Name: Drukowana matryca glikanów: czuła technika analizy repertuaru krążących przeciwciał antywęglowodanowych u małych zwierząt (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Poznaj technologię drukowanej matrycy glikanów do analizy przeciwciał antywęglowodanowych w surowicy małych zwierząt. Ta metoda umożliwia jednoczesne badanie setek celów glikanowych z wysoką czułością przy minimalnej ilości próbki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant "Fondo de Investigaciones Sanitarias" (FIS) PI13/01098 od Instytutu Zdrowia Carlosa III, hiszpańskiego Ministerstwa Zdrowia. DB-G skorzystała ze stanowiska badawczego po doktoracie finansowanego przez Unię Europejską Siódmy Program Ramowy (7PR/2007-2013) w ramach umowy o grant 603049 (TRANSLINK). Prace NK, NS i NB były wspierane przez grant #14-50-00131 Rosyjskiej Fundacji Naukowej. DB-G pragnie wyrazić wdzięczność Marcie Broto, J. Pablo Salvadorowi i Anie Sanchis za doskonałą pomoc techniczną oraz Alexandrowi Rakitko za pomoc w analizie statystycznej. Dzięki wsparciu "Pla de Doctorats Industrials de la Secretaria d'Universitats i Recerca del Department d'Empresa i Coneixement de la Generalitat de Catalunya (grant nr 2018 DI 021). Dziękujemy Programowi CERCA / Generalitat de Catalunya za wsparcie instytucjonalne.

1. Produkcja glikochipów
<ol>
	<li>Przygotowanie mikromacierzy
	<ol>
		<li>Wydrukować glikany (50 mM) i polisacharydy (10 μg/ml) w 300 mM soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS, pH 8,5) w 6 powtórzeniach na szkiełkach szklanych derywatyzowanych N-hydroksysukcynimidem, używając bezkontaktowej matrycy robotycznej (objętość kropli ~ 900 pL). Każdy slajd zawiera 4 różne bloki podtablic (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A, w kolorach) powtórzone 6 razy. Każda pojedyncza podtablica składa się ze 112 różnych plamek glikanów, w tym kontrolek (8 rzędów × 14 kolumn) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B). 
		UWAGA: Informacje dotyczące glikanów znajdują się w Tabeli Uzupełniającej 1. Biblioteka glikanów używana do drukowania mikrochipów jest wynikiem długotrwałego wysiłku syntetycznego zespołu IBCh; Przykłady syntezy opisano w powiązanych publikacjach29,30,31,32,33,34,35,36,37,38. Biblioteka glikanów zawierała antygeny grup krwi i niektóre z najczęściej występujących końcowych oligosacharydów, a także podstawowe motywy ssaków N i O sprzężonych z N i O, glikolipidów, antygeny węglowodanowe związane z nowotworem i polisacharydy z bakterii chorobotwórczych.</li>
		<li>Inkubować szkiełka w pomieszczeniu wilgotnościowym (wilgotność względna ~ 70%) w temperaturze pokojowej (25 °C) przez 1 godzinę.</li>
		<li>Mikromacierze blokujące: inkubować szkiełka przez 1,5 godziny z buforem blokującym w temperaturze pokojowej (100 mM kwas borowy, 25 mM etanoloamina, 0,2% (v/v) Tween-20 w ultraczystej wodzie).</li>
		<li>Umyj glikochip ultraczystą wodą i wysusz go powietrzem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kontrola jakości glikochipów
	<ol>
		<li>Przeanalizować dwie mikromacierze z każdej partii, używając 1 mg/ml roztworu złożonego preparatu immunoglobulin (, zawierającego IgG, IgM i IgA), 10 μg/ml roztworu biotynylowanych kozich immunoglobulin ludzkich jako przeciwciała drugorzędowego (IgM + IgG + IgA), a następnie 1 μg/ml roztworu odpowiedniego fluorescencyjnego koniugatu streptawidyny (za pomocą protokołu opisanego poniżej, patrz krok 2).</li>
		<li>Zeskanuj i przeanalizuj glikochipy (patrz krok 3, analiza macierzy glikanów).</li>
		<li>Używaj partii mikromacierzy z korelacją wewnątrz- i międzychipową wyższą niż 0,9.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Technika Glycan Array
<ol>
	<li>Przygotować następujące roztwory wodne (w wodzie ultraczystej) i przechowywać je w temperaturze pokojowej (25 °C):
	<ul>
		<li>Bufor 1: 1% (w/v) albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w PBS, 1% (v/v) Tween-20 i 0,01% (w/v) NaN3</li>
		<li>Bufor 2: 1% (w/v) BSA w PBS, 0,1% (v/v) Tween-20 i 0,01% (w/v) NaN3.</li>
		<li>Bufor 3: 0,1% (v/v) Tween-20 w PBS.</li>
		<li>Bufor 4: 0,001% (v/v) Tween-20 w PBS.</li>
	</ul>
	</li>
	<li>Przygotowanie glikochipa i próbki
	<ol>
		<li>Umieść schowek ze szkiełkami na stole, aż osiągną temperaturę pokojową (25 °C). 
		UWAGA: Używaj bezpudrowych rękawiczek lateksowych. Glikochipem należy manipulować za pomocą dolnej części szkiełka podstawowego, w której znajduje się kod kreskowy. Kod kreskowy pomoże Ci zidentyfikować prawą stronę, unikając kontaktu z powierzchnią, na której drukowane są glikany.</li>
		<li>Otwórz pudełko, weź glikochip i umieść go w komorze inkubacyjnej (25 °C), już kondycjonowanej mokrą bibułą filtracyjną w celu utrzymania stałej wilgotności wewnątrz komory.</li>
		<li>W międzyczasie rozcieńczyć surowicę myszy Buffer-1 (1:20) w probówkach o pojemności 1,5 ml. Homogenizować roztwór surowicy (5 s) za pomocą mieszalnika wirowego. 
		UWAGA: Objętość potrzebna do całkowitego pokrycia pojedynczej powierzchni glikochipa wynosi około 1 ml.</li>
		<li>Po homogenizacji inkubować rozcieńczoną surowicę w temperaturze 37 °C przez 10 minut w łaźni wodnej, aby uniknąć agregacji immunoglobulin. Odwirować probówki przez 3 minuty w temperaturze 10 000 x g i temperaturze 25 °C, zebrać supernatant i wyrzucić wstrząśnięty materiał.</li>
		<li>Ostrożnie umieścić glikochip w komorze inkubacyjnej. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 25 °C z 1 ml buforu-3 w celu usunięcia wszelkich pozostałości materiału na powierzchni glikochipa.</li>
		<li>Trzymaj glikochip w pozycji pionowej i przemyj go kilkoma kroplami Buffer-3 za pomocą plastikowej pipety Pasteura. Ostrożnie usunąć bufor z powierzchni glikochipa za pomocą bibuły filtracyjnej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Reakcja: wiązanie przeciwciał
	<ol>
		<li>Umieścić glikochip w komorze inkubacyjnej. Rozprowadzić rozcieńczoną próbkę surowicy na powierzchni glikochipa za pomocą mikropipety. Inkubować z mieszaniem orbitalnym (30 obr./min) w temperaturze 37 °C przez 1,5 godziny. Upewnij się, że cały suchy obszar powierzchni glikochipa jest pokryty rozcieńczoną próbką surowicy za pomocą końcówki pipety.</li>
		<li>Usunąć nadmiar próbki i zanurzyć glikochip na 5 minut w buforze 3 w temperaturze 25 °C. Następnie przenieś glikochip do pojemnika z buforem-4 (5 min) i na koniec umyj (5 min) glikochip ultraczystą wodą. Odwirować glikochip przez 1 minutę w temperaturze 175 x g i temperaturze 25 °C w celu usunięcia cieczy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykrywanie: przeciwciało wtórne
	<ol>
		<li>Umieścić glikochip w komorze inkubacyjnej. Rozprowadzić na powierzchni glikochipa roztwór (5 μg/ml) koziego anty-mysiego (IgG + IgM) sprzężonego z biotyną w buforze 2. Inkubować z mieszaniem orbitalnym (30 obr./min) w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.</li>
		<li>Usuń frakcję niezwiązaną i powtórz etapy mycia.</li>
		<li>Po odwirowaniu inkubować glikochip w ciemności w temperaturze 25 °C przez 45 minut (30 obr./min) z 2 μg/ml odpowiedniego roztworu streptawidyny znakowanego fluorochromem (w buforze 2).</li>
		<li>W ciemności usuń niezwiązaną frakcję i powtórz etapy mycia.</li>
		<li>Wysuszyć glikochip powietrzem. 
		Uwaga: Glycochip należy zeskanować tak szybko, jak to możliwe. Ale jeśli nie można wykonać skanowania natychmiast po barwieniu, glikochipy można przechowywać w chłodnym i suchym miejscu w ciemności.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Analiza tablicy glikanów
<ol>
	<li>Skanowanie macierzy
	<ol>
		<li>Pozostaw glikochip na stole, aż osiągnie temperaturę pokojową w ciemności. W tym samym czasie włącz skaner slajdów i laser (długość fali wzbudzenia 633 nm).</li>
		<li>Trzymając mikromatrycę, wsuń glikochip do szczeliny, aż dotknie tyłu.</li>
		<li>Zeskanuj glikochip ("uruchom łatwe skanowanie") i zapisz skan jako ". TIFF".</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kwantyfikacja tablicowa
	<ol>
		<li>Określ ilościowo tablicę za pomocą systemu analizy ScanArray. Otwórz wcześniej zeskanowane obrazy, klikając "Plik" w grupie "Konfiguracja i plik" w oknie głównym (Rysunek 1B-D)</li>
		<li>Załaduj odpowiedni szablon pliku tablicy w formacie GAL (rozmieszczenie wydrukowanych glikanów na szkiełku podstawowym) (Rysunek 1C).</li>
		<li>Dostosuj szablon GAL, ostrożnie wyrównując tablicę (siatki) z plamami na obrazie i rozpocznij kwantyfikację (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 1D).</li>
		<li>Wybierz parametry kwantyfikacji:
		<ul>
			<li>Typ kwantyfikacji: Uruchom Easy Quant.</li>
			<li>Metoda kwantyfikacji: Fixed Circle</li>
			<li>Automatyczne wyszukiwanie miejsc: odznacz wszystkie opcje</li>
			<li>Metoda normalizacji: LOWESS (Locally Weighted Scatter Plot Smoothing).</li>
		</ul>
		</li>
		<li>Zapisz dane ilościowe jako ". CSV" (Rysunek 1D). Przenieś te dane do zwykłego pliku arkusza kalkulacyjnego za pomocą programu Microsoft Excel lub innej odpowiedniej aplikacji.</li>
		<li>Jako główną metodę statystyczną należy zastosować przedział międzykwartylowy (IQR): obliczenie mediany (kwartyl 2) wszystkich sygnałów dla każdego liganda oraz odchylenie międzykwartylowe (odpowiednio 75. i 25. percentyl lub górny i dolny kwartyl Q3 i Q1).</li>
		<li>Przeprowadzanie interakcyjnej eksploracji danych przy użyciu aplikacji Eksplorator klastrów hierarchicznych.</li>
		<li>Użyj parametrów grupowania: Średnie powiązanie (UPGMA) i Odległość euklidesowa jako miara odległości podobieństwa. Wykonywanie hierarchicznego grupowania według wierszy bez normalizacji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Karlsson, G. B., Fouchier, R. A., Phogat, S., Burton, D. R., Sodroski, J., Wyatt, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+challenges+of+eliciting+neutralizing+antibodies+to+HIV-1+and+to+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The challenges of eliciting neutralizing antibodies to HIV-1 and to influenza virus.</a> Nat Rev Microbiol. 6 (2), 143-155 (2008).</li>
<li>Lu, L. L., Suscovich, T. J., Fortune, S. M., Alter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+binding%3A+antibody+effector+functions+in+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Beyond binding: antibody effector functions in infectious diseases.</a> Nat Rev Immunol. 18 (1), 46-61 (2017).</li>
<li>Bebbington, C., Yarranton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+for+the+treatment+of+bacterial+infections%3A+current+experience+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotech%22%5BJournal%5D)">Antibodies for the treatment of bacterial infections: current experience and future prospects.</a> Curr Opin Biotech. 19 (6), 613-619 (2008).</li>
<li>Murphy, K., Travers, P., Walport, M. The complement system and innate immunity. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMurphy%2C+K+%22Janeway%27s+Immunobiology%22">Janeway's Immunobiology</a>. , 7th, Garland Science. New York. 61-80 (2008).</li>
<li>Botto, M., Kirschfink, M., Macor, P., Pickering, M. C., Wurzner, R., Tedesco, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+in+human+diseases%3A+lessons+from+complement+deficiencies%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Complement in human diseases: lessons from complement deficiencies.</a> Mol Immunol. 46 (14), 2774-2783 (2009).</li>
<li>Borrok, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+antibody-dependent+cell-mediated+cytotoxicity+by+endowing+IgG+with+Fc%CE%B1RI+%28CD89%29+binding%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">Enhancement of antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity by endowing IgG with FcαRI (CD89) binding.</a> MAbs. 7 (4), 743-751 (2015).</li>
<li>Weiner, L. M., Murray, J. C., Shuptrine, C. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22424219">Antibody-based immunotherapy of cancer.</a> Cell. 148 (6), 1081-1084 (2012).</li>
<li>Ricklin, D., Hajishengallis, G., Yang, K., Lambris, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement%3A+a+key+system+for+immune+surveillance+and+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Complement: a key system for immune surveillance and homeostasis.</a> Nat Immunol. 11 (9), 785-797 (2010).</li>
<li>Prechl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generalized+quantitative+antibody+homeostasis+model%3A+antigen+saturation%2C+natural+antibodies+and+a+quantitative+antibody+network%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transl+Immunology%22%5BJournal%5D)">A generalized quantitative antibody homeostasis model: antigen saturation, natural antibodies and a quantitative antibody network.</a> Clin Transl Immunology. 6 (2), e131(2017).</li>
<li>Vojdani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+as+predictors+of+complex+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Immunopath+Ph%22%5BJournal%5D)">Antibodies as predictors of complex autoimmune diseases.</a> Int J Immunopath Ph. 21 (2), 267-278 (2008).</li>
<li>Liu, W., Peng, B., Lu, Y., Xu, W., Qian, W., Zhang, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibodies+to+tumor-associated+antigens+as+biomarkers+in+cancer+immunodiagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Autoimmun+Rev%22%5BJournal%5D)">Autoantibodies to tumor-associated antigens as biomarkers in cancer immunodiagnosis.</a> Autoimmun Rev. 10 (6), 331-335 (2011).</li>
<li>Suurmond, J., Diamond, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibodies+in+systemic+autoimmune+diseases%3A+specificity+and+pathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Autoantibodies in systemic autoimmune diseases: specificity and pathogenicity.</a> J Clin Invest. 125 (6), 2194-2202 (2015).</li>
<li>Bovin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repertoire+of+human+natural+anti-glycan+immunoglobulins.+Do+we+have+auto-antibodies%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Repertoire of human natural anti-glycan immunoglobulins. Do we have auto-antibodies?</a> Biochim Biophys Acta. 1820 (9), 1373-1382 (2012).</li>
<li>de los Rios, M., Criscitiello, M. F., Smider, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+genetic+diversity+in+antibody+repertoires+from+diverse+species%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struc+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural and genetic diversity in antibody repertoires from diverse species.</a> Curr Opin Struc Biol. 33, 27-41 (2015).</li>
<li>Pochechueva, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+printed+glycan+array%2C+suspension+array+and+ELISA+in+the+detection+of+human+anti-glycan+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconjugate+J%22%5BJournal%5D)">Comparison of printed glycan array, suspension array and ELISA in the detection of human anti-glycan antibodies.</a> Glycoconjugate J. 28 (8-9), 507-517 (2011).</li>
<li>Shilova, N., Navakouski, M., Khasbiullina, N., Blixt, O., Bovin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Printed+glycan+array%3A+antibodies+as+probed+in+undiluted+serum+and+effects+of+dilution%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconjugate+J%22%5BJournal%5D)">Printed glycan array: antibodies as probed in undiluted serum and effects of dilution.</a> Glycoconjugate J. 29 (2-3), 87-91 (2012).</li>
<li>Manimala, J. C., Roach, T. A., Li, Z., Gildersleeve, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+carbohydrate+microarray+profiling+of+27+antibodies+demonstrates+widespread+specificity+problems%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">High-throughput carbohydrate microarray profiling of 27 antibodies demonstrates widespread specificity problems.</a> Glycobiology. 17 (8), 17C-23C (2007).</li>
<li>Jacob, F., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21351089">Serum anti-glycan antibody detection of non-mucinous ovarian cancers by using a printed glycan array.</a> Int. J. Cancer. 130 (1), 138-146 (2012).</li>
<li>Lewallen, D. M., Siler, D., Iyer, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+protein-glycan+specificity%3A+effect+of+spacers+and+incubation+time%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Factors affecting protein-glycan specificity: effect of spacers and incubation time.</a> ChemBioChem. 10 (9), 1486-1489 (2009).</li>
<li>Oyelaran, O., Li, Q., Farnsworth, D., Gildersleeve, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarrays+with+varying+carbohydrate+density+reveal+distinct+subpopulations+of+serum+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Microarrays with varying carbohydrate density reveal distinct subpopulations of serum antibodies.</a> J. Proteome Res. 8 (7), 3529-3538 (2009).</li>
<li>Pochechueva, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+suspension+array+for+human+anti-carbohydrate+antibody+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Multiplex suspension array for human anti-carbohydrate antibody profiling.</a> Analyst. 136 (3), 560-569 (2011).</li>
<li>Chinarev, A. A., Galanina, O. E., Bovin, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotinylated+multivalent+glycoconjugates+for+surface+coating%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Biotinylated multivalent glycoconjugates for surface coating.</a> Methods Mol Biol. 600, 67-78 (2010).</li>
<li>Huflejt, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-carbohydrate+antibodies+of+normal+sera%3A+findings%2C+surprises+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Anti-carbohydrate antibodies of normal sera: findings, surprises and challenges.</a> Mol Immunol. 46 (15), 3037-3049 (2009).</li>
<li>Buchs, J. P., Nydegger, U. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+ABO-ELISA+for+the+quantitation+of+human+blood+group+anti-A+and+anti-B+IgM+and+IgG+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of an ABO-ELISA for the quantitation of human blood group anti-A and anti-B IgM and IgG antibodies.</a> J Immunol Methods. 118 (1), 37-46 (1989).</li>
<li>de Jager, W., Rijkers, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-phase+and+bead-based+cytokine+immunoassay%3A+a+comparison%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Solid-phase and bead-based cytokine immunoassay: a comparison.</a> Methods. 38 (4), 294-303 (2006).</li>
<li>Galanina, O. E., Mecklenburg, M., Nifantiev, N. E., Pazynina, G. V., Bovin, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GlycoChip%3A+multiarray+for+the+study+of+carbohydrate+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">GlycoChip: multiarray for the study of carbohydrate binding proteins.</a> Lab Chip. 3 (4), 260-265 (2003).</li>
<li>Willats, W. G., Rasmussen, S. E., Kristensen, T., Mikkelsen, J. D., Knox, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sugar-coated+microarrays%3A+a+novel+slide+surface+for+the+high-throughput+analysis+of+glycans%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Sugar-coated microarrays: a novel slide surface for the high-throughput analysis of glycans.</a> Proteomics. 2 (12), 1666-1671 (2002).</li>
<li>Bello-Gil, D., Khasbiullina, N., Shilova, N., Bovin, N., Mañez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repertoire+of+BALB%2Fc+mice+natural+anti-Carbohydrate+antibodies%3A+mice+vs.+humans+difference%2C+and+otherness+of+individual+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Repertoire of BALB/c mice natural anti-Carbohydrate antibodies: mice vs. humans difference, and otherness of individual animals.</a> Front Immunol. 8, 1449(2017).</li>
<li>Pazynina, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+glyco-O-sulfatome+for+profiling+of+human+natural+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr+Res%22%5BJournal%5D)">Synthetic glyco-O-sulfatome for profiling of human natural antibodies.</a> Carbohydr Res. 445, 23-31 (2017).</li>
<li>Ryzhov, I. M., Korchagina, E. Y., Popova, I. S., Tyrtysh, T. V., Paramonov, A. S., Bovin, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Block+synthesis+of+A+%28type+2%29+and+B+%28type+2%29+tetrasaccharides+related+to+the+human+ABO+blood+group+system%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr+Res%22%5BJournal%5D)">Block synthesis of A (type 2) and B (type 2) tetrasaccharides related to the human ABO blood group system.</a> Carbohydr Res. 430, 59-71 (2016).</li>
<li>Ryzhov, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function-spacer-lipid+constructs+of+Lewis+and+chimeric+Lewis%2FABH+glycans.+Synthesis+and+use+in+serological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohyd+Res%22%5BJournal%5D)">Function-spacer-lipid constructs of Lewis and chimeric Lewis/ABH glycans. Synthesis and use in serological studies.</a> Carbohyd Res. 435, 83-96 (2016).</li>
<li>Pazynina, G. V., Tsygankova, S. V., Sablina, M. A., Paramonov, A. S., Tuzikov, A. B., Bovin, N. V. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0959943616300992">Stereo- and regio-selective synthesis of spacer armed α2-6 sialooligosaccharides.</a> Mendeleev Commun. 26 (5), 380-382 (2016).</li>
<li>Pazynina, G. V., Tsygankova, S. V., Sablina, M. A., Paramonov, A. S., Formanovsky, A. A., Bovin, N. V. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0959943616000547">Synthesis of blood group pentasaccharides ALey, BLey and related tri- and tetrasaccharides.</a> Mendeleev Commun. 26 (2), 103-105 (2016).</li>
<li>Severov, V. V., Pazynina, G. V., Ovchinnikova, T. V., Bovin, N. V. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1134/S1068162015020120">The synthesis of oligosaccharides containing internal and terminal Galβ1-3GlcNAcβ fragments.</a> Russian J. Bioorgan. Chem. 41 (2), 147-160 (2015).</li>
<li>Pazynina, G. V., Tsygankova, S. V., Bovin, N. V. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0959943615001212">Synthesis of glycoprotein N-chain core fragment GlcNAcβ1-4(Fucα1-6)GlcNAc.</a> Mendeleev Commun. 25 (4), 250-251 (2015).</li>
<li>Solís, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+into+glycosciences%3A+How+chemistry%2C+biochemistry+and+biology+cooperate+to+crack+the+sugar+code%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">A guide into glycosciences: How chemistry, biochemistry and biology cooperate to crack the sugar code.</a> Biochim Biophys Acta. 1850 (1), 186-235 (2015).</li>
<li>Pazynina, G. V., et al. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/273432327_Divergent_Strategy_for_the_Synthesis_of_a2-3-Linked_Sialo-oligosaccharide_Libraries_Using_a_Neu5TFA-a2-3-Gal_Building_Block">Divergent strategy for the synthesis of α2-3-Linked sialo-oligosaccharide libraries using a Neu5TFA-(α2-3)-Gal building block.</a> Synlett. 24 (02), 226-230 (2013).</li>
<li>Blixt, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Printed+covalent+glycan+array+for+ligand+profiling+of+diverse+glycan+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Printed covalent glycan array for ligand profiling of diverse glycan binding proteins.</a> P Natl Acad Sci USA. 101 (49), 17033-17038 (2004).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+minimum+information+required+for+a+glycomics+experiment+%28MIRAGE%29+project%3A+improving+the+standards+for+reporting+glycan+microarray-based+data%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">The minimum information required for a glycomics experiment (MIRAGE) project: improving the standards for reporting glycan microarray-based data.</a> Glycobiology. 27 (4), 280-284 (2017).</li>
<li>Song, X., Heimburg-Molinaro, J., Cummings, R. D., Smith, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry+of+natural+glycan+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemistry of natural glycan microarrays.</a> Curr Opin Chem Biol. 18, 70-77 (2014).</li>
<li>Hoy, Y. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+taxonomic+composition+of+the+fecal+microbiota+in+an+inbred+mouse+strain+across+individuals+and+time%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Variation in taxonomic composition of the fecal microbiota in an inbred mouse strain across individuals and time.</a> PLoS One. 10 (11), e0142825(2015).</li>
<li>D'Argenio, V., Salvatore, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+gut+microbiome+in+the+healthy+adult+status%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">The role of the gut microbiome in the healthy adult status.</a> Clin Chim Acta. 451 (Pt A), 97-102 (2015).</li>
<li>Khasbiullina, N. R., Bovin, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypotheses+of+the+origin+of+natural+antibodies%3A+a+glycobiologist%27s+opinion%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+%28Mosc%29%22%5BJournal%5D)">Hypotheses of the origin of natural antibodies: a glycobiologist's opinion.</a> Biochemistry (Mosc). 80 (7), 820-835 (2015).</li>
<li>Butler, J. E., Sun, J., Weber, P., Navarro, P., Francis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+repertoire+development+in+fetal+and+newborn+piglets%2C+III.+Colonization+of+the+gastrointestinal+tract+selectively+diversifies+the+preimmune+repertoire+in+mucosal+lymphoid+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Antibody repertoire development in fetal and newborn piglets, III. Colonization of the gastrointestinal tract selectively diversifies the preimmune repertoire in mucosal lymphoid tissues.</a> Immunology. 100 (1), 119-130 (2000).</li>
<li>Bos, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+immunoglobulin+levels+and+naturally+occurring+antibodies+against+carbohydrate+antigens+in+germ-free+BALB%2Fc+mice+fed+chemically+defined+ultrafiltered+diet%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Serum immunoglobulin levels and naturally occurring antibodies against carbohydrate antigens in germ-free BALB/c mice fed chemically defined ultrafiltered diet.</a> Eur J Immunol. 19 (12), 2335-2339 (1980).</li>
<li>van der Heijden, P. J., Bianchi, A. T., Heidt, P. J., Stok, W., Bokhout, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Background+%28spontaneous%29+immunoglobulin+production+in+the+murine+small+intestine+before+and+after+weaning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Reprod+Immunol%22%5BJournal%5D)">Background (spontaneous) immunoglobulin production in the murine small intestine before and after weaning.</a> J Reprod Immunol. 15 (3), 217-227 (1989).</li>
<li>Krasnova, L., Wong, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+chemistry+and+biology+of+glycosylation+with+glycan+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Understanding the chemistry and biology of glycosylation with glycan synthesis.</a> Annu Rev Biochem. 85, 599-630 (2016).</li>
<li>Overkleeft, H. S., Seeberger, P. H., et al. Chemoenzymatic synthesis of glycans and glycoconjugates. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOverkleeft%2C+HS+%22Essentials+of+Glycobiology+%5BInternet%5D%22">Essentials of Glycobiology [Internet]</a>. Varki, A., et al. , 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor (NY). Chapter 54 2015-2017 (2017).</li>
</ol>

Nailya Khasbiullina i Alexey Nokel są pracownikami firmy Semiotik LLC, która jest dostawcą glikochipów użytych w tym badaniu.

Mikromacierze glikanowe stały się niezbędnymi narzędziami do badania interakcji białko-glikan40. W niniejszej pracy opisano protokół oparty na technologii PGA do badania repertuaru krążenia przeciwciał antywęglowodanowych u myszy BALB/c. Ponieważ PGA oferuje możliwość badania dużej liczby biologicznie nieznanych glikanów, jest to wyjątkowo wygodne narzędzie do odkrywania 13,15,28. Proponowana metoda daje ...

Przeciwciała odgrywają kluczową rolę w naszej obronie przed atakującymi patogenami, bezpośrednio neutralizując wirusy1,2 i bakterie2,3, poprzez aktywację układu dopełniacza4,5 i wzmocnienie fagocytozy6. Ponadto są one niezbędnymi elementami w celowaniu w raka i eliminacji komórek nowotworowych7 oraz utrzymanie homeostazy8,9.
Zaburzenia układu odpornościowego mogą prowadzić do chorób autoimmunologicznych i zapalnych10 i raka11. Wszystkie te stany patologiczne wymagają szybkiej diagnozy w celu skutecznego leczenia. W przypadku chorób autoimmunologicznych serologiczna obecność autoprzeciwciał w większości przypadków jest predyktorem w diagnostyce autoimmunizacji10,12. Przeciwciała te reagują z powierzchnią komórki i zewnątrzkomórkowymi autoantygenami i często są obecne przez wiele lat przed wystąpieniem choroby autoimmunologicznej10,12. Niedobory odporności i nowotwory są również diagnozowane za pomocą badań krwi, które mierzą poziom elementów odpornościowych, takich jak przeciwciała, lub ich aktywność funkcjonalną11.
Identyfikacja repertuaru krążących przeciwciał i ich poziomów serologicznych jest kluczowa dla ustalenia prognozy i oceny postępu wszystkich wymienionych stanów patologicznych. Wcześniej wykazaliśmy potencjał techniki PGA do analizy krążących przeciwciał u różnych gatunków zwierząt13-16, minimalizując użycie dużych objętości próbek serologicznych, unikając problemu związanego z reaktywnością krzyżową przeciwciał17 i umożliwiając wysokoprzepustowe profilowanie obszernego repertuaru przeciwciał15.
Testy immunologiczne oparte na glikanach są głównie uwarunkowane, między innymi, pochodzeniem i produkcją węglowodanów, które decydują o powinowactwie i wiązaniu ligandów15,18,19,20,21. Testy immunologiczne na bazie glikanów mogą być opracowywane w zawiesinie (mikrosferach)15,21,22 lub na powierzchniach aktywowanych płasko15,21,22,23,24. Do tych ostatnich należą ELISA (najbardziej konwencjonalna z tych metod) i PGA. Nie ma zbyt wielu danych porównujących te metodologie w tym samym środowisku eksperymentalnym15,25,26,27. Wcześniej porównaliśmy skuteczność i selektywność tych testów immunologicznych z profilem przeciwciał antyglikanowych w poszczególnych próbkach ludzkiego osocza15. W przypadku niektórych przeciwciał, takich jak przeciwciała skierowane przeciwko grupie krwi A/B, wszystkie testy immunologiczne mogą je wykryć ze statystyczną istotnością i dodatnio korelują ze sobą15,18,21. Tymczasem przeciwciała anty-P1 były przede wszystkim wykrywane przez PGA o najwyższej sile dyskryminacyjnej i nie było korelacji w oznaczeniach dokonanych przez różne testy immunologiczne oparte na glikanie15,18,21. Te różnice między metodami były głównie związane ze stosunkiem przeciwciał do antygenu i orientacją glikanów15. Tablice ELISA i zawiesiny są bardziej podatne na niespecyficzne wiązanie niż PGA, ponieważ w tych metodach występuje nadmiar antygenu nad przeciwciałami15. Ponadto orientacja glikanów w PGA jest bardziej ograniczona niż w ELISA i tablicach zawiesinowych15. Test ELISA jest wygodny, gdy badanie obejmuje ograniczony panel glikanów. Wraz z matrycami zawiesin, ELISA oferuje większą elastyczność w zakresie rekonfiguracji testu. PGA jest wyjątkowo wygodny w podejściach odkrywczych15,18,21,28. Pomimo tych wyraźnych zalet i wad, trzy wymienione testy immunologiczne mogą być wykorzystane do badania różnych aspektów interakcji glikan-przeciwciało. Ostatecznym celem badania jest wskazanie wyboru bardziej odpowiedniej metodologii.
Niniejsza praca ma na celu rozszerzenie zastosowania technologii PGA do analizy repertuaru krążących przeciwciał antyglikanowych u małych zwierząt. Jako reprezentatywny wynik przedstawiamy tutaj szczegółowy protokół oceny repertuaru naturalnych przeciwciał antywęglowodanowych u dorosłych myszy BALB/c przez PGA.

<table><tbody><tr><td>Przeciwciała</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>biotynylowane kozy anty-ludzkie Igs</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>Ref. #: 31782</td><td></td></tr><tr><td>biotynylowany kozioł anty-mysie IgM + IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Ref. #: 31807</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Robotic Arrayer sciFLEXARRAYER S5&nbsp;</td><td>Scienion AG, Berlin, Niemcy</td><td>http://www.scienion.com/products/sciflexarrayer/</td><td></td></tr> <tr><td>Tacka na plamy (komora inkubacyjna do szkiełka)</td><td>Simport, Beloeil, QC, Kanada</td><td>Nr ref. #: Wirówka M920-2</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf, Hamburg, Niemcy&nbsp;</td><td>Nr ref. #: Pipety 5810 R</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Gilson, Middleton, WI, USA</td><td>http://www.gilson.com/en/Pipette/</td><td></td></tr> <tr><td>Skaner do slajdów&nbsp;</td><td>PerkinElmer, Waltham, MA, Stany Zjednoczone</td><td>ScanArray GX Plus&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator z wytrząsaniem</td><td>Cole-Parmer, Staffordshire, Wielka Brytania</td><td>Nr ref. #: SI50</td><td></td></tr><tr><td>Próbki biologiczne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BALB/c surowice myszy</td><td>Ten artykuł</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>Complex Immunoglobulin Preparation ()</td><td>Immuno-Gem, Moskwa, Rosja</td><td>http://www.biomedservice.ru/price/goods/1/17531</td><td></td></tr><tr><td><silne>chemikalia, odczynniki i glikany&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycan library</td><td>Instytut Chemii Bioorganicznej (IBCh), Moskwa, Rosja</td><td>N/ A Albumina</td><td></td></tr><tr><td>surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,&nbsp;</td><td>Nr ref. #: A9418</td><td></td></tr><tr><td>Etanoloamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Nr ref. #: 411000</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Merck Chemicals & Life Science S.A., Madryt, Hiszpania</td><td>Ref. #: 655204</td><td></td></tr><tr><td>Fospahte buforowana sól fizjologiczna (PBS)</td><td>VWR International Eurolab S.L, Barcelona, Hiszpania</td><td>Ref. #: E404</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Ref. #: S2002</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin Alexa Fluor 555 sprzężony&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Ref. #: S21381</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin Cy5 sprugatowany</td><td>GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, Wielka Brytania</td><td>Ref. #: PA45001</td><td></td></tr><tr><td>Materiały</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-hydroksysukcynimida-derywatyzowane szkiełka podstawowe H&nbsp;</td><td>Schott-Nexterion, Jena, Niemcy</td><td>Ref. #: 1070936</td><td></td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna Whatman&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Ref. #: WHA10347509</td><td></td></tr><tr><td>Probówki 1,5 ml</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>Ref. #: 0030120086</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie i algorytmy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ScanArray Express Microarray Analysis System</td><td>PerkinElmer</td><td>http://www.per</td><td></td></tr><tr><td>kinelmer.com/microarray</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aplikacja Hierarchical Clustering Explorer</td><td>University of Maryland, MD, USA</td><td>http://www.cs.umd.edu/hcil/hce/</td><td></td></tr></tbody></table>

drukowana matryca glikanów: czuła technika analizy repertuaru krążących przeciwciał antywęglowodanowych u małych zwierząt

Printed Glycan Array: A Sensitive Technique for the Analysis of the Repertoire of Circulating Anti-carbohydrate Antibodies in Small Animals

Repertuar krążących przeciwciał antywęglowodanowych danej osoby jest często związany z jej statusem immunologicznym. Nie tylko indywidualny stan immunologiczny decyduje o sukcesie w zwalczaniu wewnętrznych i zewnętrznych potencjalnych sygnałów zagrożenia, ale także istnienie określonego wzorca krążących przeciwciał antyglikanowych (i zmienność ich poziomu serologicznego) może być znaczącym markerem wystąpienia i progresji niektórych stanów patologicznych. W tym miejscu opisujemy metodologię opartą na drukowanej macierzy glikanów (PGA), która oferuje możliwość pomiaru setek celów glikanowych z bardzo wysoką czułością; Użycie minimalnej ilości próbki, co jest powszechnym ograniczeniem występującym, gdy małe zwierzęta (szczury, myszy, chomiki itp.) są wykorzystywane jako modele do rozwiązywania problemów związanych z chorobami ludzi. Jako reprezentatywny przykład tego podejścia przedstawiamy wyniki uzyskane z analizy repertuaru naturalnych przeciwciał antyglikanowych u myszy BALB/c. Wykazaliśmy, że każda mysz BALB/c biorąca udział w badaniu, mimo że jest genetycznie identyczna i utrzymywana w tych samych warunkach, rozwija określony wzór naturalnych przeciwciał antywęglowodanowych. Praca ta ma na celu rozszerzenie zastosowania technologii PGA do badania repertuaru (specyfiki) i poziomów krążących przeciwciał przeciwwęglowodanowych, zarówno w zdrowiu, jak i podczas każdego stanu patologicznego.

W niniejszym opracowaniu przedstawiamy podsumowanie reprezentatywnych wyników uzyskanych z ilościowego oznaczenia repertuaru naturalnych przeciwciał przeciwko glikanom w populacji 20 myszy BALB/c. Glikochipy użyte w tej badaniu zawierały 419 różnych struktur glikanów. Większość glikanów została zsyntezowana jako O-glikozydy z łącznikiem -CH2CH2CH2NH2, w kilku przypadkach jako glikozydy -CH2CH2NH2 lub -NH...

Ta praca pokazuje potencjał technologii drukowanych tablic glikanowych (PGA) do analizy krążących przeciwciał antywęglowodanowych u małych zwierząt.

Drukowana matryca glikanów: czuła technika analizy repertuaru krążących przeciwciał antywęglowodanowych u małych zwierząt

The repertoire of circulating anti-carbohydrate antibodies of a given individual is often associated with its immunological status. Not only the ...

Ogólnym celem tego protokołu jest zbadanie profilu krążących przeciwciał antyglikanowych w surowicy małych zwierząt przy użyciu technologii opartej na drukowanej macierzy glikanów. Takie podejście ma potencjał we wczesnej diagnozie i właściwym leczeniu niektórych stanów patologicznych, w których przeciwciała przeciwko strukturom glikanowym odgrywają ważną rolę. Główną zaletą tej techniki jest możliwość pomiaru w tych samych warunkach eksperymentalnych setek celów glikanowych z bardzo wysoką czułością przy użyciu minimalnej ilości próbki.Do przygotowania mikromacierzy należy użyć bezkontaktowej macierzy robotycznej. Drukuje sześć powtórzeń 50 milimolowych glikanów i 10 mikrogramów na mililitr polisacharydów oraz 300 milimolowych PBS, pH 8,5 na szkiełkach z derywatyzowanego szkła cynamonowego n-hydroksy6. Każdy slajd zawiera cztery różne bloki podtablic powtórzone sześć razy.Każda pojedyncza podtablica składa się ze 112 różnych plamek glikanów, w tym kontrolnych. Inkubować szkiełka w wilgotnym pojemniku w temperaturze pokojowej przez godzinę. Aby zablokować mikromacierze, inkubuj szkiełka przez 1 1/2 godziny z buforem blokującym w temperaturze pokojowej.Następnie umyj wiór glikolowy ultra czystą wodą i wysusz go powietrzem. Przygotuj bufor od pierwszego do czwartego zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby przygotować wióry i próbki glikolu, połóż pudełko do przechowywania ze szkiełkami na stole, aż osiągną temperaturę pokojową.Otwórz pudełko i przenieś wiór glikolowy do komory inkubacyjnej, która powinna być już kondycjonowana mokrą bibułą filtracyjną, aby utrzymać stałą wilgotność wewnątrz komory. W międzyczasie rozcieńczyć surowicę myszy buforem jeden na 1,5 mililitra probówki. Homogenizować roztwór surowicy przez pięć sekund za pomocą mieszalnika wirowego.Po homogenizacji inkubować rozcieńczoną surowicę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut w łaźni wodnej, aby uniknąć agregacji immunoglobulin. Następnie odwiruj probówki przez trzy minuty w temperaturze 10 000 razy G i 25 stopni Celsjusza. Zebrać sklarowany nad osadem i wyrzucić wstrząśnięty materiał.Ostrożnie umieścić chip glikolowy w komorze inkubacyjnej. Inkubować go z jednym mililitrem buforu trzeciego, aby wyeliminować wszelkie pozostałości materiału na powierzchni chipa glikolowego. Przez 15 minut, w temperaturze 25 stopni Celsjusza.Przytrzymaj wiór glikolowy w pozycji pionowej i przemyj go kilkoma kroplami buforu trzeciego za pomocą plastikowej pipety Pasteura. Następnie ostrożnie usuń bufor z powierzchni wióra glikolowego za pomocą bibuły filtracyjnej. Umieść chip glikolowy z powrotem w komorze inkubacyjnej.Rozprowadzić rozcieńczoną próbkę surowicy na powierzchni wióra glikolowego za pomocą mikropipety. Upewnij się, że wszystkie suche obszary powierzchni wióra glikolowego są pokryte rozcieńczoną próbką surowicy za pomocą końcówki pipety. Inkubować z mieszaniem orbitalnym w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 1 1/2 godziny.Po inkubacji usunąć nadmiar próbki i zanurzyć chip glikolowy na pięć minut w buforze trzecim w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Przełóż chip glikolowy do pojemnika z buforem czwartym, a na koniec umyj wiór glikolowy ultra czystą wodą. Odwiruj wiór glikolowy przez jedną minutę w temperaturze 175 razy G i 25 stopni Celsjusza, aby usunąć płyn.Po umieszczeniu chipa glikolowego z powrotem w komorze inkubacyjnej, rozprowadź roztwór koziego anty-mysiego sprzężonego z biotyną na powierzchni chipa glikolowego. Inkubować z mieszaniem orbitalnym w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Usuń frakcję niezwiązaną i powtórz etapy mycia.Po odwirowaniu inkubować chip glikolowy w ciemności w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 45 minut z dwoma mikrogramami na mililitr odpowiedniego roztworu streptawidyny znakowanego fluorochromem w buforze drugim. Po pracy w ciemności w celu usunięcia niezwiązanej frakcji i powtórzeniu kroków mycia, wysuszyć wiór glikolowy powietrzem. Aby zeskanować matrycę, pozostaw chip glikolowy na stole, aż osiągnie temperaturę pokojową w ciemności.W tym samym czasie włącz skaner slajdów i laser. Trzymając mikromatrycę, wsuń chip glikolowy do szczeliny, aż dotknie tyłu. Zeskanuj chip glikolowy, uruchamiając program EasyScan i zapisz skan jako plik tif.Określ ilościowo tablicę za pomocą systemu analitycznego ScanArray. Otwórz wcześniej zeskanowane obrazy, klikając plik w grupie konfiguracji i plików w oknie głównym. Załaduj odpowiedni szablon pliku tablicy w formacie GAL, który reprezentuje rozmieszczenie wydrukowanych glikanów na szkiełku podstawowym.Dostosuj szablon GAL, ostrożnie wyrównując tablicę z plamkami na obrazie i rozpocznij kwantyfikację. Wybierz obwody kwantyfikacji jako typ kwantyfikacji, uruchom łatwą metodę kwantyfikacji i metodę kwantyfikacji, stały okrąg. Odznacz wszystkie opcje automatycznego wyszukiwania miejsc i wybierz lowess jako metodę normalizacji.Zapisz dane ilościowe jako plik csv. Przenieś te dane do zwykłego pliku arkusza kalkulacyjnego za pomocą programu Microsoft Excel lub innej odpowiedniej aplikacji. Genetycznie identyczne myszy nie powinny być uważane za równoważniki immunologiczne, ponieważ rozwinęły one różne wzorce naturalnych przeciwciał antywęglowodanowych.Jak pokazano tutaj, zachowano tylko 12 specyficznych glikanów. Pokazany tutaj jest reprezentatywny przykład obrazów uzyskanych ze skanowania mikroprocesorów za pomocą skanera fluorescencyjnego. Siatka jest następnie wyrównywana do punktów w każdej pojedynczej tablicy podrzędnej.Fluorescencyjny jest wykrywany dla każdego miejsca, a wyniki są przesyłane do wspólnego pliku arkusza kalkulacyjnego. Po inkubacji z mysią surowicą, chipy glikologiczne zostały zeskanowane za pomocą czytnika scan array. Dane analizowano za pomocą systemu analizy mikromacierzy, a wyniki wyrażono w RFU jako mediana plus minus mediana odchylenia bezwzględnego.Kolory niebieski i biały reprezentują sygnały wiązania tła o wartości mniejszej niż 4000 RFU. Kolor czerwony reprezentuje dodatnie sygnały wiązania większe lub równe 4000 RFU. Większość struktur glikanowych odsłoniętych w chipach glikolowych nie została rozpoznana przez repertuar krążących przeciwciał antyglikanowych myszy balp C.Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w pięć godzin i 45 minut, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać technologii matrycy glikonowej do drukarki do badania repertuaru i poziomów krążących przeciwciał antywęglowodanowych w próbkach surowicy. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że chip glikotechniczny musi być manipulowany przez dolną część światła okularów.Gdzie znajduje się kod kreskowy. Tak, aby uniknąć kontaktu z wydrukowanymi glikanami. Upewnij się również, że cały suchy obszar wióra glikologicznego jest pokryty rozcieńczoną próbką surowicy za pomocą końcówki pipety.Objętość potrzebna do całkowitego pokrycia pojedynczej powierzchni wióra glikologicznego wynosi około jednego mililitra. Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak układ zawiesiny na podstawie mikrosfery, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania związane z elastycznym wykrywaniem multipleksowym profilu przeciwciał antyglikanowych. Po wprowadzeniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się molekułami biomacralnymi i immunologią do zbadania interakcji glikolu niebiałkowego w grupie małych zwierząt.

printed-glycan-array-sensitive-technique-for-analysis-repertoire

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W niniejszym badaniu opisujemy ulepszony protokół wieloparametrycznego, wysokoprzepustowego mikrociągu przeciwciał z metodą detekcji lektynami, który może być wykorzystany do profilowania glikozylacji specyficznych białek. Protokół ten wprowadza nowe, niezawodne odczynniki i znacząco redukuje czas, koszty oraz zapotrzebowanie na sprzęt laboratoryjny w porównaniu do poprzedniej procedury.

Mikromacierze przeciwciał z blokowaniem chemicznym do multipleksowego wysokoprzepustowego profilowania specyficznej glikozylacji białek w próbkach złożonych

Ten film demonstruje technologię drukowanej macierzy glikanowej do analizy krążących przeciwciał anty-glikanowych w surowicy myszy. Przeciwciała w surowicy oddziałują ze specyficznymi glikanami na chipie, co potwierdza się za pomocą barwienia immunologicznego, a następnie skanowania fluorescencyjnego.

Wykrywanie krążących przeciwciał anty-glikanowych za pomocą drukowanej matrycy glikanów

Korzystając z drukowanej strategii mikromacierzy glikanowej, konwencjonalny test na 96-dołkowej płytce został zminiaturyzowany do analizy awidności hemaglutyniny wirusa grypy A i swoistości dla receptorów zawierających kwas sjalowy.

Zminiaturyzowany test mikromacierzy glikanów do oceny awidności i swoistości hemaglutynin wirusa grypy A

Opisujemy tutaj metodę generowania konfigurowalnych mikromacierzy antygenowych, które mogą być używane do jednoczesnego wykrywania autoprzeciwciał IgG i IgM w surowicy od ludzi i myszy. Macierze te pozwalają na wysokoprzepustowe i ilościowe wykrywanie przeciwciał przeciwko dowolnemu antygenom lub epitopom.

Generacja dwukolorowych mikromacierzy antygenowych do jednoczesnego wykrywania autoprzeciwciał IgG i IgM

Modułowe podejście do syntezy N-glikanów do dołączania do szkiełka pokrytego tlenkiem glinu (ACG) jako mikromatrycy glikanowej zostało opracowane i zademonstrowano jego zastosowanie do profilowania przeciwciała neutralizującego wirusa HIV.

Chemoenzymatyczna synteza N-glikanów do tworzenia macierzy i profilowania przeciwciał HIV

Test mikromacierzy sialoglycan może być używany do oceny przeciwciał anty-Neu5Gc w surowicach ludzkich, co czyni go potencjalnym wysokoprzepustowym testem diagnostycznym dla raka i innych przewlekłych chorób ludzkich, w których pośredniczy stan zapalny.

Profilowanie IgG anty-Neu5Gc w surowicach ludzkich za pomocą testu mikromacierzy sialoglikanu

Opisano szczegółowy protokół oczyszczania i późniejszej analizy przeciwciała monoklonalnego z pobranego płynu do hodowli komórek (HCCF) zautomatyzowanych mikrobioreaktorów. Przedstawiono również wykorzystanie analiz do określenia krytycznych atrybutów jakości (CQA) i maksymalizacji ograniczonej objętości próbki w celu wyodrębnienia istotnych informacji.

Oczyszczanie i analiza przeciwciała monoklonalnego z komórek jajnika chomika chińskiego przy użyciu zautomatyzowanego systemu mikrobioreaktora

Wzór glikozylacji przeciwciała determinuje jego skuteczność kliniczną, dlatego przemysłowe i akademickie wysiłki zmierzające do kontroli glikozylacji trwają. Ponieważ typowe kampanie glikoinżynieryjne są czasochłonne i pracochłonne, przydatne byłoby opracowanie szybkiego protokołu do scharakteryzowania wpływu genów glikozylacji za pomocą przejściowego wyciszania.

Szybka glikoinżynieria przeciwciał w komórkach jajnika chomika chińskiego

Profilowanie polimerów w mikromatrycach (MAPP) to wysokoprzepustowa technika analizy składu glikanów w próbkach biologicznych.

Profilowanie polimerów w mikromacierzy (MAPP) do wysokoprzepustowej analizy glikanów

Opracowano prostą metodę slot blot do ilościowego oznaczania hemaglutyniny i neuraminidazy wirusa grypy przy użyciu uniwersalnych przeciwciał skierowanych przeciwko ich najbardziej konserwatywnym sekwencjom, zidentyfikowanym za pomocą analiz bioinformatycznych. To innowacyjne podejście może stanowić przydatną alternatywę dla ilościowego określania wszystkich hemaglutynin i neuraminidaz wirusowych.

Analizy ilościowe wszystkich hemaglutynin i neuraminidaz wirusa grypy typu A z wykorzystaniem uniwersalnych przeciwciał w prostych testach slot blot

Poznaj technologię drukowanej matrycy glikanów do analizy przeciwciał antywęglowodanowych w surowicy małych zwierząt. Ta metoda umożliwia jednoczesne badanie setek celów glikanowych z wysoką czułością przy minimalnej ilości próbki.

Drukowana matryca glikanów: czuła technika analizy repertuaru krążących przeciwciał antywęglowodanowych u małych zwierząt

Przeglądaj więcej filmów