Name: Charakterystyka procesów naprawy DNA przy przejściowych i długotrwałych pęknięciach dwuniciowego DNA za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-08T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Poznaj mechanizmy naprawy DNA przy pęknięciach dwuniciowych za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej w liniach U2OS/DR-GFP. Ta metoda pozwala śledzić dynamikę kompleksów naprawczych i ich lokalizację w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Joelowi Sannemanowi i dr Philine Wangemann z Confocal Microscopy Core, finansowanemu przez Kansas State University College of Veterinary Medicine, za ich wsparcie wysiłków na rzecz rozwoju tej techniki. pCBASceI był prezentem od Marii Jasin (plazmid Addgene # 26477)30. Komórki U2OS DR-GFP były miłym prezentem od Marii Jasin18.

Proszę zauważyć, że ten protokół jest napisany dla komórek U2OS zawierających stronę rozpoznającą I-SceI18. Komórki nie muszą być U2OS, ale muszą zawierać lokację I-SceI. Może być konieczne dostosowanie protokołu (np. liczby wysianych komórek i czasu inkubacji) w zależności od rodzaju użytych komórek.
1. Definiowanie kinetyki formacji kompleksu naprawczego DSB
<ol>
	<li>Hoduj komórki U20S-DRGFP na 10-centymetrowej płytce do hodowli tkankowej, aż do 85–90% zlewania się.</li>
	<li>Usunąć pożywkę i inkubować w temperaturze pokojowej (RT) w 3 ml EDTA przez 2 minuty.</li>
	<li>Zastąp EDTA 1 ml trypsyny i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Upewnij się, że komórki są oderwane od powierzchni płytki, oglądając ją pod mikroskopem. Zneutralizuj trypsynę za pomocą 5 ml zmodyfikowanego podłoża Dulbecco's Modify Eagle Medium (DMEM) uzupełnionego 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliny/streptomycyny.</li>
	<li>Oznaczyć stężenie komórek w tej zawiesinie za pomocą hemocytometru i metody wykluczania błękitu trypanowego.</li>
	<li>Wysiew 6 x 103 komórek/basenik w 200 μl 96-dołkowej płytki ze szklanym dnem. Alternatywnie, wysiewaj 4 x 106 komórek w 8 ml na 12 mm szkiełkach nakrywkowych umieszczonych na 10 cm płytce. 
	UWAGA: Każda studzienka lub szkiełko nakrywkowe reprezentuje pojedynczy punkt czasowy, w tym kontrolę.</li>
	<li>Hoduj komórki przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Wywoływanie DSB
	<ol>
		<li>Zastąpić pożywkę z płytki 96-dołkowej/10 cm naczyniemH2O2rozcieńczonym do stężenia 25 μM za pomocą DMEM + 10% FBS i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.</li>
		<li>Umyj komórki 3x 1x PBS i zastąp świeżym DMEM uzupełnionym 10% FBS i 1% penicyliną/streptomycyną. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 0, 1, 4, 8, 24 i 48 godzin. Upewnić się, że w każdym doświadczeniu stosuje się świeże rozcieńczenia H2O2. 
		UWAGA: Aby uniknąć zabijania komórek przy zastosowanym tutaj stężeniuH2O2, upewnij się, że dawka uszkodzenia jest na tyle niska, aby większość komórek uniknęła apoptozy i starzenia się. Bardzo ważne jest, aby obserwować proces rekonwalescencji. Najlepiej osiągnąć to poprzez pomiar wrażliwości na różne dawki. Wykonaj test MTT lub inny test żywotności komórek, aby określić minimalne stężenie nadtlenku wodoru, które można zastosować.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utrwalanie i przepuszczalnie komórek
	<ol>
		<li>Umyj komórki 3 razy za pomocą 1x PBS. Usuń szkiełko nakrywkowe z płytki o średnicy 10 cm dla każdego punktu czasowego i umieść je w jednym dołku płytki 24-dołkowej w celu zamocowania. Użyj igły i kleszków, aby ostrożnie usunąć szkiełko nakrywkowe i uniknąć zarysowania komórek z powierzchni szkiełka nakrywkowego.</li>
		<li>Utrwalić komórki przez inkubację przez 15 minut z 4% paraformaldehydem (PFA) w wyznaczonych porach po 1 godzinie ekspozycji na H2O 2 i świeżej wymianie DMEM (0, 1, 4, 8, 24 i 48 godzin).</li>
		<li>Umyj utrwalone szkiełka nakrywkowe 3 razy za pomocą PBS. Przepuszczalność komórek za pomocą 0,5% niejonowego detergentu rozcieńczonego w 1x PBS. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej, przed przemyciem 3x PBS. 
		UWAGA: Po przepuszczalności szkiełka nakrywkowe można przechowywać w PBS w temperaturze 4 °C przez co najmniej tydzień.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Naprawa złożonej wizualizacji
	<ol>
		<li>Zablokować 96-dołkową płytkę/szkiełka nakrywkowe w roztworze 3% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 0,1% niejonowego detergentu rozcieńczonego w 1x PBS (3% roztwór BSA) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Inkubować z pierwszorzędowymi przeciwciałami, które są ukierunkowane na białko naprawcze będące przedmiotem zainteresowania, rozcieńczone zgodnie ze specyfikacjami producenta w 3% roztworze BSA przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, przed 3-krotnym przemyciem 1x PBS.</li>
		<li>Inkubować 96-dołkową płytkę/szkiełko nakrywkowe z przeciwciałem drugorzędowym rozcieńczonym zgodnie z protokołem producenta w 3% roztworze BSA. Upewnij się, że fluorofory wtórne nie mają nakładających się widm wzbudzenia lub emisji.</li>
		<li>Po umyciu komórek PBS 3 razy dodać DAPI, rozcieńczony zgodnie ze specyfikacją producenta w 1x PBS i inkubować w temperaturze RT przez 5 min.</li>
		<li>Zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach z kroplą środka montażowego, upewniając się, że strona z ogniwem jest skierowana w dół. Ostrożnie dociśnij szkiełka nakrywkowe i wchłoń nadmiar środka montażowego chusteczką.</li>
		<li>Uszczelnij szkiełka nakrywkowe szybkoschnącym przezroczystym lakierem do paznokci i upewnij się, że szkiełko nakrywkowe jest całkowicie uszczelnione szkiełkiem nakrywkowym.</li>
		<li>Wykonuj obrazy z mikroskopu konfokalnego, skupiając się na kanale DAPI, przed innymi kanałami (z sygnałami z interesującego genu naprawy DNA), aby uniknąć wprowadzania stronniczości do eksperymentu.</li>
		<li>Alternatywnie, obrazy można uzyskać, pobierając przekroje Z żądanego obszaru i kondensując obraz w jednej płaszczyźnie, aby zobrazować wszystkie wykrywalne ogniska. 
		UWAGA: Jeśli rozdzielczość DSB lub białko będące przedmiotem zainteresowania nie zostanie zaobserwowane w wybranych punktach czasowych, określ, kiedy DSB jest rozwiązywane, wybierając początkowo szeroki zakres punktów czasowych (0–48 godzin po indukcji DSB). Interesujące punkty czasowe będą się różnić w zależności od metody indukcji DSB i interesującego nas białka naprawczego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Skorzystaj z bezpłatnego oprogramowania ImageJ, aby zdefiniować jądra na obrazach mikroskopii immunofluorescencyjnej. 
	UWAGA: Aby otwierać obrazy mikroskopowe, w ImageJ musi być zainstalowana wtyczka Bio-Formats.
	<ol>
		<li>Otwórz obrazy konfokalne (.czi lub .tif), przeciągając plik obrazu do okna ImageJ lub wybierając "Importer formatów biologicznych" z paska narzędzi "Wtyczka" w ImageJ. 
		UWAGA: Pojawi się okno "Opcja importu formatów biologicznych".</li>
		<li>Wybierz "Podziel kanały", aby podzielić obraz na konstytutywne obrazy DAPI i fluorescencyjne w oknie "Opcja importu bioformatów".</li>
		<li>Wybierz "Kolorowe" w "Opcjach kolorów" z menu rozwijanego. Wybierz "OK", aby otworzyć obrazy DAPI i Histone H2AX (H2AX) jako osobne okna i wybierz obraz DAPI.</li>
		<li>Wybierz pasek narzędzi "Obraz" i opcję "Dostosuj próg", aby wybrać nuclei. 
		UWAGA: Pojawi się okno "Próg".</li>
		<li>Dostosuj próg obrazu, przesuwając dolny pasek okna "Próg" całkowicie w prawo. Dostosuj górny pasek, aż jądra staną się całkowicie czerwone z wyraźnymi konturami, a tło będzie czarne. NIE wybieraj opcji Zastosuj. Zamknij okno "Dostosuj próg".</li>
		<li>Wybierz pasek narzędzi "Analizuj" i opcję "Analizuj cząstki". Zobacz okno "Analizuj cząstki" pojawiające się na ekranie.</li>
		<li>Wprowadź minimalny rozmiar jądra. 
		UWAGA: Cząstki o wielkości mniejszej od wprowadzonej wielkości nie będą liczone jako jądra.</li>
		<li>Z menu rozwijanego "Pokaż" wybierz "Konspekty". Wybierz opcję "Dodaj do menedżera". Kliknij "OK", aby otworzyć okno "Menedżer ROI". 
		UWAGA: Kontury jąder pojawią się w osobnym oknie.</li>
		<li>Przypisz numery do jąder, które można wybrać z okna "Menedżer ROI".</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj ImageJ do ilościowego oznaczania ognisk H2AX w obrazach mikroskopii immunofluorescencyjnej.
	<ol>
		<li>Wybierz okienko ognisk "H2AX" (barwione fluorescencyjnie sprzężonym przeciwciałem drugorzędowym). Następnie wybierz pasek narzędzi "Proces" i wybierz "Znajdź maksima", aby znaleźć ogniska w jądrach. 
		UWAGA: Otworzy się okno "Znajdź maksima".</li>
		<li>Wybierz opcję "Pojedyncze punkty" z menu rozwijanego "Typ wyjścia" i wybierz "Podgląd wyboru punktu", aby wyświetlić maksima/ogniska. Wprowadź wartość "Tolerancja szumów" w zależności od intensywności fluorescencji obrazu (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1). Sprawdź, czy pojawia się białe okno z małymi czarnymi kropkami. 
		UWAGA: Te kropki reprezentują wykryte ogniska/maksima H2AX. Wartość tolerancji szumów musi być utrzymywana na stałym poziomie dla wszystkich analizowanych obrazów. Niska/wysoka tolerancja szumów będzie przedstawiać zbyt wiele/niewiele maksimów (ognisk) w jądrze i nie będzie dokładnym odwzorowaniem ognisk w jądrze.</li>
		<li>W oknie "Menedżer ROI" należy wybrać jądra, dla których należy określić ilościowo ogniska H2AX. Zaznacz wszystkie jądra, zaznaczając opcję "pokaż wszystko".</li>
		<li>Wybierz "Pomiar", aby zmierzyć liczbę maksimów/ognisk w wybranych jądrach. 
		UWAGA: Liczba maksimów/ognisk pojawia się jako wielokrotność 255, tj. jedno maksimum ma odczyt "RawIntDen" (Zintegrowana gęstość) równy 255.</li>
		<li>Skopiuj wartości "RawIntDen" i wklej je do oprogramowania w celu analizy danych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Analiza lokalizacji do długotrwałego pęknięcia dwuniciowego DNA
<ol>
	<li>Komórki nasienne na 96-dołkowych płytkach/szkiełkach nakrywkowych, jak opisano w sekcjach 1.1 i 1.2.</li>
	<li>Indukcja pęknięć dwuniciowego DNA
	<ol>
		<li>Komórki transfekcyjne z wektorem ekspresyjnym I-SceI przy użyciu odczynnika do transfekcji na bazie lipidów zgodnie ze specyfikacją producenta. Odczekaj 24–72 godziny po transfekcji, aby zmaksymalizować ekspresję endonukleazy. Określ, czy transfekcja się powiodła, lokalizując komórki z pojedynczym dużym ogniskiem jądrowym γ-H2AX.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Akwizycja obrazów
	<ol>
		<li>Utrwalić, przepuścić, zablokować i umyć 96-dołkową płytkę/szkiełka nakrywkowe zgodnie z opisem w sekcji 1.8.</li>
		<li>Współinkubować komórki z przeciwciałem przeciwko γ-H2AX i białkiem naprawczym będącym przedmiotem zainteresowania (w tym przypadku użyto pierwszorzędowego przeciwciała przeciwko RAD51) rozcieńczonym zgodnie ze specyfikacją producenta w 3% roztworze BSA.</li>
		<li>Umyć 96-dołkową płytkę/szkiełka nakrywkowe 3 razy za pomocą 1x PBS. Inkubować 96-dołkową płytkę/szkiełko nakrywkowe z przeciwciałem drugorzędowym rozcieńczonym zgodnie z protokołem producenta w 3% roztworze BSA. Upewnij się, że fluorofory wtórne nie mają nakładających się widm wzbudzenia lub emisji.</li>
		<li>Zidentyfikuj komórki, które mają duże ognisko jądrowe γ-H2AX. Rób zdjęcia tylko tych komórek, aby uniknąć stronniczości.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza długotrwałych ognisk indukowanych I-SceI
	<ol>
		<li>Analizuj długotrwałe ogniska ręcznie, licząc zarówno liczbę komórek, które mają duże ogniska γ-H2AX, jak i ogniska kolokalizowane białka naprawczego, które jest przedmiotem zainteresowania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Lindahl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instability+and+decay+of+the+primary+structure+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Instability and decay of the primary structure of DNA.</a> Nature. 362 (6422), 709-715 (1993).</li>
<li>Branzei, D., Foiani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+DNA+repair+throughout+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of DNA repair throughout the cell cycle.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (4), 297-308 (2008).</li>
<li>Ciccia, A., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+damage+response%3A+making+it+safe+to+play+with+knives%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The DNA damage response: making it safe to play with knives.</a> Mol Cell. 40 (2), 179-204 (2010).</li>
<li>Auclair, Y., Rouget, R., Drobetsky, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATR+kinase+as+master+regulator+of+nucleotide+excision+repair+during+S+phase+of+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">ATR kinase as master regulator of nucleotide excision repair during S phase of the cell cycle.</a> Cell Cycle. 8 (12), 1865-1871 (2009).</li>
<li>Awasthi, P., Foiani, M., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATM+and+ATR+signaling+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">ATM and ATR signaling at a glance.</a> J Cell Sci. 128 (23), 4255-4262 (2015).</li>
<li>Ceccaldi, R., Rondinelli, B., D'Andrea, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+Pathway+Choices+and+Consequences+at+the+Double-Strand+Break%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Repair Pathway Choices and Consequences at the Double-Strand Break.</a> Trends Cell Biol. 26 (1), 52-64 (2016).</li>
<li>Chapman, J. R., Taylor, M. R. G., Boulton, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Playing+the+End+Game%3A+DNA+Double-Strand+Break+Repair+Pathway+Choice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Playing the End Game: DNA Double-Strand Break Repair Pathway Choice.</a> Mol Cell. 47 (4), 497-510 (2012).</li>
<li>Daley, J. M., Sung, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((53BP1%2C+BRCA1%2C+and+the+Choice+between+Recombination+and+End+Joining+at+DNA+Double-Strand+Breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">53BP1, BRCA1, and the Choice between Recombination and End Joining at DNA Double-Strand Breaks.</a> Mol Cell Biol. 34 (8), 1380-1388 (2014).</li>
<li>Hartlerode, A., Odate, S., Shim, I., Brown, J., Scully, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Cycle-Dependent+Induction+of+Homologous+Recombination+by+a+Tightly+Regulated+I-SceI+Fusion+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Cell Cycle-Dependent Induction of Homologous Recombination by a Tightly Regulated I-SceI Fusion Protein.</a> PLOS ONE. 6 (3), e16501(2011).</li>
<li>Brandsma, I., Gent, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathway+choice+in+DNA+double+strand+break+repair%3A+observations+of+a+balancing+act%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Integr%22%5BJournal%5D)">Pathway choice in DNA double strand break repair: observations of a balancing act.</a> Genome Integr. 3, 9(2012).</li>
<li>Davis, A. J., Chen, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double+strand+break+repair+via+non-homologous+end-joining%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">DNA double strand break repair via non-homologous end-joining.</a> Transl Cancer Res. 2 (3), 130-143 (2013).</li>
<li>Reid, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+dynamics+of+the+nonhomologous+end-joining+machinery+during+DNA+double-strand+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Organization and dynamics of the nonhomologous end-joining machinery during DNA double-strand break repair.</a> Proc Natl Acad Sci. 112 (20), E2575-E2584 (2015).</li>
<li>Chen, J. J., Silver, D., Cantor, S., Livingston, D. M., Scully, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRCA1%2C+BRCA2%2C+and+Rad51+Operate+in+a+Common+DNA+Damage+Response+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">BRCA1, BRCA2, and Rad51 Operate in a Common DNA Damage Response Pathway.</a> Cancer Res. 59 (7 Supplement), 1752s-1756s (1999).</li>
<li>D'Andrea, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRCA1%3A+A+Missing+Link+in+the+Fanconi+Anemia%2FBRCA+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">BRCA1: A Missing Link in the Fanconi Anemia/BRCA Pathway.</a> Cancer Discov. 3 (4), 376-378 (2013).</li>
<li>Gudmundsdottir, K., Ashworth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+BRCA1+and+BRCA2+and+associated+proteins+in+the+maintenance+of+genomic+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The roles of BRCA1 and BRCA2 and associated proteins in the maintenance of genomic stability.</a> Oncogene. 25 (43), 5864-5874 (2006).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+for+DNA-PK%2C+ATM+and+ATR+in+RPA+phosphorylation+and+checkpoint+activation+in+response+to+replication+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Distinct roles for DNA-PK, ATM and ATR in RPA phosphorylation and checkpoint activation in response to replication stress.</a> Nucleic Acids Res. 40 (21), 10780-10794 (2012).</li>
<li>Wallace, N. A., Khanal, S., Robinson, K. L., Wendel, S. O., Messer, J. J., Galloway, D. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28768872">High Risk Alpha Papillomavirus Oncogenes Impair the Homologous Recombination Pathway.</a> J Virol. , (2017).</li>
<li>Pierce, A. J., Johnson, R. D., Thompson, L. H., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XRCC3+promotes+homology-directed+repair+of+DNA+damage+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">XRCC3 promotes homology-directed repair of DNA damage in mammalian cells.</a> Genes Dev. 13 (20), 2633-2638 (1999).</li>
<li>Luzhna, L., Kathiria, P., Kovalchuk, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micronuclei+in+genotoxicity+assessment%3A+from+genetics+to+epigenetics+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Micronuclei in genotoxicity assessment: from genetics to epigenetics and beyond.</a> Front Genet. 4, (2013).</li>
<li>Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologous+repair+of+DNA+damage+and+tumorigenesis%3A+the+BRCA+connection%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Homologous repair of DNA damage and tumorigenesis: the BRCA connection.</a> Oncogene. 21 (58), 8981-8993 (2002).</li>
<li>Wallace, N. A., Robinson, K., Howie, H. L., Galloway, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2-HPV+5+and+8+E6+Disrupt+Homology+Dependent+Double+Strand+Break+Repair+by+Attenuating+BRCA1+and+BRCA2+Expression+and+Foci+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathog%22%5BJournal%5D)">β-HPV 5 and 8 E6 Disrupt Homology Dependent Double Strand Break Repair by Attenuating BRCA1 and BRCA2 Expression and Foci Formation.</a> PLOS Pathog. 11 (3), e1004687(2015).</li>
<li>Wallace, N. A., Robinson, K., Howie, H. L., Galloway, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HPV+5+and+8+E6+Abrogate+ATR+Activity+Resulting+in+Increased+Persistence+of+UVB+Induced+DNA+Damage%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">HPV 5 and 8 E6 Abrogate ATR Activity Resulting in Increased Persistence of UVB Induced DNA Damage.</a> PLoS Pathog. 8 (7), (2012).</li>
<li>Mah, L. J., Vasireddy, R. S., Tang, M. M., Georgiadis, G. T., El-Osta, A., Karagiannis, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+%CE%B3H2AX+Foci+in+Response+to+Ionising+Radiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Quantification of γH2AX Foci in Response to Ionising Radiation.</a> J Vis Exp. (38), e1957(2010).</li>
<li>Popp, H. D., Brendel, S., Hofmann, W. K., Fabarius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+Microscopy+of+%CE%B3H2AX+and+53BP1+for+Analyzing+the+Formation+and+Repair+of+DNA+Double-strand+Breaks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence Microscopy of γH2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks.</a> J Vis Exp. (129), e56617(2017).</li>
<li>Burma, S., Chen, B. P., Murphy, M., Kurimasa, A., Chen, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATM+Phosphorylates+Histone+H2AX+in+Response+to+DNA+Double-strand+Breaks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">ATM Phosphorylates Histone H2AX in Response to DNA Double-strand Breaks.</a> J Biol Chem. 276 (45), 42462-42467 (2001).</li>
<li>Britton, S., Coates, J., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+high-resolution+imaging+of+Ku+foci+to+decipher+mechanisms+of+DNA+double-strand+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A new method for high-resolution imaging of Ku foci to decipher mechanisms of DNA double-strand break repair.</a> J Cell Biol. 202 (3), 579-595 (2013).</li>
<li>Landthaler, M., Shen, B. W., Stoddard, B. L., Shub, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((I-BasI+and+I-HmuI%3A+two+phage+intron-encoded+endonucleases+with+homologous+DNA+recognition+sequences+but+distinct+DNA+specificities%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">I-BasI and I-HmuI: two phage intron-encoded endonucleases with homologous DNA recognition sequences but distinct DNA specificities.</a> J Mol Biol. 358 (4), 1137-1151 (2006).</li>
<li>Lackner, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generic+strategy+for+CRISPR-Cas9-mediated+gene+tagging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A generic strategy for CRISPR-Cas9-mediated gene tagging.</a> Nat Commun. 6, 10237(2015).</li>
<li>Chan, S. H., Stoddard, B. L., Xu, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+and+engineered+nicking+endonucleases--from+cleavage+mechanism+to+engineering+of+strand-specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Natural and engineered nicking endonucleases--from cleavage mechanism to engineering of strand-specificity.</a> Nucleic Acids Res. 39 (1), 1-18 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Analiza naprawy uszkodzeń DNA w ogóle, a w szczególności naprawy pęknięć dwuniciowego DNA, jest aktywnym obszarem badań, ponieważ jej konsekwencje obejmują nowotworzenie i podstawową biologię 6,20. Manuskrypt ten szczegółowo opisuje podejście, które dokładnie analizuje udział białek RAD51 i γ-H2AX w rozdzielczości DSB poprzez HR. Patrząc w przyszłość, metoda ta może być wykorzystana do wyjaśnienia dodatkowych funkcji białek naprawczych w DSB14</...

Każdego dnia, każda komórka w ludzkim ciele jest bombardowana około 10 000 zmian DNA1. To egzystencjalne zagrożenie naraża nas na ryzyko mutacji, onkogenezy, a także śmierci komórek. Aby chronić wierność genomu, komórki ssaków ewoluowały, aby reagować na uszkodzenia DNA za pomocą złożonej serii asocjacji i modyfikacji białek. Odpowiedź ta jest zorganizowana w wiele ścieżek, znanych jako odpowiedź na uszkodzenie DNA (DDR)2,3. DDR polega na akumulacji białek naprawczych DNA w uszkodzeniach DNA, skoordynowanych zarówno czasowo, jak i przestrzennie. DDR często indukuje zatrzymanie cyklu komórkowego, aby uniknąć propagacji lub intensyfikacji uszkodzeń, które mogą wystąpić podczas replikacji uszkodzonego DNA2,4,5. Z kolei dla żywotności komórkowej konieczne jest również wyłączenie zatrzymania cyklu komórkowego poprzez odłączenie kompleksów naprawczych po zakończeniu naprawy.
Wśród różnych rodzajów uszkodzeń DNA, DSB są najbardziej szkodliwe. Brak naprawy DSB może skutkować rearanżacjami chromosomów lub delecjami na dużą skalę, takimi jak utrata całych ramion chromosomów. Naprawa DSB jest podzielona na dwie ścieżki6,7,8. Rekombinacja homologiczna (HR) wymaga chromosomu siostrzanego do użycia jako matrycy DNA, a zatem jest ograniczona do późnych faz S i G2/M cyklu komórkowego9,10. Niehomologiczne łączenie końcowe (NHEJ) nie ma tych ograniczeń, ale może powodować małe usunięcia podczas naprawy DSBs11,12.
Naprawa DSB i ogólnie DDR są aktywnymi obszarami badań. Pomimo tego, że są zorganizowane w dogodnie oddzielone ścieżki, istnieje duża redundancja. Rzeczywiście, wiele białek (na przykład BRCA1, BRCA2 i kompleks RPA) jest zaangażowanych w wiele szlaków13,14,15,16. Naprawa uszkodzenia przez jedną ścieżkę może prowadzić do pośredniego uszkodzenia, które musi zostać naprawione przez inną ścieżkę14. Przeplatanie się tych szlaków, w połączeniu z ich złożonym zadaniem rekrutacji odpowiednich białek we właściwe miejsce przez dokładnie niezbędny czas, wymaga wielopoziomowego procesu regulacyjnego.
Niedawny raport podkreśla zawiłości DDR, pokazując, że tworzenie kompleksów naprawczych, rozdzielczość i lokalizacja mogą być oddzielnie zakłócone17. Ogólnym celem poniższego protokołu jest ostateczne zbadanie zdolności komórek do naprawy DSB. Za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej można uwidocznić akumulację białek naprawczych w miejscach uszkodzenia w reprezentatywnych punktach czasowych po indukcji DSB.
Ta technika ma kilka zalet w porównaniu z powszechnie stosowanymi podejściami. Często naprawa jest badana w pojedynczych punktach czasowych i nie jest w stanie odwzorować dynamicznego procesu montażu i dysocjacji kompleksów naprawczych. Obserwowanie pełnego zakresu naprawy od początkowej aktywacji do pełnej rozdzielczości zapewnia, że opóźnienie naprawy nie zostanie błędnie zidentyfikowane jako całkowite zahamowanie. I odwrotnie, zapewnia, że indukcja reakcji naprawczej, która nie jest w stanie dezaktywować tej reakcji, nie jest błędnie identyfikowana jako normalna lub nadmierna aktywacja.
Opóźnione tworzenie kompleksu białkowego i błędna lokalizacja białek naprawczych, jednak nie mogą być jednoznacznie odróżnione przy tym podejściu. Aby ustalić, czy białka naprawcze są nieprawidłowo zlokalizowane, czy opóźnione w ich lokalizacji, można wprowadzić "długotrwały" DSB poprzez enzymatyczne rozszczepienie komórkowego DNA. Powstała zmiana jest ponownie wycinana za każdym razem, gdy jest naprawiana, co skutkuje wyraźnym dużym skupieniem na naprawie jądrowej i usuwa czasowe ograniczenie rekrutacji. Można to osiągnąć poprzez modyfikację istniejącego podejścia za pomocą rzadkiej endonukleazy tnącej (np. I-SceI) w celu wywołania długotrwałego DSB. Długowieczność DSB umożliwia wizualizację nieuchwytnych białek naprawczych za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. Zwiększona liczebność może również poprawić wizualizację, gdy wykrycie jest utrudnione przez ograniczenie jakości przeciwciał, co może być przydatne, gdy mniej zbadane białka zostaną zidentyfikowane jako mające wpływ na naprawę DNA.
Zwłaszcza, że udostępniamy wyraźne instrukcje dotyczące darmowego oprogramowania do przetwarzania i analizy obrazów (np. ImageJ). Usuwa to główną barierę finansową w analizie obrazu, otwierając badania nad naprawą uszkodzeń DNA dla szerszego grona odbiorców.

<table><tbody><tr><td>Szkiełka nakrywkowe 12 mm</td><td>VWR</td><td>89015-725</td><td></td></tr><tr><td>16% paraformaldehyd (PFA)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka</td><td>VWR</td><td>82050-892</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa szklana płyta dolna</td><td>Cellvis</td><td>P96-1.5H-N</td><td></td></tr><tr><td>Anti-H2AX Alexa488</td><td>EMD Millipore</td><td>05-636-AF488</td><td></td></tr><tr><td>Anty-Rad51 (D4B10)&nbsp;</td><td>Wtyczka Cell Signaling Technology</td><td>8875S</td><td></td></tr><tr><td>Bio-formats dla ImageJ</td><td>National Institute of Health (NIH)&nbsp;</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>VWR</td><td>97061-416</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>DMEM,</td><td>ThermoFisher Scientific 12100046 ThermoFisher Scientific</td><td>Invitrogen</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>15576-028</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td>VWR</td><td>89510-194</td><td></td></tr><tr><td>Kozia IgG Anty-Królicza Alexa594</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>&nbsp; A-11012&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru</td><td>sigma-Aldrich</td><td>216763-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie ImageJ</td><td>Narodowy Instytut Zdrowia (NIH)&nbsp;</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr> <tr><td>Wektor ekspresji SceI</td><td>Addgene</td><td>26477</td><td></td></tr><tr><td>Lakier do paznokci - Insta Dri</td><td>Sally i Hansen</td><td>Wyraźnie szybkie (103)</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Bio Basic</td><td>PD8117</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Odczynnik zapobiegający blaknięciu</td> Life <td>Technologies</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji TurboFect</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0531</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr></tbody></table>

charakterystyka procesów naprawy dna przy przejściowych i długotrwałych pęknięciach dwuniciowego dna za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej

Characterizing DNA Repair Processes at Transient and Long-lasting Double-strand DNA Breaks by Immunofluorescence Microscopy

Naprawa dwuniciowych pęknięć (DSB) w DNA jest wysoce skoordynowanym procesem, wymagającym tworzenia i rozwiązywania wielobiałkowych kompleksów naprawczych. Proces ten jest regulowany przez niezliczoną ilość białek, które sprzyjają asocjacji i dysocjacji białek z tymi zmianami. W dużej mierze dzięki możliwości wykonywania funkcjonalnych badań przesiewowych ogromnej biblioteki białek, istnieje większe uznanie dla genów niezbędnych do naprawy pęknięć dwuniciowego DNA. Często badania przesiewowe nokautów lub inhibitorów chemicznych identyfikują białka zaangażowane w procesy naprawcze poprzez wykorzystanie zwiększonej toksyczności jako markera białka, które jest wymagane do naprawy DSB. Chociaż analiza funkcjonalna jest przydatna do identyfikacji nowych białek komórkowych zaangażowanych w utrzymanie wierności genomu, wymaga określenia, czy białko będące przedmiotem zainteresowania sprzyja lokalizacji, tworzeniu lub rozdzielczości kompleksów naprawczych. 
Nagromadzenie białek naprawczych można łatwo wykryć jako odrębne ogniska jądrowe za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. W ten sposób asocjacja i dysocjacja tych białek w miejscach uszkodzenia DNA może być dostępna, obserwując te ogniska jądrowe w reprezentatywnych odstępach czasu po indukcji pęknięć dwuniciowego DNA. Podejście to może również zidentyfikować nieprawidłowo zlokalizowane białka czynnika naprawczego, jeśli defekty naprawy nie występują jednocześnie z niepełnymi opóźnieniami w naprawie. W tym scenariuszu długotrwałe pęknięcia dwuniciowego DNA można zaprojektować poprzez ekspresję rzadkiej endonukleazy tnącej (np. I-SceI) w komórkach, w których miejsce rozpoznania wspomnianego enzymu zostało zintegrowane z genomem komórkowym. Powstała zmiana jest szczególnie trudna do usunięcia, ponieważ wierna naprawa ponownie wprowadzi miejsce rozpoznania enzymu, powodując kolejną rundę rozszczepienia. W rezultacie eliminowane są różnice w kinetyce naprawy. Jeśli kompleksy naprawcze nie zostaną utworzone, lokalizacja została utrudniona. Protokół ten opisuje metodologię niezbędną do identyfikacji zmian w kinetyce naprawy, a także lokalizacji białek naprawczych.

Rysunek 1 przedstawia dobór odpowiedniej dyskryminacji szumu dla kwantyfikacji maksimów/ognisk (foci) przy użyciu programu ImageJ. Na lewym panelu znajdują się obrazy scalone DAPI oraz badanego białka naprawczego. Rysunek 1A pokazuje dyskryminację szumu na poziomie 90 i zaznacza prawidłową liczbę ognisk. Jądra na krawędzi (wskazane różową strzałką) oraz ogniska poza jądrami (wskazane żółtą strzałką) nie są liczone podczas kwantyf...

Naprawa pęknięć dwuniciowego DNA jest procesem dynamicznym, wymagającym nie tylko tworzenia kompleksów naprawczych w miejscach pęknięć, ale także ich rozwiązania po usunięciu zmiany. W tym przypadku używamy mikroskopii immunofluorescencyjnej do przejściowych i długotrwałych pęknięć dwuniciowych jako narzędzia do analizy tego mechanizmu utrzymania genomu.

Charakterystyka procesów naprawy DNA przy przejściowych i długotrwałych pęknięciach dwuniciowego DNA za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej

The repair of double-stranded breaks (DSBs) in DNA is a highly coordinated process, necessitating the formation and resolution of multi-protein repair ...

Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie naprawy DNA, takie jak sposób regulacja powstawania, lokalizacji i rozdzielczości kompleksów naprawy DNA. Główną zaletą tej techniki jest to, że może ona jednoznacznie wykrywać zmiany i naprawiać złożoną lokalizację i kinetykę. Oprócz tych naukowców ze studiów licencjackich w moim laboratorium, eksperymenty przeprowadzi trzech doktorantów.Będą to Changkun Hu, Dalton Dacus i Stephen Walterhouse. Na początek hoduj komórki U2OS/DR-GFP na 10-centymetrowej płytce do hodowli tkankowej, aż osiągną 85 do 90% zlewania się. Następnie usuń pożywkę, dodaj trzy mililitry EDTA i inkubuj komórki w temperaturze pokojowej przez trzy minuty.Zastąp EDTA jednym mililitrem trypsyny i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie dodaj pięć mililitrów DMEM, aby zneutralizować trypsynę. Po policzeniu komórek, wysiewaj sześć razy po 10 do trzeciej komórki na dołek w 200 mikrolitrach pożywki na 96-dołkowej płytce ze szklanym dnem.Alternatywnie, wysiewaj cztery razy od 10 do sześciu dołków w ośmiu mililitrach podłoża na 12-milimetrowych szkiełkach nakrywkowych umieszczonych na 10-centymetrowej płytce, a następnie hoduj komórki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Aby wywołać pęknięcia podwójnej nici lub DSB, zastąp pożywkę nadtlenkiem wodoru rozcieńczonym do stężenia 25 mikromolów z DMEM plus 10% FBS i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Umyj komórki trzy razy 1x PBS, a następnie dodaj świeży DMEM.Aby utrwalić komórki po ich inkubacji, użyj PBS, aby trzykrotnie umyć płytkę. Następnie za pomocą igły i kleszczyków ostrożnie usuń szkiełko nakrywkowe z 10-centymetrowej płytki dla każdego punktu czasowego i umieść je w jednym dołku na 24-dołkowej płytce. Dodaj 4% PFA i inkubuj komórki przez 15 minut.Następnie my, PBS, aby umyć szkiełka okładkowe trzy razy. Aby przepuszczalność komórek, dodaj 0,5% niejonowego detergentu i PBS. Inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez 15 minut.Następnie ponownie umyj komórki trzykrotnym PBS. Następnie dodać 3% BSA i 0,1% niejonowy detergent rozcieńczony w PBS do szkiełek nakrywkowych na 24-dołkowej płytce i inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez godzinę. Następnie dodaj przeciwciała pierwszorzędowe, które są ukierunkowane na białko naprawcze będące przedmiotem zainteresowania i inkubuj próbki w temperaturze pokojowej przez godzinę.Po trzykrotnym umyciu komórek PBS, dodać DAPI i inkubować płytki w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie inkubować próbki z przeciwciałami drugorzędowymi. Po umyciu ogniw jak poprzednio, użyj odczynnika montażowego, aby zamontować pokrywę szkiełka komórkową do dołu na szkiełkach.Ostrożnie dociśnij szkiełka nakrywkowe i użyj chusteczki, aby wchłonąć nadmiar odczynnika montażowego. Uszczelnij szkiełka nakrywkowe szybkoschnącym przezroczystym lakierem do paznokci i upewnij się, że szkiełko nakrywkowe jest całkowicie uszczelnione za pomocą szkiełka. Wykonuj obrazy mikroskopu konfokalnego, ustawiając ostrość na kanale DAPI.Aby zdefiniować jądra w obrazach immunofluorescencyjnych, otwórz obrazy konfokalne, przeciągając plik obrazu do okna ImageJ lub wybierając importer formatów biologicznych z paska narzędzi wtyczki w ImageJ. Następnie wybierz podzielone kanały. W obszarze opcje kolorów wybierz opcję pokolorowane z menu rozwijanego.Wybierz przycisk OK, aby otworzyć obrazy DAPI i histonów H2AX jako osobne okna, a następnie wybierz obraz DAPI. Następnie wybierz pasek narzędzi obrazu w opcji Dostosuj próg, aby wybrać jądra. Następnie dostosuj próg obrazu, przesuwając dolny pasek okna progu całkowicie w prawo.Dostosuj górny pasek, aż jądra staną się całkowicie czerwone z wyraźnymi konturami, a tło będzie czarne. Następnie wybierz pasek narzędzi analizy i opcję analizuj cząstki. Wprowadź minimalny rozmiar jądra.Z menu rozwijanego pokaż wybierz konspekty, a następnie wybierz opcję dodaj do menedżera. Kliknij przycisk OK, aby otworzyć okno menedżera ROI. W oknie Menedżer ROI przypisz numery do jąder według wyboru.Aby użyć ImageJ do ilościowego oznaczania ognisk H2AX i obrazów z mikroskopii immunofluorescencyjnej, wybierz okno ognisk H2AX. Następnie wybierz pasek narzędzi procesu i wybierz znajdź maksima, aby znaleźć ogniska w jądrach. Z menu rozwijanego typu wyjściowego wybierz opcję pojedynczych punktów i wybierz wybór punktu podglądu, aby zobrazować ogniska maksimów.Następnie wprowadź wartość tolerancji szumów w zależności od intensywności fluorescencji obrazu. W oknie menedżera ROI wybierz jądra, dla których należy określić ilościowo ogniska H2AX. Wybierz miarę, aby zmierzyć liczbę maksymalnych ognisk w wybranych jądrach.Skopiuj surowe wartości intensywności i wklej je do oprogramowania w celu analizy danych. Po umieszczeniu komórek na 96-dołkowych płytkach z szkiełkami nakrywkowymi, jak pokazano wcześniej w tym filmie, wywołaj pęknięcia podwójnej nici za pomocą środka transfekcyjnego na bazie lipidów do transfekcji komórek wektorem ekspresyjnym I-SceI. Aby uzyskać wyobrażenie sobie po umyciu vix przepuszczalnych i zablokowanych komórek, jak pokazano wcześniej, dodaj przeciwciała przeciwko gamma H2AX i napraw białko będące przedmiotem zainteresowania.Za pomocą 1x PBS umyj pokrywę płytki 96-dołkowej trzy razy. Następnie inkubować szkiełka nakrywkowe 96-dołkowej płytki z przeciwciałami drugorzędowymi. Na koniec, po zidentyfikowaniu komórek, które mają duże ognisko jądrowe gamma H2AX, ręcznie policz te, które również wykazują kolokalizację z interesującym białkiem naprawczym.Ten rysunek pokazuje rozróżnienie hałasu na poziomie 90 i oznacza prawidłową liczbę ognisk. Jądra na krawędzi i ogniska poza jądrami nie są liczone podczas oznaczania ilościowego. Pokazany tutaj panel przedstawia niską tolerancję hałasu wynoszącą 50.Liczne maksima są identyfikowane na zewnątrz jądra i wewnątrz jądra. W tym ogniwie znajduje się wysoka tolerancja szumów 220. Wykryto tylko jedno ognisko.Kolokalizacja ogniska gamma H2AX i interesującego nas białka naprawczego jest przedstawiona na tym rysunku. Nietransfekowana komórka jest pokazana tutaj, a komórka z niejądrowym ogniskiem gamma H2AX jest pokazana w prawym górnym rogu. Przy większym powiększeniu można odróżnić wyraźniejszy obraz prawdziwego ogniskowania wewnętrznego i ogniskowania niejądrowego lub zewnętrznego.Na koniec przedstawiono przykład jądrowego ogniska gamma H2AX bez kolokalizacji białka naprawczego. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu kilku dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Zgodnie z tą procedurą można zastosować inne metody, takie jak wytrącanie komutorów, w celu zidentyfikowania interakcji między białkami naprawczymi, które są przedmiotem zainteresowania.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak obserwować powstawanie i rozwiązywanie kompleksów naprawczych DNA poprzez indukowanie przejściowych pęknięć podwójnej nici w DNA. Dowiesz się również, jak jednoznacznie odróżnić błędną lokalizację czynników naprawczych od opóźnionej rekrutacji poprzez indukcję długotrwałych zmian.

characterizing-dna-repair-processes-at-transient-long-lasting-double

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Niniejszy artykuł opisuje oparte na GFP testy fluorescencyjne in vivo, które pozwalają na oddzielne ilościowe określenie rekombinacji homologicznej oraz niespecyficznego łączenia końców w komórkach ssaków.

Analiza naprawy pęknięć obu nici DNA (DSB) w komórkach ssaków

W tym filmie opisujemy metodę immunofluorescencji, aby zobrazować lokalizację białek naprawy DNA γH2AX i 53BP1 w miejscach pęknięć dwuniciowego DNA w napromieniowanych jądrach komórkowych.

Oparta na immunofluorescencji wizualizacja interakcji białek naprawy DNA

W tym filmie opisujemy technikę mikroskopii immunofluorescencyjnej do wykrywania specyficznych białek odpowiedzi na uszkodzenia DNA zlokalizowanych w miejscach pęknięć dwuniciowych DNA w ludzkich komórkach jednojądrzastych. Białka są rozpoznawane przez specyficzne przeciwciała pierwszorzędowe, które z kolei wiążą się z przeciwciałami drugorzędowymi znakowanymi fluoroforem, które fluoryzują podczas wizualizacji mikroskopowej, umożliwiając wizualizację białek jako odrębnych ognisk...

Mikroskopia immunofluorescencyjna do analizy pęknięć dwuniciowych DNA

Tutaj pokazano, jak test ligacji zbliżeniowej in situ (PLA) może być wykorzystany do wykrywania i wizualizacji bezpośrednich interakcji białko-białko między ATM i p53 w hodowlach komórek zawiesinowych narażonych na stres genotoksyczny.

Wykrywanie i wizualizacja kompleksów białkowych indukowanych uszkodzeniem DNA w hodowlach komórek zawiesinowych za pomocą testu ligacji zbliżeniowej

Mikronaświetlanie laserowe jest użytecznym narzędziem do badań nad naprawą DNA w żywych komórkach. Przedstawiono metodologiczne podejście do stosowania laserów UVA do wywoływania różnych zmian w DNA. Zoptymalizowaliśmy metodę miejscowego mikronapromieniowania, która utrzymuje normalny cykl komórkowy; W ten sposób napromieniowane komórki przechodzą przez mitozę.

Zaawansowane techniki mikroskopii konfokalnej do badania interakcji białko-białko i kinetyki zmian w DNA

Konfokalna mikroskopia fluorescencyjna i mikropromieniowanie laserowe oferują narzędzia do indukowania uszkodzeń DNA i monitorowania odpowiedzi białek naprawy DNA w wybranych obszarach subjądrowych. Technika ta znacznie poszerzyła naszą wiedzę na temat wykrywania uszkodzeń, sygnalizacji i rekrutacji. Niniejszy manuskrypt demonstruje te technologie do badania naprawy pęknięć jedno- i dwuniciowych.

Zastosowanie mikronapromieniania laserowego do badania naprawy pęknięć jedno- i dwuniciowych w komórkach ssaków

Ten manuskrypt zawiera protokół do analizy pęknięć dwuniciowych DNA za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej γH2AX i 53BP1.

Mikroskopia immunofluorescencyjna γH2AX i 53BP1 do analizy powstawania i naprawy pęknięć dwuniciowych DNA

Reakcja na uszkodzenia DNA wywołana promieniowaniem, aktywowana przez wiązkę neutronów używaną w terapii wychwytywania neutronów borowych (BNCT), nie została w pełni ustalona. Protokół ten zapewnia procedurę krok po kroku do wykrywania ognisk indukowanych promieniowaniem (RIF) białek naprawczych poprzez barwienie immunofluorescencyjne w liniach komórkowych ludzkiego raka jelita grubego po napromieniowaniu wiązką zmieszaną z neutronami.

Obrazowanie immunofluorescencyjne uszkodzeń DNA i ognisk naprawczych w ludzkich komórkach raka jelita grubego

Po uszkodzeniu DNA, ludzkie komórki aktywują niezbędne szlaki naprawcze, aby przywrócić integralność swojego genomu. W tym miejscu opisujemy metodę immunofluorescencji pośredniej jako sposób na wykrycie białek naprawy DNA, analizę ich przestrzennej i czasowej rekrutacji oraz pomoc w badaniu interakcji białko-białko w miejscach uszkodzenia DNA.

Wizualizacja oddziaływania białek naprawy DNA za pomocą immunofluorescencji

Ten artykuł przedstawia podstawowe etapy immunobarwienia i immunoprecypitacji chromatyny. Protokoły te są powszechnie stosowane do badania procesów komórkowych związanych z uszkodzeniem DNA oraz do wizualizacji i ilościowego określenia rekrutacji białek zaangażowanych w naprawę DNA.

Wizualizacja i ilościowe określanie uszkodzeń DNA specyficznych dla miejsca na podstawie endonukleazy

Poniższy protokół przedstawia wykrywanie jednoniciowych ognisk DNA w fazie G1 cyklu komórkowego za pomocą synchronizacji cyklu komórkowego, a następnie barwienia immunofluorescencyjnego RPA2.

Wizualizacja ognisk jednoniciowego DNA w fazie G1 cyklu komórkowego

Poznaj mechanizmy naprawy DNA przy pęknięciach dwuniciowych za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej w liniach U2OS/DR-GFP. Ta metoda pozwala śledzić dynamikę kompleksów naprawczych i ich lokalizację w czasie rzeczywistym.

Charakterystyka procesów naprawy DNA przy przejściowych i długotrwałych pęknięciach dwuniciowego DNA za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej (Wideo) | JoVE Journal

Charakterystyka procesów naprawy DNA przy przejściowych i długotrwałych pęknięciach dwuniciowego DNA za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej

Przeglądaj więcej filmów