Name: Ocena czynnika immunostymulującego: ekstrakcja tkanki limfatycznej i aktywacja komórek dendrytycznych zależna od drogi iniekcji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Poznaj technikę izolacji węzłów chłonnych śródpiersia u myszy po iniekcji nanomateriału immunostymulującego. Ta metoda umożliwia badanie aktywacji komórek dendrytycznych w odpowiedzi immunologicznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Te badania były wspierane przez Program Odkrywania Kreatywnych Materiałów przez Narodową Fundację Badawczą Korei (NRF) finansowane przez Ministerstwo Nauki, ICT i Planowania Przyszłości (NRF-2017M3D1A1039421) oraz przez Program Biotechnologii Morskiej finansowany przez Ministerstwo Oceanów i Rybołówstwa, Republika Korei oraz grant (20150220).

Wszystkie procedury eksperymentalne, w tym obchodzenie się ze zwierzętami, składanie ofiar i izolacja narządów, były wykonywane ściśle zgodnie z zasadami Międzynarodowego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Centrum Klinicznym Zdrowia Publicznego w Szanghaju i Centrum Medycznym Asan. Protokół badania został zatwierdzony przez odpowiednie komisje ds. Etyki Eksperymentów na Zwierzętach w Szanghajskim Centrum Klinicznym Zdrowia Publicznego (numer protokołu myszy: SYXK-2010-0098) i Centrum Medycznym Asan (2016-02-168).
1. Przygotowanie materiału
UWAGA: Nano-adiuwant, INP, składający się z samodzielnie złożonego nośnika lipidowo-DNA, a mianowicie U4T, oraz motywu CpG zawierającego oligonukleotyd, eCpG, został użyty w obecnym badaniu w celu przetestowania właściwej drogi iniekcji dla immunoterapii i szczepienia u myszy2. Co ważne, inne potencjalne cząsteczki terapeutyczne, takie jak antygeny, przeciwciała i adiuwanty, mogą być zastąpione INP i testowane przy użyciu tej samej metodologii opisanej poniżej.
<ol>
	<li>INP formulacja2,4,7
	<ol>
		<li>Wyżarzanie U4T (160 μM, nośnik) z eCpG (80 μM, zawierające sekwencję agonistyczną TLR9) w obecności 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS, pH 7,4) i MgCl2 (2 mM). Standardowa objętość do wyżarzania wynosi od 50 do 110 μl w probówce do PCR. Podgrzewać mieszaninę do temperatury 95 °C przez 10 minut, a następnie powoli schładzać (1 °C/16 min) do temperatury 25 °C za pomocą termocyklera. Protokół wyżarzania wymaga około 2 godz. 
		UWAGA: Płyn zawierający U4T jest bardzo pienisty i należy się z nim obchodzić ostrożnie.</li>
		<li>Przygotować 50 μl podwielokrotności preparatu INP; użyć 50 μl materiału do każdego wstrzyknięcia. 
		UWAGA: W przypadku 100 μl na wstrzyknięcie powtórzyć krok 1.1 z prawidłowym obliczeniem składników.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Ogólne procedury na zwierzętach
Uwaga: Alternatywne metody postępowania z myszami mogą być stosowane w zależności od wymagań laboratoryjnych i zatwierdzonych protokołów na zwierzętach8. Typ używanych myszy to 6-tygodniowe C57BL/6 i samice.
<ol>
	<li>Lista materiałów
	<ol>
		<li>Przygotuj płynny środek znieczulający (izofluran), maszynę do znieczulania, komorę inhalacyjną z dwutlenkiem węgla (CO2), wysterylizowaną gazę, kleszcze, ogranicznik myszy, rękawiczki, kleszcze haczykowate, 1-calowe nożyczki preparacyjne, 2-calowe nożyczki preparacyjne, alkohol do sterylizacji i strzykawkę insulinową.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Znieczulenie wziewne 
	UWAGA: Znieczulenie jest obowiązkowe w przypadku wstrzyknięć donosowych, podskórnych, opuszkowych i dożylnych myszy9. Do tej procedury używana jest komora indukcyjna z podłączonym parownikiem i butlą tlenu.
	<ol>
		<li>Umieść zwierzę w komorze indukcyjnej i upewnij się, że pokrywa jest szczelnie zamknięta.</li>
		<li>Przelej tlen z prędkością 1 l/min i ustaw parownik na poziom indukcji 4% dla izofluranu.</li>
		<li>Zmieniaj czas ekspozycji zwierząt w komorze w zależności od masy ciała zwierzęcia, jednak do znieczulenia konieczne jest więcej niż 10 s ekspozycji i monitorowanie co 5 minut10. 
		UWAGA: Brak odruchu pedałowania wskazuje na udane znieczulenie.</li>
		<li>Wyłącz cewkę indukcyjną izofluranu i przepuść 1 l/min tlenu, aby zapobiec narażeniu personelu na działanie izofluranu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>poświęcenie
	<ol>
		<li>Przygotuj komorę do poświęcenia inhalacji CO2 zgodnie z NIH "Wytyczne dotyczące eutanazji gryzoni przy użyciu dwutlenku węgla"11.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przetestuj reakcję knebla, aby potwierdzić, że zwierzę zostało w pełni uśmiercone.
	<ol>
		<li>Sprawdź, czy mysz jest prawidłowo poświęcona, ściskając czubek jej stopy i potwierdzając, że nie ma reakcji wymiotnej. Jeśli pojawi się odpowiedź, powtórz krok 2.2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>dezynfekcja
	<ol>
		<li>Zdezynfekuj wszystkie powierzchnie używane do wstrzykiwań lub rozwarstwień alkoholem w sprayu i wysterylizowaną gazą.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przechowywanie narządów
	<ol>
		<li>Użyj kleszczy, aby usunąć cały tłuszcz i krew otaczającą pobrane narządy. Zebrane tkanki należy przechowywać pojedynczo na szalce Petriego wypełnionej 3 ml PBS. Pojemnik i podłoże mogą się różnić w zależności od kolejnych wymagań procedury.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Trasy iniekcji
<ol>
	<li>Użyj sześciu metod iniekcji, aby zbadać odpowiedzi immunologiczne zależne od wstrzyknięcia: doustnie, donosowo, podskórnie, opuszkowo na stopę, dootrzewnowo i dożylnie8,12,13.</li>
</ol>
4. Izolacja węzłów chłonnych i śledziony
Uwaga: Używaj młodych i zdrowych szczupłych myszy (w wieku 6 tygodni) do tych procedur, ponieważ tłuszcze, które zwykle gromadzą się wokół węzłów chłonnych u starszych myszy, są trudne do usunięcia i mogą uniemożliwić prawidłową wizualizację narządu.
<ol>
	<li>Etapy poprzedzające zbiory 
	UWAGA: W tej sekcji opisano pobieranie iLN, śledziony i mLN od myszy po wstrzyknięciu w celu analizy stymulacji immunologicznej. Zapoznaj się z krokami 2.3-2.5, aby zapoznać się z metodami poświęcania, reakcji wymiotnej i dezynfekcji.
	<ol>
		<li>Przypnij kończyny myszy do chirurgicznej płyty piankowej i wysterylizuj brzuszną stronę myszy 70% etanolem.</li>
		<li>Wybierz miejsce 2 cm nad okolicą narządów płciowych i użyj haczykowatych kleszczy, aby podciągnąć zewnętrzną osłonę skóry jak namiot. Wykonaj około 1-centymetrowe nacięcie w tym miejscu i wsuń nożyczki (2 cale) pod skórę, wykonując dalsze cięcia preparacyjne.</li>
		<li>W przypadku powłoki przeciąć pionowo zewnętrzną skórę obiema rękami nożyczek (2 cale). Odsłoń narządy wewnętrzne pokryte otrzewną.</li>
		<li>Przypnij zewnętrzną warstwę skóry.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja pachwinowego węzła chłonnego (iLN)
	<ol>
		<li>Zlokalizuj iLN po lewej stronie nogi po połączeniu naczynia krwionośnego biegnącego w dół lewej nogi, które pojawia się jako pochylona litera "Y". 
		UWAGA: W przypadku myszy, którym wstrzyknięto podskórnie, należy wybrać iLN po tej samej stronie miejsca wstrzyknięcia.</li>
		<li>Odsłoń warstwę za pomocą dwóch kleszczy, aby rozerwać pokrytą warstwę lipidową i zebrać bladożółty iLN (kształt fasoli, 2 mm). W celu późniejszego leczenia i przechowywania tkanki, patrz krok 2.6.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja śledziony 14
	<ol>
		<li>Zrób namiot na środku otrzewnej za pomocą haczykowatych kleszczy w jednej ręce, a w drugiej użyj małych cienkich nożyczek (1 cal), aby przeciąć otrzewną.</li>
		<li>Użyj haczykowatych kleszczy w lewej ręce, aby chwycić jelito i odwróć je, aby zlokalizować śledzionę przypominającą czerwoną fasolę (o długości około 14 mm) przymocowaną do lewej górnej części brzucha myszy.</li>
		<li>Delikatnie wyciągnij śledzionę za pomocą innego zestawu kleszczy w prawej ręce, jednocześnie odłączając inne narządy za pomocą haczykowatych kleszczy. Wykonaj krok 2.6, aby przechowywać śledzionę. 
		UWAGA: Podczas pobierania śledziony należy zachować ostrożność, ponieważ jest to łatwo uszkodzony narząd miękki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja węzła chłonnego śródpiersia (mLN) 
	UWAGA: mLN znajduje się około 1 cm poniżej żeber i jest pokryty innymi narządami, takimi jak serce i płuca. Ze względu na jego lokalizację i niewielkie rozmiary ważne jest, aby dokładnie odsłonić otoczenie za pomocą kleszczy i nożyczek (1 cal).
	<ol>
		<li>Odetnij membranę i odłącz ją od żeber. Przytrzymaj ciało żeber kleszczami, a następnie odetnij lewą i prawą stronę żeber nożyczkami (1 cal). Przypnij odcięte żebra do ramienia myszy po prawej stronie, aby odsłonić serce i płuca. 
		UWAGA: Uważaj, aby nie przeciąć żadnego z naczyń krwionośnych wokół serca i płuc, ponieważ wyciekająca krew bardzo utrudnia zlokalizowanie maleńkiego, półprzezroczystego mLN. Jeśli jakiekolwiek naczynia krwionośne zostaną przecięte, delikatnie wchłoń krew w tym obszarze za pomocą gazy.</li>
		<li>Używając haczykowatych kleszczy w prawej ręce, delikatnie przełóż serce i płuca w prawo, aż kręgosłup zostanie odsłonięty. Użyj pary zwykłych kleszczy w lewej ręce, aby usunąć iLN za pomocą haczykowatych kleszczy w prawej ręce, aby pomóc w tym zbiorze.</li>
		<li>Chwyć płuca i odwracaj je, aż kręgosłup zostanie szeroko odsłonięty. mLN (półprzezroczysta struktura w kształcie fasoli o wielkości około 2 mm) znajduje się między płucami a kręgosłupem.</li>
		<li>Użyj haczykowatych kleszczy, aby odsłonić obszar wokół mLN, a inne kleszcze do ekstrakcji tkanki. 
		UWAGA: mLN jest otoczony wieloma innymi tkankami, które przed pobraniem należy ostrożnie usunąć kleszczami.</li>
		<li>Zobacz krok 2.7, aby uzyskać instrukcje dotyczące przechowywania zebranego mLN.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Przygotowanie próbek do cytometrii przepływowej
Uwaga: Aby sprawdzić aktywację DC w pobranym iLN, śledzionie i mLN, jednokomórkowe zawiesiny tych tkanek są barwione przeciwciałami sprzężonymi z fluorescencją jako markery specyficzne dla DC, cząsteczki kostymulujące i główne cząsteczki kompleksu zgodności tkankowej i analizowane za pomocą cytometrii przepływowej.
<ol>
	<li>Przygotowanie zawiesin jednokomórkowych: śledziona
	<ol>
		<li>Dodać 5 ml świeżej pożywki hodowlanej (CM) do 6-milimetrowego naczynia hodowlanego i umieścić próbki na lodzie.</li>
		<li>Usuń otaczającą krew i tkankę tłuszczową i umieść tkankę w pokrywie naczynia hodowlanego.</li>
		<li>Pokrój tkanki na małe fragmenty (<1 mm) zakrzywionymi nożyczkami. Zawiesić fragmenty w PBS, a następnie odwirować tkankę za pomocą wirówki o sile 646 × g przez 5 minut i usunąć supernatant.</li>
		<li>Zawiesić próbki ponownie w 3 ml CM i roztrawić fragmenty za pomocą 200 μl roztworu 2% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) uzupełnionej kolagenazą dożylną przez 20 minut.</li>
		<li>Delikatnie wstrząsnąć i inkubować próbkę w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Przefiltrować strawione tkanki przez siatkę nylonową (100 nm) i odwirować je w dół. Przemyć pojedyncze komórki w 5 ml PBS i usunąć supernatant przez odwirowanie.</li>
		<li>Ponownie zawiesić komórki w 5 ml roztworu do izolowania komórek. Ponownie załaduj kolejną warstwę 5 ml klarownego roztworu do izolacji komórek, aby utworzyć wodny stos warstwa po warstwie.</li>
		<li>Odwirować preparat komórkowy w temperaturze 2012 × g przez 10 minut. Otrzymać supernatant, który jest frakcją o mniejszej gęstości (<1,077 g/cm3), do późniejszej analizy cytometrii przepływowej.</li>
		<li>Policz liczbę komórek za pomocą hemocytometru.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie zawiesin jednokomórkowych: węzeł chłonny
	<ol>
		<li>Wykonaj kroki 5.1.1-5.1.2.</li>
		<li>Dodaj 5 ml CM za pomocą pipety o pojemności 10 ml, aby zawiesić komórki, pipetując 3-4 razy. Po dokładnym zawieszeniu komórek użyj sterylnej nylonowej siatki do przefiltrowania komórek do zebrania w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Obracać komórki w temperaturze 646 ×g przez 7 minut w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant.</li>
		<li>Dodaj dodatkowe 5 ml CM do pipety o pojemności 10 ml, aby lepiej zawiesić komórki podczas pipetowania.</li>
		<li>Umyj PBS i policz liczbę komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza cytometrii przepływowej
	<ol>
		<li>Podwielokrotność 0,5-1 × 106 komórek do każdej probówki do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS).</li>
		<li>Odwirować w temperaturze 646 × g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i zassać supernatant.</li>
		<li>Dodać 5 μl każdego rozcieńczonego preparatu przeciwciał sprzężonych z fluorescencją do komórek, aby ponownie zawiesić osad komórkowy i wirować. 
		UWAGA: Ważne jest, aby w jak największym stopniu chronić osad komórkowy przed ekspozycją na światło, ponieważ przeciwciała znakowane fluorescencyjnie są wrażliwe na światło. Wygeneruj główną mieszankę przeciwciał i zawsze dodawaj blok Fc.</li>
		<li>Przygotuj bufor FACS używając 100 μl PBS, 1% inaktywowanego termicznie zwykłego FBS i 0,1% azydku sodu.</li>
		<li>Umieścić próbkę w probówce w temperaturze 4 °C na 30 minut. Przepłukać komórki 2-4 ml buforu FACS i odwirować próbkę z prędkością 1700 obr./min przez 7 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Ponownie zawiesić komórki w 500 μl buforu FACS w ciemności. Analizuj komórki za pomocą cytometrii przepływowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Park, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Preparation+of+dodecynyl+modified+DNA+nanoparticles+with+unmethylated+CpG+adjuvant+and+ovalbumin+for+immunostimulation%22">Preparation of dodecynyl modified DNA nanoparticles with unmethylated CpG adjuvant and ovalbumin for immunostimulation</a>. , Department of Chemistry. Pukyong National University, Master Thesis. (2016).</li>
<li>Jin, J. O., Park, H., Zhang, W., de Vries, J. W., Gruszka, A., Lee, M. W., Ahn, D. R., Herrmann, A., Kwak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+delivery+of+CpG-incorporated+lipid-DNA+nanoparticles+for+spleen+DC+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Modular delivery of CpG-incorporated lipid-DNA nanoparticles for spleen DC activation.</a> Biomaterials. 115, 81-89 (2017).</li>
<li>Pal, I., Ramsey, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+lymphatic+system+in+vaccine+trafficking+and+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">The role of the lymphatic system in vaccine trafficking and immune response.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (10-11), 909-922 (2011).</li>
<li>Jin, J. O., Kwak, M., Xu, L., Kim, H., Lee, T. H., Kim, J. O., Liu, Q., Herrmann, A., Lee, P. C. W. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acsbiomaterials.7b00440">Administration of soft matter lipid-DNA nanoparticle as the immunostimulant via multiple routes of injection in vivo.</a> ACS Biomaterial Science & Engineering. 3 (9), 2054-2058 (2017).</li>
<li>Worbs, T., Hammerschmidt, S. I., Förster, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+migration+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Immunology%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell migration in health and disease.</a> Nature Review Immunology. 17 (1), 30-48 (2017).</li>
<li>Milling, S. W. F., Jenkins, C., MacPherson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collection+of+lymph-borne+dendritic+cells+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Collection of lymph-borne dendritic cells in the rat.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2263-2270 (2006).</li>
<li>Desormeaux, A., Bergeron, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphoid+tissue+targeting+of+anti-HIV+drugs+using+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Lymphoid tissue targeting of anti-HIV drugs using liposomes.</a> Methods in Enzymology. 391, 330-351 (2005).</li>
<li>Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manual+restraint+and+common+compound+administration+routes+in+mice+and+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).</li>
<li>Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Administration+of+substances+to+laboratory+animals%3A+routes+of+administration+and+factors+to+consider%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 600-613 (2011).</li>
<li><a target="_blank" href="https://staff.unimelb.edu.au/__data/assets/pdf_file/0009/1974339/STANDARD-Anaesthesia-for-mice-and-rats-FINAL.pdf">General anesthesia of mice and rats</a>. , Animal Care and Use Standards Committee. (2016).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guidelines+for+the+Euthanasia+of+Animals%22">Guidelines for the Euthanasia of Animals</a>. , Veterinary Record. (2013).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Compound Administration I. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/10198/compound-administration-i">Journal of Visualized Experiments</a>. , (2018).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Compound Administration III. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/10215/compound-administration-iii">Journal of Visualized Experiments</a>. , (2018).</li>
<li>Mebius, R. E., Kraal, G. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/nri1669">Structure and function of the spleen.</a> Nature Review Immunology. 5 (8), 606-616 (2005).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wiele postępów w nanotechnologii i immunologii osiągnięto dzięki badaniom terapeutycznym w zakresie dostarczania leków i immunostymulacji. Wiadomo, że staranny dobór metody iniekcji ma znaczenie dla immunostymulacji, która była przedmiotem niniejszego badania.
Oceniono różne drogi iniekcji dla naturalnie nietoksycznego i biodegradowalnego materiału na bazie DNA, INP (nanocząstki immunostymulacyjne), aby określić, która droga daje najlepszy wynik. Takie podejście jest również istotne w przypadk...

Postępy w immunologii i nanomateriałach doprowadziły do powstania wielu potencjalnych nowych strategii terapeutycznych do zastosowań w biomedycynie, w tym dostarczania leków i immunostymulacji. Optymalizacja drogi podania jest istotnym aspektem wpływającym na skuteczność leków immunostymulujących. Immunostymulująca nanocząstka (INP) składająca się z DNA jest nowo opracowanym nanoimmunologicznym adiuwantem, który samoorganizuje się przez separację mikrofaz ze względu na amfifilową strukturę lipid-DNA1. W związku z tym opisano protokoły INP obejmujące podawanie materiału1 in vivo różnymi drogami oraz opisano trzy procedury pobierania odpowiednich tkanek, takich jak pachwinowy węzeł chłonny (iLN), śródpiersie LN (mLN) i śledziona. Na koniec tkanki te przeanalizowano pod kątem aktywacji komórek dendrytycznych (DC), najsilniejszych komórek prezentujących antygen w układzie odpornościowym. Protokół ten może być również stosowany do oceny antygenów, przeciwciał lub innych adiuwantów immunologicznych2.
Przetestowaliśmy preparat INP, ponieważ jest to środek, który okazał się bardzo obiecujący. INP jest materiałem adiuwantowym receptora Toll-podobnego 9 (TLR9), który zawiera kwasy nukleinowe, dla których wymagana jest ocena skuteczności immunostymulacji w celu przetestowania różnych metod iniekcji3. W tym kontekście stymulacja DC jest silnym punktem końcowym dla oceny in vivo. Po fagocytozowaniu antygenu lub cząsteczek immunostymulujących przez DC w tkankach obwodowych lub krwi, komórki te migrują do narządów limfatycznych, takich jak śledziona i LNs4,5. W ten sposób analizowano aktywację DC w śledzionie, iLN i mLN zwierząt, którym wstrzyknięto zastrzyk. Prawidłowe pobranie tych tkanek ma zatem kluczowe znaczenie dla oceny odpowiedzi immunologicznej na nowy adiuwant lub patogeny5. Takie pobieranie tkanek jest również ważne dla opracowania nowatorskiej metodologii immunologicznej jako terapii przeciwnowotworowej. Ponadto protokół ten może być wykorzystany do weryfikacji skuteczności innych leków, takich jak leki przeciw ludzkiemu wirusowi niedoboru odporności6.

<table><tbody><tr><td><mocny>Materiał</silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>fosforanowy bufor solny</td><td>Corning</td><td>21-040-CVR</td><td>Organy myjące</td></tr> <tr><td>(PBS, pH 7,4)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>roztwór izofluranu&nbsp;</td><td>Aesica Queenborough limited</td><td>26675-46-7</td><td>Proces znieczulenia</td></tr><tr><td>Strzykawka Tuberculin 1 ml -</td><td>Junglim</td><td>N/A</td><td>Iniekcja</td></tr><tr><td>50 ml rurka stożkowa&nbsp;</td><td>S.P.L</td><td>50050</td><td>Proces znieczulenia</td></tr><tr><td>1 ml Strzykawka insulinowa&nbsp;</td><td>(BD Ultra-FineTM&shy;II)_short igła</td><td>324826</td><td>Wstrzyknięcie domięśniowe</td></tr><tr><td>Wysoki poziom glukozy Hyklon DMEM</td><td></td><td>SH30081.01</td><td>Przechowywanie narządów</td></tr><tr><td>Histopaque</td><td>&nbsp; Sigma-Aldrich</td><td>10771</td><td>Analiza FACS</td></tr><tr><td>Alkohol etylowy bezwodny 99,5 %&nbsp;</td><td>Daejung</td><td>4022-4110</td><td>Środek dezynfekujący</td></tr><tr><td>Equipments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FineCycler C100 (Thermocycler)</td><td>Wirówka</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> do wyżarzania Ssufine-Anealing <tr><td>Rurka FACS&nbsp;</td><td>Analiza FALCON</td><td>2052</td><td>FACS</td></tr><tr><td>Zautomatyzowany wysokowydajny cytometr przepływowy</td><td>BD (USA), analiza FACSVerse-FACS</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ocena czynnika immunostymulującego: ekstrakcja tkanki limfatycznej i aktywacja komórek dendrytycznych zależna od drogi iniekcji

Immunostimulatory Agent Evaluation: Lymphoid Tissue Extraction and Injection Route-Dependent Dendritic Cell Activation

Do oceny nowego środka terapeutycznego do immunoterapii lub szczepienia, niezbędna jest analiza aktywacji komórek odpornościowych w tkankach limfatycznych. W tym miejscu badaliśmy immunologiczne działanie nowego immunostymulatora lipidowo-DNA w postaci nanocząstek z różnych dróg podawania myszy: doustnie, donosowo, podskórnie, opuszkowo na stopy, dootrzewnowo i dożylnie. Zastrzyki te będą miały bezpośredni wpływ na odpowiedź immunologiczną, a pobieranie tkanek limfatycznych i analiza aktywacji komórek dendrytycznych (DC) w tkankach są kluczowymi elementami tych ocen. Ekstrakcja węzłów chłonnych śródpiersia (mLN) jest ważna, ale dość złożona ze względu na rozmiar i lokalizację tego narządu. Opisano etapową procedurę pobierania pachwinowych węzłów chłonnych (iLN), mLN i śledziony oraz analizy aktywacji DC za pomocą cytometrii przepływowej.

W celu oceny odpowiednich dróg podania INP dla aktywacji komórek DC w tkance limfatycznej, populację DC określono jako komórki -CD11c+ w śledzionie, iLN oraz mLN i przeanalizowano poziomy ekspresji cząsteczek kostymulujących. Podanie INP drogą podskórną (s.c.) oraz dożylną (i.v.) spowodowało znaczny wzrost ekspresji CD40, CD80 i CD86 w komórkach DC śledziony i iLN (Rycina 2B i 2C). Iniekcja INP w podusz...

Eksperymentalne procedury późniejszej ekstrakcji tkanek limfatycznych w celu przetestowania aktywacji limfoidalnych komórek dendrytycznych są opisane po leczeniu immunostymulującym nanomateriałem.

Ocena czynnika immunostymulującego: ekstrakcja tkanki limfatycznej i aktywacja komórek dendrytycznych zależna od drogi iniekcji

For evaluation of a new therapeutic agent for immunotherapy or vaccination, analysis of immune cell activation in lymphatic tissues is essential. Here, we ...

Ogólnym celem tej procedury jest zapoznanie się z unikalną techniką wymaganą do izolowania węzła chłonnego śródpiersia od myszy. Operację przeprowadzono po wstrzyknięciu materiału immunostymulującego na sześć różnych dróg u myszy. W tym badaniu wykorzystaliśmy nową klasę materiałów tworzących struktury o rozmiarach nano.Surfaktanty składają się z hydrofilowej grupy głowy i hydrofobowego ogona. Tworzą one sferyczną miceli lub inną strukturę drugorzędową w wyniku separacji mikrofagów. Wykorzystaliśmy tę właściwość do biomakrocząsteczki, jaką jest DNA.Amfifil DNA, pokazany tutaj, jako regularne nukleotydy, takie jak A, C, G, T, ma bloki hydrofilowe, podczas gdy zmodyfikowane lipidami zasady nukleotydowe komórek nerwowych działają jako jednostki hydrofobowe. Zmodyfikowany oligo został zsyntetyzowany przez syntezator DNA w oktogramach na dużą skalę. W pożywkach równo amfifilowe lipidowe DNA spontanicznie tworzą sferyczne micele o rozmiarach nano.Kiedy powstaje micela, DNA pozostaje jednoniciowe jako pusty nośnik o średnicy około 10 nanometrów. Aby wyposażyć nosiciela w immunostymulant, wystarczy rozszerzyć sekwencję DNA za pomocą adiuwanta receptora toll-podobnego dziewiątego, a mianowicie eCpG. Lipidowe DNA i zasada eCpG, dlatego zewnętrzna powierzchnia miceli ulega degradacji za pomocą sekwencji CpG.Następnie nazywamy tę nanocząstkę stymulującą układ odpornościowy jako INP. Aby określić właściwy sposób INP dla odpowiedzi immunologicznej, wstrzyknęliśmy INP myszom w 64 drogach iniekcji, w wyniku czego przeanalizowano prawidłową tkankę węzłów chłonnych. Aby uzyskać bardziej szczegółowe instrukcje dotyczące wstrzykiwań, znajdź artykuł JOB opublikowany przez Charles River w 2012 roku.Główną zaletą tego filmu jest wizualne pokazanie, jak uzyskać węzeł chłonny śródpiersia. Film wyraźnie pokazuje lokalizację węzła chłonnego śródpiersia, który wiele osób ma trudności z izolacją narządów. Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt w Centrum Klinicznym Zdrowia Publicznego w Szanghaju lub University of Ulsan College of Medicine.Ta część pokaże konkretną lokalizację narządów lub tkanek, które są kluczowe dla analizy immunologicznej. Śledziona i dwa węzły chłonne zostaną odizolowane. Po pierwsze, myszy zostały złożone w ofierze poprzez eutanazję wdychaną dwutlenkiem węgla i dołożono wszelkich starań, aby zminimalizować cierpienie, zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt.Od teraz znajdźmy narządy i wyizolujmy je. Najpierw prawidłowo zamocuj mysz na pulpicie operacyjnym za pomocą czterech kołków na dłoni myszy. Wysterylizuj obszar sekcji alkoholem.Odetnij zewnętrzną osłonę dolnej części brzucha myszy dużymi nożyczkami. Użyj kleszczyków, aby otworzyć obie strony nasadki i przymocuj ją za pomocą kołków na stole operacyjnym. Lokalizacja pachwinowego węzła chłonnego jest odsłonięta poprzez znalezienie koniunkcji naczynia schodzącego w dół w kierunku lewej nogi.Kształt naczynia wygląda jak pochylona litera alfabetu Y.Odsłoń warstwę kleszczami i wyciągnij ją ze skóry. Przetnij otrzewną mniejszymi nożyczkami, aby odsłonić narządy wewnętrzne. Przesuń jelito w prawo za pomocą kleszczy, a następnie zawiń w ukształtowaną śledzionę, która znajduje się po lewej, lewej górnej stronie brzucha.Podczas zabiegu wymagana jest dodatkowa uwaga, ponieważ śledziona jest łatwa do zakłócenia. Wreszcie kluczowy punkt tego filmu: pobieranie węzła chłonnego śródpiersia. Znajduje się pod górną częścią płuca, która jest trudna do zauważenia ze względu na jej mały rozmiar i nieco ukryte położenie.Ostrożnie odsłoń obszar za pomocą małych nożyczek i kleszczy. Wytnij również obie strony żeber i membranę. Przytnij odcięte żebra nad klatką piersiową.Podczas zabiegu należy unikać uszkadzania serca i naczyń krwionośnych, ponieważ może to spowodować zaślepienie miejsca, znajdując półprzezroczysty węzeł chłonny śródpiersia. Jeśli przez przypadek pęknie naczynie krwionośne, delikatnie wytrzyj krew gazą. Chwyć lewą stronę płuca i delikatnie odwróć ją na drugą stronę, aby zajrzeć pod płuco.Podciągnij węzeł chłonny śródpiersia za pomocą kleszczy. Po pobraniu węzła chłonnego śródpiersia upewnij się, że idealnie usunąłeś cały tłuszcz i krew otaczającą węzeł chłonny, ponieważ niepożądana tkanka może wpłynąć na analizę. Na koniec wszystkie izolowane narządy na szalce Petriego wypełnionej pożywką.Łącznie 0,1 razy 10 do szóstych komórek analizowano w tej cytometrii przepływowej. Na podstawie gettora siły i wielkości gettera, populacja leukocytów została bramkowana, a komórki zostały wykluczone przez ciemne barwienie. 24 godziny po wstrzyknięciu INP 64 drogami wstrzyknięcia, śledziona, pachwinowy węzeł chłonny i śródpiersie węzła chłonnego zostały pobrane i przeanalizowane aktywacja DC za pomocą cytometrii przepływowej.Na podstawie strategii cytometrii przepływowej populację DC zdefiniowano jako komórki CD11C dodatnie i liniowo ujemne w żywych leukocytach. Warto zauważyć, że donosowe wstrzyknięcie INP sprzyjało znacznemu wzrostowi ekspresji CD40, 80, 86 w węźle chłonnym śródpiersia w porównaniu z PBS dla kontroli. Dlatego dane te sugerowały, że donosowe wstrzyknięcie INP może być stosowane jako adiuwant błony śluzowej w celu wzmocnienia odporności w płucach.

immunostimulatory-agent-evaluation-lymphoid-tissue-extraction

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film demonstruje metodę przekształcania komórek dendrytycznych (DC) w tolerogenne DC (TolDCs) za pomocą immunomodulującego środka farmakologicznego. Konwersja ta jest potwierdzana przez ocenę funkcji TolDC poprzez ich immunosupresyjne działanie na limfocyty T CD4 +.

Wpływ immunomodulującego środka farmakologicznego na interakcję między komórkami dendrytycznymi a limfocytami T CD4+

Opisano najczęściej używaną metodę generowania dużej liczby autologicznych komórek dendrytycznych (DC) do wykorzystania w immunoterapii nowotworów.  Metoda wykorzystuje IL-4 i GM-CSF do różnicowania DC od monocytów.  Niedojrzałe DC są stymulowane do dojrzewania, a następnie ładowane antygenami przed wstrzyknięciem z powrotem pacjentowi.

Przygotowanie dojrzałych komórek dendrytycznych obciążonych antygenem nowotworowym do immunoterapii

Profilaktyczne i terapeutyczne szczepienia często nie stymulują silnej odpowiedzi immunologicznej z powodu tygodniowego drenażu szczepionki do węzłów chłonnych, a w konsekwencji słabego zaangażowania komórek odpornościowych. Poprzez bezpośrednie wstrzyknięcie szczepionki do węzłów chłonnych, tzw. wstrzyknięcie dolimfatyczne, można znacznie poprawić skuteczność szczepionki i zmniejszyć dawki szczepionki.

Immunoterapia dolimfatyczna i szczepienie u myszy

Niedojrzałe komórki dendrytyczne mogą być selektywnie różnicowane w tolerogenne lub dojrzałe komórki dendrytyczne, aby regulować równowagę między odpornością a tolerancją. W pracy przedstawiono sposób generowania z niedojrzałych komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów (moDC), tolerogennych in vitro i dojrzałych moDC, które różnią się fenotypami metabolicznymi.

Wytwarzanie niedojrzałych, dojrzałych i tolerogennych komórek dendrytycznych o różnych fenotypach metabolicznych

DC (MoDC) pochodzące z monocytów może wykrywać niewielkie ilości cząsteczek związanych z niebezpieczeństwem i dlatego jest łatwo zapoczątkowane. Przedstawiamy szczegółowy protokół izolacji MoDC z krwi i nowotworów oraz ich aktywacji za pomocą kompleksów immunologicznych, podkreślając jednocześnie kluczowe środki ostrożności, które należy wziąć pod uwagę, aby uniknąć ich przedwczesnej aktywacji.

Protokół izolacji komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów myszy i ich późniejsza aktywacja in vitro za pomocą nowotworowych kompleksów immunologicznych

Prezentujemy tutaj aplikację do standardowej techniki immunologicznej (proliferacja OT-I barwiona CFSE) przeznaczonej do szybkiego monitorowania wytwarzania cytotoksycznych limfocytów T (CTL) za pośrednictwem adiuwantów in vivo. To szybkie oszacowanie zdolności CTL jest przydatne do opracowywania szczepionek profilaktycznych przeciwko patogenom wewnątrzkomórkowym, a także terapeutycznych szczepionek przeciwnowotworowych.

Szybka ocena in vivo zdolności wytwarzania cytotoksycznych limfocytów T adiuwantu w celu opracowania szczepionki

Tutaj prezentujemy protokół rozwoju i charakterystyki tolerogennych komórek dendrytycznych (TolDCs) oraz oceny ich immunoterapeutycznej użyteczności.

Rozwój i charakterystyka funkcjonalna mysich tolerogennych komórek dendrytycznych

Tutaj prezentujemy protokół do określenia in vivo aktywacji, proliferacji i różnicowania Th1 naiwnych komórek T CD4 (limfocytów T) indukowanych przez komórki dendrytyczne (DC) pochodzące ze szpiku kostnego GM-CSF. Ponadto protokół ten opisuje izolację komórek BM i T, wytwarzanie prądu stałego oraz transfer adoptywny komórek DC i T.

Mysi model in vivo do pomiaru naiwnej aktywacji, proliferacji i różnicowania Th1 limfocytów T CD4 indukowanych przez komórki dendrytyczne pochodzące ze szpiku kostnego

Urządzenie lub płytka do transimmunizacji (TI) i związane z nim protokoły zostały opracowane w celu odtworzenia kluczowych cech pozaustrojowej fotochemoterapii (ECP), w warunkach eksperymentalnych, pozwalając na produkcję fizjologicznie aktywowanych, przestrajalnych komórek dendrytycznych (DC) do immunoterapii raka.

Nowy protokół generowania fizjologicznych immunogennych komórek dendrytycznych

Metodologia opisuje wytwarzanie komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów bydlęcych (MoDC) i ich zastosowanie do oceny in vitro kandydatów na antygeny podczas opracowywania potencjalnych szczepionek weterynaryjnych u bydła.

Oznaczanie immunogenności szczepionki przy użyciu komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów bydlęcych

Opisujemy procedurę oceny zdolności środków farmakologicznych do generowania tolerogennych komórek dendrytycznych z naiwnych komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów in vitro i walidacji ich siły poprzez autologiczne generowanie regulatorowych limfocytów T.

Prosta i skuteczna metoda testowania środków immunomodulujących do wytwarzania tolerogennych komórek dendrytycznych z ludzkich monocytów CD14+

Poznaj technikę izolacji węzłów chłonnych śródpiersia u myszy po iniekcji nanomateriału immunostymulującego. Ta metoda umożliwia badanie aktywacji komórek dendrytycznych w odpowiedzi immunologicznej.

Ocena czynnika immunostymulującego: ekstrakcja tkanki limfatycznej i aktywacja komórek dendrytycznych zależna od drogi iniekcji

Przeglądaj więcej filmów