Badanie kiełkowania teliosporu za pomocą analizy mikrooddychania i mikrodysekcji

Ogólnym celem przedstawionych tutaj procedur jest identyfikacja etapów kiełkowania zarodników, aby można było ocenić poziomy transkryptów genów. Analiza tych zmian dostarczy dalszych informacji na temat krytycznego etapu rozprzestrzeniania się choroby. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące przejść podczas kiełkowania teliopore, które są związane ze zmianami w poziomach transkryptów genów, a tym samym odzwierciedlają zmiany w kontroli ekspresji genów.

Głównymi zaletami tej techniki jest to, że identyfikuje ona przejścia w poziomie oddychania, które nie odpowiadają widocznym przełącznikom morfologicznym i pozwala na fizyczną izolację teliospory na różnych etapach kiełkowania. Technika ta ma implikacje dla kontroli rozprzestrzeniania się patogenów, ponieważ pozwala nam zidentyfikować kluczowe przejścia w kiełkowaniu zarodników, które, jeśli zostaną zmienione, mogą blokować rozprzestrzenianie się choroby. Rozpocznij tę procedurę od zakażenia kolbami kukurydzy, zbioru telioporów, a także testu żywotności i kiełkowania telioporu, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Aby wywołać kiełkowanie, najpierw zważ równą ilość teliospory dla każdego eksperymentu oddychania. W komorze bezpieczeństwa biologicznego dodaj teliospory do autoklawizowanej komory oddechowej. Napełnij komorę bulionem z dekstrozy ziemniaczanej, uzupełnionym siarczanem streptomycyny i siarczanem kanamycyny.

Pipetować w górę i w dół, aby utworzyć zawiesinę telioporu. Umieść pokrywę komory w komorze, aby uzyskać hermetyczne uszczelnienie. Aby uzyskać pomiar OCR, należy najpierw umieścić komorę w stelażu studzienki w łaźni wodnej.

Następnie umieść sondę tlenową w otworze komory. Monitoruj punkty danych pojawiające się w czasie rzeczywistym w programie śledzenia czujnika. Pozwól sondzie ustabilizować się przez około trzy minuty po umieszczeniu sondy w komorze.

Kliknij przycisk Zmierz, aby mierzyć poziom tlenu w sposób ciągły przez sześć godzin, z pomiarami rejestrowanymi w odstępach dwusekundowych. Zatrzymaj pomiar i powtórz te kroki dla każdej próbki, która ma być analizowana, przed wyeksportowaniem danych do programu Microsoft Excel i przeprowadzeniem analizy danych zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Umieść około 10 miligramów teliospory umatus w 1,5 mililitrowej mikroprobówce wirówkowej.

Zawiesić teliospory w 500 mikrolitrach PDB uzupełnionego siarczanem streptomycyny. Delikatnie odpipetować do mieszania, aż w podłożu nie będzie grudek teliospor. Przenieść zawiesinę telioporu do automatycznie klawowanej 250-mililitrowej kolby Erlina Meyera, zawierającej PDB, uzupełnionej siarczanem streptomycyny.

Inkubować kolbę przez noc w temperaturze 28 stopni Celsjusza, wstrząsając z prędkością 90 obr./min. Przygotuj szalkę Petriego, pipetując od czterech do pięciu pięciomikrolitrowych kropli wody destylowanej na wierzch szalki Petriego. Następnie na szalce Petriego należy pobrać pipetą trzy dwumikrolitrowe kropelki roztworu stabilizującego RNA, które zostaną użyte do pobrania próbki.

Odpipetuj również 30 pięciomikrolitrowych kropelek kiełkujących teliospory na szalce Petriego. Dodaj 15 mililitrów oleju mineralnego do szalki Petriego. Przed kontynuowaniem upewnij się, że wszystkie kropelki są pokryte olejem.

Następnie przygotuj mikrokapilę o średnicy 15 mikronów, kołnierzu o długości jednego milimetra, długości 55 mililitrów i kącie końcówki 20 stopni. Umieść go w uchwycie mikrokapilarnym i zanurz w oleju mineralnym, gdzie działanie kapilarne pozwoli olejowi mineralnemu dostać się do mikrokapilary. Zwolnij ciśnienie w mikrokapilarze przed doprowadzeniem go do kropli wody.

Zassać, aby przygotować mikrokapilę wodą. Za pomocą elementów sterujących mikromanipulatora przenieś przygotowaną mikrokapilę do jednej z kropelek kiełkowania i wniknij w kropelkę. Obniż mikrokapilę i doprowadź ujście mikrokapilary do kiełkującego teliospora na etapie kiełkowania będącego przedmiotem zainteresowania.

Powoli zasysaj, aby uchwycić kiełkujący teliospore. Przestań zasysać, gdy teliospora dostanie się do mikrokapilary. Powtarzaj, aż w mikrokapilarze znajdzie się około pięciu teliospory.

Podnieś mikrokapilar za pomocą mikromanipulatora i przyłóż go do kropli zbiorczej roztworu stabilizującego RNA. Przeniknąć do kropelki i wstrzyknąć teliospory do kropelki. Powtarzaj te kroki, aż zostanie przechwyconych około 1 000 teliospory.

Aby odzyskać pobraną kropelkę, odpipetuj kroplę i przenieś ją do pokrywy wolnej od 2,0 mililitra mikrocentralnej probówki DNA RNA. Ostrożnie przecieraj olej mineralny za pomocą pipety, nie naruszając kropli zbierającej. Teliospory mogą być teraz wykorzystywane do dalszych zastosowań, takich jak izolacja RNA.

Wykres ten ilustruje typowy wynik oceny zmian poziomu tlenu w zawiesinach teliospory indukowanych do kiełkowania. W stosunku do teliospor nieindukowanych, separacja wskazująca na początek oddychania następuje po około 30 minutach. Biorąc pod uwagę, że ustawienie i transport próbki do sondy tlenowej zajmuje około 15 minut, czas ten wynosi w rzeczywistości 45 minut.

Pokazano tutaj pięć etapów kiełkowania teliospore. W pierwszym etapie teliospory są indukowane do kiełkowania, ale nie wykazują morfologicznych oznak kiełkowania. Stadium drugie teliospory pokazują wyłoniony promycelium o długości mniejszej niż średnica teliospory.

W trzecim etapie długość promycelium jest większa niż średnica teliosporu. Etap czwarty charakteryzuje się promycelią z przyczepionymi bazydiosporami. A w piątym etapie pojawiają się pączkujące bazydiospory.

Tutaj pokazano asynchronicznie kiełkujące teliospory, a mikrokapilar jest umieszczony w pobliżu teliosporu trzeciego stopnia. Teliospora trzeciego stopnia jest następnie zasysana do mikrokapilary i przenoszona do kropli roztworu zbiorczego. Po opanowaniu, ta technika mikrodysekcji może być wykorzystana do wyizolowania 1000 specyficznych dla stadium teliospory w ciągu sześciu do siedmiu godzin.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o częstych przerwach. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak fizycznie izolować zarodniki na morfologicznie odrębnych etapach kiełkowania. I określ czas rozpoczęcia oddychania.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności z koniecznością utrzymania bezpłodności. I potrzeba cierpliwości i izolowania typów komórek poprzez mikropreparację. Rozwój tej techniki toruje drogę patologom grzybów do zbadania morfologicznych i molekularnych aspektów kiełkowania niszczycielskich grzybów pleśni i rdzy, które zagrażają globalnemu bezpieczeństwu żywnościowemu.

Chociaż ta technika ma zastosowanie do nas, ligomatystów, może być również stosowana w wielu innych niszczycielskich patogenach upraw rolnych, które powodują straty w wysokości miliardów dolarów rocznie. Zgodnie z tą procedurą można wykonać inne metody, takie jak izolacja RNA, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak: jaki jest profil i czas zmiany poziomu transkryptu?