Name: Metoda hodowli organotypowej do badania rozwoju zarodkowych tkanek kurczaka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 12 s
Description: Poznaj metodę hodowli organotypowej zarodkowych tkanek kurczaka do badania rozwoju oka. Ta technika umożliwia analizę interakcji między siatkówką a nabłonkiem barwnikowym w kontrolowanych warunkach in vitro bez toksycznego wpływu na cały zarodek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Gregory'emu Hallerowi (Uniwersytet Mount Saint Vincent) za jego wstępną pracę nad rozwojem protokołu. Autorzy pragną również podziękować Nicholasowi Jonesowi (Mount Saint Vincent University) za jego wiedzę techniczną i pomoc w filmowaniu i produkcji audiowizualnej części rękopisu. Daniel Andrews otrzymał wsparcie finansowe od MSVU i Kanadyjskiej Rady ds. Badań Przyrodniczych i Inżynieryjnych (NSERC) w ramach nagrody Undergraduate Student Research Award. Tamara A. Franz-Odendaal otrzymała wsparcie w ramach grantu NSERC Discovery Grant.

UWAGA: Dla stadiów zarodkowych użyj tabeli inscenizacji Hamburger and Hamilton12 (HH).
1. Inkubacja zarodków
<ol>
	<li>Inkubować zapłodnione jaja kurze w sterylnym inkubatorze o kontrolowanej temperaturze w temperaturze 37 °C ± 1 °C i wilgotności ~40%.</li>
	<li>Obracaj jaja 1 raz dziennie i pozwól im wysiadywać do HH34 (8 dni po zapłodnieniu).</li>
</ol>
2. Przygotowanie i sterylizacja materiałów
<ol>
	<li>W przypadku 12 zarodków należy przelać w autoklawie 2 litry wody destylowanej, 1 l 0,85% soli fizjologicznej dla kurcząt, 12 szklanych pipet, 1 pudełko chusteczek papierowych, 24 kwadraty półporowatej bibuły filtracyjnej o wymiarach 2,5 cm x 2,5 cm i 24 kwadraty stalowej siatki drucianej o wymiarach 2,5 cm x 2,5 cm z krawędziami zakrzywionymi w dół. Aby wysterylizować materiały, należy je sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez co najmniej 15 minut. 
	UWAGA: Autoklawowanie materiałów można wykonać z wyprzedzeniem.</li>
	<li>Wysterylizuj inkubator 70% etanolem, wycierając boki, półki i drzwi. Umieść 2 plastikowe pojemniki zawierające autoklawowaną wodę destylowaną w inkubatorze, aby utrzymać wilgotność. Rozgrzej inkubator do hodowli do 37 °C ± 1 °C i wilgotności ~40%. Upewnij się, że inkubator jest całkowicie ciemny; Jeśli drzwi są przezroczyste, przykryj je folią aluminiową.</li>
	<li>Podgrzej 100 ml pożywki i 1 ml penicyliny, umieszczając je w inkubatorze hodowli.</li>
	<li>Przykryj miejsce pracy ręcznikiem papierowym i wysterylizuj ławkę, spryskując ją 70% etanolem. W podobny sposób wysterylizuj 2 pary kleszczy, nożyczki do wypreparowania, żyletkę i plastikową łyżkę z 70% etanolem.</li>
	<li>Umieść na stole 12 sterylnych szalek Petriego o średnicy 100 mm i 24 sterylne szalki Petriego o średnicy 35 mm i 24 sterylne szalki Petriego o średnicy 35 mm. Upewnij się, że naczynia pozostają w sterylnej torbie do czasu użycia.</li>
</ol>
3. Przygotowanie zarodków
UWAGA: Od tego momentu noś ochronną maskę przeciwpyłową, aby uniknąć skażenia kultur. Infekcja bakteryjna lub grzybicza zrujnuje kulturę i istnieje ryzyko jej szybkiego rozprzestrzenienia się na wszystkie kultury w inkubatorze.
<ol>
	<li>Rozbij jajo i przenieś zarodek na 100-milimetrową szalkę Petriego zawierającą 0,85% soli fizjologicznej dla kurcząt. Uporządkuj zarodek zgodnie z cechami anatomicznymi opisanymi w wytycznych dotyczących oceny stopnia zarodka Hamburgera i Hamiltona12 i potwierdź, że zarodek ma HH34.</li>
	<li>Przetnij szyję, a następnie przetnij głowę zarodka na pół w linii środkowej za pomocą wysterylizowanej żyletki. Za pomocą sterylnych kleszczy usuń mózg. Pozostaw dziób nienaruszony.</li>
</ol>
4. Konfiguracja kultury
<ol>
	<li>Umieść 2 szalki Petriego o średnicy 35 mm wewnątrz jednej szalki Petriego o średnicy 100 mm.</li>
	<li>Umieść stalową siatkę drucianą wewnątrz każdej szalki Petriego o średnicy 35 mm.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy przenieś 1 z przeciętych na pół głów na kawałek półporowatej bibuły filtracyjnej o wymiarach 2,5 cm x 2,5 cm z okiem skierowanym do góry. Upewnij się, że chusteczka jest bezpieczna i nie zsuwa się po lekkim przechyleniu.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy ostrożnie umieść tkankę oka i bibułę filtracyjną na stalowej siatce drucianej na 1 z 35-milimetrowych szalek Petriego, tworząc podniesiony etap z tkanką oka na górze.</li>
	<li>Powtórz kroki 4.3 i 4.4 z drugą połową głowy.</li>
	<li>Za pomocą sterylnej szklanej pipety ostrożnie dodaj pożywkę bezpośrednio do każdej płytki Petriego o średnicy 35 mm, aż osiągnie poziom bibuły filtracyjnej. Nie zanurzaj połowy głowy w pożywce.</li>
	<li>Dodać 50 μl 10 000 U/ml penicyliny-streptomycyny do pożywki na każdej szalce Petriego.</li>
	<li>Złóż kawałek bibuły w mały kwadrat i umieść go w szalce Petriego o średnicy 100 mm. Zwilż go autoklawowaną wodą destylowaną.</li>
	<li>Umieść naczynie hodowlane w sterylnym, ciemnym inkubatorze w temperaturze 37 °C ± 1 °C i wilgotności ~40% przez okres do 4 dni.</li>
	<li>Powtórz kroki 3 i 4 dla każdego zarodka. 
	UWAGA: Liczba potrzebnych zarodków będzie zależeć od konkretnego eksperymentu; Tutaj opisujemy protokół dla 12 zarodków.</li>
</ol>
5. Utrzymanie kultury
<ol>
	<li>Raz dziennie należy uzupełnić plastikowe pojemniki w inkubatorze świeżą, autoklawowaną wodą destylowaną.</li>
	<li>Codziennie sprawdzaj wszystkie kultury pod kątem infekcji bakteryjnych lub grzybiczych. Kultury, które uległy rozpadowi lub w których podłoże zmieniło kolor, są zakażone. Wyrzuć wszystkie zainfekowane kultury.</li>
</ol>
6. Fiksacja
<ol>
	<li>Po przeprowadzeniu hodowli wyjmij wszystkie szalki z inkubatora.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy delikatnie zdejmij oko z bibuły filtracyjnej, uważając, aby nie rozerwać tkanki.</li>
	<li>Utrwalić tkankę oka w 4% paraformaldehydzie w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem przez noc w temperaturze 4 °C lub w 10% neutralnie buforowanej formalinie przez noc w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przechowywać tkankę w temperaturze 4 °C w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami.</li>
</ol>

<ol><li>Franz-Odendaal, T. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18855894">Towards understanding the development of scleral ossicles in the chicken, Gallus gallus.</a> Developmental Dynamics. 237 (11), 3240-3251 (2008).</li>
<li>Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+motor+proteins+in+echinoderm+embryos%3A+an+argument+in+support+of+antibody+inhibition+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motility+and+the+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Functions of motor proteins in echinoderm embryos: an argument in support of antibody inhibition experiments.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 39 (4), 257-260 (1998).</li>
<li>Horakova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+FGFR+inhibitors+on+chicken+limb+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%2C+Growth+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Effect of FGFR inhibitors on chicken limb development.</a> Development, Growth & Differentiation. 56 (8), 555-572 (2014).</li>
<li>Gerlach, G. F., Morales, E. E., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbead+Implantation+in+the+Zebrafish+Embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo.</a> Journal of Visualized Experiments. (101), e52943(2015).</li>
<li>Luz-Madrigal, A., Grajales-Esquivel, E., Del Rio-Tsonis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+Embryonic+Chick+Eyes%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Electroporation of Embryonic Chick Eyes.</a> Bio-protocol. 5 (12), e1498(2015).</li>
<li>Roach, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+organ+culture+of+embryonic+chick+femora%3A+a+system+for+investigating+bone+and+cartilage+formation+at+an+intermediate+level+of+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Long-term organ culture of embryonic chick femora: a system for investigating bone and cartilage formation at an intermediate level of organization.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 5 (1), 85-100 (1990).</li>
<li>Jung, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+inhibitory+action+of+BMPs+and+their+relationships+with+activators+in+feather+formation%3A+implications+for+periodic+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Local inhibitory action of BMPs and their relationships with activators in feather formation: implications for periodic patterning.</a> Developmental Biology. 196 (1), 11-23 (1998).</li>
<li>McKinnell, I. W., Turmaine, M., Patel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+Hedgehog+functions+by+localizing+the+region+of+proliferation+in+early+developing+feather+buds%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Sonic Hedgehog functions by localizing the region of proliferation in early developing feather buds.</a> Developmental Biology. 272 (1), 76-88 (2004).</li>
<li>Smith, E. L., Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+take+on+an+old+story%3A+chick+limb+organ+culture+for+skeletal+niche+development+and+regenerative+medicine+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22European+Cells+%26+Materials%22%5BJournal%5D)">A new take on an old story: chick limb organ culture for skeletal niche development and regenerative medicine evaluation.</a> European Cells & Materials. 26, 91-106 (2013).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Spermatogenesis+in+Explanted+Adult+Mouse+Testis+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In Vitro Spermatogenesis in Explanted Adult Mouse Testis Tissues.</a> PLoS One. 10 (6), e0130171(2015).</li>
<li>Ochoa-Villarreal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+cell+culture+strategies+for+the+production+of+natural+products%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+Reports%22%5BJournal%5D)">Plant cell culture strategies for the production of natural products.</a> BMB Reports. 49 (3), 149-158 (2016).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).</li>
<li>Yu, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4380223/">The developmental biology of feather follicles.</a> The International Journal of Developmental Biology. 48 (0), 181-191 (2004).</li>
<li>Jabalee, J., Hillier, S., Franz-Odendaal, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+investigation+of+cellular+dynamics+during+the+development+of+intramembranous+bones%3A+the+scleral+ossicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">An investigation of cellular dynamics during the development of intramembranous bones: the scleral ossicles.</a> Journal of Anatomy. 223 (4), 311-320 (2013).</li>
<li>Trowell, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+culture+of+mature+organs+in+a+synthetic+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">The culture of mature organs in a synthetic medium.</a> Experimental Cell Research. 16 (1), 118-147 (1959).</li>
<li>Pinto, C. B., Hall, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+an+understanding+of+the+epithelial+requirement+for+osteogenesis+in+scleral+mesenchyme+of+the+embryonic+chick%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Zoology%22%5BJournal%5D)">Toward an understanding of the epithelial requirement for osteogenesis in scleral mesenchyme of the embryonic chick.</a> Journal of Experimental Zoology. 259 (1), 92-108 (1991).</li>
<li>Mbiene, J. P., MacCallum, D. K., Mistretta, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+cultures+of+embryonic+rat+tongue+support+tongue+and+gustatory+papilla+morphogenesis+in+vitro+without+intact+sensory+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Organ cultures of embryonic rat tongue support tongue and gustatory papilla morphogenesis in vitro without intact sensory ganglia.</a> Journal of Comparative Neurology. 377 (3), 324-340 (1997).</li>
<li>Cloney, K., Franz-Odendaal, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+ex-ovo+culturing+of+chick+embryos+to+advanced+stages+of+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Optimized ex-ovo culturing of chick embryos to advanced stages of development.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), e52129(2015).</li>
<li>Korn, M. J., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Windowing+chicken+eggs+for+developmental+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Windowing chicken eggs for developmental studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (8), e306(2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten wykorzystuje uznane techniki hodowli tkankowej w celu osiągnięcia wzrostu oka kurczaka od 8 dnia embrionalnego (HH34) in vitro przez 4 dni. Ta metoda hodowli siatkowej została pierwotnie opisana przezTrowella 15. Zoptymalizowaliśmy protokół z badania Pinto i Halla z 1991 roku16, wykorzystując półporowatą membranę z siatką do badania sygnałów indukcyjnych między oddzielonymi warstwami tkanek embrionalnego oka kurczaka15. Stosując...

Embrionalny kurczak (Gallus gallus) jest doskonałym organizmem modelowym, powszechnie używanym w dziedzinie biologii. Jego okres inkubacji wynosi około 21 dni, a wiele jaj może być inkubowanych jednocześnie, dzięki czemu eksperymenty są szybkie i skuteczne. Być może najważniejsze jest to, że zarodek jest również łatwy do manipulowania, co umożliwia szeroko zakrojone badania kluczowych procesów rozwojowych oraz genów i białek, które napędzają te procesy.
Embrionalne oko kurczaka to złożony narząd, który rozwija się poprzez interakcję wielu różnych tkanek, podobnych do wielu innych układów ciała. Metoda ta umożliwia badanie rozwoju tych tkanek, szczególnie w zaawansowanych stadiach rozwoju. Na przykład wielowarstwowa siatkówka może być szczególnie interesująca dla osób zajmujących się rozwojem układu nerwowego. Alternatywne metody, które umożliwiają badanie innych tkanek oka, takich jak rogówka, ciało szkliste, soczewka, twardówka i powieki, są korzystne dla naukowców. Oko zarodkowe kurczaka zawiera również szereg płaskich kości, kosteczek twardówkowych, które mogą być wykorzystane jako model do badania indukcji i kostnienia kości śródbłoniastej u kręgowców1.
Obecnie istnieje wiele metod wykorzystywanych do badania rozwoju embrionalnego. Mikroiniekcje przeciwciał hamujących lub innych cząsteczek hamujących2,3, chirurgicznie wszczepione mikrogranulki nasączone inhibitorem4, oraz elektroporacja5 to metody, które mogą być użyte do obniżenia poziomu genów lub białek będących przedmiotem zainteresowania w zarodku. Podobne metody stosuje się do zwiększania regulacji białek. Metody te nie są pozbawione ograniczeń. Na przykład, w przypadku stosowania substancji chemicznych w celu zmiany rozwoju embrionalnego, należy ocenić śmiertelny wpływ na zarodek, a to ogranicza stosowanie wyżej wymienionych metod do miejscowych miejsc stosowania w dawkach wystarczająco niskich, aby zapewnić przeżywalność zarodka.
Hodowla tkanek in vitro była stosowana w szerokim zakresie organizmów do badania rozwoju i może być wykorzystana do ominięcia niektórych z wyżej wymienionych ograniczeń. Na przykład, femora6, feather buds7,8 i limbs9 kurczaka zostały przebadane przy użyciu metod hodowli tkankowej, podobnie jak jądra mouse10 oraz korzenie i łodygi roślin11. Metody te zapewniają naukowcom wysoki stopień kontroli nad rozwojem tkanek, takich jak zdolność do wahań temperatury i zmiany dostępności składników odżywczych. Izolacja tkanki z całego zarodka sprawia również, że jest on znacznie mniej podatny na śmiertelne działanie chemikaliów, umożliwiając w ten sposób badania manipulacyjne na skalę globalną przy wyższych stężeniach. Kolejną godną uwagi zaletą hodowli in vitro jest zachowanie środowiska komórkowego tkanki; Układ tkanek pozostaje względnie niezmieniony, co umożliwia badanie interakcji między różnymi typami tkanek9. W związku z tym hodowla in vitro otwiera drzwi do dodatkowych podejść eksperymentalnych, które nie są dostępne w modelach in vivo lub in ovo.
Obecnie badanie rozwoju embrionalnego oka kurczaka za pomocą chemikaliów jest szczególnie trudne. Zarodek jest pokryty wieloma błonami pozazarodkowymi, co utrudnia stosowanie mikrogranulek lub chemikaliów; Zarodek jest również bardzo aktywny w jaju wraz z wiekiem, co jeszcze bardziej komplikuje i tak już trudną metodę. Protokół ten umożliwia łatwy dostęp do oka i otaczających go tkanek, eliminując te bariery, a jednocześnie dając nowe możliwości badania procesów rozwojowych w obrębie oka. Protokół ten został opracowany w celu zbadania indukcji kosteczek twardówkowych w obrębie oka zarodkowego.

<table><tbody><tr><td>Szalki Petriego do hodowli komórkowych 35 mm</td><td>Corning</td><td>353001</td><td>łatwe do uchwycenia naczynie do hodowli tkankowych, polistyren, niepirogenne</td></tr><tr><td>Szalki Petriego 100 mm do hodowli komórkowych</td><td>Corning</td><td>353003</td><td>naczynie do hodowli tkankowych, polistyren, niepirogenna</td></tr><tr><td>bibułka papierowa</td><td>Kimtech</td><td>34155</td><td>Wycieraczki Kimtech Science Brand, 280 w kartonie</td></tr><tr>z<td>siatki drucianej</td><td>nie</td><td>dotyczy</td><td>siatka druciana ze stali nierdzewnej (rozmiar siatki 0,7 mm)</td></tr> <tr><td>jednorazowe pipety szklane</td><td>VWR</td><td>14673-010</td> Jednorazowe pożywki <td>ze szkła borokrzemianowego 5 3/4 "</td></tr><tr><td></td><td>Gibco</td><td>12591-038</td><td>Modyfikacja Fitton-Jackson, [+] L-glutamina z czerwienią fenolową (BGJB)</td></tr><tr><td>penicylina-streptomycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4458</td><td>10000 jednostek/ml penicyliny filtr stabilizowany roztworem streptomycyny</td></tr><tr><td> papier</td><td>Whatman</td><td>1454 090</td><td>półporowata bibuła filtracyjna 90 mm</td></tr><tr><td>zapłodnione jaja</td><td>kurze Dalhousie University Agricultural College</td><td>n/a</td><td>można uzyskać z lokalnych gospodarstw</td></tr><tr><td>chlorek sodu (NaCl)</td><td>EMD</td><td>SX0420-3</td><td>kryształy chlorku sodu, odczynnik klasy</td></tr><tr><td>1 L szklana butelka</td><td>VWR</td><td>89000-240</td><td>1 L pirex autoklawowalna szklana butelka</td></tr><tr><td>etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP82011</td><td>70% pojemniki tupperware klasy biologii molekularnej</td></tr><tr><td></td><td>n/a</td><td>nie dotyczy</td><td>kupione w sklepie i wysterylizowane</td></tr><tr><td>jednorazowymi żyletkami EtOH Przemysłowe żyletki</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td>z pojedynczą krawędzią (chirurgiczna stal węglowa)</td></tr> <tr><td>plastikowe łyżki</td><td>nie</td><td></td> dotyczy nie dotyczy <td>w sklepie i sterylizowane za pomocą</td></tr><tr><td>maski przeciwpyłowej</td> EtOH <td>3M</td><td>nie dotyczy</td><td>3M 8500 Comfort Mask</td></tr><tr><td>paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>paraformaldehyd, klasa odczynnika, krystaliczna</td></tr><tr><td>formalina buforowana obojętnie</td><td>Fisher Scientific</td><td>72210</td><td>10% neutralna buforowana sól fizjologiczna buforowana fosforanem formaliny</td></tr><tr><td>(PBS)</td> <td>n/a</td><td>nie dotyczy</td><td>10X sól fizjologiczna buforowana fosforanami pH 7,4 (137mM NaCl, 2,5mM KCl, 4,3mM Na2HPO4, 1,4mM KH2PO4)</td></tr><tr><td>15 ml probówki falcon</td><td>VWR</td><td>21008-216</td><td>wstępnie sterylizowane probówki wirówkowe</td></tr><tr><td>kleszcze</td><td>FST</td><td>brak</td><td>drobnych kleszczyków</td></tr> sól <tr><td>fizjologiczna dla piskląt&nbsp;</td><td>Nie</td><td>dotyczy n/a&nbsp;</td><td>0,85% NaCl</td></tr><tr><td>Folia aluminiowa</td><td>Nie dotyczy</td><td></td> Ręcznik <td>papierowy kupiony w sklepie</td></tr><tr><td>Nie</td><td></td><td></td> dotyczy <td>Kupiony w sklepie</td></tr></tbody></table>

metoda hodowli organotypowej do badania rozwoju zarodkowych tkanek kurczaka

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

Embrionalny kurczak jest powszechnie używany jako niezawodny organizm modelowy do rozwoju kręgowców. Jego dostępność i krótki okres inkubacji sprawiają, że idealnie nadaje się do eksperymentów. Obecnie badania nad tymi szlakami rozwojowymi w zarodku kurczaka prowadzone są poprzez stosowanie inhibitorów i leków w zlokalizowanych miejscach i w niskich stężeniach przy użyciu różnych metod. Hodowla tkanek in vitro jest techniką, która umożliwia badanie tkanek oddzielonych od organizmu gospodarza, przy jednoczesnym ominięciu wielu fizycznych ograniczeń występujących podczas pracy z całymi zarodkami, takich jak podatność zarodków na wysokie dawki potencjalnie śmiertelnych substancji chemicznych. W tym miejscu przedstawiamy protokół hodowli organotypowej do hodowli zarodkowej połowy głowy kurczaka in vitro, który stwarza nowe możliwości badania procesów rozwojowych wykraczające poza obecnie stosowane metody.

Stosując tę metodę, embrionalne oko kurczaka można hodować in vitro przez 4 dni, począwszy od 8. dnia rozwoju (HH34). Cztery dni rozwoju in ovo odpowiadają stanowi HH38.
Ta metoda hodowli wspiera rozwój zawiązków piór wokół oka i na powiekach (Rycina 1B). Zawiązki piór te nie występują in ovo w stadium HH34 przed rozpoczęciem hodowli (Rycina 1A</strong...

Tutaj prezentujemy protokół hodowli organotypowej do hodowli embrionalnych organów kurczaka in vitro. Za pomocą tej metody można badać rozwój zarodkowej tkanki kurczaka, przy zachowaniu wysokiego stopnia kontroli nad środowiskiem hodowli.

Metoda hodowli organotypowej do badania rozwoju zarodkowych tkanek kurczaka

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

Ogólnym celem tego protokołu jest zapewnienie dostępu do embrionalnych oczu kurczaka w warunkach in vitro, aby umożliwić dogłębne badanie złożonych ścieżek rozwojowych w zarodku. U zarodka kurczaka badanie oka jest często trudne ze względu na rozwój powiek, ruch zarodka i wzrost dodatkowych tkanek embrionalnych. Związki takie jak leki i inhibitory mogą również mieć śmiertelny wpływ na zarodek, co utrudnia wykorzystanie tych związków do modulowania szlaków genowych.Postępy w hodowli tkanek in vitro pozwoliły naukowcom wyizolować te tkanki i wyeliminować wiele z wyżej wymienionych barier. Nasz protokół jest korzystny, ponieważ pozwala nam badać oko jako całość, w tym wszystkie tkanki, które mają potencjał do interakcji podczas rozwoju, takie jak siatkówka nerwowa i nabłonek barwnikowy siatkówki. Rozpocznij od autoklawowania materiałów, aby upewnić się, że wszystkie roztwory i sprzęt są sterylne przed zabiegiem.Aby to zrobić, przelej w autoklawie dwa litry wody destylowanej i jeden litr soli fizjologicznej dla kurczaków, a także pudełko chusteczek, półporowatą bibułę filtracyjną, siatkę drucianą, pojemniki na wodę i jednorazowe szklane pipety. Dokładnie wysterylizuj półki i drzwi inkubatora przy użyciu 70% etanolu, a następnie napełnij pojemniki autoklawowaną, destylowaną wodą i podgrzej inkubator do 37 stopni Celsjusza. Podgrzej pożywkę wraz z tubką antybiotyku penicyliny streptomycyny w inkubatorze.Połóż ręcznik papierowy w poprzek miejsca pracy i wysterylizuj 70% etanolem. Wysterylizuj wszystkie kleszcze i nożyczki. Trzymając głowę kurczaka w autoklawizowanym roztworze soli fizjologicznej, przetnij głowę pisklęcia na pół w linii środkowej, pozostawiając trochę tkanki w takcie wokół każdego oka.Dodatkowa tkanka pomoże oku utrzymać pewne napięcie w kulturze, a także pomoże w pobieraniu składników odżywczych przez oko i zapobiegnie zsuwaniu się oka z bibuły filtracyjnej. Tkanki te służą również jako punkty orientacyjne podczas orientowania oka w późniejszej analizie. Pozostaw wypreparowaną tkankę w soli fizjologicznej dla piskląt o temperaturze pokojowej podczas przygotowywania kultury.Przygotuj danie z kulturą. Umieść dwie 35-milimetrowe szalki Petriego w jednej 100-milimetrowej szalce Petriego. Umieść jeden stolik z siatki drucianej w każdym małym naczyniu.Umieść pół głowicy z okiem na kawałku bibuły filtracyjnej, lekko przechylając, aby oko nie zsunęło się z bibuły. Przenieś bibułę i bibułę filtracyjną na małą szalkę Petriego na stoliku z siatki drucianej. Powtórz z drugą połową głowy tego samego zarodka.Dodaj pożywkę hodowlaną do każdej z dwóch małych szalek Petriego. Doprowadzić podłoże do poziomu bibuły. Nie zanurzaj tkanki w podłożu.Dodaj 50 mikrolitrów roztworu podstawowego antybiotyku penicyliny streptomycyny do pożywki w każdym naczyniu, aby zapobiec infekcji bakteryjnej. Umieść złożony kawałek cienkiej chusteczki na wewnętrznej krawędzi większej szalki Petriego i zwilż go wodą destylowaną. Inkubuj kulturę w ciemnym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez okres do czterech dni.Po przeprowadzeniu hodowli usuń tkankę z bibuły filtracyjnej i utrwal w 4% paraformaldehydzie. Pierwsza kolumna przedstawia oko HH34, reprezentujące embrionalne oko pisklęcia na początku hodowli. Druga kolumna przedstawia embrionalne oko pisklęcia hodowane przez cztery dni, począwszy od HH34.Trzecia kolumna pokazuje oko HH38, co odpowiada czterem dniom rozwoju in ovo poza HH34. Panele od A do F są niebarwione, podczas gdy panele od G do I są barwione na obecność enzymu fosfatazy alkalicznej. Górny rząd, panele od A do C, pokazuje, że oko nadal rozwija się w całej kulturze, o czym świadczy pojawienie się pąków piór i wzrost powiek, wskazywany strzałkami w każdym panelu.Środkowy rząd, panele od D do F, pokazuje, że brodawki spojówkowe zaczynają się degenerować w kulturze. Dolny rząd, panele od G do I, pokazuje, że czasoprzestrzenny wzorzec indukcji kosteczek twardówkowych jest utrzymywany w kulturze, służąc jako przykład ścieżki rozwojowej, którą można badać za pomocą tej metody. Protokół ten pozwala tkankom zachować kluczowe przestrzenne i czasowe aspekty rozwoju przez cały okres hodowli.Protokół ten stanowi kluczowy postęp w hodowli całych narządów zmysłów, zapewniając alternatywną metodologię badania skomplikowanych ścieżek rozwojowych.

organotypic-culture-method-to-study-development-embryonic-chicken

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

W tym filmie zaprezentowano New culture – metodę, dzięki której zarodki kurcząt są hodowane poza jajem przez maksymalnie 24 hr. Metoda ta umożliwia badanie wczesnego rozwoju (od pręgi pierwotnej do 14 som.), co odpowiada okresowi E7-9 u myszy. Zastosowania tej techniki obejmują elektroporację, hybrydyzację in situ oraz immunohistochemię.

Metoda hodowli wczesnych zarodków kurczaka ex vivo (nowa hodowla)

W niniejszym artykule przedstawiamy prostą metodologię umożliwiającą długotrwałą hodowlę embrionów ptaków ex-ovo. Technika ta jest idealna do eksperymentów podłużnych, które wymagają pełnej dostępności optycznej i/lub sterylnego transportu embrionów ptaków.

System hodowli embrionów kurzych ex-ovo odpowiedni do obrazowania i zastosowań mikrochirurgicznych

Niniejszy artykuł opisuje znakowanie powierzchniowe oraz hodowlę tkanek ex ovo we wczesnym embrionie kurczaka. Przedstawiono techniki umożliwiające obrazowanie w jasnym polu, fluorescencyjne oraz z wykorzystaniem tomografii optycznej koherencyjnej w trybie time-lapse. Śledzenie znaczników powierzchniowych z wysoką rozdzielczością czasowo-przestrzenną pozwala na obliczenie wielkości kinematycznych, takich jak odkształcenia morfogenetyczne, zarówno w dwóch, jak i w trzech wymiarach.

Śledzenie deformacji tkankowych w procesach morfogenetycznych we wczesnym zarodku kurczaka

Kultury Slice ułatwiają manipulowanie rozwojem zarodka za pomocą zaburzeń genowych i farmakologicznych. Jednakże warunki hodowli muszą zapewniać, że normalny rozwój może przebiegać w ograniczonym środowisku wycinka. Ilustrujemy protokół, który ułatwia prawidłowy rozwój rdzenia kręgowego, aby przebiegał przez co najmniej 24 godziny.

Protokół hodowli plastrów rdzenia kręgowego zarodków kurczaka

Modele hodowli komórkowych zapewniają szczegółową kontrolę nad warunkami środowiskowymi, a tym samym stanowią potężną platformę do wyjaśnienia wielu aspektów biologii komórek neuronalnych. Opisujemy szybką, niedrogą i niezawodną metodę izolacji, dysocjacji i hodowli neuronów czuciowych z zarodków piskląt. Podano również szczegółowe informacje na temat przygotowania podłoża i immunocytochemii.

Izolacja i hodowla zdysocjowanych neuronów czuciowych z zarodków piskląt

Oglądanie i dostęp do zarodka kurczaka podczas rozwoju może być wyzwaniem. Opracowaliśmy metodę ex ovo, która jest prosta, opłacalna i może być łatwo stosowana w klasie lub w środowisku badawczym. Metoda ta zapewnia dostęp do zarodka w późnych stadiach rozwoju zarodkowego (HH 40).

Zoptymalizowana hodowla ex-ovo zarodków piskląt do zaawansowanych etapów rozwoju

Ten artykuł przedstawia zaktualizowane podejście do klasycznego systemu chimery kury przepiórczej do badania formowania się narządów, poprzez połączenie nowatorskich procedur eksperymentalnych in vitro i in ovo.

Dwuetapowe podejście do badania wczesnych i późnych etapów powstawania narządów w modelu ptasim: paradygmat organogenezy grasicy i przytarczyc

Ten artykuł przedstawia metodę izolowania czystych tkanek embrionalnych z zarodków przepiórek i kurczaków, które mogą być łączone w celu utworzenia chimerycznych organów ex vivo.

Izolacja tkanek embrionalnych i tworzenie chimerycznych narządów przepiórki i kurczaka na przykładzie grasicy

Rekombinowane kończyny to potężny model eksperymentalny, który pozwala badać proces różnicowania komórek i generowania wzorców pod wpływem sygnałów embrionalnych. Protokół ten przedstawia szczegółową metodę generowania rekombinowanych kończyn z komórkami mezodermalnymi kończyn kurczaka, które można dostosować do innych typów komórek uzyskanych z różnych organizmów.

Test rekombinowanych kończyn kurczaka w celu zrozumienia morfogenezy, wzorca i wczesnych etapów różnicowania komórek

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół przeszczepu organoidów nerkowych w jamie celomicznej zarodków kurczaków. Metoda ta indukuje unaczynienie i przyspieszone dojrzewanie organoidów w ciągu 8 dni i może być wykorzystana do skutecznego badania tych procesów.

Skuteczne unaczynienie organoidów nerkowych poprzez docelomiczne przeszczepienie zarodków kurczaków

Tutaj opisujemy protokoły dla trzech typów hodowli eksplantatów skóry embrionalnej ptaków, które mogą być użyte do badania interakcji tkankowych, obrazowania 4D filmu poklatkowego (3D plus czas), globalnych lub lokalnych zaburzeń funkcji molekularnych oraz charakterystyki biologii systemów.

Wykorzystanie eksplantatów ze skóry ptaków do badania wzorców tkanek i organogenezy

Poznaj metodę hodowli organotypowej zarodkowych tkanek kurczaka do badania rozwoju oka. Ta technika umożliwia analizę interakcji między siatkówką a nabłonkiem barwnikowym w kontrolowanych warunkach in vitro bez toksycznego wpływu na cały zarodek.

Metoda hodowli organotypowej do badania rozwoju zarodkowych tkanek kurczaka

Przeglądaj więcej filmów