Drukowana matryca glikanów: czuła technika analizy repertuaru krążących przeciwciał antywęglowodanowych u małych zwierząt
14 lutego 2019
Ta praca pokazuje potencjał technologii drukowanych tablic glikanowych (PGA) do analizy krążących przeciwciał antywęglowodanowych u małych zwierząt.
Ogólnym celem tego protokołu jest zbadanie profilu krążących przeciwciał antyglikanowych w surowicy małych zwierząt przy użyciu technologii opartej na drukowanej macierzy glikanów. Takie podejście ma potencjał we wczesnej diagnozie i właściwym leczeniu niektórych stanów patologicznych, w których przeciwciała przeciwko strukturom glikanowym odgrywają ważną rolę. Główną zaletą tej techniki jest możliwość pomiaru w tych samych warunkach eksperymentalnych setek celów glikanowych z bardzo wysoką czułością przy użyciu minimalnej ilości próbki.
Do przygotowania mikromacierzy należy użyć bezkontaktowej macierzy robotycznej. Drukuje sześć powtórzeń 50 milimolowych glikanów i 10 mikrogramów na mililitr polisacharydów oraz 300 milimolowych PBS, pH 8,5 na szkiełkach z derywatyzowanego szkła cynamonowego n-hydroksy6. Każdy slajd zawiera cztery różne bloki podtablic powtórzone sześć razy.
Każda pojedyncza podtablica składa się ze 112 różnych plamek glikanów, w tym kontrolnych. Inkubować szkiełka w wilgotnym pojemniku w temperaturze pokojowej przez godzinę. Aby zablokować mikromacierze, inkubuj szkiełka przez 1 1/2 godziny z buforem blokującym w temperaturze pokojowej.
Następnie umyj wiór glikolowy ultra czystą wodą i wysusz go powietrzem. Przygotuj bufor od pierwszego do czwartego zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby przygotować wióry i próbki glikolu, połóż pudełko do przechowywania ze szkiełkami na stole, aż osiągną temperaturę pokojową.
Otwórz pudełko i przenieś wiór glikolowy do komory inkubacyjnej, która powinna być już kondycjonowana mokrą bibułą filtracyjną, aby utrzymać stałą wilgotność wewnątrz komory. W międzyczasie rozcieńczyć surowicę myszy buforem jeden na 1,5 mililitra probówki. Homogenizować roztwór surowicy przez pięć sekund za pomocą mieszalnika wirowego.
Po homogenizacji inkubować rozcieńczoną surowicę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut w łaźni wodnej, aby uniknąć agregacji immunoglobulin. Następnie odwiruj probówki przez trzy minuty w temperaturze 10 000 razy G i 25 stopni Celsjusza. Zebrać sklarowany nad osadem i wyrzucić wstrząśnięty materiał.
Ostrożnie umieścić chip glikolowy w komorze inkubacyjnej. Inkubować go z jednym mililitrem buforu trzeciego, aby wyeliminować wszelkie pozostałości materiału na powierzchni chipa glikolowego. Przez 15 minut, w temperaturze 25 stopni Celsjusza.
Przytrzymaj wiór glikolowy w pozycji pionowej i przemyj go kilkoma kroplami buforu trzeciego za pomocą plastikowej pipety Pasteura. Następnie ostrożnie usuń bufor z powierzchni wióra glikolowego za pomocą bibuły filtracyjnej. Umieść chip glikolowy z powrotem w komorze inkubacyjnej.
Rozprowadzić rozcieńczoną próbkę surowicy na powierzchni wióra glikolowego za pomocą mikropipety. Upewnij się, że wszystkie suche obszary powierzchni wióra glikolowego są pokryte rozcieńczoną próbką surowicy za pomocą końcówki pipety. Inkubować z mieszaniem orbitalnym w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 1 1/2 godziny.
Po inkubacji usunąć nadmiar próbki i zanurzyć chip glikolowy na pięć minut w buforze trzecim w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Przełóż chip glikolowy do pojemnika z buforem czwartym, a na koniec umyj wiór glikolowy ultra czystą wodą. Odwiruj wiór glikolowy przez jedną minutę w temperaturze 175 razy G i 25 stopni Celsjusza, aby usunąć płyn.
Po umieszczeniu chipa glikolowego z powrotem w komorze inkubacyjnej, rozprowadź roztwór koziego anty-mysiego sprzężonego z biotyną na powierzchni chipa glikolowego. Inkubować z mieszaniem orbitalnym w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Usuń frakcję niezwiązaną i powtórz etapy mycia.
Po odwirowaniu inkubować chip glikolowy w ciemności w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 45 minut z dwoma mikrogramami na mililitr odpowiedniego roztworu streptawidyny znakowanego fluorochromem w buforze drugim. Po pracy w ciemności w celu usunięcia niezwiązanej frakcji i powtórzeniu kroków mycia, wysuszyć wiór glikolowy powietrzem. Aby zeskanować matrycę, pozostaw chip glikolowy na stole, aż osiągnie temperaturę pokojową w ciemności.
W tym samym czasie włącz skaner slajdów i laser. Trzymając mikromatrycę, wsuń chip glikolowy do szczeliny, aż dotknie tyłu. Zeskanuj chip glikolowy, uruchamiając program EasyScan i zapisz skan jako plik tif.
Określ ilościowo tablicę za pomocą systemu analitycznego ScanArray. Otwórz wcześniej zeskanowane obrazy, klikając plik w grupie konfiguracji i plików w oknie głównym. Załaduj odpowiedni szablon pliku tablicy w formacie GAL, który reprezentuje rozmieszczenie wydrukowanych glikanów na szkiełku podstawowym.
Dostosuj szablon GAL, ostrożnie wyrównując tablicę z plamkami na obrazie i rozpocznij kwantyfikację. Wybierz obwody kwantyfikacji jako typ kwantyfikacji, uruchom łatwą metodę kwantyfikacji i metodę kwantyfikacji, stały okrąg. Odznacz wszystkie opcje automatycznego wyszukiwania miejsc i wybierz lowess jako metodę normalizacji.
Zapisz dane ilościowe jako plik csv. Przenieś te dane do zwykłego pliku arkusza kalkulacyjnego za pomocą programu Microsoft Excel lub innej odpowiedniej aplikacji. Genetycznie identyczne myszy nie powinny być uważane za równoważniki immunologiczne, ponieważ rozwinęły one różne wzorce naturalnych przeciwciał antywęglowodanowych.
Jak pokazano tutaj, zachowano tylko 12 specyficznych glikanów. Pokazany tutaj jest reprezentatywny przykład obrazów uzyskanych ze skanowania mikroprocesorów za pomocą skanera fluorescencyjnego. Siatka jest następnie wyrównywana do punktów w każdej pojedynczej tablicy podrzędnej.
Fluorescencyjny jest wykrywany dla każdego miejsca, a wyniki są przesyłane do wspólnego pliku arkusza kalkulacyjnego. Po inkubacji z mysią surowicą, chipy glikologiczne zostały zeskanowane za pomocą czytnika scan array. Dane analizowano za pomocą systemu analizy mikromacierzy, a wyniki wyrażono w RFU jako mediana plus minus mediana odchylenia bezwzględnego.
Kolory niebieski i biały reprezentują sygnały wiązania tła o wartości mniejszej niż 4000 RFU. Kolor czerwony reprezentuje dodatnie sygnały wiązania większe lub równe 4000 RFU. Większość struktur glikanowych odsłoniętych w chipach glikolowych nie została rozpoznana przez repertuar krążących przeciwciał antyglikanowych myszy balp C.
Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w pięć godzin i 45 minut, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać technologii matrycy glikonowej do drukarki do badania repertuaru i poziomów krążących przeciwciał antywęglowodanowych w próbkach surowicy. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że chip glikotechniczny musi być manipulowany przez dolną część światła okularów.
Gdzie znajduje się kod kreskowy. Tak, aby uniknąć kontaktu z wydrukowanymi glikanami. Upewnij się również, że cały suchy obszar wióra glikologicznego jest pokryty rozcieńczoną próbką surowicy za pomocą końcówki pipety.
Objętość potrzebna do całkowitego pokrycia pojedynczej powierzchni wióra glikologicznego wynosi około jednego mililitra. Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak układ zawiesiny na podstawie mikrosfery, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania związane z elastycznym wykrywaniem multipleksowym profilu przeciwciał antyglikanowych. Po wprowadzeniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się molekułami biomacralnymi i immunologią do zbadania interakcji glikolu niebiałkowego w grupie małych zwierząt.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsza praca wykazuje potencjał technologii drukowanych macierzy glikanowych (PGA) w analizie krążących przeciwciał przeciwko węglowodanom u małych zwierząt. Podejście to umożliwia wysokoczuły pomiar wielu docelowych glikanów przy użyciu minimalnej objętości próbki.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Immunologia
- Biotechnologia
Wstęp
- Krążące przeciwciała przeciwko glikanom odgrywają istotną rolę w różnych stanach patologicznych.
- Zrozumienie natury tych przeciwciał może ułatwić wczesną diagnostykę i zastosowanie odpowiedniego leczenia.
- Technologia drukowanych macierzy glikanowych pozwala na jednoczesną analizę licznych struktur glikanowych.
- Metoda ta jest szczególnie użyteczna w modelach małych zwierząt.
Cel badania
- Analiza profilu krążących przeciwciał przeciwglikanowych u małych zwierząt.
- Badanie potencjału technologii PGA w diagnostyce schorzeń związanych z przeciwciałami przeciwglikanowymi.
- Wykazanie czułości i wydajności tej metody w warunkach badawczych.
Zastosowane metody
- Wykorzystanie bezkontaktowego robotycznego arrayera do przygotowania macierzy mikroarray.
- Nanoszenie sześciu powtórzeń glikanów i polisacharydów na szkiełka przedmiotowe.
- Zastosowanie buforu PBS w celu zapewnienia optymalnych warunków podczas analizy.
- Analiza odpowiedzi przeciwciał z wykorzystaniem przygotowanej macierzy glikanowej.
Główne wyniki
- Wykazano wysoką czułość w pomiarze przeciwciał ukierunkowanych na glikany.
- Kierunkowo udowodniono możliwość jednoczesnej analizy setek celów glikanowych.
- Uzyskano wgląd w profile przeciwciał w surowicy małych zwierząt.
- Podkreślono zalety technologii PGA w badaniach immunologicznych.
Wnioski
- Technologia PGA jest obiecującym narzędziem do badania przeciwciał antyglikanowych.
- Metoda ta może pomóc w wczesnej diagnostyce chorób związanych ze strukturami glikanów.
- Dalsze badania mogą rozszerzyć zakres jej zastosowań w różnych dziedzinach biomedycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Technologia drukowanych macierzy glikanowych (PGA) umożliwia wysokoczułe profilowanie krążących przeciwciał przeciwcukrowych z minimalnych objętości surowicy, co rozwiązuje krytyczny problem ograniczeń w badaniach na małych modelach zwierzęcych. Możliwość ta wspiera wczesne odkrywanie biomarkerów oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego w badaniach nad immunologią i chorobami zakaźnymi poprzez powiązanie repertoarów przeciwciał specyficznych dla glikanów ze stanami patologicznymi. Metoda ta zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celów terapeutycznych, dostarczając ilościowych i powtarzalnych odczytów humoralnych odpowiedzi immunologicznych przeciwko różnorodnym strukturom glikanów.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez mapowanie naturalnych repertuarów przeciwciał antyglikanowych w genetycznie identycznych modelach, co pozwala ujawnić indywidualną zmienność immunologiczną.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego dzięki wysokoczułemu wykrywaniu setek celów glikanowych przy minimalnym zużyciu materiału, co pozwala na oszczędność cennych próbek przedklinicznych.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia selekcję projektów w portfolio poprzez identyfikację konserwatywnych i zmiennych specyficzności glikanowych, które mogą korelować z podatnością na chorobę lub odpornością na nią.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Generuje zestandaryzowane, powtarzalne sygnały fluorescencyjne (RFU) znormalizowane metodą Lowess, co umożliwia wiarygodne porównywanie próbek oraz warunków eksperymentalnych.
- Skalowalność: Każdy slajd zawiera cztery bloki podmacierzy z sześcioma powtórzeniami, co pozwala na wysokoprzepustowe badanie wzorców wiązania przeciwciał specyficznych dla glikanów.
- Integracja z procesem pracy: Wyniki w postaci danych ilościowych są eksportowane do formatu CSV kompatybilnego z analizą w arkuszach kalkulacyjnych, co usprawnia późniejszą obsługę danych w potokach badawczych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Łączy profile krążących przeciwciał przeciwglikanowych ze stanem immunologicznym, oferując potencjalną ścieżkę biomarkerową do wczesnego wykrywania stanów patologicznych w modelach małych zwierząt.
- Ciągłość translacyjna: Wspiera decyzje o postępie skorygowane o ryzyko poprzez korelację repertuarów przeciwciał przeciwglikanowych z początkiem i progresją choroby, co zaznaczono w implikacjach badania dla modelowania chorób ludzkich.
- Mechanistyczna redukcja ryzyka: Zmniejsza niejednoznaczność w badaniach nad mechanizmami odpornościowymi, dostarczając bezpośrednich danych o wiązaniu przeciwciał specyficznych dla glikanów, zamiast wnioskować o funkcji na podstawie testów skoncentrowanych na białkach.
Integracja potoku i przepływu pracy
Technologia PGA wpisuje się w początkowy etap procesu odkrywania leków, wspierając formułowanie hipotez w immunologii przed identyfikacją związku wiodącego, a jej wyniki stanowią podstawę walidacji przedklinicznej poprzez profilowanie immunologiczne zgodne z biomarkerami.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez ujawnianie specyficznych dla osobników wzorców przeciwciał antyglikanowych w modelach izogenicznych, wskazując na ograniczenia wynikające z założenia równoważności immunologicznej.
- Screening: Zapewnia gotowość do analizy dzięki standaryzacji etapów przygotowania preparatów, blokowania i inkubacji, co gwarantuje spójną prezentację glikanów i detekcję przeciwciał.
- Analityka: Generuje ilościowe pomiary RFU z medianą odchylenia bezwzględnego, umożliwiając statystyczne porównanie wiązania przeciwciał w odniesieniu do różnych celów glikanowych i próbek.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez identyfikację biomarkerów glikanowych, które mogą odzwierciedlać stan choroby, co wspiera ekstrapolację do badań nad immunologią człowieka.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę do wielokrotnego wykorzystania w immunoprofilowaniu, w której zwalidowane panele glikanowe mogą być stosowane w wielu modelach chorób i obszarach terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez ograniczenie niejednoznaczności mechanistycznej w humoralnych odpowiedziach immunologicznych na węglowodany.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność dzięki drukowaniu w powtórzeniach, znormalizowanej kwantyfikacji i zdefiniowanym progom sygnału (np. 4000 RFU dla wiązania pozytywnego).
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez umożliwienie wczesnego wykrywania biomarkerów immunologicznych, co zmniejsza ryzyko niepowodzenia na późnych etapach z powodu nieprzewidzianych mechanizmów odpornościowych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez identyfikację sygnatur przeciwciał specyficznych dla glikanów, które mogą wskazywać na zróżnicowany przebieg choroby lub odpowiedź na leczenie.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej w zakresie obsługi mikromacierzy, detekcji fluorescencji oraz normalizacji danych przy użyciu narzędzi takich jak ScanArray i EasyQuant.
- Zależy od bezdotykowych robotycznych systemów do nanoszenia macierzy, skanerów fluorescencyjnych oraz infrastruktury do przygotowywania buforów niezbędnych do drukowania glikanów i przeprowadzania analiz.
- Wymaga standaryzacji rozcieńczania próbek, warunków inkubacji oraz protokołów płukania pomiędzy zespołami w celu zminimalizowania zmienności odczytów wiązania przeciwciał.
- Wiąże się z koniecznością uwzględnienia adaptacji przy rozszerzaniu metody na inne gatunki lub rodzaje próbek, w szczególności w odniesieniu do czynników rozcieńczenia surowicy i wydajności blokowania.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak konieczność unikania kontaktu z wydrukowanymi punktami glikanów podczas obsługi oraz zapewnienie pełnego pokrycia powierzchni przez próbki podczas inkubacji.
