Metoda hodowli organotypowej do badania rozwoju zarodkowych tkanek kurczaka

Ogólnym celem tego protokołu jest zapewnienie dostępu do embrionalnych oczu kurczaka w warunkach in vitro, aby umożliwić dogłębne badanie złożonych ścieżek rozwojowych w zarodku. U zarodka kurczaka badanie oka jest często trudne ze względu na rozwój powiek, ruch zarodka i wzrost dodatkowych tkanek embrionalnych. Związki takie jak leki i inhibitory mogą również mieć śmiertelny wpływ na zarodek, co utrudnia wykorzystanie tych związków do modulowania szlaków genowych.

Postępy w hodowli tkanek in vitro pozwoliły naukowcom wyizolować te tkanki i wyeliminować wiele z wyżej wymienionych barier. Nasz protokół jest korzystny, ponieważ pozwala nam badać oko jako całość, w tym wszystkie tkanki, które mają potencjał do interakcji podczas rozwoju, takie jak siatkówka nerwowa i nabłonek barwnikowy siatkówki. Rozpocznij od autoklawowania materiałów, aby upewnić się, że wszystkie roztwory i sprzęt są sterylne przed zabiegiem.

Aby to zrobić, przelej w autoklawie dwa litry wody destylowanej i jeden litr soli fizjologicznej dla kurczaków, a także pudełko chusteczek, półporowatą bibułę filtracyjną, siatkę drucianą, pojemniki na wodę i jednorazowe szklane pipety. Dokładnie wysterylizuj półki i drzwi inkubatora przy użyciu 70% etanolu, a następnie napełnij pojemniki autoklawowaną, destylowaną wodą i podgrzej inkubator do 37 stopni Celsjusza. Podgrzej pożywkę wraz z tubką antybiotyku penicyliny streptomycyny w inkubatorze.

Połóż ręcznik papierowy w poprzek miejsca pracy i wysterylizuj 70% etanolem. Wysterylizuj wszystkie kleszcze i nożyczki. Trzymając głowę kurczaka w autoklawizowanym roztworze soli fizjologicznej, przetnij głowę pisklęcia na pół w linii środkowej, pozostawiając trochę tkanki w takcie wokół każdego oka.

Dodatkowa tkanka pomoże oku utrzymać pewne napięcie w kulturze, a także pomoże w pobieraniu składników odżywczych przez oko i zapobiegnie zsuwaniu się oka z bibuły filtracyjnej. Tkanki te służą również jako punkty orientacyjne podczas orientowania oka w późniejszej analizie. Pozostaw wypreparowaną tkankę w soli fizjologicznej dla piskląt o temperaturze pokojowej podczas przygotowywania kultury.

Przygotuj danie z kulturą. Umieść dwie 35-milimetrowe szalki Petriego w jednej 100-milimetrowej szalce Petriego. Umieść jeden stolik z siatki drucianej w każdym małym naczyniu.

Umieść pół głowicy z okiem na kawałku bibuły filtracyjnej, lekko przechylając, aby oko nie zsunęło się z bibuły. Przenieś bibułę i bibułę filtracyjną na małą szalkę Petriego na stoliku z siatki drucianej. Powtórz z drugą połową głowy tego samego zarodka.

Dodaj pożywkę hodowlaną do każdej z dwóch małych szalek Petriego. Doprowadzić podłoże do poziomu bibuły. Nie zanurzaj tkanki w podłożu.

Dodaj 50 mikrolitrów roztworu podstawowego antybiotyku penicyliny streptomycyny do pożywki w każdym naczyniu, aby zapobiec infekcji bakteryjnej. Umieść złożony kawałek cienkiej chusteczki na wewnętrznej krawędzi większej szalki Petriego i zwilż go wodą destylowaną. Inkubuj kulturę w ciemnym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez okres do czterech dni.

Po przeprowadzeniu hodowli usuń tkankę z bibuły filtracyjnej i utrwal w 4% paraformaldehydzie. Pierwsza kolumna przedstawia oko HH34, reprezentujące embrionalne oko pisklęcia na początku hodowli. Druga kolumna przedstawia embrionalne oko pisklęcia hodowane przez cztery dni, począwszy od HH34.

Trzecia kolumna pokazuje oko HH38, co odpowiada czterem dniom rozwoju in ovo poza HH34. Panele od A do F są niebarwione, podczas gdy panele od G do I są barwione na obecność enzymu fosfatazy alkalicznej. Górny rząd, panele od A do C, pokazuje, że oko nadal rozwija się w całej kulturze, o czym świadczy pojawienie się pąków piór i wzrost powiek, wskazywany strzałkami w każdym panelu.

Środkowy rząd, panele od D do F, pokazuje, że brodawki spojówkowe zaczynają się degenerować w kulturze. Dolny rząd, panele od G do I, pokazuje, że czasoprzestrzenny wzorzec indukcji kosteczek twardówkowych jest utrzymywany w kulturze, służąc jako przykład ścieżki rozwojowej, którą można badać za pomocą tej metody. Protokół ten pozwala tkankom zachować kluczowe przestrzenne i czasowe aspekty rozwoju przez cały okres hodowli.

Protokół ten stanowi kluczowy postęp w hodowli całych narządów zmysłów, zapewniając alternatywną metodologię badania skomplikowanych ścieżek rozwojowych.