Metoda hodowli organotypowej do badania rozwoju zarodkowych tkanek kurczaka
August 25th, 2018
Tutaj prezentujemy protokół hodowli organotypowej do hodowli embrionalnych organów kurczaka in vitro. Za pomocą tej metody można badać rozwój zarodkowej tkanki kurczaka, przy zachowaniu wysokiego stopnia kontroli nad środowiskiem hodowli.
Ogólnym celem tego protokołu jest zapewnienie dostępu do embrionalnych oczu kurczaka w warunkach in vitro, aby umożliwić dogłębne badanie złożonych ścieżek rozwojowych w zarodku. U zarodka kurczaka badanie oka jest często trudne ze względu na rozwój powiek, ruch zarodka i wzrost dodatkowych tkanek embrionalnych. Związki takie jak leki i inhibitory mogą również mieć śmiertelny wpływ na zarodek, co utrudnia wykorzystanie tych związków do modulowania szlaków genowych.
Postępy w hodowli tkanek in vitro pozwoliły naukowcom wyizolować te tkanki i wyeliminować wiele z wyżej wymienionych barier. Nasz protokół jest korzystny, ponieważ pozwala nam badać oko jako całość, w tym wszystkie tkanki, które mają potencjał do interakcji podczas rozwoju, takie jak siatkówka nerwowa i nabłonek barwnikowy siatkówki. Rozpocznij od autoklawowania materiałów, aby upewnić się, że wszystkie roztwory i sprzęt są sterylne przed zabiegiem.
Aby to zrobić, przelej w autoklawie dwa litry wody destylowanej i jeden litr soli fizjologicznej dla kurczaków, a także pudełko chusteczek, półporowatą bibułę filtracyjną, siatkę drucianą, pojemniki na wodę i jednorazowe szklane pipety. Dokładnie wysterylizuj półki i drzwi inkubatora przy użyciu 70% etanolu, a następnie napełnij pojemniki autoklawowaną, destylowaną wodą i podgrzej inkubator do 37 stopni Celsjusza. Podgrzej pożywkę wraz z tubką antybiotyku penicyliny streptomycyny w inkubatorze.
Połóż ręcznik papierowy w poprzek miejsca pracy i wysterylizuj 70% etanolem. Wysterylizuj wszystkie kleszcze i nożyczki. Trzymając głowę kurczaka w autoklawizowanym roztworze soli fizjologicznej, przetnij głowę pisklęcia na pół w linii środkowej, pozostawiając trochę tkanki w takcie wokół każdego oka.
Dodatkowa tkanka pomoże oku utrzymać pewne napięcie w kulturze, a także pomoże w pobieraniu składników odżywczych przez oko i zapobiegnie zsuwaniu się oka z bibuły filtracyjnej. Tkanki te służą również jako punkty orientacyjne podczas orientowania oka w późniejszej analizie. Pozostaw wypreparowaną tkankę w soli fizjologicznej dla piskląt o temperaturze pokojowej podczas przygotowywania kultury.
Przygotuj danie z kulturą. Umieść dwie 35-milimetrowe szalki Petriego w jednej 100-milimetrowej szalce Petriego. Umieść jeden stolik z siatki drucianej w każdym małym naczyniu.
Umieść pół głowicy z okiem na kawałku bibuły filtracyjnej, lekko przechylając, aby oko nie zsunęło się z bibuły. Przenieś bibułę i bibułę filtracyjną na małą szalkę Petriego na stoliku z siatki drucianej. Powtórz z drugą połową głowy tego samego zarodka.
Dodaj pożywkę hodowlaną do każdej z dwóch małych szalek Petriego. Doprowadzić podłoże do poziomu bibuły. Nie zanurzaj tkanki w podłożu.
Dodaj 50 mikrolitrów roztworu podstawowego antybiotyku penicyliny streptomycyny do pożywki w każdym naczyniu, aby zapobiec infekcji bakteryjnej. Umieść złożony kawałek cienkiej chusteczki na wewnętrznej krawędzi większej szalki Petriego i zwilż go wodą destylowaną. Inkubuj kulturę w ciemnym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez okres do czterech dni.
Po przeprowadzeniu hodowli usuń tkankę z bibuły filtracyjnej i utrwal w 4% paraformaldehydzie. Pierwsza kolumna przedstawia oko HH34, reprezentujące embrionalne oko pisklęcia na początku hodowli. Druga kolumna przedstawia embrionalne oko pisklęcia hodowane przez cztery dni, począwszy od HH34.
Trzecia kolumna pokazuje oko HH38, co odpowiada czterem dniom rozwoju in ovo poza HH34. Panele od A do F są niebarwione, podczas gdy panele od G do I są barwione na obecność enzymu fosfatazy alkalicznej. Górny rząd, panele od A do C, pokazuje, że oko nadal rozwija się w całej kulturze, o czym świadczy pojawienie się pąków piór i wzrost powiek, wskazywany strzałkami w każdym panelu.
Środkowy rząd, panele od D do F, pokazuje, że brodawki spojówkowe zaczynają się degenerować w kulturze. Dolny rząd, panele od G do I, pokazuje, że czasoprzestrzenny wzorzec indukcji kosteczek twardówkowych jest utrzymywany w kulturze, służąc jako przykład ścieżki rozwojowej, którą można badać za pomocą tej metody. Protokół ten pozwala tkankom zachować kluczowe przestrzenne i czasowe aspekty rozwoju przez cały okres hodowli.
Protokół ten stanowi kluczowy postęp w hodowli całych narządów zmysłów, zapewniając alternatywną metodologię badania skomplikowanych ścieżek rozwojowych.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł przedstawia protokół kultury organotypowej zarodkowych narządów kurczaka, ze szczególnym skupieniem się na oku. Ta metoda pozwala badaczom na badanie rozwoju zarodkowych tkanek w kontrolowanym środowisku in vitro.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia rozwoju
- Techniki kultury in vitro
Tło
- Badanie zarodkowych oczu kurczaka jest wyzwaniem z powodu rozwoju powiek i ruchu zarodka.
- Dodatkowe tkanki zarodkowe komplikują analizę rozwoju oka.
- Używanie leków i inhibitorów może być śmiertelne dla zarodka, utrudniając badania.
- Techniki kultury in vitro pomagają odizolować tkanki do badań.
Cel badania
- Aby zapewnić dostęp do zarodkowych oczu kurczaka na potrzeby badań rozwojowych.
- Aby umożliwić badanie złożonych ścieżek rozwojowych.
- Aby badać interakcje między różnymi tkankami oka podczas rozwoju.
Stosowane metody
- Autoklawizowanie materiałów w celu zapewnienia sterylności.
- Kultura organotypowa zarodkowych tkanek kurczaka.
- Izolacja oka i jego współpracujących tkanek.
- Dogłębna analiza ścieżek rozwojowych.
Główne wyniki
- Protokół umożliwia badanie oka jako całości.
- Można obserwować interakcje między siatkówką nerwową a barwnikowym nabłonkiem siatkówki.
- Badania można przeprowadzać bez śmiertelnych efektów związków na zarodku.
- Zgłębienie zrozumienia procesów rozwoju oka.
Wnioski
- Protokół kultury organotypowej jest skuteczny w badaniu zarodkowych oczu kurczaka.
- Ta metoda przezwycięża bariery obecne w tradycyjnych badaniach zarodkowych.
- Stanowi platformę dla przyszłych badań nad biologią rozwoju.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Studying complex developmental pathways in vivo is often limited by embryo lethality, tissue accessibility, and compound toxicity. Organotypic culturing of embryonic chicken tissues enables isolated, controlled examination of organ-level interactions while preserving spatiotemporal developmental dynamics. This approach supports mechanistic de-risking in early discovery by providing a disease-relevant system for target validation and pathway interrogation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by maintaining tissue architecture and intercellular signaling during development.
- Operational Value: Reduces reliance on whole-embryo models, minimizing variability from embryo movement and lethal compound exposure.
- Predictive Value: Supports functional target validation by allowing dose-response testing of inhibitors and drugs in a viable tissue context.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a standardized platform for quantitative readouts of tissue morphology and biomarker expression over time.
- Operational Value: Facilitates assay reproducibility through sterile, defined culture conditions and consistent tissue preparation.
- Scalability Value: Enables parallel processing of multiple half-head cultures for comparative compound screening.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Maintains disease-relevant developmental timelines, allowing correlation with in-ovo stages such as HH34 to HH38.
- Mechanistic De-risking: Preserves spatiotemporal patterns like scleral ossicle induction, supporting biomarker-aligned pathway analysis.
- Continuity Value: Bridges discovery and preclinical workflows by enabling longitudinal observation of tissue degeneration and maturation.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target validation to preclinical evaluation by providing a reproducible system for developmental pathway analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of gene pathways through localized compound application without systemic embryo toxicity.
- Screening: Enables standardized, quantitative assessment of tissue responses to pharmacological modulators.
- Analytics: Generates measurable outputs including tissue structural changes, degeneration patterns, and enzyme expression profiles.
- Translational Research: Aligns with preclinical validation by maintaining developmental progression comparable to in-ovo timelines.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying sensory organ development across multiple projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by preserving native tissue interactions and developmental kinetics.
- Operational Value: Enhances reproducibility through sterile technique, defined media, and controlled incubation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing false positives from embryo lethality or compensatory mechanisms.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated developmental pathway modulation.
Implementation Considerations
- Requires aseptic technique and access to autoclave, incubator, and sterile dissection tools.
- Dependent on consistent embryo staging and nutrient medium preparation.
- Necessitates standardization of tissue orientation and filter paper placement for reliable imaging.
- Limited to ex vivo culture duration of up to four days before significant tissue degeneration.
- Requires optimization for specific readouts such as immunofluorescence or enzymatic staining.
