Ocena czynnika immunostymulującego: ekstrakcja tkanki limfatycznej i aktywacja komórek dendrytycznych zależna od drogi iniekcji
September 16th, 2018
Eksperymentalne procedury późniejszej ekstrakcji tkanek limfatycznych w celu przetestowania aktywacji limfoidalnych komórek dendrytycznych są opisane po leczeniu immunostymulującym nanomateriałem.
Ogólnym celem tej procedury jest zapoznanie się z unikalną techniką wymaganą do izolowania węzła chłonnego śródpiersia od myszy. Operację przeprowadzono po wstrzyknięciu materiału immunostymulującego na sześć różnych dróg u myszy. W tym badaniu wykorzystaliśmy nową klasę materiałów tworzących struktury o rozmiarach nano.
Surfaktanty składają się z hydrofilowej grupy głowy i hydrofobowego ogona. Tworzą one sferyczną miceli lub inną strukturę drugorzędową w wyniku separacji mikrofagów. Wykorzystaliśmy tę właściwość do biomakrocząsteczki, jaką jest DNA.
Amfifil DNA, pokazany tutaj, jako regularne nukleotydy, takie jak A, C, G, T, ma bloki hydrofilowe, podczas gdy zmodyfikowane lipidami zasady nukleotydowe komórek nerwowych działają jako jednostki hydrofobowe. Zmodyfikowany oligo został zsyntetyzowany przez syntezator DNA w oktogramach na dużą skalę. W pożywkach równo amfifilowe lipidowe DNA spontanicznie tworzą sferyczne micele o rozmiarach nano.
Kiedy powstaje micela, DNA pozostaje jednoniciowe jako pusty nośnik o średnicy około 10 nanometrów. Aby wyposażyć nosiciela w immunostymulant, wystarczy rozszerzyć sekwencję DNA za pomocą adiuwanta receptora toll-podobnego dziewiątego, a mianowicie eCpG. Lipidowe DNA i zasada eCpG, dlatego zewnętrzna powierzchnia miceli ulega degradacji za pomocą sekwencji CpG.
Następnie nazywamy tę nanocząstkę stymulującą układ odpornościowy jako INP. Aby określić właściwy sposób INP dla odpowiedzi immunologicznej, wstrzyknęliśmy INP myszom w 64 drogach iniekcji, w wyniku czego przeanalizowano prawidłową tkankę węzłów chłonnych. Aby uzyskać bardziej szczegółowe instrukcje dotyczące wstrzykiwań, znajdź artykuł JOB opublikowany przez Charles River w 2012 roku.
Główną zaletą tego filmu jest wizualne pokazanie, jak uzyskać węzeł chłonny śródpiersia. Film wyraźnie pokazuje lokalizację węzła chłonnego śródpiersia, który wiele osób ma trudności z izolacją narządów. Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt w Centrum Klinicznym Zdrowia Publicznego w Szanghaju lub University of Ulsan College of Medicine.
Ta część pokaże konkretną lokalizację narządów lub tkanek, które są kluczowe dla analizy immunologicznej. Śledziona i dwa węzły chłonne zostaną odizolowane. Po pierwsze, myszy zostały złożone w ofierze poprzez eutanazję wdychaną dwutlenkiem węgla i dołożono wszelkich starań, aby zminimalizować cierpienie, zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt.
Od teraz znajdźmy narządy i wyizolujmy je. Najpierw prawidłowo zamocuj mysz na pulpicie operacyjnym za pomocą czterech kołków na dłoni myszy. Wysterylizuj obszar sekcji alkoholem.
Odetnij zewnętrzną osłonę dolnej części brzucha myszy dużymi nożyczkami. Użyj kleszczyków, aby otworzyć obie strony nasadki i przymocuj ją za pomocą kołków na stole operacyjnym. Lokalizacja pachwinowego węzła chłonnego jest odsłonięta poprzez znalezienie koniunkcji naczynia schodzącego w dół w kierunku lewej nogi.
Kształt naczynia wygląda jak pochylona litera alfabetu Y.Odsłoń warstwę kleszczami i wyciągnij ją ze skóry. Przetnij otrzewną mniejszymi nożyczkami, aby odsłonić narządy wewnętrzne. Przesuń jelito w prawo za pomocą kleszczy, a następnie zawiń w ukształtowaną śledzionę, która znajduje się po lewej, lewej górnej stronie brzucha.
Podczas zabiegu wymagana jest dodatkowa uwaga, ponieważ śledziona jest łatwa do zakłócenia. Wreszcie kluczowy punkt tego filmu: pobieranie węzła chłonnego śródpiersia. Znajduje się pod górną częścią płuca, która jest trudna do zauważenia ze względu na jej mały rozmiar i nieco ukryte położenie.
Ostrożnie odsłoń obszar za pomocą małych nożyczek i kleszczy. Wytnij również obie strony żeber i membranę. Przytnij odcięte żebra nad klatką piersiową.
Podczas zabiegu należy unikać uszkadzania serca i naczyń krwionośnych, ponieważ może to spowodować zaślepienie miejsca, znajdując półprzezroczysty węzeł chłonny śródpiersia. Jeśli przez przypadek pęknie naczynie krwionośne, delikatnie wytrzyj krew gazą. Chwyć lewą stronę płuca i delikatnie odwróć ją na drugą stronę, aby zajrzeć pod płuco.
Podciągnij węzeł chłonny śródpiersia za pomocą kleszczy. Po pobraniu węzła chłonnego śródpiersia upewnij się, że idealnie usunąłeś cały tłuszcz i krew otaczającą węzeł chłonny, ponieważ niepożądana tkanka może wpłynąć na analizę. Na koniec wszystkie izolowane narządy na szalce Petriego wypełnionej pożywką.
Łącznie 0,1 razy 10 do szóstych komórek analizowano w tej cytometrii przepływowej. Na podstawie gettora siły i wielkości gettera, populacja leukocytów została bramkowana, a komórki zostały wykluczone przez ciemne barwienie. 24 godziny po wstrzyknięciu INP 64 drogami wstrzyknięcia, śledziona, pachwinowy węzeł chłonny i śródpiersie węzła chłonnego zostały pobrane i przeanalizowane aktywacja DC za pomocą cytometrii przepływowej.
Na podstawie strategii cytometrii przepływowej populację DC zdefiniowano jako komórki CD11C dodatnie i liniowo ujemne w żywych leukocytach. Warto zauważyć, że donosowe wstrzyknięcie INP sprzyjało znacznemu wzrostowi ekspresji CD40, 80, 86 w węźle chłonnym śródpiersia w porównaniu z PBS dla kontroli. Dlatego dane te sugerowały, że donosowe wstrzyknięcie INP może być stosowane jako adiuwant błony śluzowej w celu wzmocnienia odporności w płucach.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł opisuje procedurę izolowania węzłów chłonnych śródpiersia od myszy po wstrzyknięciu nanomateriału immunostymulującego. Technika koncentruje się na ekstrakcji tkanek limfatycznych w celu oceny aktywacji komórek dendrytycznych limfoidowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Immunologia
- Nanotechnologia
Tło
- Rozumienie aktywacji komórek dendrytycznych limfoidowych jest kluczowe dla badań immunologicznych.
- Materiały immunostymulujące mogą zwiększać odpowiedzi immunologiczne.
- Struktury nanoskalowe mają unikalne właściwości, które mogą być wykorzystywane w zastosowaniach biologicznych.
- Techniki izolacji są niezbędne do badania określonych typów komórek odpornościowych.
Cel badania
- Zapoznanie badaczy z techniką izolowania węzłów chłonnych śródpiersia.
- Ocenienie efektów nowej klasy nanomateriału immunostymulującego.
- Zbadanie aktywacji komórek dendrytycznych limfoidowych po leczeniu.
Stosowane metody
- Wstrzyknięcie materiału immunostymulującego sześcioma różnymi drogami u myszy.
- Izolowanie węzłów chłonnych śródpiersia za pomocą specyficznych technik chirurgicznych.
- Wykorzystanie środków powierzchniowo czynnych do tworzenia struktur nanoskalowych.
- Zastosowanie DNA jako bio makrocząsteczki w badaniu.
Główne wyniki
- Skuteczna izolacja tkanek limfatycznych od myszy.
- Aktywacja komórek dendrytycznych limfoidowych obserwowana po leczeniu.
- Demonstracja skuteczności nanomateriału immunostymulującego.
- Wgląd w rolę struktur nanoskalowych w odpowiedziach immunologicznych.
Wnioski
- Technika izolowania węzłów chłonnych śródpiersia jest skuteczna i powtarzalna.
- Nanomateriały immunostymulujące mogą znacząco wpływać na aktywację komórek odpornościowych.
- Dalsze badania są uzasadnione, aby zbadać pełny potencjał tych materiałów w immunologii.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Precise evaluation of immunostimulatory agents requires robust methods for extracting and analyzing lymphoid tissues to assess dendritic cell activation across administration routes. This workflow enables biopharma teams to compare immune activation profiles of novel nanoparticle-based agents, supporting predictive confidence in early immunotherapy and vaccine discovery. The approach directly informs route-of-administration decisions and portfolio triage for immunomodulatory candidates.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of immune activation mechanisms by quantifying dendritic cell responses in lymphoid tissues.
- Supports biological de-risking by comparing activation signatures across multiple administration routes.
- Facilitates functional target validation for immunostimulatory nanoparticle candidates.
Screening & Assay Development
- Provides standardized tissue extraction and flow cytometry protocols for reproducible immune cell analysis.
- Delivers quantitative readouts of dendritic cell activation markers (CD40, CD80, CD86) for assay development.
- Enables screening of administration routes to optimize immunogenicity profiles.
Translational & Preclinical Research
- Aligns immune activation data with route-dependent delivery strategies for translational vaccine and immunotherapy research.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling direct tissue-level immune monitoring.
- Informs risk-adjusted advancement of candidates with favorable activation and safety profiles.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the immunotherapy discovery continuum from early target validation through preclinical candidate selection, enabling direct comparison of immune activation across administration routes.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on immunostimulant mechanism and tissue-specific activation.
- Screening: Provides reproducible, quantitative flow cytometry outputs for cross-route comparison.
- Analytics: Delivers marker-based dendritic cell activation data to inform candidate ranking.
- Translational Research: Connects route-dependent immune activation to preclinical delivery strategies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable tissue extraction and analysis workflow for nanoparticle immunostimulant evaluation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in immunostimulant mechanism and route selection.
- Operational Value: Standardizes tissue extraction and flow cytometry for reproducible immune profiling.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions for immunomodulatory candidates based on quantitative immune activation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of candidates with optimal activation and delivery profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine dissection and lymphoid tissue extraction, especially for mediastinal lymph nodes.
- Needs access to flow cytometry instrumentation and analytical infrastructure for immune cell profiling.
- Demands cross-team standardization of tissue handling and gating strategies for reproducibility.
- Adaptation may be needed for different animal models or tissue targets.
- Careful tissue preparation is critical to avoid contamination and ensure accurate immune cell analysis.
