Izolacja i hodowla jelitowych komórek macierzystych w świńskim modelu segmentowego niedokrwienia jelita cienkiego

Ten protokół umożliwi czytelnikom pomyślne stworzenie świńskiego modelu segmentowego niedokrwienia jelit, a następnie izolację i hodowlę jelitowych komórek macierzystych do badania naprawy nabłonka po urazie.

Ogólnym celem tej procedury jest ocena wpływu niedokrwienia jelit na komórki macierzyste nabłonka jelitowego. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii komórek macierzystych, takie jak to, w jaki sposób komórki macierzyste są odporne na uszkodzenia i przyczyniają się do naprawy po urazie niedokrwiennym. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to duży model zwierzęcy, który można wykorzystać do badania klinicznych chorób jelit i naprawy.

Procedurę zademonstrują Amy Stieler Stewart, doktorantka, i John Freund, specjalista ds. badań z mojego laboratorium. Zacznij od użycia ostrza skalpela, aby wykonać od ośmiu do 10 centymetrów brzusznego nacięcia linii środkowej na brzuchu wyśrodkowanym na pępku ośmio- do 10-tygodniowej świni mieszańcowej Yorkshire. Zlokalizuj jelito czcze, około 40 centymetrów ustnie do połączenia krętniczo-kątniczego.

Podwiąż jelito obwodowo dwa razy, aby wyznaczyć 10-centymetrowe pętle jelita czczego z jednym centymetrem między każdą ligaturą. Utwórz dwie pętle na każdy punkt czasowy niedokrwienia sąsiadujące ze sobą, jedną dla niedokrwienia i jedną dla niedokrwienia z dodatkową godziną reperfuzji. Aby wywołać odwracalne całkowite niedokrwienie, użyj zacisków naczyniowych buldoga lub hemostatów, aby zablokować około trzech naczyń krezkowych na zacisk przez odpowiedni okres czasu doświadczalnego.

Utrzymuj brzuch zakryty przez cały okres niedokrwienia. Pod koniec eksperymentu użyj nożyczek Metzenbauma, aby najpierw zebrać kontrolny fragment normalnego jelita czczego co najmniej pięć do 10 centymetrów proksymalnie do ostatniej pętli niedokrwiennej, a następnie zebrać resztę pętli. Przechowuj pętle z każdego punktu czasu kontuzji w małych pojemnikach z lodowatym PBS do czasu izolacji krypty.

Aby wyizolować kryptowe komórki macierzyste, użyj drutu o średnicy 20 mm i kleszczyków tkankowych, aby odwrócić każdą pętlę jelita cienkiego, tak aby powierzchnia błony śluzowej była odsłonięta. Zszyj górną i dolną część każdej pętli bezpiecznie do drutu i opłucz każdą odwróconą pętlę w lodowatym PBS. Po usunięciu wszystkich zanieczyszczeń świetlnych natychmiast umieść próbki w pojedynczych 50-mililitrowych stożkowych probówkach zawierających 30 mililitrów odczynnika dysocjacyjnego numer jeden na lodzie na 30 minut z wytrząsaniem i inwersją co pięć minut.

Pod koniec okresu inkubacji przenieść próbki do odpowiednich 50-mililitrowych probówek zawierających 30 mililitrów odczynnika dysocjacyjnego numer dwa i zagnieździć próbki z dwu- do czterogodzinnej pętli niedokrwiennej przez odwirowanie. Ponownie zawiesić granulki w pięciu mililitrach PBS i użyć 50 mikrolitrowej porcji z każdej próbki, aby sprawdzić stopień powiązania krypty i ilość zanieczyszczeń za pomocą mikroskopii świetlnej. Następnie umieść próbki w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 10 minut z wstrząsaniem lub odwróceniem co pięć minut.

Następnie przenieś próbki bezpośrednio do 25 mililitrów lodowatego PBS na lodzie w wytrząsarce orbitalnej ustawionej na 60 obr./min na dwie do pięciu minut wytrząsania z dodatkowym ręcznym wstrząsaniem lub odwróceniem co 30 sekund. Pod koniec inkubacji wytrząsania sprawdzić stopień powiązania krypty i ilość zanieczyszczeń, a następnie przenieść próbki do nowych 50-mililitrowych stożkowych probówek zawierających 25 mililitrów zimnego PBS do wytrząsania, aż nienaruszone krypty zostaną odizolowane z minimalną ilością zanieczyszczeń i kosmków. Gdy pętle zostaną całkowicie zdysocjowane, usuń pozostałą tkankę, osadź próbki przez odwirowanie i ponownie zawieś pozostałe granulki krypty w pięciu mililitrach świeżego PBS.

Następnie podamy 150 krypt na probówkę do pojedynczych probówek mikrowirówek i osadzamy krypty przez mikrowirowanie. Używając wstępnie schłodzonej pipety, delikatnie ponownie zawiesić granulki z 50 mikrolitrami mieszanki wzorcowej na studzienkę, a następnie szybko pipetować 15 razy, aby wymieszać. Następnie dozuj kroplę krypty o pojemności 50 mikrolitrów do środka każdej studzienki wstępnie zrobaczonej i siatkowanej 24-dołkowej płytki i umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po 30 minutach pokryj każdy kotlet matrycowy 500 mikrolitrami na studzienkę pożywki z komórek macierzystych nabłonka jelitowego, dodając 500 mikrolitrów sterylnego PBS do nieużywanych studzienek, aby utrzymać wilgotność i policz liczbę platerowanych krypt dnia zero. Dodawaj czynniki wzrostu do każdej studzienki co 48 godzin, zastępując supernatant co 96 godzin 500 mikrolitrami świeżej pożywki uzupełnionej czynnikiem wzrostu. Całkowite niedokrwienie jelita powstaje w pętlach jelita cienkiego za pomocą niedrożności naczyń za pomocą szwów lub zacisków, jak pokazano.

Jeśli zostanie wykonany prawidłowo, uraz niedokrwienny rozpocznie się na końcu kosmków jelitowych i będzie migrował w dół w krypcie wraz ze wzrostem czasu trwania niedokrwienia. Jednym z częstych błędów w technice chirurgicznej może wystąpić, gdy naczynia krwionośne nie są podwiązane lub zaciśnięte równomiernie, co powoduje niedokrwienie krwotoczne, w którym cienkościenna żyła zapada się przed tętnicą, umożliwiając naciekanie tkanek przez dodatkową krew. Po usunięciu niedokrwiennych pętli jelitowych, krypty jelitowe można z powodzeniem wyizolować zgodnie z protokołem dysocjacji, jak właśnie pokazano.

Krypty z bardziej uszkodzonych punktów czasowych są często uszkodzone i zawierają więcej odłamków komórkowych tła w porównaniu z tymi, które nie uległy żadnym lub niewielkim uszkodzeniom. Kiedy normalne i łagodnie uszkodzone krypty jelitowe są platerowane w hodowli, enterosfery tworzą się w ciągu 24 do 48 godzin. W przypadku poważnego uszkodzenia niedokrwiennego krypty jelitowe przeżywają, ale ulegają uszkodzeniu, co początkowo prowadzi do powstania znacznie mniejszych kulek.

Po 72 do 120 godzinach enteroidy ze wszystkich krypt stają się bardziej złożone z oczywistymi centralnymi światłami i pączkującymi strukturami oraz z ogólnie zmniejszoną wydajnością wzrostu krypt, a także zmniejszonym rozmiarem enteroidów pochodzących z poważnie uszkodzonej tkanki jelitowej. Po opanowaniu, procedury izolacji krypty można wykonać w ciągu około dwóch do trzech godzin, jeśli zostaną wykonane prawidłowo. Najlepiej, aby krypty zebrane do posiewu pochodziły z płukania, a nie z frakcji dysocjacyjnych ze względu na zwiększone prawdopodobieństwo zanieczyszczenia kultur we frakcji dysocjacji.

Metoda ta może być również stosowana do badania skuteczności leków stosowanych w leczeniu urazów nabłonka wynikających z niedokrwienia plus minus reperfuzji. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią przewodu pokarmowego do zbadania wpływu niedokrwienia na nabłonek, w szczególności na jelitowe komórki macierzyste w translacyjnym, klinicznie istotnym dużym modelu zwierzęcym. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak tworzyć niedokrwienie jelit z reperfuzją lub bez, a także izolować krypty jelitowe do hodowli 3D po urazie in vivo.