Wytwarzanie gradientowego nanowzoru za pomocą techniki nanoimprintingu termicznego i badanie przesiewowe odpowiedzi komórek tworzących kolonie śródbłonka

Główną zaletą tej techniki jest to, że może ona wytwarzać gradientowe wzory o wysokiej odtwarzalności i umożliwiła badanie przesiewowe odpowiedzi komórek na struktury obserwacyjne pasożytów. Reakcja obserwowana na stymulację fizyczną nie jest jeszcze w pełni odkryta. Wierzymy, że nasza metoda będzie niezbędnym narzędziem do odkrycia tych nieznanych mechanizmów.

Aby rozpocząć, podłącz zlewkę z podwójnym płaszczem zawierającą roztwór do elektropolerowania do cyrkulatora i ustaw temperaturę na siedem stopni Celsjusza. Pozostaw roztwór mieszany przez co najmniej 30 minut, aż temperatura spadnie do siedmiu stopni Celsjusza. Zanurz ultraczystą aluminiową płytkę i przeciwelektrodę węglową w roztworze do elektropolerowania za pomocą zacisków krokodylkowych i drutu miedzianego.

Dostosuj położenie aluminiowej płytki w przeciwelektrodzie węglowej tak, aby była zwrócona do siebie. Podłącz aluminiową płytkę do dodatniego zacisku i podłącz przeciwelektrodę węglową do ujemnego zacisku zasilacza prądu stałego. Po przyłożeniu napięcia 20 woltów aluminiowa płyta przechodzi od szorstkiej, pozbawionej połysku powierzchni do lustrzanej powierzchni w kolorze srebrnym.

Aby wykonać anodowanie pierwotne, wlej jeden litr elektrolitu do dwulitrowej zlewki z podwójnym płaszczem. Zanurzono polerowaną aluminiową płytkę i przeciwelektrodę węglową w roztworze za pomocą krokodylków w drucie miedzianym. Zamontuj pionowy wał na cokole w kształcie litery U.

Przymocuj mieszadło górne i wirnik za pomocą metalowych zacisków. Umieść śmigło wirnika w pobliżu dolnego końca obu elektrod. Ustaw prędkość obrotową mieszadła nad głową w zakresie od 200 do 300 obr./min i przyłóż napięcie 195 woltów podczas mieszania przez 16 godzin.

Po pierwotnej anodyzacji kolor aluminiowej płyty zmienia się ze srebrnego na szary. Aby wykonać swędzenie tlenku glinu, zanurz anodowaną aluminiową płytkę w roztworze do trawienia. Zapieczętować górną część zlewki folią aluminiową i pozostawić do mieszania przez co najmniej 10 godzin.

Na etapie trawienia kolor aluminiowej płytki zmienia się z szarego na biały. W przypadku anodowania wtórnej należy ustawić te same warunki eksperymentalne, co w przypadku anodowania pierwotnego i ponownie przyłożyć napięcie 195 woltów przez sześć godzin. Po wtórnej anodyzacji kolor aluminiowej płyty zmienia się z białego z powrotem na szary.

Aby wykonać gradientowe poszerzenie porów, najpierw podłącz zlewkę z podwójnym płaszczem zawierającą roztwór kwasu fosforowego do cyrkulatora i ustaw temperaturę na 30 stopni Celsjusza. Umieść liniowy ruchomy stolik pionowo obok zlewki i przymocuj wspornik do ruchomej części stolika liniowego. Ustaw ruchomą część stolika liniowego w pozycji wyjściowej.

Przymocuj zacisk wspornika i załaduj anodowaną aluminiową płytę. Manipuluj położeniem aluminiowej płytki ręcznie, tak aby aluminiowa płyta znalazła się tuż nad powierzchnią roztworu. Stopniowo zanurzaj aluminiową płytkę w roztworze z prędkością czterech przecinków, ośmiu, sześciu mikronów na sekundę przez 120 minut, aby uzyskać 35-milimetrową formę AAO o gradiencie wielkości od 120 nanometrów do 200 nanometrów.

Uruchom stoper w momencie, gdy aluminiowa płytka dotknie powierzchni roztworu. Po upływie 100 minut połowa pleśni AAO powinna znajdować się w roztworze. Aby wykonać formy GP 200 do 280 i GP 280 do 360, zanurzono cały obszar formy GP 120 do 200 w roztworze poszerzającym pory odpowiednio na dwie do czterech godzin.

Zanurz formę AAO i roztwór piranii na 30 sekund za pomocą niemetalowej pęsety. Kilkakrotnie spłucz formę AAO wodą dejonizowaną. Namocz formę w wodzie dejonizowanej na 30 minut i włóż do alkoholu metylowego na kolejne 30 minut.

Całkowicie wysuszyć formę AAO w próżni przez trzy godziny. W celu samodzielnego osadzania monowarstw zanurz formę AAO w 57 mililitrach filtrowanego i heksanu oraz 100-mililitrowej zlewce. Następnie dodaj trzy mililitry roztworu podstawowego HDFS do heksanu N, aby uzyskać 2,9 milimolowy roztwór HDFS i odczekaj 10 minut, aż reakcja będzie postępować.

Po przeniesieniu formy AAO na świeżą i heksan, namocz formę AAO w 60 mililitrach metoksy-nonafluorobutanu. Ultradźwiękowo czyść formę AAO w zlewce przez 10 sekund jednorazowo, aby usunąć fizycznie zaadsorbowane cząsteczki HDFS. Powtórz procedurę czyszczenia 10 razy przed wysuszeniem formy AAO w próżni przez 24 godziny.

Wytnij jednopunktowy arkusz styropianu o grubości jednego milimetra do rozmiaru dwóch punktów, dziewięciu milimetrów szerokości i trzech punktów siedmiu milimetrów długości, za pomocą obcinaka do płytek drukowanych. Pracując w czystym pomieszczeniu, wytnij formę AAO 35 milimetrów od dołu za pomocą szczypiec. Na odwrocie należy zaznaczyć nazwę próbki i producenta danych.

Wyczyść ośmiopunktowy wafel o średnicy zero cali niewielką dawką alkoholu etylowego, a następnie połóż arkusze styropianu na wafli i zamontuj formę AAO. Następnie umieść dolną folię w szufladzie imprintera termicznego i przymocuj górną folię do uszczelki, następnie połóż wafel na dolnej folii i umieść uszczelkę na płytce. Upewnij się, że na wafli nie ma kurzu.

Po zamknięciu szuflady termika i drukarki zastosuj 165 stopni Celsjusza ciepła i 620 punktów pięć/dwa kilopaskale nacisku od 100 sekund. Następnie schłodzić próbkę do temperatury pokojowej. Po ostygnięciu odpowietrz komorę, a ciśnienie spadnie do zera kilogramów Pascala.

Delikatnie przekręć arkusz styropianu, aby uwolnić formę AAO. Zbierz 50 mililitrów ludzkiej krwi za pomocą probówki z inhibitorem heparyny. Umieść sześć mililitrów hydrofilowego roztworu polisacharydów w 15-mililitrowej probówce i dodaj osiem mililitrów krwi do hydrofilowego roztworu polisacharydów.

Krew należy natychmiast pobrać i powoli dodawać do hydrofilowego roztworu polisacharydów. Po odwirowaniu probówki o stężeniu 1020 razy G przez 20 minut w celu osadzenia komórek, należy zebrać nieprzezroczystą warstwę komórek i przenieść do nowej 15-mililitrowej probówki. Przy 10 mililitrach PBS zawierających 10% FBS odwirować probówkę pod ciśnieniem 1020 razy G przez 10 minut, aby osadzać komórki.

Usunąć supernatant i dodać bufor do lizy czerwonych krwinek. Po inkubacji na lodzie przez pięć minut w PBS zawierającym 10% FBS i odwirowaniu probówki w temperaturze 1020 razy G przez pięć minut w celu osadzenia komórek. Usuń supernatant i dodaj jeden mililitr pożywki do ekspansji komórek śródbłonka uzupełnionej 10% FBS.

Zasiej osiem punktów zero milionów komórek na studzienkę dla każdego naczynia kodowanego kolagenem. Indukuj ludzkie i eteryczne komórki tworzące kolonie zgodnie z opisem w protokole tekstowym i hoduj komórki do przejścia siedmiu w celu dalszych eksperymentów. Następnie pokryj płytki gradientowego nano wzoru jednym mililitrem jednoprocentowego roztworu do powlekania białka w punkcie zerowym w PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej.

Sporządzić zawiesinę ludzkich ECFC z szalki hodowlanej za pomocą standardowej metody podziału komórek przy użyciu trypsyny. Po rozcieńczeniu zawiesiny komórkowej w celu uzyskania pożądanej konfluencji, wysiewanie ludzkich ECFC zatrzymuje się na gradientowych płytkach o nano wzorze w płaskiej kontroli. Hodować komórki na płaskich lub gradientowych płytkach o nano wzorze przez dwa dni w inkubatorze.

Zdjęcia te pokazują formy AAO wykonane w trzech różnych warunkach poszerzania wylewu. Jedna strona o najkrótszym czasie zanurzenia w roztworze do trawienia kwasem fosforowym ma najmniejszy rozmiar porów, podczas gdy druga strona o najdłuższym czasie w roztworze do trawienia ma największy rozmiar porów. Ponieważ wzór nano został przeniesiony na polistyren metodą nadruku termicznego, na powierzchni polistyrenu generowane są struktury nano filarów, a gradient wielkości formy AAO jest utrzymywany w płytkach o wzorze nano.

Zlewające się ludzkie ECFC wykazywały typową morfologię przypominającą bruk, która kształtowała kolonię, którą można łatwo odróżnić pod mikroskopem kontrastu fazowego. Po dwóch dniach hodowli ludzkich ECFC na płaskich płytkach o gradientowym nanowzorze, zaobserwowano znaczny wzrost filopodiów w komórkach hodowanych na GP od 120 do 200. I odwrotnie, nie zaobserwowano żadnej znaczącej zmiany w GP 200 do 280 lub GP 280 do 360 w porównaniu z płaską kontrolą.

Wynik ten wskazuje, że odpowiedź komórek jest różna w zależności od wielkości nanostruktury powierzchniowej. Istnieje wiele kroków, aby wyprodukować płytkę z wzorem nano. Na początku może to być skomplikowane, ale po opanowaniu bez problemu uzyskasz wzory z gradientem rozmiaru pragnień.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć doskonałe zrozumienie, jak produkować gradientowe płytki z nano wzorem i kultywować do człowieka i głupszą serię tworzenia kolonii na płytce nano pattern. Ta metoda jest również dostępna dla różnych typów serii. Metoda ta może stanowić pomost między inżynierią materiałową a biotechnologią, który pomoże zrozumieć iniekcję komórek i topografię powierzchni Nano.