Modelowanie kostniakomięsaka za pomocą zespołu Li-Fraumeni Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste pochodzące od pacjenta

Ten model kostniakomięsaka oparty na zespole Li-Fraumeni oparty na iPSC może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad kostniakomięsakiem dotyczące wykorzystania komórek iP pacjenta w modelowaniu raka. Główną zaletą tego modelu jest to, że pozwala na generowanie nieograniczonej liczby komórek na wszystkich etapach rozwoju kostniakomięsaka do badań mechanistycznych, identyfikacji biomarkerów i badań przesiewowych leków. Ruoji zademonstruje procedurę hodowli komórkowej, a ja zademonstruję procedurę zwierzęcą.

Po dwóch tygodniach wspólnej hodowli fibroblastów embrionalnych myszy lub MEF przemyj 80 do 90% zlewającą się hodowlę komórek iPS pięcioma mililitrami DPBS, a następnie dodaj jeden mililitr roztworu odrywającego komórki do komórek na trzyminutową inkubację w temperaturze pokojowej. Bardzo ważne jest, aby utrzymać komórki iPS w dobrych warunkach na MEF przez co najmniej 14 dni, aby komórki były w stanie przyczepić się do płytki pokrytej żelatyną w celu różnicowania się w mezenchymalne komórki macierzyste. Gdy komórki odczepią się od dna płytki, dodaj dziewięć mililitrów pożywki hodowlanej MEF/MSC do komórek, aby zneutralizować roztwór do odrywania komórek i przenieś zawiesinę komórek do niepowlekanej 100-milimetrowej płytki do hodowli tkankowej.

Inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez 30 minut, aby umożliwić MEF przyłączenie się do płytki i ostrożnie zebrać nieprzyłączony supernatant zawierający komórki iPS. Odwirować roztwór komórek iPS i ponownie zawiesić osad w sześciu mililitrach pożywki różnicującej MSE. Następnie wysiewaj dwa mililitry komórek do każdego z trzech 0,1% pokrytych żelatyną studzienek sześciodołkowej płytki hodowlanej i umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na 28 dni, karmiąc komórki świeżą pożywką co dwa dni, aby usunąć wszelkie nieprzyłączone lub martwe komórki.

W 28 dniu widoczne będą duże masy zróżnicowanych komórek z podobnymi do fibroblastów MSC obserwowanymi na krawędziach klastrów. Umyj kultury komórkowe jednym mililitrem DPBS na studzienkę, a następnie odłącz je 0,5 mililitra 0,25% trypsyny-EDTA na studzienkę w temperaturze pokojowej. Po trzech minutach zneutralizować tyropsynę za pomocą 1,5 mililitra pożywki hodowlanej MEF/MSE na studzienkę i połączyć odłączone MME w jednej 15-mililitrowej stożkowej probówce w celu ich odwirowania.

Ponownie zawiesić osad w trzech mililitrach pożywki hodowlanej MEF/MSE i wysiać komórki na 60-milimetrowej płytce pokrytej żelatyną o grubości 0,1%, zmieniając podłoże co dwa dni, aż komórki osiągną 100% konfluencję. Po podzieleniu w 100% zlewającej się kultury w stosunku jeden do trzech, MSCs będą się szybko rozmnażać, wykazując morfologię podobną do fibroblastów i tworząc wirowy wzór hodowli, gdy kultura osiągnie dużą gęstość. MSCs pochodzące z komórek iPS można również badać za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego pod kątem markerów mezenchymalnych komórek macierzystych w dowolnym momencie ich różnicowania.

Aby zróżnicować MSE na osteoblasty, należy nanieść odpowiednią liczbę MSE z 95% zlewającej się hodowli komórkowej na płytkę do hodowli komórkowej w odpowiedniej objętości pożywki hodowlanej MEF/MSC na 24 godziny. Następnie należy rozpocząć zastępowanie supernatantu odpowiednią objętością pożywki różnicującej osteoblasty następnego dnia i co dwa kolejne dni aż do końca okresu hodowli. Aby wykryć związaną z kośćmi fosfatazę alkaliczną wytwarzaną przez preosteoblasty i depozycję minerałów wytwarzaną przez dojrzałe osteoblasty, należy przeprowadzić odpowiednio barwienie fosfatazą alkaliczną i czerwienią alizarynową S, zgodnie z protokołem producenta w odpowiednich eksperymentalnych punktach czasowych.

Aby stworzyć model nowotworzenia in vivo ze zróżnicowanymi osteoblastami, należy umieścić odpowiednią liczbę MSC w pięciu 100-milimetrowych szalkach, aby rozpocząć różnicowanie osteoblastów. W 14 dniu różnicowania osteoblastów przemyj pięć płytek hodowlanych osteoblastów pięcioma mililitrami DPBS i potraktuj komórki 1,5 mililitra roztworu odłączającego osteoblasty na miskę. Po 30 minutach inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza potwierdzić oderwanie komórek za pomocą mikroskopii świetlnej i zneutralizować roztwór oddzielający świeżą pożywką do różnicowania osteoblastów.

Połącz komórki w 50-mililitrowej stożkowej probówce do ich odwirowania i ponownie zawieś osad w 25 mililitrach świeżej pożywki do różnicowania osteoblastów. Przefiltrować roztwór komórkowy przez sitko o wielkości 70 mikronów, aby usunąć wszelkie zagregowane komórki przed zliczeniem i odłożyć 1 X 10 na 7 komórek na wstrzyknięcie podskórne. Osadzać komórki przez wirowanie i rozpuszczać komórki w stężeniu 1 X 10 do 7 osteoblastów na 50 mikrolitrów lodowatego stężenia DPBS.

Wymieszaj osteoblasty z równą objętością macierzy błony podstawnej wolnej od czerwieni fenolowej i umieść komórki na lodzie do momentu ich wstrzyknięcia. Po potwierdzeniu braku odpowiedzi na uszczypnięcie palca u ośmiotygodniowej nagiej samicy myszy z obniżoną odpornością, załaduj komórki do jednomililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 27 i podskórnie wstrzyknij 100 mikrolitrów komórek w zdezynfekowany bok zwierzęcia. Następnie monitoruj myszy z cotygodniowym kołataniem serca w miejscu wstrzyknięcia pod kątem wzrostu podskórnej gęstości guzkowej.

Powstawanie guza należy obserwować między szóstym a 10 tygodniem po wstrzyknięciu. Uznane klony komórek LFS iPS powinny wykazywać typową morfologię ludzkich embrionalnych komórek macierzystych i wykazywać dodatnią aktywność fosfatazy alkalicznej. Komórki LFS iPS wykazują również wysoką ekspresję mRNA czynnika pluripotencji porównywalną z ludzkimi liniami embrionalnych komórek macierzystych i znacznie wyższą niż poziomy obserwowane w fibroblastach rodzicielskich.

Pomyślnie zróżnicowane MSC LFS wykazują również ekspresję typowych markerów MSC, w tym CD44, CD73, CD105 i CD166, ocenianych za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego. Kiedy MSCs są poddawane sygnałom różnicowania osteogennego, zróżnicowane komórki zaczynają wykazywać dodatnią aktywność fosfatazy alkalicznej w dziewiątym dniu i odkładanie minerałów w 21 dniu. Różnicujące się osteoblasty wykazują również zwiększoną ekspresję genów preosteoblastów i dojrzałych osteoblastów w całym procesie różnicowania.

Sześć do 10 tygodni po wstrzyknięciu osteoblastu guzy wywodzące się z osteoblastów LFS wykazują niedojrzałe cechy osteoblastów, w tym dodatnią aktywność fosfatazy alkalicznej, dodatnie odkładanie się macierzy kolagenowej i ujemną mineralizację. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak różnicować komórki iPS zespołu Li-Fraumeni w osteoblasty i generować model kostniakomięsaka in vivo przy użyciu osteoblastów pochodzących od pacjenta. Oprócz kostniakomięsaka, ten model choroby oparty na komórkach iPS zespołu Li-Fraumeni można również zastosować do innych nowotworów złośliwych związanych z zespołem Li-Fraumeni, takich jak mięsak tkanek miękkich, rak piersi i guzy mózgu.