokół opisuje zakażenie korzeni Solanum tuberosum pasożytniczymi nicieniami w warunkach szklarniowych in vivo oraz transgeniczne korzenie ziemniaka in vitro do analizy histochemicznej struktury korzenia za pomocą mikroskopii optycznej.

Zakażenie in vivo i in vitro korzeni ziemniaka nicieniami pasożytniczymi roślin w celu oceny indukowanych zmian strukturalnych

Poznaj metodę analizy transkryptomicznej odpowiedzi Bacillus mycoides na wysięki z korzeni ziemniaka. Protokół pozwala identyfikować kluczowe geny bakteryjne zaangażowane w interakcje roślina-mikroorganizm, z zastosowaniem do różnych endofitów.

Interakcja roślina-mikroorganizm: odpowiedź transkrypcyjna Bacillus mycoides na wysięki z korzeni ziemniaka

Przeglądaj więcej filmów