Kwantyfikacja morfologii mikrogleju na podstawie mikrofotografii immunohistochemicznej tkanki przygotowanej za pomocą ImageJ
5 czerwca 2018
Mikroglej to komórki odpornościowe mózgu, które badają i reagują na zmienione fizjologie mózgu poprzez zmiany morfologiczne, które mogą być oceniane ilościowo. Protokół ten przedstawia protokół analizy oparty na ImageJ, aby przedstawić morfologię mikrogleju jako ciągłe dane zgodnie z takimi wskaźnikami, jak rozgałęzienie komórki, złożoność i kształt.
Ogólnym celem tych metod analizy szkieletu i fraktali jest pomiar morfologii mikrogleju na podstawie tkanki przygotowanej przez IHC, przy użyciu metod ilościowych, które są zarówno z natury wysokoprzepustowe, jak i czułe na wykrywanie niewielkich różnic w kształtach komórek. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neurozapalności, definiując niuanse formy i funkcji mikrogleju w zdrowiu i chorobie. Główną zaletą tej techniki jest to, że określa ona ilościowo morfologię mikrogleju przy użyciu zmiennych ciągłych, a nie kategorycznych.
Opisane tutaj metody nie wymagają zastrzeżonego oprogramowania i mogą być używane do badań przesiewowych regionów mózgu lub analizy komórka po komórce. Procedurę zademonstruje Kimberly Young, technik z mojego laboratorium. Przed rozpoczęciem upewnij się, że wtyczka AnalayzeSkeleton została pobrana na ImageJ lub Fidżi.
Następnie otwórz stos Z o grubości 30 mikronów, na którym znajduje się mózg barwiony immunologicznie Iba1. Jeśli używasz mikrofotografii fluorescencyjnej, upewnij się, że obraz jest 8-bitowy i przekonwertuj go na skalę szarości, aby jak najlepiej zobrazować wszystkie pozytywne zabarwienia. Na pasku narzędzi kliknij opcję Obraz, Tabele odnośników, Szarości.
Jeśli używasz zdjęcia w jasnym polu DAB, najpierw użyj wtyczki filtra pasmowo-przepustowego FFT z ustawieniami domyślnymi. Kliknij opcję Proces, FFT, Filtr pasmowoprzepustowy, a następnie przekonwertuj na skalę szarości. Jeśli obraz jest zbyt ciemny, aby zobrazować proces mikrogleju, użyj paska narzędzi i kliknij Obraz, Dostosuj, Jasność/Kontrast.
W razie potrzeby dostosuj suwaki minimum lub maksimum, aż do krawędzi histogramu, ale nie dalej. Regulacja jasności powoduje największą zmienność w analizie danych i dlatego jest najbardziej krytycznym krokiem. Następnie uruchom filtr Maska wyostrzająca, aby jeszcze bardziej zwiększyć kontrast, klikając Proces, Filtry, Maska wyostrzająca.
Wykonaj krok usuwania plamek, aby usunąć szum soli i pieprzu generowany przez maskę wyostrzającą. Użyj paska narzędzi i kliknij opcję Proces, Szum, Usuń plamki. Przekonwertuj obraz na binarny, wybierając Obraz, Dostosuj, Próg.
Następnie zastosuj funkcję Despeckle do obrazu binarnego, aby usunąć pozostały szum pojedynczego piksela. Następnie zastosuj funkcję Zamknij, klikając Proces, Binarny, Zamknij, aby połączyć ciemne piksele oddzielone maksymalnie dwoma pikselami. Następnie usuń wartości odstające, klikając pozycję Proces, Szum, Usuń wartości odstające.
Po zapisaniu obrazu jako osobnego pliku do wykorzystania w przyszłości, zszkieletuj obraz za pomocą paska narzędzi, klikając Proces, Binarny, Szkieletuj. Wybierz szkieletowany obraz i uruchom wtyczkę AnalyzeSkeleton, klikając pozycję Wtyczki, Szkielet, Analizuj szkielet i zaznaczając pole informacji o gałęzi. Skopiuj dane z wyników i danych wyjściowych informacji o gałęzi, a następnie wklej dane do arkusza kalkulacyjnego programu Excel.
W programie Excel przytnij dane, aby usunąć fragmenty szkieletu, które powstają w wyniku IHC i akwizycji obrazu. Określ, jaka długość fragmentów zostanie przycięta z zestawu danych, otwierając szkieletowany obraz w ImageJ i wybierając narzędzie Linia. Zmierz kilka fragmentów, zwracając uwagę na średnią długość, i zdecyduj o wartości odcięcia, która powinna być spójna w całym zbiorze danych.
Sortuj arkusz kalkulacyjny programu Excel niestandardowo, klikając opcję Sortuj i filtruj, Sortowanie niestandardowe. Sortuj według wokseli końcowych od największego do najmniejszego, a na nowym poziomie według gałęzi Mx PT od największego do najmniejszego. Usuń każdy wiersz zawierający dwa punkty końcowe o maksymalnej długości gałęzi mniejszej niż wartość odcięcia.
Zsumuj dane w kolumnie punktów końcowych, aby obliczyć łączną liczbę punktów końcowych zebranych z obrazu. Powtórz te czynności dla danych informacyjnych gałęzi po posortowaniu według długości gałęzi. Po przycięciu i zsumowaniu wszystkich danych podziel dane z każdego obrazu przez liczbę somy mikrogleju na odpowiednim obrazie.
Wprowadź końcowy punkt końcowy oraz długość komórki i długości gałęzi na komórkę do oprogramowania statystycznego. Upewnij się, że wtyczka FracLac została pobrana. Następnie użyj narzędzia prostokąta, aby narysować ROI.
Upewnij się, że pole jest wystarczająco duże, aby przechwycić całą komórkę i może pozostać spójne w całym zestawie danych. W oknie Menedżer ROI wybierz opcję Aktualizuj, aby zablokować ROI na losowo wybranej komórce na mikrofotografii. Otwórz obraz binarny zawierający wybraną komórkę.
Kliknij dwukrotnie narzędzie Pędzel, ustaw kolor na i dostosuj szerokość pędzla zgodnie z potrzebami. Korzystając z pasującej mikrofotografii jako odniesienia, użyj pędzla, aby usunąć sąsiednie procesy komórkowe, połączyć pofragmentowane procesy i wyizolować komórkę będącą przedmiotem zainteresowania. Po odizolowaniu komórki binarnej zapisz plik binarny.
Przekonwertuj komórkę binarną na konspekt za pomocą paska narzędzi, za pomocą Proces, Binarny, Konspekt. Na pasku narzędzi otwórz FracLac za pomocą paska narzędzi, klikając Wtyczki, Analiza fraktalna, FracLac i wybierz BC dla zliczania pól. W oknie Projektowanie siatki ustaw wartość Num G na cztery.
W obszarze Opcje grafiki zaznacz pole metryki, aby przeanalizować wypukłą powłokę i okrąg ograniczający komórki. Po zakończeniu wybierz pozycję W porządku, a następnie wybierz przycisk Skanuj, aby uruchomić skanowanie zliczające pola na wybranym obrazie. W oknie Wyniki kadłuba i okręgu skopiuj wszystkie żądane wyniki danych.
Następnie zrób to samo w oknie Podsumowanie liczby pól. Przenieś skopiowane dane do pliku Excel lub oprogramowania statystycznego. Ten wykres przedstawia dane podsumowujące punkty końcowe mikrogleju na komórkę i długość przetwarzania na komórkę w nieuszkodzonej i uszkodzonej tkance korowej.
Jest to wynik analizy z zastosowanym protokołem. W obu przypadkach przeprowadzono analizę statystyczną za pomocą testu T Studenta, a następnie przeanalizowano trzy obrazy. Należy zwrócić uwagę na zmienność stosowania protokołu między użytkownikami.
Różnice te zostały podsumowane tutaj, gdzie ten sam zbiór danych był analizowany przez dwóch niezależnych użytkowników stosujących identyczny protokół. Chociaż trendy są podobne we wszystkich obszarach, zmienność między użytkownikami wpływa na znaczenie danych. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że celem jest uzyskanie szkieletu lub modelu konturowego, który jest reprezentatywny dla oryginalnego mikrofotografii.
Oznacza to, że kroki mogą być modyfikowalne w zależności od konkretnych potrzeb badacza. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak szybko określić ilościowo morfologię mikrogleju na podstawie mikrofotografii tkanki immunohistochemicznej za pomocą łatwo dostępnego oprogramowania komputerowego.
Przegląd
Ten artykuł przedstawia protokół ilościowego oceniania morfologii mikrogleju za pomocą ImageJ, koncentrując się na analizie immunoistochemicznie przygotowanej tkanki mózgowej. Metoda ma na celu zbadanie zmian w kształcie mikrogleju związanych z stanami neurozapalnymi, uwzględniając kluczowe aspekty funkcji mikrogleju zarówno w zdrowiu, jak i w chorobie.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia komórki
- Immunologia
Tło
- Mikroglej działa jako główne komórki odpornościowe w mózgu, reagując na zmiany fizjologiczne.
- Ilościowa analiza morfologii mikrogleju może zapewnić wgląd w neuro zapalenie.
- Ten protokół wykorzystuje oprogramowanie nieobjęte prawami ochronnymi, zapewniając dostępność do badania różnych obszarów mózgu.
- Wysokowydajne metody ułatwiają wykrywanie subtelnych różnic morfologicznych.
Cel badania
- Aby umożliwić szczegółową analizę morfologii mikrogleju w zdrowym i chorobowym stanie mózgu.
- Aby zastosować ciągłe metryki danych (np. rozgałęzienie komórek) dla bardziej precyzyjnych ocen.
- Aby odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące neurozapalenia dotyczących kształtu i funkcji mikrogleju.
Stosowane metody
- Analiza jest przeprowadzana na immunoistochemicznie przygotowanej tkankach mózgowych z wykorzystaniem ImageJ.
- Zastosowanie technik takich jak szkieletyzacja i analiza fraktalna w celu ilościowego określenia morfologii mikrogleju.
- Kroki obejmują regulację jasności/ kontrastu, konwersję binarną i stosowanie różnych filtrów.
- Analiza statystyczna i przycinanie danych są szczegółowo opisane, aby zapewnić solidne wyniki.
- Zawarte są zalecenia dotyczące izolowaniu komórek i analizie określonych obszarów zainteresowania (ROI).
Główne wyniki
- Wyniki ilościowe obejmują punkty końcowe i miary długości gałęzi na komórkę w różnych warunkach.
- Wstępne wyniki pokazują trendy w morfologii mikrogleju, które mogą się różnić w zależności od stanu urazu.
- Analiza podkreśla znaczenie zmienności morfologicznej w funkcji mikrogleju podczas stanu zapalnego.
- Różnice między użytkownikami wpływają na znaczenie danych, ale pozostają spójne w kierunku trendu.
Wnioski
- To badanie dostarcza szczegółowego, powtarzalnego protokołu do ilościowej oceny morfologii mikrogleju.
- Zwiększa to zrozumienie dynamiki mikrogleju w zdrowiu i chorobie, oferując implikacje dla badań neurozapalnych.
- Opisane metody sprzyjają adaptowalności analiz dostosowanych do określonych potrzeb badawczych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantitative microglia morphology analysis using ImageJ enables objective, high-throughput assessment of neuroinflammatory states in preclinical models. This approach supports early discovery teams by providing sensitive, reproducible metrics for cellular phenotyping and mechanistic de-risking. The protocol's accessibility and scalability facilitate portfolio-wide evaluation of neuroimmune targets and disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of microglial activation and morphological phenotypes in brain tissue.
- Supports functional target validation by linking cell shape metrics to neuroinflammatory status.
- Facilitates mechanistic de-risking through objective, continuous variable outputs.
- Improves predictive confidence for neuroimmune target selection and triage.
Screening & Assay Development
- Prepares validated image analysis workflows for downstream compound screening.
- Standardizes morphological quantification across multiple brain regions and conditions.
- Generates reproducible, quantitative outputs for assay benchmarking and optimization.
- Enables scalable, high-throughput screening of microglial responses to perturbations.
Translational & Preclinical Research
- Aligns morphological endpoints with disease-relevant neuroinflammatory biomarkers.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of neuroimmune mechanisms.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on quantitative cellular readouts.
- Enhances translational confidence by enabling cross-study comparability of microglial phenotypes.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling standardized, quantitative analysis of microglia in immunohistochemistry-prepared tissue.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification in neuroinflammation research.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible image analysis for compound evaluation.
- Analytics: Provides quantitative outputs such as endpoints, branch lengths, and complexity metrics for robust statistical comparison.
- Translational Research: Connects morphological data to disease-relevant biomarkers and preclinical endpoints.
- Enterprise Reuse: Offers a non-proprietary, adaptable workflow for broad application across neuroimmune research portfolios.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neuroimmune target validation.
- Operational Value: Promotes standardization, reproducibility, and scalability in image-based phenotyping.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neuroinflammatory programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in image analysis and neuroanatomy for accurate ROI selection and data interpretation.
- Needs access to immunohistochemistry-prepared tissue and open-source ImageJ plugins (AnalyzeSkeleton, FracLac).
- Demands cross-user standardization to minimize inter-operator variability in data outputs.
- Adaptable to various brain regions and experimental models with protocol modifications as needed.
- Careful thresholding and image preprocessing are critical to ensure data quality and comparability.
