Wydajne wytwarzanie białka homeobox trzustki/dwunastnicy 1⁺ w tylnym odcinku jelita przedniego/trzustki z hPSC w kulturach adhezyjnych

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) w komórki białka homeobox 1⁺ trzustki/dwunastnicy (PDX1⁺) w celu wytworzenia linii trzustki w oparciu o jednowarstwowy wzrost pojedynczych komórek bez typu kolonijnego. Metoda ta jest odpowiednia do wytwarzania jednorodnych komórek pochodzących z hPSC, manipulacji genetycznych i badań przesiewowych.

Główną zaletą tej techniki jest to, że przed stymulacją komórki są równomiernie rozpraszane, a następnie stymulowane równomiernie w tandemowej adhezji komórek. Procedurę zademonstruje Azuma Kimura, doktorantka z naszego laboratorium. Aby rozpocząć tę procedurę, przenieś sześć mililitrów RPMI 1640 do rurki schłodzonej do czterech stopni Celsjusza na lodzie.

Używając schłodzonych jednomililitrowych końcówek pipet, dodaj dwa miligramy matrycy membrany podstawnej. Dobrze wymieszaj przez delikatne pipetowanie, aby uzyskać matrycę błony podstawnej o stężeniu 0,33 miligrama na mililitr. Następnie za pomocą pipety przenieś dwa mililitry rozcieńczonej matrycy błony podstawnej do każdej studzienki sześciodołkowej płytki do hodowli komórkowej.

Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 60 do 90 minut. Następnie trzymaj płytkę w temperaturze pokojowej do trzech godzin, aż będzie gotowa do użycia. Najpierw odessać zużytą pożywkę i za pomocą pipety dodać dwa mililitry 0,5 milimolowego EDTA do każdej studzienki, aby przemyć hPCS hodowane na płytce sześciodołkowej.

Następnie odessaj EDTA ze studzienek i dodaj dwa mililitry świeżego 0,5 milimolowego EDTA do każdej studzienki. Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie odessaj EDTA z każdej studzienki.

Dodać jeden mililitr pożywki konserwacyjnej hPSC o temperaturze pokojowej, uzupełnionej 10 mikromolami Y27632 do każdej studzienki. Delikatnie, ale szybko odpipetować, aby zdmuchnąć przyczepione komórki na płytce i zgrupować zbrylone komórki na pojedyncze komórki. Przenieść zawiesinę komórek do 50-mililitrowej probówki wirówkowej zawierającej cztery mililitry pożywki konserwacyjnej hPSC uzupełnionej 10 mikromolowym Y27632 na studzienkę i wymieszać przez pipetowanie.

Następnie wymieszaj 15 mikrolitrów zawiesiny komórkowej z 15 mikrolitrami błękitu trypanowego w probówce. Za pomocą pipety o pojemności 10 mikrolitrów przenieś 10 mikrolitrów zawiesiny rozcieńczonych komórek do szkiełek do liczenia komórek w dwóch egzemplarzach. Korzystając z automatycznego licznika komórek, policz liczbę komórek i oblicz gęstość komórek w zawiesinie komórek.

Zawiesinę komórek należy umieścić w 50-mililitrowej probówce o gęstości od jednego do półtora miliona komórek na każdą studzienkę, która ma być użyta. Odwirować probówkę o stężeniu 200 razy G i w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie za pomocą pipety odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki, używając jednego mililitra pożywki stopnia 1A na studzienkę.

Delikatnie odpipetować zawiesinę komórek, a następnie dodać kolejny mililitr pożywki stopnia 1A do dołka. Za pomocą pipety o pojemności 1000 mikrolitrów odessać rozcieńczoną matrycę błony podstawnej z dołków wcześniej przygotowanej płytki do hodowli komórkowej. Natychmiast delikatnie odpipetować zawiesinę w probówce i przenieść dwa mililitry do każdego dołka płytki sześciodołkowej.

Przykryj talerz folią aluminiową, aby chronić go przed światłem i umieść talerz na czystej ławce w temperaturze pokojowej na 10 do 15 minut. Następnie ostrożnie przenieś płytkę do inkubatora w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla i nawilżoną atmosferą na 24 godziny. Najpierw delikatnie potrząśnij płytką i za pomocą pipety odessaj zużyte podłoże.

Następnie dodaj dwa mililitry DPBS do każdej studzienki. Ponownie delikatnie potrząśnij płytką i zassaj zużyty DPBS. Dodaj cztery mililitry pożywki etapu 1B, wstępnie podgrzanej do 37 stopni Celsjusza, do każdej studzienki.

Ostrożnie przenieś płytkę do inkubatora w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla i wilgotną atmosferą do hodowli na 48 godzin. Następnie delikatnie potrząśnij płytką i zassaj zużyte podłoże. Dodaj dwa mililitry DPBS do każdej studzienki.

Powtórz ten aspirację i dodanie DPBS jeszcze jeden raz. Delikatnie wstrząśnij płytką i odessaj zużyty DPBS. Dodaj cztery mililitry pożywki etapu 1B, wstępnie podgrzanej do 37 stopni Celsjusza, do każdej studzienki.

Ostrożnie przenieś płytkę do inkubatora w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla i wilgotną atmosferą do hodowli na 24 godziny. Najpierw delikatnie potrząśnij płytką i odessaj zużyte podłoże. Dodaj dwa mililitry DPBS do każdego dołka płytki sześciodołkowej.

Następnie delikatnie potrząśnij płytką i odessaj zużyty DPBS. Dodaj cztery mililitry pożywki drugiego stopnia, wstępnie podgrzanej do 37 stopni Celsjusza, do każdej studzienki. Ostrożnie przenieś płytkę do inkubatora w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla i wilgotną atmosferą do hodowli na cztery dni.

Delikatnie potrząśnij płytką i odessaj zużyte podłoże. Dodaj dwa mililitry DPBS do każdej studzienki. Powtórz ten proces zasysania i dodawania DPPS jeszcze raz.

Następnie delikatnie potrząśnij płytką i zassaj zużyty DPBS. Dodaj cztery mililitry pożywki trzeciego stopnia, wstępnie podgrzanej do 37 stopni Celsjusza, do każdej studzienki. Ostrożnie przenieś płytkę do inkubatora w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla i wilgotną atmosferą do hodowli na trzy dni.

W tym badaniu rozmnażające się hIPSE są skondensowane i tworzą jednorodną monowarstwę, która nadaje się do różnicowania. Niezróżnicowane hIPSE są dysocjowane i ponownie zasiewane jako pojedyncze komórki o niskiej gęstości komórek. W ciągu godziny komórki są mocowane do płytki i zaczynają wykazywać wystające elementy.

Pierwszego dnia komórki są proliferowane i dobrze rozmieszczone, aby pokryć od 80 do 90% powierzchni. W trzecim i czwartym dniu komórki tworzą jednorodny jednowarstwowy arkusz, który można opisać jako wygląd kostki brukowej. W tym momencie większość komórek przestaje wyrażać SOX2, który jest markerem komórek niezróżnicowanych, a zamiast tego wyraża ostateczny marker endodermy, SOX17, przy ponad 90%Większość komórek SOX17-dodatnich wyraża FOXA2.

Następnie komórki zaczynają wyrażać prymitywne markery goptupy, HNF1-beta i HNF4-alfa, a ostatecznie wyrażają tylny marker progenitorowy trzustki, PDX1, na poziomie ponad 90%Indukcja komórek PDX1-dodatnia jest odtwarzalna w innej linii hIPSE, 1231A3, i linii hESE, KhES-3. Wyniki QRTPCR ekspresji markerów stopnia zaawansowania mRNA są zgodne z barwieniem immunologicznym, a ekspresja PDX1 w MRNA jest widoczna w trzecim stadium i znacznie wzrasta po jego zakończeniu. Ponieważ niezróżnicowane komórki ESIPS są hodowane jako kolonie, poszczególne komórki są lokalnie w innym stanie.

Protokół ten zapewnia sposób na równomierną stymulację komórek w celu wybranego różnicowania.