Name: Drukowana matryca glikanów: czuła technika analizy repertuaru krążących przeciwciał antywęglowodanowych u małych zwierząt (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Poznaj technologię drukowanej matrycy glikanów do analizy przeciwciał antywęglowodanowych w surowicy małych zwierząt. Ta metoda umożliwia jednoczesne badanie setek celów glikanowych z wysoką czułością przy minimalnej ilości próbki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez grant "Fondo de Investigaciones Sanitarias" (FIS) PI13/01098 od Instytutu Zdrowia Carlosa III, hiszpańskiego Ministerstwa Zdrowia. DB-G skorzystała ze stanowiska badawczego po doktoracie finansowanego przez Unię Europejską Siódmy Program Ramowy (7PR/2007-2013) w ramach umowy o grant 603049 (TRANSLINK). Prace NK, NS i NB były wspierane przez grant #14-50-00131 Rosyjskiej Fundacji Naukowej. DB-G pragnie wyrazić wdzięczność Marcie Broto, J. Pablo Salvadorowi i Anie Sanchis za doskonałą pomoc techniczną oraz Alexandrowi Rakitko za pomoc w analizie statystycznej. Dzięki wsparciu "Pla de Doctorats Industrials de la Secretaria d'Universitats i Recerca del Department d'Empresa i Coneixement de la Generalitat de Catalunya (grant nr 2018 DI 021). Dziękujemy Programowi CERCA / Generalitat de Catalunya za wsparcie instytucjonalne.

1. Produkcja glikochipów
<ol>
	<li>Przygotowanie mikromacierzy
	<ol>
		<li>Wydrukować glikany (50 mM) i polisacharydy (10 μg/ml) w 300 mM soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS, pH 8,5) w 6 powtórzeniach na szkiełkach szklanych derywatyzowanych N-hydroksysukcynimidem, używając bezkontaktowej matrycy robotycznej (objętość kropli ~ 900 pL). Każdy slajd zawiera 4 różne bloki podtablic (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A, w kolorach) powtórzone 6 razy. Każda pojedyncza podtablica składa się ze 112 różnych plamek glikanów, w tym kontrolek (8 rzędów × 14 kolumn) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B). 
		UWAGA: Informacje dotyczące glikanów znajdują się w Tabeli Uzupełniającej 1. Biblioteka glikanów używana do drukowania mikrochipów jest wynikiem długotrwałego wysiłku syntetycznego zespołu IBCh; Przykłady syntezy opisano w powiązanych publikacjach29,30,31,32,33,34,35,36,37,38. Biblioteka glikanów zawierała antygeny grup krwi i niektóre z najczęściej występujących końcowych oligosacharydów, a także podstawowe motywy ssaków N i O sprzężonych z N i O, glikolipidów, antygeny węglowodanowe związane z nowotworem i polisacharydy z bakterii chorobotwórczych.</li>
		<li>Inkubować szkiełka w pomieszczeniu wilgotnościowym (wilgotność względna ~ 70%) w temperaturze pokojowej (25 °C) przez 1 godzinę.</li>
		<li>Mikromacierze blokujące: inkubować szkiełka przez 1,5 godziny z buforem blokującym w temperaturze pokojowej (100 mM kwas borowy, 25 mM etanoloamina, 0,2% (v/v) Tween-20 w ultraczystej wodzie).</li>
		<li>Umyj glikochip ultraczystą wodą i wysusz go powietrzem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kontrola jakości glikochipów
	<ol>
		<li>Przeanalizować dwie mikromacierze z każdej partii, używając 1 mg/ml roztworu złożonego preparatu immunoglobulin (, zawierającego IgG, IgM i IgA), 10 μg/ml roztworu biotynylowanych kozich immunoglobulin ludzkich jako przeciwciała drugorzędowego (IgM + IgG + IgA), a następnie 1 μg/ml roztworu odpowiedniego fluorescencyjnego koniugatu streptawidyny (za pomocą protokołu opisanego poniżej, patrz krok 2).</li>
		<li>Zeskanuj i przeanalizuj glikochipy (patrz krok 3, analiza macierzy glikanów).</li>
		<li>Używaj partii mikromacierzy z korelacją wewnątrz- i międzychipową wyższą niż 0,9.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Technika Glycan Array
<ol>
	<li>Przygotować następujące roztwory wodne (w wodzie ultraczystej) i przechowywać je w temperaturze pokojowej (25 °C):
	<ul>
		<li>Bufor 1: 1% (w/v) albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w PBS, 1% (v/v) Tween-20 i 0,01% (w/v) NaN3</li>
		<li>Bufor 2: 1% (w/v) BSA w PBS, 0,1% (v/v) Tween-20 i 0,01% (w/v) NaN3.</li>
		<li>Bufor 3: 0,1% (v/v) Tween-20 w PBS.</li>
		<li>Bufor 4: 0,001% (v/v) Tween-20 w PBS.</li>
	</ul>
	</li>
	<li>Przygotowanie glikochipa i próbki
	<ol>
		<li>Umieść schowek ze szkiełkami na stole, aż osiągną temperaturę pokojową (25 °C). 
		UWAGA: Używaj bezpudrowych rękawiczek lateksowych. Glikochipem należy manipulować za pomocą dolnej części szkiełka podstawowego, w której znajduje się kod kreskowy. Kod kreskowy pomoże Ci zidentyfikować prawą stronę, unikając kontaktu z powierzchnią, na której drukowane są glikany.</li>
		<li>Otwórz pudełko, weź glikochip i umieść go w komorze inkubacyjnej (25 °C), już kondycjonowanej mokrą bibułą filtracyjną w celu utrzymania stałej wilgotności wewnątrz komory.</li>
		<li>W międzyczasie rozcieńczyć surowicę myszy Buffer-1 (1:20) w probówkach o pojemności 1,5 ml. Homogenizować roztwór surowicy (5 s) za pomocą mieszalnika wirowego. 
		UWAGA: Objętość potrzebna do całkowitego pokrycia pojedynczej powierzchni glikochipa wynosi około 1 ml.</li>
		<li>Po homogenizacji inkubować rozcieńczoną surowicę w temperaturze 37 °C przez 10 minut w łaźni wodnej, aby uniknąć agregacji immunoglobulin. Odwirować probówki przez 3 minuty w temperaturze 10 000 x g i temperaturze 25 °C, zebrać supernatant i wyrzucić wstrząśnięty materiał.</li>
		<li>Ostrożnie umieścić glikochip w komorze inkubacyjnej. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 25 °C z 1 ml buforu-3 w celu usunięcia wszelkich pozostałości materiału na powierzchni glikochipa.</li>
		<li>Trzymaj glikochip w pozycji pionowej i przemyj go kilkoma kroplami Buffer-3 za pomocą plastikowej pipety Pasteura. Ostrożnie usunąć bufor z powierzchni glikochipa za pomocą bibuły filtracyjnej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Reakcja: wiązanie przeciwciał
	<ol>
		<li>Umieścić glikochip w komorze inkubacyjnej. Rozprowadzić rozcieńczoną próbkę surowicy na powierzchni glikochipa za pomocą mikropipety. Inkubować z mieszaniem orbitalnym (30 obr./min) w temperaturze 37 °C przez 1,5 godziny. Upewnij się, że cały suchy obszar powierzchni glikochipa jest pokryty rozcieńczoną próbką surowicy za pomocą końcówki pipety.</li>
		<li>Usunąć nadmiar próbki i zanurzyć glikochip na 5 minut w buforze 3 w temperaturze 25 °C. Następnie przenieś glikochip do pojemnika z buforem-4 (5 min) i na koniec umyj (5 min) glikochip ultraczystą wodą. Odwirować glikochip przez 1 minutę w temperaturze 175 x g i temperaturze 25 °C w celu usunięcia cieczy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykrywanie: przeciwciało wtórne
	<ol>
		<li>Umieścić glikochip w komorze inkubacyjnej. Rozprowadzić na powierzchni glikochipa roztwór (5 μg/ml) koziego anty-mysiego (IgG + IgM) sprzężonego z biotyną w buforze 2. Inkubować z mieszaniem orbitalnym (30 obr./min) w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.</li>
		<li>Usuń frakcję niezwiązaną i powtórz etapy mycia.</li>
		<li>Po odwirowaniu inkubować glikochip w ciemności w temperaturze 25 °C przez 45 minut (30 obr./min) z 2 μg/ml odpowiedniego roztworu streptawidyny znakowanego fluorochromem (w buforze 2).</li>
		<li>W ciemności usuń niezwiązaną frakcję i powtórz etapy mycia.</li>
		<li>Wysuszyć glikochip powietrzem. 
		Uwaga: Glycochip należy zeskanować tak szybko, jak to możliwe. Ale jeśli nie można wykonać skanowania natychmiast po barwieniu, glikochipy można przechowywać w chłodnym i suchym miejscu w ciemności.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Analiza tablicy glikanów
<ol>
	<li>Skanowanie macierzy
	<ol>
		<li>Pozostaw glikochip na stole, aż osiągnie temperaturę pokojową w ciemności. W tym samym czasie włącz skaner slajdów i laser (długość fali wzbudzenia 633 nm).</li>
		<li>Trzymając mikromatrycę, wsuń glikochip do szczeliny, aż dotknie tyłu.</li>
		<li>Zeskanuj glikochip ("uruchom łatwe skanowanie") i zapisz skan jako ". TIFF".</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kwantyfikacja tablicowa
	<ol>
		<li>Określ ilościowo tablicę za pomocą systemu analizy ScanArray. Otwórz wcześniej zeskanowane obrazy, klikając "Plik" w grupie "Konfiguracja i plik" w oknie głównym (Rysunek 1B-D)</li>
		<li>Załaduj odpowiedni szablon pliku tablicy w formacie GAL (rozmieszczenie wydrukowanych glikanów na szkiełku podstawowym) (Rysunek 1C).</li>
		<li>Dostosuj szablon GAL, ostrożnie wyrównując tablicę (siatki) z plamami na obrazie i rozpocznij kwantyfikację (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 1D).</li>
		<li>Wybierz parametry kwantyfikacji:
		<ul>
			<li>Typ kwantyfikacji: Uruchom Easy Quant.</li>
			<li>Metoda kwantyfikacji: Fixed Circle</li>
			<li>Automatyczne wyszukiwanie miejsc: odznacz wszystkie opcje</li>
			<li>Metoda normalizacji: LOWESS (Locally Weighted Scatter Plot Smoothing).</li>
		</ul>
		</li>
		<li>Zapisz dane ilościowe jako ". CSV" (Rysunek 1D). Przenieś te dane do zwykłego pliku arkusza kalkulacyjnego za pomocą programu Microsoft Excel lub innej odpowiedniej aplikacji.</li>
		<li>Jako główną metodę statystyczną należy zastosować przedział międzykwartylowy (IQR): obliczenie mediany (kwartyl 2) wszystkich sygnałów dla każdego liganda oraz odchylenie międzykwartylowe (odpowiednio 75. i 25. percentyl lub górny i dolny kwartyl Q3 i Q1).</li>
		<li>Przeprowadzanie interakcyjnej eksploracji danych przy użyciu aplikacji Eksplorator klastrów hierarchicznych.</li>
		<li>Użyj parametrów grupowania: Średnie powiązanie (UPGMA) i Odległość euklidesowa jako miara odległości podobieństwa. Wykonywanie hierarchicznego grupowania według wierszy bez normalizacji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Karlsson, G. B., Fouchier, R. A., Phogat, S., Burton, D. R., Sodroski, J., Wyatt, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+challenges+of+eliciting+neutralizing+antibodies+to+HIV-1+and+to+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The challenges of eliciting neutralizing antibodies to HIV-1 and to influenza virus.</a> Nat Rev Microbiol. 6 (2), 143-155 (2008).</li>
<li>Lu, L. L., Suscovich, T. J., Fortune, S. M., Alter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+binding%3A+antibody+effector+functions+in+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Beyond binding: antibody effector functions in infectious diseases.</a> Nat Rev Immunol. 18 (1), 46-61 (2017).</li>
<li>Bebbington, C., Yarranton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+for+the+treatment+of+bacterial+infections%3A+current+experience+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotech%22%5BJournal%5D)">Antibodies for the treatment of bacterial infections: current experience and future prospects.</a> Curr Opin Biotech. 19 (6), 613-619 (2008).</li>
<li>Murphy, K., Travers, P., Walport, M. The complement system and innate immunity. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMurphy%2C+K+%22Janeway%27s+Immunobiology%22">Janeway's Immunobiology</a>. , 7th, Garland Science. New York. 61-80 (2008).</li>
<li>Botto, M., Kirschfink, M., Macor, P., Pickering, M. C., Wurzner, R., Tedesco, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+in+human+diseases%3A+lessons+from+complement+deficiencies%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Complement in human diseases: lessons from complement deficiencies.</a> Mol Immunol. 46 (14), 2774-2783 (2009).</li>
<li>Borrok, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+antibody-dependent+cell-mediated+cytotoxicity+by+endowing+IgG+with+Fc%CE%B1RI+%28CD89%29+binding%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">Enhancement of antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity by endowing IgG with FcαRI (CD89) binding.</a> MAbs. 7 (4), 743-751 (2015).</li>
<li>Weiner, L. M., Murray, J. C., Shuptrine, C. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22424219">Antibody-based immunotherapy of cancer.</a> Cell. 148 (6), 1081-1084 (2012).</li>
<li>Ricklin, D., Hajishengallis, G., Yang, K., Lambris, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement%3A+a+key+system+for+immune+surveillance+and+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Complement: a key system for immune surveillance and homeostasis.</a> Nat Immunol. 11 (9), 785-797 (2010).</li>
<li>Prechl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generalized+quantitative+antibody+homeostasis+model%3A+antigen+saturation%2C+natural+antibodies+and+a+quantitative+antibody+network%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transl+Immunology%22%5BJournal%5D)">A generalized quantitative antibody homeostasis model: antigen saturation, natural antibodies and a quantitative antibody network.</a> Clin Transl Immunology. 6 (2), e131(2017).</li>
<li>Vojdani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+as+predictors+of+complex+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Immunopath+Ph%22%5BJournal%5D)">Antibodies as predictors of complex autoimmune diseases.</a> Int J Immunopath Ph. 21 (2), 267-278 (2008).</li>
<li>Liu, W., Peng, B., Lu, Y., Xu, W., Qian, W., Zhang, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibodies+to+tumor-associated+antigens+as+biomarkers+in+cancer+immunodiagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Autoimmun+Rev%22%5BJournal%5D)">Autoantibodies to tumor-associated antigens as biomarkers in cancer immunodiagnosis.</a> Autoimmun Rev. 10 (6), 331-335 (2011).</li>
<li>Suurmond, J., Diamond, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibodies+in+systemic+autoimmune+diseases%3A+specificity+and+pathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Autoantibodies in systemic autoimmune diseases: specificity and pathogenicity.</a> J Clin Invest. 125 (6), 2194-2202 (2015).</li>
<li>Bovin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repertoire+of+human+natural+anti-glycan+immunoglobulins.+Do+we+have+auto-antibodies%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Repertoire of human natural anti-glycan immunoglobulins. Do we have auto-antibodies?</a> Biochim Biophys Acta. 1820 (9), 1373-1382 (2012).</li>
<li>de los Rios, M., Criscitiello, M. F., Smider, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+genetic+diversity+in+antibody+repertoires+from+diverse+species%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struc+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural and genetic diversity in antibody repertoires from diverse species.</a> Curr Opin Struc Biol. 33, 27-41 (2015).</li>
<li>Pochechueva, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+printed+glycan+array%2C+suspension+array+and+ELISA+in+the+detection+of+human+anti-glycan+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconjugate+J%22%5BJournal%5D)">Comparison of printed glycan array, suspension array and ELISA in the detection of human anti-glycan antibodies.</a> Glycoconjugate J. 28 (8-9), 507-517 (2011).</li>
<li>Shilova, N., Navakouski, M., Khasbiullina, N., Blixt, O., Bovin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Printed+glycan+array%3A+antibodies+as+probed+in+undiluted+serum+and+effects+of+dilution%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconjugate+J%22%5BJournal%5D)">Printed glycan array: antibodies as probed in undiluted serum and effects of dilution.</a> Glycoconjugate J. 29 (2-3), 87-91 (2012).</li>
<li>Manimala, J. C., Roach, T. A., Li, Z., Gildersleeve, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+carbohydrate+microarray+profiling+of+27+antibodies+demonstrates+widespread+specificity+problems%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">High-throughput carbohydrate microarray profiling of 27 antibodies demonstrates widespread specificity problems.</a> Glycobiology. 17 (8), 17C-23C (2007).</li>
<li>Jacob, F., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21351089">Serum anti-glycan antibody detection of non-mucinous ovarian cancers by using a printed glycan array.</a> Int. J. Cancer. 130 (1), 138-146 (2012).</li>
<li>Lewallen, D. M., Siler, D., Iyer, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+protein-glycan+specificity%3A+effect+of+spacers+and+incubation+time%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Factors affecting protein-glycan specificity: effect of spacers and incubation time.</a> ChemBioChem. 10 (9), 1486-1489 (2009).</li>
<li>Oyelaran, O., Li, Q., Farnsworth, D., Gildersleeve, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarrays+with+varying+carbohydrate+density+reveal+distinct+subpopulations+of+serum+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Microarrays with varying carbohydrate density reveal distinct subpopulations of serum antibodies.</a> J. Proteome Res. 8 (7), 3529-3538 (2009).</li>
<li>Pochechueva, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+suspension+array+for+human+anti-carbohydrate+antibody+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Multiplex suspension array for human anti-carbohydrate antibody profiling.</a> Analyst. 136 (3), 560-569 (2011).</li>
<li>Chinarev, A. A., Galanina, O. E., Bovin, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotinylated+multivalent+glycoconjugates+for+surface+coating%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Biotinylated multivalent glycoconjugates for surface coating.</a> Methods Mol Biol. 600, 67-78 (2010).</li>
<li>Huflejt, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-carbohydrate+antibodies+of+normal+sera%3A+findings%2C+surprises+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Anti-carbohydrate antibodies of normal sera: findings, surprises and challenges.</a> Mol Immunol. 46 (15), 3037-3049 (2009).</li>
<li>Buchs, J. P., Nydegger, U. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+ABO-ELISA+for+the+quantitation+of+human+blood+group+anti-A+and+anti-B+IgM+and+IgG+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of an ABO-ELISA for the quantitation of human blood group anti-A and anti-B IgM and IgG antibodies.</a> J Immunol Methods. 118 (1), 37-46 (1989).</li>
<li>de Jager, W., Rijkers, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-phase+and+bead-based+cytokine+immunoassay%3A+a+comparison%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Solid-phase and bead-based cytokine immunoassay: a comparison.</a> Methods. 38 (4), 294-303 (2006).</li>
<li>Galanina, O. E., Mecklenburg, M., Nifantiev, N. E., Pazynina, G. V., Bovin, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GlycoChip%3A+multiarray+for+the+study+of+carbohydrate+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">GlycoChip: multiarray for the study of carbohydrate binding proteins.</a> Lab Chip. 3 (4), 260-265 (2003).</li>
<li>Willats, W. G., Rasmussen, S. E., Kristensen, T., Mikkelsen, J. D., Knox, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sugar-coated+microarrays%3A+a+novel+slide+surface+for+the+high-throughput+analysis+of+glycans%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Sugar-coated microarrays: a novel slide surface for the high-throughput analysis of glycans.</a> Proteomics. 2 (12), 1666-1671 (2002).</li>
<li>Bello-Gil, D., Khasbiullina, N., Shilova, N., Bovin, N., Mañez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repertoire+of+BALB%2Fc+mice+natural+anti-Carbohydrate+antibodies%3A+mice+vs.+humans+difference%2C+and+otherness+of+individual+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Repertoire of BALB/c mice natural anti-Carbohydrate antibodies: mice vs. humans difference, and otherness of individual animals.</a> Front Immunol. 8, 1449(2017).</li>
<li>Pazynina, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+glyco-O-sulfatome+for+profiling+of+human+natural+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr+Res%22%5BJournal%5D)">Synthetic glyco-O-sulfatome for profiling of human natural antibodies.</a> Carbohydr Res. 445, 23-31 (2017).</li>
<li>Ryzhov, I. M., Korchagina, E. Y., Popova, I. S., Tyrtysh, T. V., Paramonov, A. S., Bovin, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Block+synthesis+of+A+%28type+2%29+and+B+%28type+2%29+tetrasaccharides+related+to+the+human+ABO+blood+group+system%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr+Res%22%5BJournal%5D)">Block synthesis of A (type 2) and B (type 2) tetrasaccharides related to the human ABO blood group system.</a> Carbohydr Res. 430, 59-71 (2016).</li>
<li>Ryzhov, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function-spacer-lipid+constructs+of+Lewis+and+chimeric+Lewis%2FABH+glycans.+Synthesis+and+use+in+serological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohyd+Res%22%5BJournal%5D)">Function-spacer-lipid constructs of Lewis and chimeric Lewis/ABH glycans. Synthesis and use in serological studies.</a> Carbohyd Res. 435, 83-96 (2016).</li>
<li>Pazynina, G. V., Tsygankova, S. V., Sablina, M. A., Paramonov, A. S., Tuzikov, A. B., Bovin, N. V. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0959943616300992">Stereo- and regio-selective synthesis of spacer armed α2-6 sialooligosaccharides.</a> Mendeleev Commun. 26 (5), 380-382 (2016).</li>
<li>Pazynina, G. V., Tsygankova, S. V., Sablina, M. A., Paramonov, A. S., Formanovsky, A. A., Bovin, N. V. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0959943616000547">Synthesis of blood group pentasaccharides ALey, BLey and related tri- and tetrasaccharides.</a> Mendeleev Commun. 26 (2), 103-105 (2016).</li>
<li>Severov, V. V., Pazynina, G. V., Ovchinnikova, T. V., Bovin, N. V. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1134/S1068162015020120">The synthesis of oligosaccharides containing internal and terminal Galβ1-3GlcNAcβ fragments.</a> Russian J. Bioorgan. Chem. 41 (2), 147-160 (2015).</li>
<li>Pazynina, G. V., Tsygankova, S. V., Bovin, N. V. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0959943615001212">Synthesis of glycoprotein N-chain core fragment GlcNAcβ1-4(Fucα1-6)GlcNAc.</a> Mendeleev Commun. 25 (4), 250-251 (2015).</li>
<li>Solís, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+into+glycosciences%3A+How+chemistry%2C+biochemistry+and+biology+cooperate+to+crack+the+sugar+code%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">A guide into glycosciences: How chemistry, biochemistry and biology cooperate to crack the sugar code.</a> Biochim Biophys Acta. 1850 (1), 186-235 (2015).</li>
<li>Pazynina, G. V., et al. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/273432327_Divergent_Strategy_for_the_Synthesis_of_a2-3-Linked_Sialo-oligosaccharide_Libraries_Using_a_Neu5TFA-a2-3-Gal_Building_Block">Divergent strategy for the synthesis of α2-3-Linked sialo-oligosaccharide libraries using a Neu5TFA-(α2-3)-Gal building block.</a> Synlett. 24 (02), 226-230 (2013).</li>
<li>Blixt, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Printed+covalent+glycan+array+for+ligand+profiling+of+diverse+glycan+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Printed covalent glycan array for ligand profiling of diverse glycan binding proteins.</a> P Natl Acad Sci USA. 101 (49), 17033-17038 (2004).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+minimum+information+required+for+a+glycomics+experiment+%28MIRAGE%29+project%3A+improving+the+standards+for+reporting+glycan+microarray-based+data%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">The minimum information required for a glycomics experiment (MIRAGE) project: improving the standards for reporting glycan microarray-based data.</a> Glycobiology. 27 (4), 280-284 (2017).</li>
<li>Song, X., Heimburg-Molinaro, J., Cummings, R. D., Smith, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry+of+natural+glycan+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemistry of natural glycan microarrays.</a> Curr Opin Chem Biol. 18, 70-77 (2014).</li>
<li>Hoy, Y. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+taxonomic+composition+of+the+fecal+microbiota+in+an+inbred+mouse+strain+across+individuals+and+time%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Variation in taxonomic composition of the fecal microbiota in an inbred mouse strain across individuals and time.</a> PLoS One. 10 (11), e0142825(2015).</li>
<li>D'Argenio, V., Salvatore, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+gut+microbiome+in+the+healthy+adult+status%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">The role of the gut microbiome in the healthy adult status.</a> Clin Chim Acta. 451 (Pt A), 97-102 (2015).</li>
<li>Khasbiullina, N. R., Bovin, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypotheses+of+the+origin+of+natural+antibodies%3A+a+glycobiologist%27s+opinion%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+%28Mosc%29%22%5BJournal%5D)">Hypotheses of the origin of natural antibodies: a glycobiologist's opinion.</a> Biochemistry (Mosc). 80 (7), 820-835 (2015).</li>
<li>Butler, J. E., Sun, J., Weber, P., Navarro, P., Francis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+repertoire+development+in+fetal+and+newborn+piglets%2C+III.+Colonization+of+the+gastrointestinal+tract+selectively+diversifies+the+preimmune+repertoire+in+mucosal+lymphoid+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Antibody repertoire development in fetal and newborn piglets, III. Colonization of the gastrointestinal tract selectively diversifies the preimmune repertoire in mucosal lymphoid tissues.</a> Immunology. 100 (1), 119-130 (2000).</li>
<li>Bos, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+immunoglobulin+levels+and+naturally+occurring+antibodies+against+carbohydrate+antigens+in+germ-free+BALB%2Fc+mice+fed+chemically+defined+ultrafiltered+diet%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Serum immunoglobulin levels and naturally occurring antibodies against carbohydrate antigens in germ-free BALB/c mice fed chemically defined ultrafiltered diet.</a> Eur J Immunol. 19 (12), 2335-2339 (1980).</li>
<li>van der Heijden, P. J., Bianchi, A. T., Heidt, P. J., Stok, W., Bokhout, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Background+%28spontaneous%29+immunoglobulin+production+in+the+murine+small+intestine+before+and+after+weaning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Reprod+Immunol%22%5BJournal%5D)">Background (spontaneous) immunoglobulin production in the murine small intestine before and after weaning.</a> J Reprod Immunol. 15 (3), 217-227 (1989).</li>
<li>Krasnova, L., Wong, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+chemistry+and+biology+of+glycosylation+with+glycan+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Understanding the chemistry and biology of glycosylation with glycan synthesis.</a> Annu Rev Biochem. 85, 599-630 (2016).</li>
<li>Overkleeft, H. S., Seeberger, P. H., et al. Chemoenzymatic synthesis of glycans and glycoconjugates. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOverkleeft%2C+HS+%22Essentials+of+Glycobiology+%5BInternet%5D%22">Essentials of Glycobiology [Internet]</a>. Varki, A., et al. , 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor (NY). Chapter 54 2015-2017 (2017).</li>
</ol>

Nailya Khasbiullina i Alexey Nokel są pracownikami firmy Semiotik LLC, która jest dostawcą glikochipów użytych w tym badaniu.

Mikromacierze glikanowe stały się niezbędnymi narzędziami do badania interakcji białko-glikan40. W niniejszej pracy opisano protokół oparty na technologii PGA do badania repertuaru krążenia przeciwciał antywęglowodanowych u myszy BALB/c. Ponieważ PGA oferuje możliwość badania dużej liczby biologicznie nieznanych glikanów, jest to wyjątkowo wygodne narzędzie do odkrywania 13,15,28. Proponowana metoda daje ...

Przeciwciała odgrywają kluczową rolę w naszej obronie przed atakującymi patogenami, bezpośrednio neutralizując wirusy1,2 i bakterie2,3, poprzez aktywację układu dopełniacza4,5 i wzmocnienie fagocytozy6. Ponadto są one niezbędnymi elementami w celowaniu w raka i eliminacji komórek nowotworowych7 oraz utrzymanie homeostazy8,9.
Zaburzenia układu odpornościowego mogą prowadzić do chorób autoimmunologicznych i zapalnych10 i raka11. Wszystkie te stany patologiczne wymagają szybkiej diagnozy w celu skutecznego leczenia. W przypadku chorób autoimmunologicznych serologiczna obecność autoprzeciwciał w większości przypadków jest predyktorem w diagnostyce autoimmunizacji10,12. Przeciwciała te reagują z powierzchnią komórki i zewnątrzkomórkowymi autoantygenami i często są obecne przez wiele lat przed wystąpieniem choroby autoimmunologicznej10,12. Niedobory odporności i nowotwory są również diagnozowane za pomocą badań krwi, które mierzą poziom elementów odpornościowych, takich jak przeciwciała, lub ich aktywność funkcjonalną11.
Identyfikacja repertuaru krążących przeciwciał i ich poziomów serologicznych jest kluczowa dla ustalenia prognozy i oceny postępu wszystkich wymienionych stanów patologicznych. Wcześniej wykazaliśmy potencjał techniki PGA do analizy krążących przeciwciał u różnych gatunków zwierząt13-16, minimalizując użycie dużych objętości próbek serologicznych, unikając problemu związanego z reaktywnością krzyżową przeciwciał17 i umożliwiając wysokoprzepustowe profilowanie obszernego repertuaru przeciwciał15.
Testy immunologiczne oparte na glikanach są głównie uwarunkowane, między innymi, pochodzeniem i produkcją węglowodanów, które decydują o powinowactwie i wiązaniu ligandów15,18,19,20,21. Testy immunologiczne na bazie glikanów mogą być opracowywane w zawiesinie (mikrosferach)15,21,22 lub na powierzchniach aktywowanych płasko15,21,22,23,24. Do tych ostatnich należą ELISA (najbardziej konwencjonalna z tych metod) i PGA. Nie ma zbyt wielu danych porównujących te metodologie w tym samym środowisku eksperymentalnym15,25,26,27. Wcześniej porównaliśmy skuteczność i selektywność tych testów immunologicznych z profilem przeciwciał antyglikanowych w poszczególnych próbkach ludzkiego osocza15. W przypadku niektórych przeciwciał, takich jak przeciwciała skierowane przeciwko grupie krwi A/B, wszystkie testy immunologiczne mogą je wykryć ze statystyczną istotnością i dodatnio korelują ze sobą15,18,21. Tymczasem przeciwciała anty-P1 były przede wszystkim wykrywane przez PGA o najwyższej sile dyskryminacyjnej i nie było korelacji w oznaczeniach dokonanych przez różne testy immunologiczne oparte na glikanie15,18,21. Te różnice między metodami były głównie związane ze stosunkiem przeciwciał do antygenu i orientacją glikanów15. Tablice ELISA i zawiesiny są bardziej podatne na niespecyficzne wiązanie niż PGA, ponieważ w tych metodach występuje nadmiar antygenu nad przeciwciałami15. Ponadto orientacja glikanów w PGA jest bardziej ograniczona niż w ELISA i tablicach zawiesinowych15. Test ELISA jest wygodny, gdy badanie obejmuje ograniczony panel glikanów. Wraz z matrycami zawiesin, ELISA oferuje większą elastyczność w zakresie rekonfiguracji testu. PGA jest wyjątkowo wygodny w podejściach odkrywczych15,18,21,28. Pomimo tych wyraźnych zalet i wad, trzy wymienione testy immunologiczne mogą być wykorzystane do badania różnych aspektów interakcji glikan-przeciwciało. Ostatecznym celem badania jest wskazanie wyboru bardziej odpowiedniej metodologii.
Niniejsza praca ma na celu rozszerzenie zastosowania technologii PGA do analizy repertuaru krążących przeciwciał antyglikanowych u małych zwierząt. Jako reprezentatywny wynik przedstawiamy tutaj szczegółowy protokół oceny repertuaru naturalnych przeciwciał antywęglowodanowych u dorosłych myszy BALB/c przez PGA.

<table><tbody><tr><td>Przeciwciała</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>biotynylowane kozy anty-ludzkie Igs</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>Ref. #: 31782</td><td></td></tr><tr><td>biotynylowany kozioł anty-mysie IgM + IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Ref. #: 31807</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Robotic Arrayer sciFLEXARRAYER S5&nbsp;</td><td>Scienion AG, Berlin, Niemcy</td><td>http://www.scienion.com/products/sciflexarrayer/</td><td></td></tr> <tr><td>Tacka na plamy (komora inkubacyjna do szkiełka)</td><td>Simport, Beloeil, QC, Kanada</td><td>Nr ref. #: Wirówka M920-2</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf, Hamburg, Niemcy&nbsp;</td><td>Nr ref. #: Pipety 5810 R</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Gilson, Middleton, WI, USA</td><td>http://www.gilson.com/en/Pipette/</td><td></td></tr> <tr><td>Skaner do slajdów&nbsp;</td><td>PerkinElmer, Waltham, MA, Stany Zjednoczone</td><td>ScanArray GX Plus&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator z wytrząsaniem</td><td>Cole-Parmer, Staffordshire, Wielka Brytania</td><td>Nr ref. #: SI50</td><td></td></tr><tr><td>Próbki biologiczne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BALB/c surowice myszy</td><td>Ten artykuł</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>Complex Immunoglobulin Preparation ()</td><td>Immuno-Gem, Moskwa, Rosja</td><td>http://www.biomedservice.ru/price/goods/1/17531</td><td></td></tr><tr><td><silne>chemikalia, odczynniki i glikany&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycan library</td><td>Instytut Chemii Bioorganicznej (IBCh), Moskwa, Rosja</td><td>N/ A Albumina</td><td></td></tr><tr><td>surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,&nbsp;</td><td>Nr ref. #: A9418</td><td></td></tr><tr><td>Etanoloamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Nr ref. #: 411000</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Merck Chemicals & Life Science S.A., Madryt, Hiszpania</td><td>Ref. #: 655204</td><td></td></tr><tr><td>Fospahte buforowana sól fizjologiczna (PBS)</td><td>VWR International Eurolab S.L, Barcelona, Hiszpania</td><td>Ref. #: E404</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Ref. #: S2002</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin Alexa Fluor 555 sprzężony&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Ref. #: S21381</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin Cy5 sprugatowany</td><td>GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, Wielka Brytania</td><td>Ref. #: PA45001</td><td></td></tr><tr><td>Materiały</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-hydroksysukcynimida-derywatyzowane szkiełka podstawowe H&nbsp;</td><td>Schott-Nexterion, Jena, Niemcy</td><td>Ref. #: 1070936</td><td></td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna Whatman&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Ref. #: WHA10347509</td><td></td></tr><tr><td>Probówki 1,5 ml</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>Ref. #: 0030120086</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie i algorytmy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ScanArray Express Microarray Analysis System</td><td>PerkinElmer</td><td>http://www.per</td><td></td></tr><tr><td>kinelmer.com/microarray</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aplikacja Hierarchical Clustering Explorer</td><td>University of Maryland, MD, USA</td><td>http://www.cs.umd.edu/hcil/hce/</td><td></td></tr></tbody></table>

drukowana matryca glikanów: czuła technika analizy repertuaru krążących przeciwciał antywęglowodanowych u małych zwierząt

Printed Glycan Array: A Sensitive Technique for the Analysis of the Repertoire of Circulating Anti-carbohydrate Antibodies in Small Animals

Repertuar krążących przeciwciał antywęglowodanowych danej osoby jest często związany z jej statusem immunologicznym. Nie tylko indywidualny stan immunologiczny decyduje o sukcesie w zwalczaniu wewnętrznych i zewnętrznych potencjalnych sygnałów zagrożenia, ale także istnienie określonego wzorca krążących przeciwciał antyglikanowych (i zmienność ich poziomu serologicznego) może być znaczącym markerem wystąpienia i progresji niektórych stanów patologicznych. W tym miejscu opisujemy metodologię opartą na drukowanej macierzy glikanów (PGA), która oferuje możliwość pomiaru setek celów glikanowych z bardzo wysoką czułością; Użycie minimalnej ilości próbki, co jest powszechnym ograniczeniem występującym, gdy małe zwierzęta (szczury, myszy, chomiki itp.) są wykorzystywane jako modele do rozwiązywania problemów związanych z chorobami ludzi. Jako reprezentatywny przykład tego podejścia przedstawiamy wyniki uzyskane z analizy repertuaru naturalnych przeciwciał antyglikanowych u myszy BALB/c. Wykazaliśmy, że każda mysz BALB/c biorąca udział w badaniu, mimo że jest genetycznie identyczna i utrzymywana w tych samych warunkach, rozwija określony wzór naturalnych przeciwciał antywęglowodanowych. Praca ta ma na celu rozszerzenie zastosowania technologii PGA do badania repertuaru (specyfiki) i poziomów krążących przeciwciał przeciwwęglowodanowych, zarówno w zdrowiu, jak i podczas każdego stanu patologicznego.

W niniejszym opracowaniu przedstawiamy podsumowanie reprezentatywnych wyników uzyskanych z ilościowego oznaczenia repertuaru naturalnych przeciwciał przeciwko glikanom w populacji 20 myszy BALB/c. Glikochipy użyte w tej badaniu zawierały 419 różnych struktur glikanów. Większość glikanów została zsyntezowana jako O-glikozydy z łącznikiem -CH2CH2CH2NH2, w kilku przypadkach jako glikozydy -CH2CH2NH2 lub -NH...

Ta praca pokazuje potencjał technologii drukowanych tablic glikanowych (PGA) do analizy krążących przeciwciał antywęglowodanowych u małych zwierząt.

Drukowana matryca glikanów: czuła technika analizy repertuaru krążących przeciwciał antywęglowodanowych u małych zwierząt

The repertoire of circulating anti-carbohydrate antibodies of a given individual is often associated with its immunological status. Not only the ...

Ogólnym celem tego protokołu jest zbadanie profilu krążących przeciwciał antyglikanowych w surowicy małych zwierząt przy użyciu technologii opartej na drukowanej macierzy glikanów. Takie podejście ma potencjał we wczesnej diagnozie i właściwym leczeniu niektórych stanów patologicznych, w których przeciwciała przeciwko strukturom glikanowym odgrywają ważną rolę. Główną zaletą tej techniki jest możliwość pomiaru w tych samych warunkach eksperymentalnych setek celów glikanowych z bardzo wysoką czułością przy użyciu minimalnej ilości próbki.Do przygotowania mikromacierzy należy użyć bezkontaktowej macierzy robotycznej. Drukuje sześć powtórzeń 50 milimolowych glikanów i 10 mikrogramów na mililitr polisacharydów oraz 300 milimolowych PBS, pH 8,5 na szkiełkach z derywatyzowanego szkła cynamonowego n-hydroksy6. Każdy slajd zawiera cztery różne bloki podtablic powtórzone sześć razy.Każda pojedyncza podtablica składa się ze 112 różnych plamek glikanów, w tym kontrolnych. Inkubować szkiełka w wilgotnym pojemniku w temperaturze pokojowej przez godzinę. Aby zablokować mikromacierze, inkubuj szkiełka przez 1 1/2 godziny z buforem blokującym w temperaturze pokojowej.Następnie umyj wiór glikolowy

printed-glycan-array-sensitive-technique-for-analysis-repertoire

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W niniejszym badaniu opisujemy ulepszony protokół wieloparametrycznego, wysokoprzepustowego mikrociągu przeciwciał z metodą detekcji lektynami, który może być wykorzystany do profilowania glikozylacji specyficznych białek. Protokół ten wprowadza nowe, niezawodne odczynniki i znacząco redukuje czas, koszty oraz zapotrzebowanie na sprzęt laboratoryjny w porównaniu do poprzedniej procedury.

Mikromacierze przeciwciał z blokowaniem chemicznym do multipleksowego wysokoprzepustowego profilowania specyficznej glikozylacji białek w próbkach złożonych

Ten film demonstruje technologię drukowanej macierzy glikanowej do analizy krążących przeciwciał anty-glikanowych w surowicy myszy. Przeciwciała w surowicy oddziałują ze specyficznymi glikanami na chipie, co potwierdza się za pomocą barwienia immunologicznego, a następnie skanowania fluorescencyjnego.

Wykrywanie krążących przeciwciał anty-glikanowych za pomocą drukowanej matrycy glikanów

Korzystając z drukowanej strategii mikromacierzy glikanowej, konwencjonalny test na 96-dołkowej płytce został zminiaturyzowany do analizy awidności hemaglutyniny wirusa grypy A i swoistości dla receptorów zawierających kwas sjalowy.

Zminiaturyzowany test mikromacierzy glikanów do oceny awidności i swoistości hemaglutynin wirusa grypy A

Opisujemy tutaj metodę generowania konfigurowalnych mikromacierzy antygenowych, które mogą być używane do jednoczesnego wykrywania autoprzeciwciał IgG i IgM w surowicy od ludzi i myszy. Macierze te pozwalają na wysokoprzepustowe i ilościowe wykrywanie przeciwciał przeciwko dowolnemu antygenom lub epitopom.

Generacja dwukolorowych mikromacierzy antygenowych do jednoczesnego wykrywania autoprzeciwciał IgG i IgM

Modułowe podejście do syntezy N-glikanów do dołączania do szkiełka pokrytego tlenkiem glinu (ACG) jako mikromatrycy glikanowej zostało opracowane i zademonstrowano jego zastosowanie do profilowania przeciwciała neutralizującego wirusa HIV.

Chemoenzymatyczna synteza N-glikanów do tworzenia macierzy i profilowania przeciwciał HIV

Test mikromacierzy sialoglycan może być używany do oceny przeciwciał anty-Neu5Gc w surowicach ludzkich, co czyni go potencjalnym wysokoprzepustowym testem diagnostycznym dla raka i innych przewlekłych chorób ludzkich, w których pośredniczy stan zapalny.

Profilowanie IgG anty-Neu5Gc w surowicach ludzkich za pomocą testu mikromacierzy sialoglikanu

Opisano szczegółowy protokół oczyszczania i późniejszej analizy przeciwciała monoklonalnego z pobranego płynu do hodowli komórek (HCCF) zautomatyzowanych mikrobioreaktorów. Przedstawiono również wykorzystanie analiz do określenia krytycznych atrybutów jakości (CQA) i maksymalizacji ograniczonej objętości próbki w celu wyodrębnienia istotnych informacji.

Oczyszczanie i analiza przeciwciała monoklonalnego z komórek jajnika chomika chińskiego przy użyciu zautomatyzowanego systemu mikrobioreaktora

Wzór glikozylacji przeciwciała determinuje jego skuteczność kliniczną, dlatego przemysłowe i akademickie wysiłki zmierzające do kontroli glikozylacji trwają. Ponieważ typowe kampanie glikoinżynieryjne są czasochłonne i pracochłonne, przydatne byłoby opracowanie szybkiego protokołu do scharakteryzowania wpływu genów glikozylacji za pomocą przejściowego wyciszania.

Szybka glikoinżynieria przeciwciał w komórkach jajnika chomika chińskiego

Profilowanie polimerów w mikromatrycach (MAPP) to wysokoprzepustowa technika analizy składu glikanów w próbkach biologicznych.

Profilowanie polimerów w mikromacierzy (MAPP) do wysokoprzepustowej analizy glikanów

Opracowano prostą metodę slot blot do ilościowego oznaczania hemaglutyniny i neuraminidazy wirusa grypy przy użyciu uniwersalnych przeciwciał skierowanych przeciwko ich najbardziej konserwatywnym sekwencjom, zidentyfikowanym za pomocą analiz bioinformatycznych. To innowacyjne podejście może stanowić przydatną alternatywę dla ilościowego określania wszystkich hemaglutynin i neuraminidaz wirusowych.

Analizy ilościowe wszystkich hemaglutynin i neuraminidaz wirusa grypy typu A z wykorzystaniem uniwersalnych przeciwciał w prostych testach slot blot

Poznaj technologię drukowanej matrycy glikanów do analizy przeciwciał antywęglowodanowych w surowicy małych zwierząt. Ta metoda umożliwia jednoczesne badanie setek celów glikanowych z wysoką czułością przy minimalnej ilości próbki.

Drukowana matryca glikanów: czuła technika analizy repertuaru krążących przeciwciał antywęglowodanowych u małych zwierząt

Przeglądaj więcej filmów