Drukowana matryca glikanów: czuła technika analizy repertuaru krążących przeciwciał antywęglowodanowych u małych zwierząt
February 14th, 2019
Ta praca pokazuje potencjał technologii drukowanych tablic glikanowych (PGA) do analizy krążących przeciwciał antywęglowodanowych u małych zwierząt.
Ogólnym celem tego protokołu jest zbadanie profilu krążących przeciwciał antyglikanowych w surowicy małych zwierząt przy użyciu technologii opartej na drukowanej macierzy glikanów. Takie podejście ma potencjał we wczesnej diagnozie i właściwym leczeniu niektórych stanów patologicznych, w których przeciwciała przeciwko strukturom glikanowym odgrywają ważną rolę. Główną zaletą tej techniki jest możliwość pomiaru w tych samych warunkach eksperymentalnych setek celów glikanowych z bardzo wysoką czułością przy użyciu minimalnej ilości próbki.
Do przygotowania mikromacierzy należy użyć bezkontaktowej macierzy robotycznej. Drukuje sześć powtórzeń 50 milimolowych glikanów i 10 mikrogramów na mililitr polisacharydów oraz 300 milimolowych PBS, pH 8,5 na szkiełkach z derywatyzowanego szkła cynamonowego n-hydroksy6. Każdy slajd zawiera cztery różne bloki podtablic powtórzone sześć razy.
Każda pojedyncza podtablica składa się ze 112 różnych plamek glikanów, w tym kontrolnych. Inkubować szkiełka w wilgotnym pojemniku w temperaturze pokojowej przez godzinę. Aby zablokować mikromacierze, inkubuj szkiełka przez 1 1/2 godziny z buforem blokującym w temperaturze pokojowej.
Następnie umyj wiór glikolowy ultra czystą wodą i wysusz go powietrzem. Przygotuj bufor od pierwszego do czwartego zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby przygotować wióry i próbki glikolu, połóż pudełko do przechowywania ze szkiełkami na stole, aż osiągną temperaturę pokojową.
Otwórz pudełko i przenieś wiór glikolowy do komory inkubacyjnej, która powinna być już kondycjonowana mokrą bibułą filtracyjną, aby utrzymać stałą wilgotność wewnątrz komory. W międzyczasie rozcieńczyć surowicę myszy buforem jeden na 1,5 mililitra probówki. Homogenizować roztwór surowicy przez pięć sekund za pomocą mieszalnika wirowego.
Po homogenizacji inkubować rozcieńczoną surowicę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut w łaźni wodnej, aby uniknąć agregacji immunoglobulin. Następnie odwiruj probówki przez trzy minuty w temperaturze 10 000 razy G i 25 stopni Celsjusza. Zebrać sklarowany nad osadem i wyrzucić wstrząśnięty materiał.
Ostrożnie umieścić chip glikolowy w komorze inkubacyjnej. Inkubować go z jednym mililitrem buforu trzeciego, aby wyeliminować wszelkie pozostałości materiału na powierzchni chipa glikolowego. Przez 15 minut, w temperaturze 25 stopni Celsjusza.
Przytrzymaj wiór glikolowy w pozycji pionowej i przemyj go kilkoma kroplami buforu trzeciego za pomocą plastikowej pipety Pasteura. Następnie ostrożnie usuń bufor z powierzchni wióra glikolowego za pomocą bibuły filtracyjnej. Umieść chip glikolowy z powrotem w komorze inkubacyjnej.
Rozprowadzić rozcieńczoną próbkę surowicy na powierzchni wióra glikolowego za pomocą mikropipety. Upewnij się, że wszystkie suche obszary powierzchni wióra glikolowego są pokryte rozcieńczoną próbką surowicy za pomocą końcówki pipety. Inkubować z mieszaniem orbitalnym w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 1 1/2 godziny.
Po inkubacji usunąć nadmiar próbki i zanurzyć chip glikolowy na pięć minut w buforze trzecim w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Przełóż chip glikolowy do pojemnika z buforem czwartym, a na koniec umyj wiór glikolowy ultra czystą wodą. Odwiruj wiór glikolowy przez jedną minutę w temperaturze 175 razy G i 25 stopni Celsjusza, aby usunąć płyn.
Po umieszczeniu chipa glikolowego z powrotem w komorze inkubacyjnej, rozprowadź roztwór koziego anty-mysiego sprzężonego z biotyną na powierzchni chipa glikolowego. Inkubować z mieszaniem orbitalnym w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Usuń frakcję niezwiązaną i powtórz etapy mycia.
Po odwirowaniu inkubować chip glikolowy w ciemności w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 45 minut z dwoma mikrogramami na mililitr odpowiedniego roztworu streptawidyny znakowanego fluorochromem w buforze drugim. Po pracy w ciemności w celu usunięcia niezwiązanej frakcji i powtórzeniu kroków mycia, wysuszyć wiór glikolowy powietrzem. Aby zeskanować matrycę, pozostaw chip glikolowy na stole, aż osiągnie temperaturę pokojową w ciemności.
W tym samym czasie włącz skaner slajdów i laser. Trzymając mikromatrycę, wsuń chip glikolowy do szczeliny, aż dotknie tyłu. Zeskanuj chip glikolowy, uruchamiając program EasyScan i zapisz skan jako plik tif.
Określ ilościowo tablicę za pomocą systemu analitycznego ScanArray. Otwórz wcześniej zeskanowane obrazy, klikając plik w grupie konfiguracji i plików w oknie głównym. Załaduj odpowiedni szablon pliku tablicy w formacie GAL, który reprezentuje rozmieszczenie wydrukowanych glikanów na szkiełku podstawowym.
Dostosuj szablon GAL, ostrożnie wyrównując tablicę z plamkami na obrazie i rozpocznij kwantyfikację. Wybierz obwody kwantyfikacji jako typ kwantyfikacji, uruchom łatwą metodę kwantyfikacji i metodę kwantyfikacji, stały okrąg. Odznacz wszystkie opcje automatycznego wyszukiwania miejsc i wybierz lowess jako metodę normalizacji.
Zapisz dane ilościowe jako plik csv. Przenieś te dane do zwykłego pliku arkusza kalkulacyjnego za pomocą programu Microsoft Excel lub innej odpowiedniej aplikacji. Genetycznie identyczne myszy nie powinny być uważane za równoważniki immunologiczne, ponieważ rozwinęły one różne wzorce naturalnych przeciwciał antywęglowodanowych.
Jak pokazano tutaj, zachowano tylko 12 specyficznych glikanów. Pokazany tutaj jest reprezentatywny przykład obrazów uzyskanych ze skanowania mikroprocesorów za pomocą skanera fluorescencyjnego. Siatka jest następnie wyrównywana do punktów w każdej pojedynczej tablicy podrzędnej.
Fluorescencyjny jest wykrywany dla każdego miejsca, a wyniki są przesyłane do wspólnego pliku arkusza kalkulacyjnego. Po inkubacji z mysią surowicą, chipy glikologiczne zostały zeskanowane za pomocą czytnika scan array. Dane analizowano za pomocą systemu analizy mikromacierzy, a wyniki wyrażono w RFU jako mediana plus minus mediana odchylenia bezwzględnego.
Kolory niebieski i biały reprezentują sygnały wiązania tła o wartości mniejszej niż 4000 RFU. Kolor czerwony reprezentuje dodatnie sygnały wiązania większe lub równe 4000 RFU. Większość struktur glikanowych odsłoniętych w chipach glikolowych nie została rozpoznana przez repertuar krążących przeciwciał antyglikanowych myszy balp C.
Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w pięć godzin i 45 minut, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać technologii matrycy glikonowej do drukarki do badania repertuaru i poziomów krążących przeciwciał antywęglowodanowych w próbkach surowicy. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że chip glikotechniczny musi być manipulowany przez dolną część światła okularów.
Gdzie znajduje się kod kreskowy. Tak, aby uniknąć kontaktu z wydrukowanymi glikanami. Upewnij się również, że cały suchy obszar wióra glikologicznego jest pokryty rozcieńczoną próbką surowicy za pomocą końcówki pipety.
Objętość potrzebna do całkowitego pokrycia pojedynczej powierzchni wióra glikologicznego wynosi około jednego mililitra. Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak układ zawiesiny na podstawie mikrosfery, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania związane z elastycznym wykrywaniem multipleksowym profilu przeciwciał antyglikanowych. Po wprowadzeniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się molekułami biomacralnymi i immunologią do zbadania interakcji glikolu niebiałkowego w grupie małych zwierząt.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Niniejsza praca pokazuje potencjał technologii macierzy glikanów drukowanych (PGA) do analizy krążących przeciwciał przeciwko węglowodanom u małych zwierząt. To podejście umożliwia pomiar wysokiej czułości wielu celów glikanowych przy użyciu minimalnej objętości próbki.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Nauki o mózgu
- Immunologia
- Biotechnologia
Tło
- Krążące przeciwciała przeciwko glikanom odgrywają znaczącą rolę w różnych schorzeniach.
- Wczesna diagnoza i odpowiednie leczenie mogą być ułatwione dzięki zrozumieniu tych przeciwciał.
- Technologia macierzy glikanów drukowanych umożliwia jednoczesną analizę licznych struktur glikanowych.
- Ta metoda jest szczególnie przydatna w modelach małych zwierząt.
Cel badania
- Analiza profilu krążących przeciwciał przeciwko glikanom u małych zwierząt.
- Eksploracja potencjału technologii PGA w diagnozowaniu schorzeń związanych z przeciwciałami glikanowymi.
- Wykażanie czułości i wydajności tej metody w środowisku badawczym.
Wykorzystane metody
- Wykorzystanie bezkontaktowego robotycznego aplikatora do przygotowania macierzy.
- Druk sześciu powtórzeń glikanów i polisacharydów na szklanych slajdach.
- Użycie buforu PBS w celu uzyskania optymalnych warunków podczas odczynu.
- Analiza odpowiedzi przeciwciał za pomocą drukowanej macierzy glikanów.
Główne wyniki
- Wykażono wysoką czułość w pomiarze przeciwciał ukierunkowanych na glikany.
- Wykazano zdolność jednoczesnej analizy setek celów glikanowych.
- Dostarczono wgląd w profile przeciwciał w surowatce małych zwierząt.
- Podkreślono zalety technologii PGA w badaniach immunologicznych.
Wnioski
- Technologia PGA jest obiecującym narzędziem do badania przeciwciał przeciwko glikanom.
- Ta metoda może pomóc we wczesnej diagnozie chorób związanych ze strukturami glikanowymi.
- Dalsze badania mogą rozszerzyć jej zastosowanie w różnych dziedzinach biomedycznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Printed glycan array (PGA) technology enables high-sensitivity profiling of circulating anti-carbohydrate antibodies from minimal serum volumes, addressing a critical constraint in small animal model studies. This capability supports early biomarker discovery and mechanistic de-risking in immunology and infectious disease research by linking glycan-specific antibody repertoires to pathological conditions. The method enhances predictive confidence in target validation by providing quantitative, reproducible readouts of humoral immune responses against diverse glycan structures.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping natural anti-glycan antibody repertoires in genetically identical models, revealing individual immunological variation.
- Operational Value: Supports biological de-risking through high-sensitivity detection of hundreds of glycan targets using minimal sample input, conserving precious preclinical specimens.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by identifying conserved and variable glycan specificities that may correlate with disease susceptibility or resistance.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized, reproducible fluorescent signals (RFU) normalized via Lowess method, enabling reliable comparison across samples and experimental conditions.
- Scalability: Each slide contains four blocks of subarrays with six replicates, allowing high-throughput screening of glycan-specific antibody binding patterns.
- Workflow Integration: Outputs quantified data in CSV format compatible with spreadsheet analysis, streamlining downstream data handling in discovery pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Links circulating anti-glycan antibody profiles to immunological status, offering a potential biomarker pathway for early detection of pathological conditions in small animal models.
- Translational Continuity: Supports risk-adjusted advancement decisions by correlating glycan antibody repertoires with disease onset and progression, as noted in the study’s implications for human disease modeling.
- Mechanistic De-risking: Reduces ambiguity in immune mechanism studies by providing direct, glycan-specific antibody binding data rather than inferring function from protein-centric assays.
Pipeline & Workflow Integration
PGA technology fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis generation in immunology before lead identification, with outputs informing preclinical validation through biomarker-aligned immune profiling.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by revealing individual-specific anti-glycan antibody patterns in isogenic models, highlighting limitations of assuming immunological equivalence.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized slide preparation, blocking, and incubation steps that ensure consistent glycan presentation and antibody detection.
- Analytics: Generates quantitative RFU measurements with median absolute deviation, enabling statistical comparison of antibody binding across glycan targets and samples.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by identifying glycan biomarkers that may reflect disease state, supporting extrapolation to human immunology studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for immunoprofiling, where validated glycan panels can be applied across multiple disease models and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in humoral immune responses to carbohydrates.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through replicate printing, normalized quantification, and defined signal thresholds (e.g., 4000 RFU for positive binding).
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of immunological biomarkers, reducing late-stage failure risk due to unanticipated immune mechanisms.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying glycan-specific antibody signatures that may indicate differential disease progression or treatment response.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microarray handling, fluorescence detection, and data normalization using tools like ScanArray and EasyQuant.
- Depends on non-contact robotic arrayers, fluorescence scanners, and buffer preparation infrastructure for glycan printing and assay execution.
- Necessitates cross-team standardization of sample dilution, incubation conditions, and washing protocols to minimize variability in antibody binding readings.
- Involves adaptation considerations when extending to different species or sample types, particularly regarding serum dilution factors and blocking efficiency.
- Includes practical limitations such as the need to avoid contact with printed glycan spots during handling and ensuring complete surface coverage of samples during incubation.
