Reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją w monokomórkach po patch-clamp

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w badaniach neurobiologicznych, takie jak charakterystyka populacji neurologicznej lub identyfikacja źródeł i celów systemów transmisyjnych. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona szybko i łatwo określić profil ekspresji wstępnie wybranego zestawu genów z pojedynczej komórki. Tak więc ta metoda może zapewnić wgląd w losową mysz różnorodności.

Może być również stosowany do innych typów komórek, takich jak astrocyty i w wielu modelach zwierzęcych. Ta demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ kroki zatrzymujące i aspirujące mogą być trudne do nauczenia, ponieważ dane wymagają pewnej ilości cytoplazmy do analizy. Przed sekcją przygotuj zestaw do preparacji zawierający nożyczki chirurgiczne, nożyczki do cienkiej tęczówki, dwie szpatułki, kleszcze, krążek z filtrem papierowym i klej cyjanoakrylowy.

Następnie nasącz roztwór do cięcia na zimno lodem Carbogyn i schłodzić komorę tnącą w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Następnie usuń skórę głowy zwierzęcia i otwórz czaszkę. Ostrożnie wyekstrahuj mózg i umieść go w małej zlewce wypełnionej karbogenicznym roztworem do cięcia na zimno z lodu.

Następnie wyjmij komorę tnącą z minus 20 stopni Celsjusza i usuń wilgoć ręcznikiem papierowym. Ostrożnie przeprowadź sekcję mózgu, aby wyizolować obszar zainteresowania. Przyklej go do komory tnącej i dodaj karbobinowany, lodowaty roztwór do cięcia na zimno.

Za pomocą wibratonu pokrój plastry o grubości 300 mikrometrów. Przenieś plastry do komory spoczynkowej wypełnionej natlenionym roztworem do krojenia o temperaturze pokojowej i pozwól im dojść do siebie przez co najmniej 30 minut. W przypadku RT-PCR pojedynczej komórki i docelowej charakterystyki komórek, należy ograniczyć zapis całych komórek do nie dłużej niż 20 minut, aby zachować mRNAzę.

Na koniec nagrania przygotuj probówkę PCR o pojemności 500 mikrolitrów wypełnioną dwoma mikrolitrami mieszanki 5xRT i 0,5 mikrolitra 20xDTT. Zakręć nim i przechowuj na lodzie. Następnie zbierz cytoplazmę komórki, stosując delikatne podciśnienie.

Monitoruj i kontroluj zawartość komórki przed dostaniem się do pipety, zachowując szczelne zamknięcie i unikaj pobierania jądra, jeśli pod uwagę brane są niektóre geny. W przypadku genu ważne jest, aby unikać gromadzenia się jądra i dołączyć zestaw starterów mających na celu amplifikację gDNA, aby przygotować się do ogólnego zanieczyszczenia. Jeśli jądro zbliża się do końcówki pipety, zwolnij podciśnienie i odsuń pipetę.

Upewnij się, że szczelne zamknięcie jest zachowane i wznowić pobieranie cytoplazmy w nowym miejscu pipety. Następnie delikatnie wyjmij pipetę, aby utworzyć łatkę na zewnątrz, aby ograniczyć zanieczyszczenie przez zanieczyszczenia zewnątrzkomórkowe i sprzyjać zamknięciu błony komórkowej w celu późniejszej analizy histochemicznej. Należy pamiętać, że wypustki, mikromanipulatory, klawiatura komputerowa lub mysz komputerowa są naładowanymi protonami źródłami zanieczyszczenia rnazą.

Jeśli zostały dotknięte podczas nagrywania, zmień rękawice. Następnie przymocuj pipetę do wytłoku i wyrzuć jego zawartość do probówki PCR, stosując nadciśnienie. Wbij końcówkę pipety do probówki PCR, aby ułatwić pobranie jej zawartości.

Następnie krótko odwirować probówkę, dodać 0,5 mikrolitra inhibitora RNAzy i 0,5 mikrolitra RTAse. Delikatnie wymieszaj, ponownie odwiruj i inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia zakręć probówką i przechowuj ją w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez okres do kilku miesięcy.

Do czasu analizy PCR i wykonania pierwszego kroku amplikacji. Aby zwalidować PCR, wymieszaj i rozcieńcz parę starterów, dodaj jeden mikromolowiec za pomocą pipety przeznaczonej do jednokomórkowego RTPCR. Ustaw termocykler na trzy minuty w temperaturze 95 stopni Celsjusza, uruchom 40 cykli, a następnie ostatni etap wydłużania w temperaturze 72 stopni Celsjusza na pięć minut.

Aby zminimalizować powstawanie dimerów starterów, wykonaj gorący start, umieszczając probówki PCR w termocyklerze nagrzanym do 95 stopni Celsjusza. Po 30 sekundach szybko wylej 20 mikrolitrów mieszanki podkładowej na olej. Po zweryfikowaniu pary starterów przetestuj ją za pomocą protokołu multipleksu.

Wymieszać i rozcieńczyć zewnętrzny starter w jednym mikromolu. Mieszankę podkładową multiplex należy przechowywać w temperaturze ujemnej 20 stopni Celsjusza przez okres do kilku tygodni. Następnie przygotuj mieszankę wstępną i umieść ją na lodzie.

Przesuń probówkę do PCR, odkręć ją i dodaj dwie krople oleju mineralnego. Po trzech minutach w temperaturze 95 stopni Celsjusza uruchom 20 cykli PCR. Wykonać gorący rozruch zgodnie z opisem z 20 mikrolitrami multipleksowej mieszanki starterów.

Następnie należy przygotować liczbę probówek PCR identyczną z liczbą analizowanych genów. Przygotować mieszankę wstępną, używając jednego mikrolitra pierwszego produktu PCR na gen jako matrycy. Dostosuj wszystkie objętości do liczby genów do analizy i rozważ użycie 10% dodatkowej objętości, aby skompensować błędy pipetowania.

Delikatnie wstrząśnij, odkręć probówkę i wyślij 80 mikrolitrów premiksu do każdej probówki PCR. Dodaj dwie krople oleju mineralnego na tubkę, nie dotykając ścianki ani nakrętki tubek. Uruchom 35 cykli PCR, a następnie wykonaj gorący start, wyrzucając 20 mikrolitrów wewnętrznej mieszanki starterów.

Przeanalizuj drugie projekty PCR za pomocą elektroforezy w żelu aragose. Neuron piramidowy warstwy piątej został wizualnie zidentyfikowany przez dużą somę i wydatny dendryt wierzchołkowy. Zapis za pomocą ogniw ciągnących ujawnił typowe właściwości elektrofizjologiczne regularnych neuronów impulsowych warstwy piątej o niskiej rezystancji wejściowej, długotrwałych potencjałach czynnościowych i wyraźnej adaptacji do częstotliwości skoków.

Analiza molekularna tego neuronu ujawniła ekspresję vGluT1, potwierdzając jego glutamitygiczny fenotyp. Neuron ten wykazywał również ekspresję somatostatyny i ATP1-alfa-1 oraz trzech podjednostek sodowo-potasowych ATPA. Znakowanie biocytyną zarejestrowanych neuronów potwierdziło morfologię piramidalną.

Zgodnie z oczekiwaniami dotyczącymi neuronów glutamityggicznych, analiza molekularna 26 komórek piramidowych warstwy piątej ujawniła ekspresję vGluT1, ale żadnego z dwóch. Raz technikę można wykonać w ciągu dwóch dni, jeśli jest prawidłowo uformowana. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby zachować szczególną ostrożność, aby uniknąć zanieczyszczeń.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak sondować ekspresję 10 genów jednocześnie z pojedynczych komórek charakteryzujących się grudkami łat zgodnie z wycinkami mózgu, po pobraniu cytoplazmy, odwrotnej transkrypcji i PCR na gorąco. Nie zapominaj, że praca z bromkiem etydyny może być bardzo niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek i fartuchów laboratoryjnych.