Name: Reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją w monokomórkach po patch-clamp (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Poznaj metodę RT-PCR w pojedynczych komórkach po patch-clamp w badaniach neuronów piramidowych warstwy piątej. Technika ta umożliwia analizę profilu ekspresji genów z jednej komórki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Dr. Alexandre Mourot za komentarze do manuskryptu. Prace te były wspierane przez dotacje z Agence Nationale de la Recherche (ANR 2011 MALZ 003 01; ANR-15-CE16-0010 i ANR-17-CE37-0010-03), BLG jest wspierany przez stypendium Fondation pour la Recherche sur Alzheimer. Dziękujemy ośrodku dla zwierząt IBPS (Paryż, Francja).

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Multipleksowy RT-PCR z pojedynczą komórką po patch-clampie może jednocześnie i niezawodnie badać ekspresję ponad 30 genów w elektrofizjologicznie zidentyfikowanych komórkach5. Analiza ekspresji genów na poziomie pojedynczej komórki wymaga wysoce wydajnych starterów PCR. Jednym z najbardziej ograniczających kroków jest zebranie zawartości komórki. Jej skuteczność zależy od średnicy końcówki pipety z plastrem, która musi być jak największa, a jednocześnie dopasowana do wielkości komórki. Udowodniono...

Kora mózgowa składa się z wielu typów komórek zaangażowanych w różne procesy fizjologiczne. Ich identyfikacja i charakterystyka, warunek wstępny do zrozumienia ich specyficznych funkcji, może być bardzo trudna, biorąc pod uwagę dużą różnorodność morfologiczną, fizjologiczną i molekularną, która charakteryzuje typy komórek korowych1,2,3,4.
Jednokomórkowy multipleksowy RT-PCR opiera się na połączeniu technik patch-clamp i RT-PCR. Może jednocześnie badać ekspresję ponad 30 predefiniowanych genów w elektrofizjologicznie zidentyfikowanych komórkach5. Włączenie znacznika neuronalnego do pipety rejestrującej dodatkowo pozwala na morfologiczną charakterystykę zarejestrowanych komórek po odkryciu histochemicznym6,7,8,9,10. Jest to bardzo przydatna technika klasyfikacji typów neuronów na podstawie wielowymiarowej analizy ich cech fenotypowych5,9,10,<sup class="xref">11,12,13,14. Jednokomórkowy multipleksowy RT-PCR nadaje się również do charakteryzacji komórek nieneuronalnych, takich jak astrocyty15,16,17, i może być praktycznie stosowany do każdej struktury mózgu18,19,20,21,22,23 i typ komórki, zakładając, że można je zapisać w konfiguracji całej komórki.
Ta technika jest bardzo wygodna do identyfikacji źródeł komórkowych i/lub celów systemów transmisyjnych7,8,15,16,20,21,24,25,26,27,28, zwłaszcza gdy brakuje specyficznych przeciwciał. Opiera się na nagraniach patch-clamp z wizualnie zidentyfikowanych komórek29, a tym samym umożliwia również celowanie w komórki w określonym środowisku komórkowym8,15,16. Ponadto, ponieważ cytoarchitektura tkanki mózgowej jest zachowana w wycinkach mózgu, podejście to umożliwia również badanie anatomicznych relacji charakteryzowanych komórek z elementami neuronalnymi i nieneuronalnymi7,8,18.
Ponieważ ta technika jest ograniczona ilością pobranej cytoplazmy i wydajnością RT, wykrycie mRNA wyrażonego przy niskiej liczbie kopii może być trudne. Chociaż inne podejścia oparte na technologii RNaseq pozwalają na analizę całego transkryptomu pojedynczych komórek3,4,30,31, wymagają drogich sekwenatorów o wysokiej przepustowości, niekoniecznie dostępnych dla każdego laboratorium. Ponieważ technika RT-PCR z multipleksem jednokomórkowym wykorzystuje PCR w punkcie końcowym, wymaga jedynie powszechnie dostępnych termocyklerów. Można go łatwo opracować w laboratoriach wyposażonych w zestawy elektrofizjologiczne i nie wymaga drogiego sprzętu. Może dostarczyć w ciągu jednego dnia jakościową analizę ekspresji predefiniowanego zestawu genów. W ten sposób podejście to zapewnia łatwy dostęp do charakterystyki molekularnej pojedynczych komórek w szybki sposób.

<table><tbody><tr><td>MACAW v.2.0.5</td><td>NCBI</td><td></td><td>Wielokrotne wyrównanie do projektowania podkładu</td></tr><tr><td>Ditiothreitol</td><td>VWR</td><td>443852A</td><td>RT</td></tr><tr><td>Losowe startery</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>11034731001</td><td>RT</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-4065-52</td><td>RT i PCR</td></tr><tr><td>RNasin Inhibitory rybonukleazy</td><td>Promega</td><td>N2511</td><td>RT</td></tr><tr><td>SuperScript II Odwrotna transkryptaza</td><td>Invitrogen</td><td>18064014</td><td>RT</td></tr><tr><td>Taq DNA Polimeraza</td><td>Qiagen</td><td>201205</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Olej mineralny</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>M5904-5ML</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Startery</td><td>PCR Sigma-Aldrich (Merck)</td><td></td><td>PCR / odsolone i rozcieńczone w 200 &mikro; </td></tr><tr><td>M Probówki, 0,5 mL, płaska nakrętka</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AB0350</td><td>RT i PCR</td></tr><tr><td>BT10 Series - 10 &micro; L Końcówka filtra</td><td>Neptune Scientific</td><td>BT10</td><td>RT i PCR</td></tr><tr><td>BT20 Series - 20 & mikro; L Końcówka filtra</td><td>Neptune Scientific</td><td>BT20</td><td>RT i PCR</td></tr><tr><td>BT200 Series - 200 &micro; L Końcówka filtra</td><td>Neptune Scientific</td><td>BT200</td><td>RT i PCR</td></tr><tr><td>BT1000 Series - 1000 &micro; L Końcówka filtra</td><td>Neptune Scientific</td><td>BT1000.96</td><td>RT i PCR</td></tr><tr><td>DNA Thermal Cylcer</td><td>Perkin Elmer Cetus</td><td></td><td>PCR</td></tr><tr><td>Bromek etydyny</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td> <td>E1510-10ML</td><td>Elektroforeza w żelu agarozowym</td></tr><tr><td>Bufor Tris-Boran-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td> <td>T4415-1L</td><td>Elektroforeza w żelu agarozowym</td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Life Technologies</td><td>16500-500</td><td>Elektroforeza w żelu agarozowym</td></tr><tr><td>&Phi; X174 DNA-Hae III Digest</td><td>NEB (New England BioLabs)</td><td>N3026S</td><td>Elektroforeza w żelu agarozowym</td></tr><tr><td>EDA 290</td><td>Kodak</td><td></td><td>Elektroforeza w żelu agarozowym</td></tr><tr><td>Elektroforeza Zasilanie EPS 3500</td><td>Pharmacia Biotech</td><td></td><td>Elektroforeza w żelu agarozowym</td></tr><tr><td>Midi Pozioma jednostka elekroforezy Model SHU13</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td></td><td>Elektroforeza w żelu agarozowym</td></tr><tr><td>Gładki papier o satynowym wyglądzie</td><td>Fisherbrand</td><td>1748B</td><td>Wewnętrzny roztwór zacisku krosowego</td></tr><tr><td>Hydroksyd potasu</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>60377</td><td>Roztwór wewnętrzny</td>zacisku</tr><tr><td>krosowego Glikol etylenowy-bis(2-aminoetyloeter)-N,N,N&prime;,N&prime;-tetraoctowy</td><td>Kwas Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>E3889</td><td>Wewnętrzny roztwór zacisku krosowego</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>H4034</td><td>Roztwór wewnętrzny zacisku krosowego</td></tr><tr><td>D-glukonian potasu</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>G4500</td><td>Roztwór wewnętrzny zacisku krosowego</td></tr><tr><td>Roztwór chlorku magnezu</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>M1028</td><td>Roztwór wewnętrzny zacisku krosowego</td></tr><tr><td>5500 Osmometr ciśnienia pary</td><td>Wescor</td><td></td><td>Roztwór wewnętrzny zacisku krosowego</td></tr><tr><td>Biocytyna</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>B4261</td><td>Wewnętrzny roztwór zacisku krosowego</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>S5016</td><td>Przygotowanie plastra</td></tr><tr><td>D-(+)-Glukoza jednowodna</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>49159</td><td>Przygotowanie plastrów</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>S6191</td><td>Przygotowanie plastrów</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>60128</td><td>Przygotowanie plastrów</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>31437-M</td><td>Przygotowanie plastrów</td></tr><tr><td>Fosforan sodu jednozasadowy</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>S5011</td><td>Przygotowanie plastrów</td></tr><tr><td>Roztwór chlorku magnezu</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>63069</td><td>Przygotowanie plastrów</td></tr><tr><td>Roztwór chlorku wapnia</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>21115</td><td>Przygotowanie</td></tr> <tr>plastrów<td>Kwas kynureninowy</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>K3375</td><td>Przygotowanie plastrów</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Piramal Healthcare UK</td><td></td><td>Przygotowanie plastrów</td></tr><tr><td>VT 1000S</td><td>Leica Biosystems</td><td>14047235613</td><td>Przygotowanie plastrów</td></tr><tr><td>Roztwór nadtlenku wodoru</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>H1009</td><td>Czyszczenie ustawień zacisku krosowego</td></tr><tr><td>Cienkościenne szklane kapilary z żarnikiem</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW150F-4</td><td>Zacisk krosowy</td></tr><tr><td>PP-83</td><td>Zacisk krosowy</td><td>Narishige</td><td></td></tr><tr><td>Mikroładowarka Eppendorf</td> Zacisk <td>krosowy</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td></tr><tr><td>BX51WI Mikroskop pionowy</td> Zacisk <td>krosowy</td><td>Olympus</td><td></td></tr><tr><td>XC-ST70/CE CCD CZARNO-BIAŁA KAMERA WIDEO</td> Zacisk <td>krosowy</td><td>Sony</td><td></td></tr><tr><td>Axopatch 200B Wzmacniacz</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>Zacisk krosowy</td>Digidata 1440 Urządzenia molekularne Zacisk krosowy pCLAMP 10 pakiet oprogramowania Urządzenia molekularne Patch Clamp 10 ml strzykawka Terumo SS-10ES Wydalanie serii E z prostym korpusem (uchwyt)Phymep 64-0997 Wydalanie dwuzasadowego fosforanu sodu <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>S7907</td><td>Rewelacja histochemiczna</td></tr><tr><td>Fosforan sodu jednozasadowy</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>S8282</td><td>Rewelacja histochemiczna</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>P6148</td><td>Rewelacja histochemiczna</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>X100</td><td>Objawienie histochemiczne</td></tr><tr><td>Żelatyna ze skóry</td> <td>ryb zimnowodnychSigma-Aldrich (Merck)</td><td>G7041</td><td>Rewelacja histochemiczna</td></tr><tr><td>Streptawidyna, koniugat Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S11223</td><td>Objawienie histochemiczne</td></tr><tr><td>Płytka 24-dołkowa</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662160</td><td>Rewelacja histochemiczna</td></tr></tbody></table>

reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją w monokomórkach po patch-clamp

Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp

Kora mózgowa składa się z wielu typów komórek wykazujących różne cechy morfologiczne, fizjologiczne i molekularne. Ta różnorodność utrudnia łatwą identyfikację i charakterystykę tych typów komórek, co jest warunkiem wstępnym do badania ich specyficznych funkcji. W artykule opisano protokół multipleksowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-PCR) w multipleksie, który pozwala, po zapisie patch-clamp w plasterkach, na jednoczesne wykrycie ekspresji kilkudziesięciu genów w jednej komórce. Ta prosta metoda może być stosowana z charakterystyką morfologiczną i ma szerokie zastosowanie do określania cech fenotypowych różnych typów komórek i ich szczególnego środowiska komórkowego, np. w pobliżu naczyń krwionośnych. Zasada tego protokołu polega na zarejestrowaniu komórki za pomocą techniki patch-clamp, zebraniu i odwrotnej transkrypcji jej zawartości cytoplazmatycznej oraz jakościowym wykryciu ekspresji predefiniowanego zestawu genów za pomocą multipleksowego PCR. Wymaga starannego zaprojektowania starterów PCR i wewnątrzkomórkowego roztworu patch-clamp kompatybilnego z RT-PCR. Aby zapewnić selektywne i niezawodne wykrywanie transkryptów, technika ta wymaga również odpowiednich kontroli, od zbierania cytoplazmy po etapy amplifikacji. Chociaż omówione tutaj środki ostrożności muszą być ściśle przestrzegane, praktycznie każde laboratorium elektrofizjologiczne może korzystać z techniki multipleksowej pojedynczej komórki RT-PCR.

Reprezentatywną walidację metody multipleksowej RT-PCR przedstawiono na Rysunku 3. Protokół został opracowany w celu jednoczesnego zbadania ekspresji 12 różnych genów. Pęcherzykowy transporter glutaminianu vGluT1 został przyjęty jako kontrola pozytywna dla neuronów glutaminergicznych42. Enzymy syntetyzujące GABA (GAD65 i GAD 67), neuropeptyd Y (NPY) oraz somatostatyna (SOM) służyły jako markery interneuronów GABAergicznych<sup class="x...

Ten protokół opisuje kluczowe kroki i środki ostrożności wymagane do przeprowadzenia reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją w pojedynczej komórce po patch-clamp. Technika ta jest prostą i skuteczną metodą analizy profilu ekspresji z góry określonego zestawu genów z pojedynczej komórki, charakteryzującego się zapisami patch-clamp.

Reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją w monokomórkach po patch-clamp

The cerebral cortex is composed of numerous cell types exhibiting various morphological, physiological, and molecular features. This diversity hampers ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w badaniach neurobiologicznych, takie jak charakterystyka populacji neurologicznej lub identyfikacja źródeł i celów systemów transmisyjnych. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona szybko i łatwo określić profil ekspresji wstępnie wybranego zestawu genów z pojedynczej komórki. Tak więc ta metoda może zapewnić wgląd w losową mysz różnorodności.Może być również stosowany do innych typów komórek, takich jak astrocyty i w wielu modelach zwierzęcych. Ta demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ kroki zatrzymujące i aspirujące mogą być trudne do nauczenia, ponieważ dane wymagają pewnej ilości cytoplazmy do analizy. Przed sekcją przygotuj zestaw do preparacji zawierający nożyczki chirurgiczne, nożyczki do cienkiej tęczówki, dwie szpatułki, kleszcze, krążek z filtrem papierowym i klej cyjanoakrylowy.Następnie nasącz roztwór do cięcia na zimno lodem Carbogyn i schłodzić komorę tnącą w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Następnie usuń skórę głowy zwierzęcia i otwórz czaszkę. Ostrożnie wyekstrahuj mózg i umieść go w małej zlewce wypełnionej karbogenicznym roztworem do cięcia na zimno z lodu.Następnie wyjmij ko

single-cell-multiplex-reverse-transcription-polymerase-chain-reaction

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Niezawodna metoda wysokowydajnej ekspresji in vitro i następującego po niej zapisu elektrofizjologicznego rekombinowanych napięciowo zależnych kanałów jonowych w hodowlach ludzkich komórek embrionalnej nerki (HEK-293T).

Zoptymalizowana strategia transfekcji dla ekspresji i rejestracji elektrofizjologicznej rekombinowanych napięciowo zależnych kanałów jonowych w komórkach HEK-293T

W pierwszej kolejności neurony są charakteryzowane elektrofizjologicznie. Następnie z rejestrowanego neuronu aspiruje się cytoplazmę i poddaje ją analizie RT-PCR w celu wykrycia ekspresji mRNA dla enzymów syntezy neuroprzekaźników, kanałów jonowych oraz receptorów.

Profilowanie ekspresji mRNA napięciowo zależnych kanałów potasowych w neuronach istoty czarnej z wykorzystaniem technik jedno-komórkowego RT-PCR

Profilowanie ekspresji pojedynczych komórek umożliwia szczegółową analizę ekspresji genów w poszczególnych komórkach. Opisujemy metody izolacji kardiomiocytów oraz przygotowania otrzymanych lizatów do analizy całego transkryptomu za pomocą mikromacierzy lub qPCR specyficznych celów.

Profilowanie transkrypcyjne pojedynczych komórek kardiomiocytów dorosłej myszy

Opisano metodę izolacji pojedynczych komórek siatkówki oraz następującej po niej amplifikacji ich cDNA. Transkryptomika pojedynczych komórek pozwala określić stopień heterogeniczności komórkowej występującej w tkance oraz odkryć nowe geny markerowe dla rzadkich populacji komórek. Dołączony protokół można dostosować do wielu różnych typów komórek.

Profilowanie pojedynczych komórek rozwijających się i dojrzałych neuronów siatkówki

Ten protokół opisuje technikę zwaną elektrofizjologią klamer całokomórkowych, która jest metodą badania właściwości elektrycznych neuronów Mauthnera i innych komórek siateczkowo-rdzeniowych w zarodkach danio pręgowanego.

Elektrofizjologia klamer krosowych całych komórek: metoda badania właściwości elektrycznych neuronów

Wieloelektrodowe nagrania patch-clamp stanowią skomplikowane zadanie. Pokazujemy tutaj, w jaki sposób, poprzez automatyzację wielu etapów eksperymentu, można przyspieszyć proces prowadzący do jakościowej poprawy wydajności i liczby nagrań.

Wspomagany komputerowo wieloelektrodowy system krosówek

Tutaj opisano procedurę uzyskiwania długich odcinków zapisu prądu z jednego kanału jonowego za pomocą techniki patch-clamp dołączonej do komórki. Metoda ta pozwala na obserwację w czasie rzeczywistym wzorca konformacji kanałów otwórz-zamknij, które leżą u podstaw sygnału biologicznego. Dane te informują o właściwościach kanałów w niezakłóconych błonach biologicznych.

Jednokanałowe nagrywanie z zaciskiem krosowym dołączonym do komórki

Ten protokół opisuje, jak ocenić ekspresję dużej liczby genów na poziomie klonalnym. Jednokomórkowy RT-qPCR daje wysoce wiarygodne wyniki z dużą czułością dla setek próbek i genów.

Ekspresja genów w pojedynczej komórce za pomocą multipleksu RT-qPCR w celu scharakteryzowania heterogeniczności rzadkich populacji limfoidalnych

Ten artykuł opisuje, jak selektywność jonowa rodopsyny kanałowej jest określana za pomocą elektrofizjologicznych zapisów całokomórkowych z użyciem komórek HEK293. W tym miejscu przedstawiono eksperymentalną procedurę badania selektywności chlorkowej selektywnej dla anionów rodopsyny kanałowej. Procedura ta może być jednak przenoszona na inne rodopsyny kanałowe o wyraźnej selektywności.

Zapisy całokomórkowe patch-clamp do elektrofizjologicznego oznaczania selektywności jonowej w rodopsynach kanałowych

Tutaj zaprezentowaliśmy metodę sekwencjonowania mRNA z multipleksowaną pojedynczą komórką do profilowania ekspresji genów w tkankach embrionalnych myszy. Metoda sekwencjonowania mRNA pojedynczej komórki oparta na kropelkach (scRNA-Seq) w połączeniu ze strategiami multipleksowania może profilować pojedyncze komórki z wielu próbek jednocześnie, co znacznie obniża koszty odczynników i minimalizuje eksperymentalne efekty wsadowe.

Multipleksowana analiza sekwencjonowania mRNA pojedynczej komórki komórek embrionalnych myszy

Poznaj metodę RT-PCR w pojedynczych komórkach po patch-clamp w badaniach neuronów piramidowych warstwy piątej. Technika ta umożliwia analizę profilu ekspresji genów z jednej komórki.

Reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją w monokomórkach po patch-clamp

Przeglądaj więcej filmów