Name: Badanie kiełkowania teliosporu za pomocą analizy mikrooddychania i mikrodysekcji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Poznaj metody badania kiełkowania teliospor grzybów smutowych poprzez analizę mikrooddychania i mikrodysekcję. Technika ta pozwala izolować zarodniki na różnych etapach germinacji i identyfikować zmiany metaboliczne kluczowe dla kontroli rozprzestrzeniania chorób.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Dr. Paulowi Frostowi za korzystanie z jego mikrorespirometru oraz Nicole Wagner i Alexowi Bellowi za pomoc techniczną. Praca ta została sfinansowana z grantu NSERC dla B.J.S.

1. Zakażenie kolbą kukurydzy
<ol>
	<li>Uprawiaj Zea mays (odmiana Golden Bantam), aż uformują się kolby i zaczną się jedwabić (około 60 dni).</li>
	<li>Szczepy haploidalne U. maydis kompatybilne z kulturą przy użyciu standardowych protokołów, jak opisano wcześniej7.</li>
	<li>Infekuj kolby kukurydzy przy użyciu standardowych protokołów, jak opisano wcześniej7.</li>
</ol>
2. Zbieranie teliospore
<ol>
	<li>Wyposażenie autoklawu (lejki Büchnera, kolby Büchnera, blendery, butelki wirówkowe o pojemności 250 ml, płaskie szpatułki i woda) przy użyciu standardowego cyklu suszenia z co najmniej 30-minutową sterylizacją w temperaturze 121 °C (standardowy cykl ciekły dla wody).</li>
	<li>Usuń zainfekowane kolby z roślin (około 28-35 dni po infekcji) za pomocą brzytwy i umieść kolby na tacy pokrytej ochraniaczem ławki.</li>
	<li>Usuń guzy z kolb za pomocą żyletki i zbierz w zlewce.</li>
	<li>Napełnij kubek blendera laboratoryjnego o pojemności 250 ml guzami do około 1/3 wypełnienia i dodaj autoklawowany dH2O, aż kubek blendera będzie wypełniony w około 3/4. Zakłócić guzy, pulsując blenderem na niskim poziomie, aż do homogenizacji.</li>
	<li>Podłączyć pompę próżniową do syfonu, a następnie do kolby Büchnera o pojemności 1 l.</li>
	<li>Włóż duży lejek Büchnera do kolby i wyłóż dno lejka Büchnera czterema warstwami gazy.</li>
	<li>Włącz pompę próżniową.</li>
	<li>Przelej porcję homogenizowanych guzów przez gazę i zeskrob szpatułką.</li>
	<li>Wlej trochę dH2O do gazy, aby przepłukać teliospory.</li>
	<li>Powtarzaj, aż dH2O przechodzące przez gazę będzie klarowne.</li>
	<li>Wyciśnij gazę zawierającą homogenizowany materiał nowotworowy do filtra, aby zapewnić maksymalny powrót do telioporu.</li>
	<li>Gdy 1-litrowa kolba Büchnera zbliża się do napełnienia, należy ją przelać do dużej kolby Erlenmeyera i odłożyć na bok.</li>
	<li>Włóż nowy kawałek gazy do filtra i powtarzaj kroki (2.7–2.12), aż wszystkie guzy zostaną przerwane i przefiltrowane.</li>
	<li>Przefiltrowane teliospory przelać do autoklawowanych butelek wirówkowych o pojemności 250 ml i odwirować przy 1 000 x g przez 5 minut, a następnie zdekantować supernatant.</li>
	<li>Powtarzać krok 2.14, aż wszystkie przefiltrowane teliospory zostaną granulowane przez odwirowanie.</li>
	<li>Zawiesić granulki w niewielkiej ilości wody i przenieść do probówek wirówkowych o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Odwirować probówki o stężeniu 1 000 x g przez 5 minut i zdekantować supernatant.</li>
	<li>Zawiesić osad w około 50 mldH2O, odwirować probówki o sile 1 000 x g przez 5 minut i zdekantować supernatant. Delikatnie zeskrob szarą wierzchnią warstwę szpatułką i wyrzuć ją. Powtarzaj, aż na wierzchu nie będzie już szarej warstwy.</li>
	<li>Próbki należy suszyć przez noc w eksykatorze próżniowym.</li>
	<li>Wysuszone teliospory przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia.</li>
	<li>W razie potrzeby potraktuj teliospory siarczanem miedzi8 przed wywołaniem kiełkowania. Jeśli nie zostanie poddany obróbce, należy przeprowadzić dokładną analizę mikroskopową teliospory, aby potwierdzić, że próbka reprezentuje czyste teliospory i jest pozbawiona zanieczyszczeń bakteryjnych lub innych.
	<ol>
		<li>Odważyć około 50 mg teliospory w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Dodać około 1,0 ml 0,75%CuSO4 do 1,5 ml probówki mikrowirówkowej zawierającej teliopory. Pipetować w górę i w dół, aby zawiesić teliospory w roztworze CuSO4, a następnie mieszać próbkę przez 3 godziny.</li>
		<li>Odwirować próbkę o masie 2 500 x g przez 5 minut i usunąć supernatant. Zawiesić osad teliosporu sterylną wodą, powtórzyć wirowanie i usunąć supernatant.</li>
		<li>Powtórz krok 2.21.3 jeszcze dwa razy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Test żywotności i kiełkowania teliosporu
<ol>
	<li>Odważyć około 10 mg teliospory U. maydis w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, aby ocenić ich żywotność i czas kiełkowania.</li>
	<li>W komorze bezpieczeństwa biologicznego przygotować bulion z dekstrozy ziemniaczanej (PDB, 24 g/l) uzupełniony siarczanem streptomycyny (160 μg/ml).</li>
	<li>Zawiesić teliospory w 500 μl PDB. Delikatnie odpipetować, aby wymieszać i rozbić wszystkie grudki teliosporów.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę telioporu do autoklawowanej kolby Erlenmeyera o pojemności 250 ml zawierającej 10 ml PDB.</li>
	<li>Inkubować kolbę w temperaturze 28 °C, wytrząsając z prędkością 90 obr./min przez 12–16 godzin.</li>
	<li>W komorze bezpieczeństwa biologicznego należy pobrać próbkę teliospory o objętości 20 μl indukowanych do kiełkowania i przygotować szkiełko mikroskopowe.</li>
	<li>Za pomocą mikroskopu oceń wizualnie obecne etapy kiełkowania i obecność zanieczyszczenia bakteryjnego.
	<ol>
		<li>Policz liczbę teliospor w stadiach od I do V za pomocą hemocytometru i określ procent, który wykiełkował.</li>
		<li>Jeśli obecne są tylko teliospory w stadium I, należy kontynuować inkubację kolby przez łącznie 24 godziny przed oceną kiełkowania teliopore. Kontynuować inkubację przez maksymalnie 48 godzin, zanim uzna się próbkę za niezdolną do życia.</li>
		<li>Jeśli występuje zanieczyszczenie bakteryjne, uzupełnij PDB siarczanem kanamycyny (50 μg/ml) oraz siarczanem streptomycyny (160 μg/ml), a następnie powtórz kroki od 3.1 do 3.7. Jeśli zanieczyszczenie bakteryjne utrzymuje się, potraktuj teliospory siarczanem miedzi i powtórz kroki od 3.1 do 3.7.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Indukcja kiełkowania w celu monitorowania oddychania
<ol>
	<li>Zważyć równą ilość (np. 50 mg) teliospory dla każdego doświadczenia oddechowego.</li>
	<li>W komorze bezpieczeństwa biologicznego dodaj teliospory do autoklawizowanej komory oddechowej.</li>
	<li>Napełnij komorę PDB (24 g/l) uzupełnionym siarczanem streptomycyny (160 μg/ml) i siarczanem kanamycyny (50 μg/ml).</li>
	<li>Pipetować w górę i w dół, aby utworzyć zawiesinę telioporu.</li>
	<li>Umieść pokrywę komory w komorze, aby uzyskać hermetyczne uszczelnienie.</li>
</ol>
5. Uzyskiwanie pomiarów wskaźnika zużycia tlenu (OCR)
<ol>
	<li>Umieścić komorę w stojaku komory w łaźni wodnej (podgrzanej do 28 °C).</li>
	<li>Umieść sondę Ø2 w otworze komory.</li>
	<li>Monitoruj punkty danych pojawiające się w czasie rzeczywistym w programie "SensorTrace Rate" i pozwól sondzie ustabilizować się (~3 minuty po umieszczeniu sondy w komorze).</li>
	<li>Kliknij "Pomiar", aby mierzyć poziomyO2 w sposób ciągły przez 6 godzin, z pomiarami zarejestrowanymi w odstępach 2 s.</li>
	<li>Zatrzymaj pomiar i powtórz kroki 4.1–5.4 dla każdej próbki, która ma być analizowana.</li>
	<li>Wyeksportuj dane do programu Microsoft Excel, klikając "Plik | Eksport | Zapisz jako .xls".</li>
</ol>
6. Analiza danych
<ol>
	<li>Obliczać OCR
	<ol>
		<li>W wyeksportowanym pliku Excel w zakładce "Within_Rates" zapisz "Szybkość" dla każdego pomiaru komory (nmol/h).</li>
		<li>Dla każdej próbki doświadczalnej odejmij "Szybkość" ślepej komory od "Szybkości" komory próbki doświadczalnej, aby uzyskać skorygowaną wartość OCR, i weź bezwzględną wartość tej liczby.</li>
		<li>Oblicz całkowity OCR na mg teliospory, dzieląc skorygowaną bezwzględną wartość OCR przez użytą masę komórkową.</li>
		<li>Średnie wartości powtórzonej wartości "OCR na mg teliosporów" dla każdego szczepu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analizuj dane za pomocą odpowiedniej metody statystycznej (np. test t-studenta, analiza wariancji) przy użyciu programu Microsoft Excel lub innych programów statystycznych.</li>
	<li>Aby narysować surowe dane na wykresie, oblicz procent tlenu pozostałego dla każdego punktu czasowego, który chcesz narysować na wykresie. Podziel pierwszy odczyt przez sam i pomnóż przez 100 (pozostało 100% tlenu), a następnie podziel każdy kolejny odczyt przez pierwszy odczyt i pomnóż przez 100, aby uzyskać procent tlenu pozostałego w komorze.</li>
</ol>
7. Indukcja kiełkowania teliosporu w celu wyizolowania teliospory na różnych etapach kiełkowania
<ol>
	<li>Przygotować PDB (24 g/l) uzupełniony siarczanem streptomycyny (160 μg/ml) w komorze bezpieczeństwa biologicznego.</li>
	<li>Umieścić około 10 mg teliospory U. maydis w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Zawiesić teliospory w 500 μl PDB. Delikatnie odpipetować do mieszania, aż w podłożu nie będzie grudek teliospor.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę telioporu do autoklawowanej kolby Erlenmeyera o pojemności 250 ml zawierającej PDB uzupełnioną siarczanem streptomycyny.</li>
	<li>Inkubować kolbę przez noc w temperaturze 28 °C, wytrząsając z prędkością 90 obr./min.</li>
</ol>
8. Przygotowanie szalki Petriego i mikromanipulatora
<ol>
	<li>Przygotować szalkę Petriego (57cm2), pipetując rzędy kropel do przygotowania mikrokapilarnego i pobrania próbki.
	<ol>
		<li>Odpipetować 5 μl (x4) dH2O kropelek w poprzek górnej części szalki Petriego.</li>
		<li>Odpipetować 2 μl (x3) roztworu stabilizującego RNA na szalce Petriego, który ma być użyty do pobrania próbki.</li>
		<li>Odpipetować 5 μl (x30) kropelek kiełkujących teliospory na szalce Petriego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodaj 15 ml oleju mineralnego na szalkę Petriego. Przed kontynuowaniem upewnij się, że wszystkie kropelki są pokryte olejem.</li>
	<li>Przygotuj mikrokapilę o średnicy wewnętrznej 15 μm, kołnierzu 1 mm, długości 55 mm i kącie końcówki 20°, umieszczając ją w uchwycie mikrokapilary i zanurzając w oleju mineralnym, gdzie działanie kapilarne pozwoli olejowi mineralnemu dostać się do mikrokapilary. Zwolnij ciśnienie w mikrokapilarze przed doprowadzeniem go do kropli wody. Zassać, aby przygotować mikrokapilę wodą.</li>
</ol>
9. Izolacja specyficznych dla danego etapu kiełkujących teliospor
<ol>
	<li>Za pomocą elementów sterujących mikromanipulatora przenieś przygotowaną mikrokapilę do jednej z kropelek kiełkowania. Przeniknij do kropelki, opuść mikrokapilę i doprowadź ujście mikrokapilary do kiełkującego teliospora na etapie kiełkowania będącego przedmiotem zainteresowania.</li>
	<li>Powoli aspiruj, aby uchwycić kiełkujący teliospore. Przestań zasysać, gdy teliospora dostanie się do mikrokapilary. Powtarzaj, aż w mikrokapilarze znajdzie się około pięciu teliospory.</li>
	<li>Podnieś mikrokapilar za pomocą mikromanipulatora i przyłóż go do kropli zbiorczej roztworu stabilizującego RNA. Przeniknąć do kropli i wstrzyknąć teliospory do kropli.</li>
	<li>Powtarzaj kroki od 8.1 do 8.3, aż zostanie przechwyconych około 1000 teliospory.</li>
</ol>
10. Odzyskiwanie kropli kolekcji
<ol>
	<li>Odpipetować kroplę i przenieść ją do pokrywy probówki mikrowirówkowej o pojemności 2,0 ml wolnej od RNaz/DNaz. Ostrożnie usuń olej mineralny za pomocą pipety, nie naruszając kropli zbierającej.</li>
	<li>Teliospory można używać do dalszych zastosowań, takich jak izolacja RNA.</li>
</ol>

<ol><li>Saville, B. J., Donaldson, M. E., Doyle, C. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSaville%2C+BJ+%22Meiosis+-+Molecular+Mechanisms+and+Cytogenetic+Diversity%22">Meiosis - Molecular Mechanisms and Cytogenetic Diversity</a>. Swan, A. , InTech. 411-460 (2012).</li>
<li>Christensen, J. J. <a target="_blank" href="https://trove.nla.gov.au/work/14819898">Monograph Number 2</a>. , The American Phytopathological Society. Worcester, MA. (1963).</li>
<li>Caltrider, P. D., Gottlieb, D. Respiratory activity and enzymes for glucose catabolism in fungal spores. Phytopathology. 53, 1021-1030 (1963).</li>
<li>Allen, P. J. <a target="_blank" href="http://www.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev.py.03.090165.001525">Metabolic aspects of spore germination in fungi.</a> Ann. Rev. Phytopathol. 3, 313-342 (1965).</li>
<li>Warburg, O. Metabolism of tumours. Biochemische Zeitschrift. 142, 317-333 (1923).</li>
<li>Ostrowski, L. A., Saville, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+antisense+transcripts+are+linked+to+the+modulation+of+mitochondrial+function+and+teliospore+dormancy+in+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Natural antisense transcripts are linked to the modulation of mitochondrial function and teliospore dormancy in Ustilago maydis.</a> Mol Microbiol. 103 (5), 745-763 (2017).</li>
<li>Morrison, E. N., Donaldson, M. E., Saville, B. J. <a target="_blank" href="http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/07060661.2012.697077">Identification and analysis of genes expressed in the Ustilago maydis dikaryon: uncovering a novel class of pathogenesis genes.</a> Canadian Journal of Plant Pathology-Revue Canadienne De Phytopathologie. 34 (3), 417-435 (2012).</li>
<li>Doyle, C. E., Cheung, H. Y. K., Spence, K. L., Saville, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unh1%2C+an+Ustilago+maydis+Ndt80-like+protein%2C+controls+completion+of+tumor+maturation%2C+teliospore+development%2C+and+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genetics+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Unh1, an Ustilago maydis Ndt80-like protein, controls completion of tumor maturation, teliospore development, and meiosis.</a> Fungal Genetics and Biology. 94, 54-68 (2016).</li>
<li>Stade, S., Brambl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+biogenesis+during+fungal+spore+germination%3A+respiration+and+cytochrome+c+oxidase+in+Neurospora+crassa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial biogenesis during fungal spore germination: respiration and cytochrome c oxidase in Neurospora crassa.</a> J Bacteriol. 147 (3), 757-767 (1981).</li>
<li>Brambl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+developing+mitochondrial+genetic+and+respiratory+functions+in+germinating+fungal+spores%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Characteristics of developing mitochondrial genetic and respiratory functions in germinating fungal spores.</a> Biochim Biophys Acta. 396 (2), 175-186 (1975).</li>
<li>Sacadura, N. T., Saville, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+and+EST+analyses+of+Ustilago+maydis+germinating+teliospores%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genet+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene expression and EST analyses of Ustilago maydis germinating teliospores.</a> Fungal Genet Biol. 40 (1), 47-64 (2003).</li>
<li>Hilderbrand, E. M. <a target="_blank" href="https://www.jstor.org/stable/4353196">Techniques for the isolation of single microorganisms.</a> Botanical Review. 4 (12), 38(1938).</li>
<li>Seto, A. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Analysis+of+gene+transcripts+during+Ustilago+maydis+teliospore+dormancy+and+germination%22">Analysis of gene transcripts during Ustilago maydis teliospore dormancy and germination</a>. , Trent University. M.Sc. thesis (2013).</li>
<li>Fröhlich, J., König, H. <a target="_blank" href="http://www.springer.com/us/book/9783540281801">Soil Biology - Intestinal Microorganisms of Termites and Other Invertebrates</a>. König, H., Varma, A. , Springer. 425-437 (2006).</li>
<li>Choi, Y., Hyde, K., Ho, W. <a target="_blank" href="https://pdfs.semanticscholar.org/cca7/01a80499de99d3bb5f3bbf4ead24b6bf3d5d.pdf">Single spore isolation of fungi.</a> Fungal Diversity. 3, 11(1999).</li>
<li>Sherman, F. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S007668790250954X">Getting started with yeast.</a> Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology, Pt B. 350, 3-41 (2002).</li>
<li>Chen, Y., Seguin-Swartz, G. <a target="_blank" href="http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/07060660309507000">A rapid method for assessing the viability of fungal spores.</a> Canadian Journal of Plant Pathology-Revue Canadienne De Phytopathologie. 24 (2), 230-232 (2002).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych ani innych konfliktów interesów, które mogliby ujawnić.

Biotroficzne patogeny roślin podstawczaków powodują miliardy dolarów strat w uprawach rocznie. Zdecydowana większość tych patogenów wytwarza teliospory, które są integralną częścią rozprzestrzeniania się grzybów i rozmnażania płciowego. Zdobycie wiedzy na temat rozwoju i kiełkowania teliospory ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia rozprzestrzeniania się wyniszczających chorób wywoływanych przez te grzyby. W celu identyfikacji zmian molekularnych w kluczowych punktach kontrolnych opracowaliśmy metodę identyfikacji czasu z...

Grzyby smutku (Ustilaginales) składają się z ponad 1600 gatunków, które infekują trawy, w tym ważne uprawy zbóż, takie jak kukurydza, jęczmień i pszenica, powodując miliardy dolarów strat w plonach rocznie1. Grzyby te charakteryzują się wytwarzaniem teliopor, które mają ciemno zabarwione ściany komórkowe i są środkami dyspersyjnymi. Teliospory chronią materiał genetyczny podczas stresu związanego z rozprzestrzenianiem się między roślinami żywicielskimi i mogą utrzymywać się w stanie uśpienia przez lata2. W związku z tym teliospory są istotnym składnikiem rozprzestrzeniania się choroby.
W celu zbadania biologii teliosporów, nasze laboratorium wykorzystuje model grzyba smutku Ustilago maydis (U. maydis), który jest czynnikiem wywołującym chorobę 'pospolity smutek kukurydziany'. Dojrzałe teliospory U. maydis charakteryzują się zahamowaniem wzrostu, zmniejszonym metabolizmem komórkowym i niskim poziomem oddychania komórkowego3. W sprzyjających warunkach środowiskowych (np. obecność określonych cukrów) teliospory U. maydis kiełkują i dokonują mejozy, wytwarzając bazydiospory, które mogą zainicjować nowe rundy infekcji. Kiełkowanie charakteryzuje się zwiększonym oddychaniem, powrotem do aktywności metabolicznej i przejściem przez obserwowalne morfologiczne etapy kiełkowania4.
Początkowy etap kiełkowania obejmuje zwiększone oddychanie i funkcje metaboliczne, jednak nie ma morfologicznych oznak zmian. Pierwotne pomiary zmian oddechowych u U. maydis zostały przeprowadzone ponad 50 lat temu, mierząc manometrycznie zużycie tlenu za pomocą aparatu z kolby Warburga5. Opracowaliśmy nową, prostą metodę badania precyzyjnych zmian w oddychaniu podczas kiełkowania teliopore poprzez pomiar zużycia tlenu w czasie kiełkowania za pomocą mikrorespirometru typu Clark. Wcześniej używaliśmy tej metody do badania zmian częstości oddechów między haploidalnymi komórkami U. maydis typu dzikiego a mutantami z wadliwymi mitochondriami6, i dostosowaliśmy protokół tutaj, aby badać zmiany w oddychaniu teliospore podczas kiełkowania. Zapewnia to sposób na dokładne zidentyfikowanie czasu zmiany oddychania, dzięki czemu możemy celować w teliospory w odpowiednim czasie po rozpoczęciu kiełkowania w celu zbadania wczesnych zdarzeń molekularnych. Postęp kiełkowania można śledzić mikroskopijnie, gdy promycelia wyłoni się z teliosporu, ale asynchroniczna natura hamowała izolację wystarczającej liczby teliospory na danym etapie do zbadania. Opracowaliśmy technikę mikrodysekcji podobną do tych stosowanych do zapłodnienia in vitro, aby fizycznie zbierać teliospory na różnych etapach morfologicznych kiełkowania.

<table><tbody><tr><td>Siarczan streptomycyny</td><td>BioShop</td><td>STP101</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan kanamycyny</td><td>BioShop</td><td>KAN201</td><td></td></tr><tr><td>Rosół z dekstrozy ziemniaczanej</td><td>BD Difco</td><td>254920</td><td></td></tr><tr><td>1 l Blender laboratoryjny Waring</td><td></td><td>7011S</td><td></td></tr><tr><td>Gaza</td><td>VWR</td><td>470150-438</td><td></td></tr><tr><td>Eksykator polipropylenowy Nalgene z kranem</td>System mikrooddychania <td>ThermoFisher Scientific</td><td>5310-0250</td><td></td></tr><tr><td>Unisense</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Czujnik mikrooddychania (O2)</td>Wzmacniacz miernika <td>Unisense</td><td>OX10</td><td></td></tr><tr><td>MicroOptode</td><td></td><td>Unisense N/A</td><td></td></tr><tr><td>MR-CH Mały</td> czujnik <td>Unisense</td><td>MR-CHoprogramowanie</td><td></td></tr> do <tr><td>śledzenia</td> szybkości śledzenia<td>Unisense</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Stojak do mikrooddychania</td><td>Unisense</td><td>MR2-Rack</td><td></td></tr><tr><td>Mieszadło do mikrooddychania</td><td>Unisense</td><td>MR2-Co</td><td></td></tr><tr><td>System mikrodysekcji</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axio Vert.A1 Mikroskop światła odwróconego</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coarse Coarse Manipulator</td><td>Narishige</td><td>MMN-1</td><td></td></tr><tr><td>Trójosiowy wiszący joystick Olejowy mikromanipulator hydrauliczny</td><td>Narishige</td><td>MMO-202ND</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowtryskiwacz pneumatyczny</td><td>Narishige</td><td>IM-11-2</td><td></td></tr><tr><td>TransferTip (ES)</td><td>Eppendorf</td><td>5175107004</td><td></td></tr></tbody></table>

badanie kiełkowania teliosporu za pomocą analizy mikrooddychania i mikrodysekcji

Investigating Teliospore Germination Using Microrespiration Analysis and Microdissection

Grzyby smutku są czynnikami etiologicznymi wielu wyniszczających chorób rolniczych. Charakteryzują się wytwarzaniem teliospor, które są grubościennymi środkami dyspersyjnymi. Teliospory mogą pozostawać w stanie uśpienia przez dziesięciolecia. Stan spoczynku charakteryzuje się niskim tempem metabolizmu, wstrzymaną biosyntezą makromolekularną i znacznie obniżonym poziomem oddychania. Po otrzymaniu wymaganych sygnałów środowiskowych teliospory kiełkują, tworząc komórki haploidalne, które mogą zainicjować nowe rundy infekcji. Kiełkowanie telioporów charakteryzuje się wznowieniem biosyntezy makromolekularnej, zwiększonym oddychaniem i dramatycznymi zmianami morfologicznymi. Aby precyzyjnie zmierzyć zmiany w oddychaniu komórkowym we wczesnych stadiach kiełkowania, opracowaliśmy prosty protokół wykorzystujący respirometr typu Clarka. Późniejsze etapy kiełkowania wyróżniają się specyficznymi zmianami morfologicznymi, ale kiełkowanie jest asynchroniczne. Opracowaliśmy technikę mikrodysekcji, która umożliwia nam zbieranie teliospor na różnych etapach kiełkowania.

Wykorzystując metodę opartą na mikrorespirometrze typu Clarka do pomiaru zmian w oddychaniu podczas spoczynku i kiełkowania teliospor, potwierdzono, że teliospory w stanie spoczynku wykazują niski poziom oddychania (~1,075 µmol/h/mg) w porównaniu do kiełkujących teliospór (~2,614 µmol/h/mg; Rysunek 1A). Reprezentuje to ~2,4-krotną zmianę średniej szybkości oddychania pomiędzy teliosporami w stanie spoczynku a teliosporami poddanymi indukcji kiełkowania. Dodat...

Grzyby smutku powodują wiele niszczycielskich chorób rolniczych. Są rozproszone jako uśpione teliospory, które kiełkują w odpowiedzi na sygnały środowiskowe. Przedstawiamy dwie metody badania zmian molekularnych podczas kiełkowania: pomiar wzrostu oddychania w celu wykrycia aktywacji metabolicznej i ocenę zmieniających się zdarzeń molekularnych poprzez izolację teliospory na różnych etapach morfologicznych.

Badanie kiełkowania teliosporu za pomocą analizy mikrooddychania i mikrodysekcji

Smut fungi are the etiological agents of several devastating agricultural diseases. They are characterized by the production of teliospores, which are ...

Ogólnym celem przedstawionych tutaj procedur jest identyfikacja etapów kiełkowania zarodników, aby można było ocenić poziomy transkryptów genów. Analiza tych zmian dostarczy dalszych informacji na temat krytycznego etapu rozprzestrzeniania się choroby. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące przejść podczas kiełkowania teliopore, które są związane ze zmianami w poziomach transkryptów genów, a tym samym odzwierciedlają zmiany w kontroli ekspresji genów.Głównymi zaletami tej techniki jest to, że identyfikuje ona przejścia w poziomie oddychania, które nie odpowiadają widocznym przełącznikom morfologicznym i pozwala na fizyczną izolację teliospory na różnych etapach kiełkowania. Technika ta ma implikacje dla kontroli rozprzestrzeniania się patogenów, ponieważ pozwala nam zidentyfikować kluczowe przejścia w kiełkowaniu zarodników, które, jeśli zostaną zmienione, mogą blokować rozprzestrzenianie się choroby. Rozpocznij tę procedurę od zakażenia kolbami kukurydzy, zbioru telioporów, a także testu żywotności i kiełkowania telioporu, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Aby wywołać kiełkowanie, najpierw zważ równą ilość teliospory dla każdego eksperymentu oddychania. W komorze bezpieczeństwa biologicznego dodaj teliospory do autoklawizowanej komory oddechowej. Napełnij komorę bulionem z dekstrozy ziemniaczanej, uzupełnionym siarczanem streptomycyny i siarczanem kanamycyny.Pipetować w górę i w dół, aby utworzyć zawiesinę telioporu. Umieść pokrywę komory w komorze, aby uzyskać hermetyczne uszczelnienie. Aby uzyskać pomiar OCR, należy najpierw umieścić komorę w stelażu studzienki w łaźni wodnej.Następnie umieść sondę tlenową w otworze komory. Monitoruj punkty danych pojawiające się w czasie rzeczywistym w programie śledzenia czujnika. Pozwól sondzie ustabilizować się przez około trzy minuty po umieszczeniu sondy w komorze.Kliknij przycisk Zmierz, aby mierzyć poziom tlenu w sposób ciągły przez sześć godzin, z pomiarami rejestrowanymi w odstępach dwusekundowych. Zatrzymaj pomiar i powtórz te kroki dla każdej próbki, która ma być analizowana, przed wyeksportowaniem danych do programu Microsoft Excel i przeprowadzeniem analizy danych zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Umieść około 10 miligramów teliospory umatus w 1,5 mililitrowej mikroprobówce wirówkowej.Zawiesić teliospory w 500 mikrolitrach PDB uzupełnionego siarczanem streptomycyny. Delikatnie odpipetować do mieszania, aż w podłożu nie będzie grudek teliospor. Przenieść zawiesinę telioporu do automatycznie klawowanej 250-mililitrowej kolby Erlina Meyera, zawierającej PDB, uzupełnionej siarczanem streptomycyny.Inkubować kolbę przez noc w temperaturze 28 stopni Celsjusza, wstrząsając z prędkością 90 obr./min. Przygotuj szalkę Petriego, pipetując od czterech do pięciu pięciomikrolitrowych kropli wody destylowanej na wierzch szalki Petriego. Następnie na szalce Petriego należy pobrać pipetą trzy dwumikrolitrowe kropelki roztworu stabilizującego RNA, które zostaną użyte do pobrania próbki.Odpipetuj również 30 pięciomikrolitrowych kropelek kiełkujących teliospory na szalce Petriego. Dodaj 15 mililitrów oleju mineralnego do szalki Petriego. Przed kontynuowaniem upewnij się, że wszystkie kropelki są pokryte olejem.Następnie przygotuj mikrokapilę o średnicy 15 mikronów, kołnierzu o długości jednego milimetra, długości 55 mililitrów i kącie końcówki 20 stopni. Umieść go w uchwycie mikrokapilarnym i zanurz w oleju mineralnym, gdzie działanie kapilarne pozwoli olejowi mineralnemu dostać się do mikrokapilary. Zwolnij ciśnienie w mikrokapilarze przed doprowadzeniem go do kropli wody.Zassać, aby przygotować mikrokapilę wodą. Za pomocą elementów sterujących mikromanipulatora przenieś przygotowaną mikrokapilę do jednej z kropelek kiełkowania i wniknij w kropelkę. Obniż mikrokapilę i doprowadź ujście mikrokapilary do kiełkującego teliospora na etapie kiełkowania będącego przedmiotem zainteresowania.Powoli zasysaj, aby uchwycić kiełkujący teliospore. Przestań zasysać, gdy teliospora dostanie się do mikrokapilary. Powtarzaj, aż w mikrokapilarze znajdzie się około pięciu teliospory.Podnieś mikrokapilar za pomocą mikromanipulatora i przyłóż go do kropli zbiorczej roztworu stabilizującego RNA. Przeniknąć do kropelki i wstrzyknąć teliospory do kropelki. Powtarzaj te kroki, aż zostanie przechwyconych około 1 000 teliospory.Aby odzyskać pobraną kropelkę, odpipetuj kroplę i przenieś ją do pokrywy wolnej od 2,0 mililitra mikrocentralnej probówki DNA RNA. Ostrożnie przecieraj olej mineralny za pomocą pipety, nie naruszając kropli zbierającej. Teliospory mogą być teraz wykorzystywane do dalszych zastosowań, takich jak izolacja RNA.Wykres ten ilustruje typowy wynik oceny zmian poziomu tlenu w zawiesinach teliospory indukowanych do kiełkowania. W stosunku do teliospor nieindukowanych, separacja wskazująca na początek oddychania następuje po około 30 minutach. Biorąc pod uwagę, że ustawienie i transport próbki do sondy tlenowej zajmuje około 15 minut, czas ten wynosi w rzeczywistości 45 minut.Pokazano tutaj pięć etapów kiełkowania teliospore. W pierwszym etapie teliospory są indukowane do kiełkowania, ale nie wykazują morfologicznych oznak kiełkowania. Stadium drugie teliospory pokazują wyłoniony promycelium o długości mniejszej niż średnica teliospory.W trzecim etapie długość promycelium jest większa niż średnica teliosporu. Etap czwarty charakteryzuje się promycelią z przyczepionymi bazydiosporami. A w piątym etapie pojawiają się pączkujące bazydiospory.Tutaj pokazano asynchronicznie kiełkujące teliospory, a mikrokapilar jest umieszczony w pobliżu teliosporu trzeciego stopnia. Teliospora trzeciego stopnia jest następnie zasysana do mikrokapilary i przenoszona do kropli roztworu zbiorczego. Po opanowaniu, ta technika mikrodysekcji może być wykorzystana do wyizolowania 1000 specyficznych dla stadium teliospory w ciągu sześciu do siedmiu godzin.Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o częstych przerwach. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak fizycznie izolować zarodniki na morfologicznie odrębnych etapach kiełkowania. I określ czas rozpoczęcia oddychania.Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności z koniecznością utrzymania bezpłodności. I potrzeba cierpliwości i izolowania typów komórek poprzez mikropreparację. Rozwój tej techniki toruje drogę patologom grzybów do zbadania morfologicznych i molekularnych aspektów kiełkowania niszczycielskich grzybów pleśni i rdzy, które zagrażają globalnemu bezpieczeństwu żywnościowemu.Chociaż ta technika ma zastosowanie do nas, ligomatystów, może być również stosowana w wielu innych niszczycielskich patogenach upraw rolnych, które powodują straty w wysokości miliardów dolarów rocznie. Zgodnie z tą procedurą można wykonać inne metody, takie jak izolacja RNA, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak: jaki jest profil i czas zmiany poziomu transkryptu?

investigating-teliospore-germination-using-microrespiration-analysis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Mikromanipulacja komórkami drożdży jest niezbędna do analizy genetycznej mejozy lub do selekcji zygot diploidalnych. Mikromanipulacje te przeprowadza się przy użyciu mikroigły mikroskopu sekcyjnego. Mikroigła służy do przenoszenia komórek i jest sterowana przez mikromanipulator, który może być dostępny w różnych stopniach automatyzacji.

Wypreparowanie woreczków Saccharomyces Cerevisiae

Białka fuzyjne z GFP są powszechnie wykorzystywane do wizualizacji organelli za pomocą mikroskopii konfokalnej. Jednak przesiewanie mutacji wpływających na morfologię organelli zazwyczaj wymaga indywidualnej mutogenezy i jest czasochłonne. W niniejszej pracy prezentujemy metodę jednoczesnego wprowadzenia markerów organelle-GFP do prawie 5 000 genów nieessentialnych u drożdży.

Wysokoprzepustowa metoda globalnego badania morfologii organelli w *S. cerevisiae*

Molekularne podstawy przestrzennie specyficznych odpowiedzi fitochromów są badane z wykorzystaniem roślin transgenicznych wykazujących deficyty fitochromów specyficzne dla tkanek i organów. W celu zidentyfikowania genów zaangażowanych w przestrzennie specyficzne odpowiedzi fitochromów stosuje się izolację konkretnych komórek wykazujących indukowane wyczerpanie chromoforu fitochromu za pomocą sortowania komórek aktywowane fluorescencją (FACS), a następnie analizy mikromacierzy.

Badanie odpowiedzi fitochromów specyficznych dla tkanek i organów z wykorzystaniem profilowania ekspresji specyficznej dla typów komórek wspomaganego przez FACS u Arabidopsis thaliana

Źródło: Wen, J., Pasman, et al., Wizualizacja germinosomów i błony wewnętrznej w zarodnikach Bacillus subtilis . J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film demonstruje zastosowanie mikroskopii oświetlenia strukturalnego do uzyskania trójwymiarowych obrazów fluorescencyjnych, które ujawniają organizację białek kiełkujących w zarodnikach bakterii.

Wizualizacja białek kiełkujących w błonie wewnętrznej zarodników bakterii

Tutaj opisujemy test kolorymetryczny do wykrywania obecności cukrów redukujących podczas kiełkowania zarodników bakterii.

Wykrywanie fragmentów kory mózgowej podczas kiełkowania przetrwalników bakteryjnych

Ten protokół ilustruje ważne kolejne kroki wymagane do oceny znaczenia monitorowania parametrów żywotności i procesów naprawy DNA w ożywianiu zarodników Bacillus subtilis po leczeniu osoczem niskociśnieniowym poprzez śledzenie znakowanych fluorescencyjnie białek naprawczych DNA za pomocą czasowo-rozdzielczej mikroskopii konfokalnej i skaningowej mikroskopii elektronowej.

Badanie szkodliwego wpływu niskociśnieniowej sterylizacji plazmowej na przeżywalność zarodników Bacillus subtilis przy użyciu mikroskopii żywych komórek

Opisujemy metodę badania zdolności komórek roślinnych rosnących na wierzchołkach, w tym łagiewek pyłkowych, włośników i protonematy mchu, do wydłużania się przez ekstremalnie wąskie szczeliny (~1 μm) w urządzeniu mikroprzepływowym.

Opracowanie urządzeń mikroprzepływowych do badania zdolności wydłużania komórek roślinnych rosnących wierzchołkowo w ekstremalnie małych przestrzeniach

Tutaj prezentujemy protokoły dla początkujących badaczy, które rozpoczynają fenotypowanie dla farmakologicznie ważnego rodzaju bakterii Streptomyces.

Wizualna i mikroskopowa ocena mutantów rozwojowych Streptomyces

Białka receptora germinantu skupiają się w 'germinosomach' w wewnętrznej błonie zarodników Bacillus subtilis. Opisujemy protokół wykorzystujący mikroskopię super rozdzielczości i fluorescencyjne białka reporterowe do wizualizacji germinosomów. Protokół identyfikuje również wewnętrzne domeny błony zarodnikowej, które są preferencyjnie barwione barwnikiem błonowym FM4-64.

Wizualizacja germinosomów i błony wewnętrznej w zarodnikach Bacillus subtilis

Ten protokół ma na celu dostarczenie szczegółowych procedur zbierania, utrwalania i utrzymywania próbek roślin mykoheterotroficznych, stosując różne techniki mikroskopowe, takie jak skaningowa i transmisyjna mikroskopia elektronowa, mikroskopia świetlna, konfokalna i fluorescencyjna do badania kolonizacji grzybów w tkankach roślinnych i nasionach kiełkujących z grzybami mikoryzowymi.

Techniki mikroskopowe interpretacji kolonizacji grzybów w tkankach roślin mykoheterotroficznych i symbiotycznego kiełkowania nasion

Ten protokół opisuje przygotowanie nienaruszonych próbek warstwy komórek bielma w nasionach Arabidopsis thaliana. Metoda wymaga jedynie powszechnego sprzętu laboratoryjnego, takiego jak igła do wstrzykiwań i precyzyjne kleszcze, i umożliwia obrazowanie fluorescencyjne żywych komórek bielma w wysokiej rozdzielczości zarówno w rozwijających się, jak i dojrzałych nasionach.

Przygotowanie nienaruszonej tkanki do analizy mikroskopowej warstwy komórek bielma w rozwijających się i dojrzałych nasionach Arabidopsis

Poznaj metody badania kiełkowania teliospor grzybów smutowych poprzez analizę mikrooddychania i mikrodysekcję. Technika ta pozwala izolować zarodniki na różnych etapach germinacji i identyfikować zmiany metaboliczne kluczowe dla kontroli rozprzestrzeniania chorób.

Badanie kiełkowania teliosporu za pomocą analizy mikrooddychania i mikrodysekcji

Przeglądaj więcej filmów