Ocena czynnika immunostymulującego: ekstrakcja tkanki limfatycznej i aktywacja komórek dendrytycznych zależna od drogi iniekcji
16 września 2018
Eksperymentalne procedury późniejszej ekstrakcji tkanek limfatycznych w celu przetestowania aktywacji limfoidalnych komórek dendrytycznych są opisane po leczeniu immunostymulującym nanomateriałem.
Ogólnym celem tej procedury jest zapoznanie się z unikalną techniką wymaganą do izolowania węzła chłonnego śródpiersia od myszy. Operację przeprowadzono po wstrzyknięciu materiału immunostymulującego na sześć różnych dróg u myszy. W tym badaniu wykorzystaliśmy nową klasę materiałów tworzących struktury o rozmiarach nano.
Surfaktanty składają się z hydrofilowej grupy głowy i hydrofobowego ogona. Tworzą one sferyczną miceli lub inną strukturę drugorzędową w wyniku separacji mikrofagów. Wykorzystaliśmy tę właściwość do biomakrocząsteczki, jaką jest DNA.
Amfifil DNA, pokazany tutaj, jako regularne nukleotydy, takie jak A, C, G, T, ma bloki hydrofilowe, podczas gdy zmodyfikowane lipidami zasady nukleotydowe komórek nerwowych działają jako jednostki hydrofobowe. Zmodyfikowany oligo został zsyntetyzowany przez syntezator DNA w oktogramach na dużą skalę. W pożywkach równo amfifilowe lipidowe DNA spontanicznie tworzą sferyczne micele o rozmiarach nano.
Kiedy powstaje micela, DNA pozostaje jednoniciowe jako pusty nośnik o średnicy około 10 nanometrów. Aby wyposażyć nosiciela w immunostymulant, wystarczy rozszerzyć sekwencję DNA za pomocą adiuwanta receptora toll-podobnego dziewiątego, a mianowicie eCpG. Lipidowe DNA i zasada eCpG, dlatego zewnętrzna powierzchnia miceli ulega degradacji za pomocą sekwencji CpG.
Następnie nazywamy tę nanocząstkę stymulującą układ odpornościowy jako INP. Aby określić właściwy sposób INP dla odpowiedzi immunologicznej, wstrzyknęliśmy INP myszom w 64 drogach iniekcji, w wyniku czego przeanalizowano prawidłową tkankę węzłów chłonnych. Aby uzyskać bardziej szczegółowe instrukcje dotyczące wstrzykiwań, znajdź artykuł JOB opublikowany przez Charles River w 2012 roku.
Główną zaletą tego filmu jest wizualne pokazanie, jak uzyskać węzeł chłonny śródpiersia. Film wyraźnie pokazuje lokalizację węzła chłonnego śródpiersia, który wiele osób ma trudności z izolacją narządów. Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt w Centrum Klinicznym Zdrowia Publicznego w Szanghaju lub University of Ulsan College of Medicine.
Ta część pokaże konkretną lokalizację narządów lub tkanek, które są kluczowe dla analizy immunologicznej. Śledziona i dwa węzły chłonne zostaną odizolowane. Po pierwsze, myszy zostały złożone w ofierze poprzez eutanazję wdychaną dwutlenkiem węgla i dołożono wszelkich starań, aby zminimalizować cierpienie, zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt.
Od teraz znajdźmy narządy i wyizolujmy je. Najpierw prawidłowo zamocuj mysz na pulpicie operacyjnym za pomocą czterech kołków na dłoni myszy. Wysterylizuj obszar sekcji alkoholem.
Odetnij zewnętrzną osłonę dolnej części brzucha myszy dużymi nożyczkami. Użyj kleszczyków, aby otworzyć obie strony nasadki i przymocuj ją za pomocą kołków na stole operacyjnym. Lokalizacja pachwinowego węzła chłonnego jest odsłonięta poprzez znalezienie koniunkcji naczynia schodzącego w dół w kierunku lewej nogi.
Kształt naczynia wygląda jak pochylona litera alfabetu Y.Odsłoń warstwę kleszczami i wyciągnij ją ze skóry. Przetnij otrzewną mniejszymi nożyczkami, aby odsłonić narządy wewnętrzne. Przesuń jelito w prawo za pomocą kleszczy, a następnie zawiń w ukształtowaną śledzionę, która znajduje się po lewej, lewej górnej stronie brzucha.
Podczas zabiegu wymagana jest dodatkowa uwaga, ponieważ śledziona jest łatwa do zakłócenia. Wreszcie kluczowy punkt tego filmu: pobieranie węzła chłonnego śródpiersia. Znajduje się pod górną częścią płuca, która jest trudna do zauważenia ze względu na jej mały rozmiar i nieco ukryte położenie.
Ostrożnie odsłoń obszar za pomocą małych nożyczek i kleszczy. Wytnij również obie strony żeber i membranę. Przytnij odcięte żebra nad klatką piersiową.
Podczas zabiegu należy unikać uszkadzania serca i naczyń krwionośnych, ponieważ może to spowodować zaślepienie miejsca, znajdując półprzezroczysty węzeł chłonny śródpiersia. Jeśli przez przypadek pęknie naczynie krwionośne, delikatnie wytrzyj krew gazą. Chwyć lewą stronę płuca i delikatnie odwróć ją na drugą stronę, aby zajrzeć pod płuco.
Podciągnij węzeł chłonny śródpiersia za pomocą kleszczy. Po pobraniu węzła chłonnego śródpiersia upewnij się, że idealnie usunąłeś cały tłuszcz i krew otaczającą węzeł chłonny, ponieważ niepożądana tkanka może wpłynąć na analizę. Na koniec wszystkie izolowane narządy na szalce Petriego wypełnionej pożywką.
Łącznie 0,1 razy 10 do szóstych komórek analizowano w tej cytometrii przepływowej. Na podstawie gettora siły i wielkości gettera, populacja leukocytów została bramkowana, a komórki zostały wykluczone przez ciemne barwienie. 24 godziny po wstrzyknięciu INP 64 drogami wstrzyknięcia, śledziona, pachwinowy węzeł chłonny i śródpiersie węzła chłonnego zostały pobrane i przeanalizowane aktywacja DC za pomocą cytometrii przepływowej.
Na podstawie strategii cytometrii przepływowej populację DC zdefiniowano jako komórki CD11C dodatnie i liniowo ujemne w żywych leukocytach. Warto zauważyć, że donosowe wstrzyknięcie INP sprzyjało znacznemu wzrostowi ekspresji CD40, 80, 86 w węźle chłonnym śródpiersia w porównaniu z PBS dla kontroli. Dlatego dane te sugerowały, że donosowe wstrzyknięcie INP może być stosowane jako adiuwant błony śluzowej w celu wzmocnienia odporności w płucach.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje procedurę izolacji węzłów chłonnych śródpiersia u myszy po wstrzyknięciu nanomateriału immunostymulującego. Technika ta koncentruje się na ekstrakcji tkanek limfatycznych w celu oceny aktywacji dendrytycznych komórek limfatycznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Immunologia
- Nanotechnologia
Wprowadzenie
- Zrozumienie aktywacji dendrytycznych komórek limfoidalnych jest kluczowe dla badań immunologicznych.
- Materiały immunostymulujące mogą wzmacniać odpowiedzi immunologiczne.
- Struktury nanometryczne posiadają unikalne właściwości, które mogą być wykorzystane w zastosowaniach biologicznych.
- Techniki izolacji są niezbędne do badania specyficznych typów komórek odpornościowych.
Cel badania
- Zapoznanie badaczy z techniką izolacji węzłów chłonnych śródpiersia.
- Ocena efektów działania nowej klasy nanomateriału immunostymulującego.
- Zbadanie aktywacji limfoidalnych komórek dendrytycznych po zastosowaniu leczenia.
Zastosowane metody
- Iniekcja materiału immunostymulującego sześcioma różnymi drogami podania u myszy.
- Izolacja węzłów chłonnych śródpiersia z zastosowaniem specyficznych technik chirurgicznych.
- Wykorzystanie surfaktantów do tworzenia struktur w nanoskali.
- Zastosowanie DNA jako biomakrocząsteczki w badaniu.
Główne wyniki
- Skuteczna izolacja tkanek limfatycznych od myszy.
- Obserwowana aktywacja dendrytycznych komórek limfoidalnych po zastosowaniu preparatu.
- Wykazanie skuteczności immunostymulującego nanomateriału.
- Wgląd w rolę struktur nanometrycznych w odpowiedziach immunologicznych.
Wnioski
- Technika izolacji węzłów chłonnych śródpiersia jest skuteczna i powtarzalna.
- Nanomateriały immunostymulujące mogą znacząco wpływać na aktywację komórek odpornościowych.
- Dalsze badania są uzasadnione w celu pełnego zbadania potencjału tych materiałów w immunologii.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Precyzyjna ocena agentów immunostymulujących wymaga zastosowania solidnych metod ekstrakcji i analizy tkanek limfoidalnych w celu oceny aktywacji komórek dendrytycznych w zależności od drogi podania. Niniejszy schemat pracy umożliwia zespołom biofarmaceutycznym porównanie profili aktywacji immunologicznej nowych agentów opartych na nanocząsteczkach, co zwiększa wiarygodność predykcyjną we wczesnej fazie odkrywania immunoterapii i szczepionek. Podejście to bezpośrednio wpływa na decyzje dotyczące wyboru drogi podania oraz selekcję kandydatów na leki immunomodulujące w ramach portfolio projektowego.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia badanie mechanizmów aktywacji odpornościowej poprzez ilościowe określanie odpowiedzi komórek dendrytycznych w tkankach limfatycznych.
- Wspiera biologiczną minimalizację ryzyka poprzez porównywanie sygnatur aktywacji dla wielu dróg podania.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celu dla kandydackich nanopartykuł immunostymulujących.
Przesiew i opracowywanie testów
- Zapewnia standaryzowane protokoły ekstrakcji tkanek i cytometrii przepływowej w celu uzyskania powtarzalnych wyników analizy komórek odpornościowych.
- Umożliwia ilościowe pomiary markerów aktywacji komórek dendrytycznych (CD40, CD80, CD86) na potrzeby opracowania testów.
- Umożliwia przesiewową ocenę dróg podania w celu optymalizacji profili immunogenności.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje dane dotyczące aktywacji odpornościowej ze strategiami dostarczania zależnymi od drogi podania w badaniach translacyjnych nad szczepionkami i immunoterapią.
- Wspiera ciągłość procesu od etapu odkrywania do walidacji przedklinicznej, umożliwiając bezpośrednie monitorowanie odpowiedzi odpornościowej na poziomie tkanek.
- Umożliwia dostosowany do ryzyka rozwój kandydatów wykazujących korzystne profile aktywacji i bezpieczeństwa.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta integruje się z procesem odkrywania immunoterapii – od wczesnej walidacji celu po wybór kandydata przedklinicznego – umożliwiając bezpośrednie porównanie aktywacji układu odpornościowego w zależności od drogi podania.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących mechanizmu działania immunostymulatorów oraz aktywacji specyficznej dla tkanki.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki cytometrii przepływowej do porównań między różnymi drogami podania.
- Analityka: Dostarcza danych o aktywacji komórek dendrytycznych opartych na markerach w celu ustalenia rankingu kandydatów.
- Badania translacyjne: Łączy zależną od drogi podania aktywację odpornościową ze strategiami dostarczania leków w fazie przedklinicznej.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia powtarzalny schemat ekstrakcji i analizy tkanek do oceny immunostymulatorów w postaci nanocząsteczek.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w zakresie mechanizmu działania immunostymulatorów oraz wyboru drogi podania.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje ekstrakcję tkanek i cytometrię przepływową w celu uzyskania powtarzalnego profilowania immunologicznego.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) dla kandydatów immunomodulujących w oparciu o ilościową aktywację odpornościową.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację kandydatów z optymalnymi profilami aktywacji i dostarczania, z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w sekcji myszy oraz wyodrębnianiu tkanki limfatycznej, w szczególności węzłów chłonnych śródpiersia.
- Niezbędny jest dostęp do aparatury do cytometrii przepływowej oraz infrastruktury analitycznej do profilowania komórek odpornościowych.
- Wymagana jest międzyzespołowa standaryzacja sposobu postępowania z tkankami oraz strategii bramkowania w celu zapewnienia powtarzalności.
- Możliwa może być konieczność adaptacji metody do różnych modeli zwierzęcych lub innych tkanek docelowych.
- Staranne przygotowanie tkanek jest kluczowe dla uniknięcia kontaminacji i zapewnienia dokładnej analizy komórek odpornościowych.
