Charakterystyka procesów naprawy DNA przy przejściowych i długotrwałych pęknięciach dwuniciowego DNA za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej

Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie naprawy DNA, takie jak sposób regulacja powstawania, lokalizacji i rozdzielczości kompleksów naprawy DNA. Główną zaletą tej techniki jest to, że może ona jednoznacznie wykrywać zmiany i naprawiać złożoną lokalizację i kinetykę. Oprócz tych naukowców ze studiów licencjackich w moim laboratorium, eksperymenty przeprowadzi trzech doktorantów.

Będą to Changkun Hu, Dalton Dacus i Stephen Walterhouse. Na początek hoduj komórki U2OS/DR-GFP na 10-centymetrowej płytce do hodowli tkankowej, aż osiągną 85 do 90% zlewania się. Następnie usuń pożywkę, dodaj trzy mililitry EDTA i inkubuj komórki w temperaturze pokojowej przez trzy minuty.

Zastąp EDTA jednym mililitrem trypsyny i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie dodaj pięć mililitrów DMEM, aby zneutralizować trypsynę. Po policzeniu komórek, wysiewaj sześć razy po 10 do trzeciej komórki na dołek w 200 mikrolitrach pożywki na 96-dołkowej płytce ze szklanym dnem.

Alternatywnie, wysiewaj cztery razy od 10 do sześciu dołków w ośmiu mililitrach podłoża na 12-milimetrowych szkiełkach nakrywkowych umieszczonych na 10-centymetrowej płytce, a następnie hoduj komórki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Aby wywołać pęknięcia podwójnej nici lub DSB, zastąp pożywkę nadtlenkiem wodoru rozcieńczonym do stężenia 25 mikromolów z DMEM plus 10% FBS i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Umyj komórki trzy razy 1x PBS, a następnie dodaj świeży DMEM.

Aby utrwalić komórki po ich inkubacji, użyj PBS, aby trzykrotnie umyć płytkę. Następnie za pomocą igły i kleszczyków ostrożnie usuń szkiełko nakrywkowe z 10-centymetrowej płytki dla każdego punktu czasowego i umieść je w jednym dołku na 24-dołkowej płytce. Dodaj 4% PFA i inkubuj komórki przez 15 minut.

Następnie my, PBS, aby umyć szkiełka okładkowe trzy razy. Aby przepuszczalność komórek, dodaj 0,5% niejonowego detergentu i PBS. Inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez 15 minut.

Następnie ponownie umyj komórki trzykrotnym PBS. Następnie dodać 3% BSA i 0,1% niejonowy detergent rozcieńczony w PBS do szkiełek nakrywkowych na 24-dołkowej płytce i inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez godzinę. Następnie dodaj przeciwciała pierwszorzędowe, które są ukierunkowane na białko naprawcze będące przedmiotem zainteresowania i inkubuj próbki w temperaturze pokojowej przez godzinę.

Po trzykrotnym umyciu komórek PBS, dodać DAPI i inkubować płytki w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie inkubować próbki z przeciwciałami drugorzędowymi. Po umyciu ogniw jak poprzednio, użyj odczynnika montażowego, aby zamontować pokrywę szkiełka komórkową do dołu na szkiełkach.

Ostrożnie dociśnij szkiełka nakrywkowe i użyj chusteczki, aby wchłonąć nadmiar odczynnika montażowego. Uszczelnij szkiełka nakrywkowe szybkoschnącym przezroczystym lakierem do paznokci i upewnij się, że szkiełko nakrywkowe jest całkowicie uszczelnione za pomocą szkiełka. Wykonuj obrazy mikroskopu konfokalnego, ustawiając ostrość na kanale DAPI.

Aby zdefiniować jądra w obrazach immunofluorescencyjnych, otwórz obrazy konfokalne, przeciągając plik obrazu do okna ImageJ lub wybierając importer formatów biologicznych z paska narzędzi wtyczki w ImageJ. Następnie wybierz podzielone kanały. W obszarze opcje kolorów wybierz opcję pokolorowane z menu rozwijanego.

Wybierz przycisk OK, aby otworzyć obrazy DAPI i histonów H2AX jako osobne okna, a następnie wybierz obraz DAPI. Następnie wybierz pasek narzędzi obrazu w opcji Dostosuj próg, aby wybrać jądra. Następnie dostosuj próg obrazu, przesuwając dolny pasek okna progu całkowicie w prawo.

Dostosuj górny pasek, aż jądra staną się całkowicie czerwone z wyraźnymi konturami, a tło będzie czarne. Następnie wybierz pasek narzędzi analizy i opcję analizuj cząstki. Wprowadź minimalny rozmiar jądra.

Z menu rozwijanego pokaż wybierz konspekty, a następnie wybierz opcję dodaj do menedżera. Kliknij przycisk OK, aby otworzyć okno menedżera ROI. W oknie Menedżer ROI przypisz numery do jąder według wyboru.

Aby użyć ImageJ do ilościowego oznaczania ognisk H2AX i obrazów z mikroskopii immunofluorescencyjnej, wybierz okno ognisk H2AX. Następnie wybierz pasek narzędzi procesu i wybierz znajdź maksima, aby znaleźć ogniska w jądrach. Z menu rozwijanego typu wyjściowego wybierz opcję pojedynczych punktów i wybierz wybór punktu podglądu, aby zobrazować ogniska maksimów.

Następnie wprowadź wartość tolerancji szumów w zależności od intensywności fluorescencji obrazu. W oknie menedżera ROI wybierz jądra, dla których należy określić ilościowo ogniska H2AX. Wybierz miarę, aby zmierzyć liczbę maksymalnych ognisk w wybranych jądrach.

Skopiuj surowe wartości intensywności i wklej je do oprogramowania w celu analizy danych. Po umieszczeniu komórek na 96-dołkowych płytkach z szkiełkami nakrywkowymi, jak pokazano wcześniej w tym filmie, wywołaj pęknięcia podwójnej nici za pomocą środka transfekcyjnego na bazie lipidów do transfekcji komórek wektorem ekspresyjnym I-SceI. Aby uzyskać wyobrażenie sobie po umyciu vix przepuszczalnych i zablokowanych komórek, jak pokazano wcześniej, dodaj przeciwciała przeciwko gamma H2AX i napraw białko będące przedmiotem zainteresowania.

Za pomocą 1x PBS umyj pokrywę płytki 96-dołkowej trzy razy. Następnie inkubować szkiełka nakrywkowe 96-dołkowej płytki z przeciwciałami drugorzędowymi. Na koniec, po zidentyfikowaniu komórek, które mają duże ognisko jądrowe gamma H2AX, ręcznie policz te, które również wykazują kolokalizację z interesującym białkiem naprawczym.

Ten rysunek pokazuje rozróżnienie hałasu na poziomie 90 i oznacza prawidłową liczbę ognisk. Jądra na krawędzi i ogniska poza jądrami nie są liczone podczas oznaczania ilościowego. Pokazany tutaj panel przedstawia niską tolerancję hałasu wynoszącą 50.

Liczne maksima są identyfikowane na zewnątrz jądra i wewnątrz jądra. W tym ogniwie znajduje się wysoka tolerancja szumów 220. Wykryto tylko jedno ognisko.

Kolokalizacja ogniska gamma H2AX i interesującego nas białka naprawczego jest przedstawiona na tym rysunku. Nietransfekowana komórka jest pokazana tutaj, a komórka z niejądrowym ogniskiem gamma H2AX jest pokazana w prawym górnym rogu. Przy większym powiększeniu można odróżnić wyraźniejszy obraz prawdziwego ogniskowania wewnętrznego i ogniskowania niejądrowego lub zewnętrznego.

Na koniec przedstawiono przykład jądrowego ogniska gamma H2AX bez kolokalizacji białka naprawczego. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu kilku dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Zgodnie z tą procedurą można zastosować inne metody, takie jak wytrącanie komutorów, w celu zidentyfikowania interakcji między białkami naprawczymi, które są przedmiotem zainteresowania.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak obserwować powstawanie i rozwiązywanie kompleksów naprawczych DNA poprzez indukowanie przejściowych pęknięć podwójnej nici w DNA. Dowiesz się również, jak jednoznacznie odróżnić błędną lokalizację czynników naprawczych od opóźnionej rekrutacji poprzez indukcję długotrwałych zmian.