Izolacja ludzkich komórek zrębu endometrium do dendualizacji in vitro

Metoda ta może być wykorzystana do udzielenia odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie medycyny reprodukcyjnej dotyczące podstawowych mechanizmów molekularnych decydualizacji i zrozumienia ról określonych genów w decydualizacji komórek zrębu endometrium. Badanie to zawiera szczegółowy protokół izolacji ludzkich komórek zrębu endometrium, a następnie sztucznego decydualizacji poprzez suplementację hormonów do pożywki hodowlanej. Ekspresja zmian hormonalnych, takich jak prolaktyna i białko wiążące insulinopodobny czynnik wzrostu, może być wykorzystana do potwierdzenia i ilościowego określenia stopnia decydualizacji.

Co ważne, wykazano również zdolność tego protokołu do przeprowadzania knockdownu specyficznego dla genu. Przenieś biopsję za pomocą wysterylizowanych kleszczy do 50-mililitrowej probówki zawierającej dziesięć mililitrów świeżego HBSF, a następnie odwiruj przy 500x G przez 90 sekund. Za pomocą pipety o pojemności jednego ml wyjmij pożywkę i dodaj trzy ml wstępnie podgrzanej pożywki izolacyjnej hES.

Zdekantować biopsję do 10-centymetrowego naczynia zawierającego pięć ml pożywki izolacyjnej hES i rozpocząć siekanie za pomocą kleszczy Dumont 5 i cienkich nożyczek do ściegu prostego przez około 20 minut. Używając jednej pipety o pojemności ml, przenieś posiekaną biopsję do nowej probówki o pojemności 50 ml i dodaj dodatkowe siedem ml pożywki izolacyjnej hES do naczynia, aby przenieść pozostałe kawałki do probówki o pojemności 50 ml. Następnie odwirować próbkę przez dwie minuty w temperaturze 800x G i usunąć supernatant za pomocą pipety o pojemności jednego ml.

Następnie przefiltruj mieszankę trawienia DNazy-1 i kolagenazy przez filtr 0,2 mikrona przymocowany do 10-mililitrowej strzykawki bezpośrednio na granulce. Następnie wiruj probówkę przez 10 sekund, aby ponownie zawiesić osad i inkubuj przez 90 minut w łaźni wodnej. Po każdych 10 minutach wiruj rurkę przez 10 sekund, aby upewnić się, że tkanka jest prawidłowo strawiona.

Po inkubacji przefiltruj zawiesinę przez sitko o wielkości 40 mikronów ułożone na nowej 50-mililitrowej probówce w celu odzyskania komórek zrębu, a następnie odwiruj zebrane komórki przy 800x G przez 2,5 minuty. Po odwirowaniu delikatnie usuń supernatant za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego. Następnie ponownie zawieś osad komórkowy w 10 mililitrach świeżej pożywki izolacyjnej hES, a następnie odwiruj w temperaturze 800x G przez 2,5 minuty.

Po odwirowaniu ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w sześciu mililitrach świeżej pożywki hES. Następnie, aby usunąć krwinki, powoli ułóż zawieszone komórki na trzech mililitrach pożywki o gradientzie gęstości i odwiruj próbkę przy 400x G przez 30 minut. Po odwirowaniu zebrać supernatant bez naruszania pożywki o gradiencie gęstości.

Następnie dodaj pożywkę hES, aby uzyskać całkowitą objętość do 10 mililitrów i ponownie odwiruj próbkę przy 800x G przez 2,5 minuty. Po odwirowaniu usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w sześciu mililitrach pożywki hES. Następnie umieść komórki w kolbie o średnicy 75 centymetrów, dodając sześć mililitrów reprodukcji komórek i 10 mililitrów pożywki hES do kolby, a następnie delikatnie wymieszaj poprzez kołysanie kolby.

Po posiewie sprawdź gęstość komórek pod mikroskopem, a następnie hoduj komórki w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla przez trzy do pięciu dni, upewniając się, że zmieniasz pożywkę hES co dwa dni. Po 48 godzinach komórki powinny rosnąć jako monowarstwa. Zwykle po pięciu dniach komórki osiągają 80 do 90% zbiegu w kolbie o średnicy 75 centymetrów.

W przypadku transfekcji siRNA zacznij od posiewu 800 000 komórek na studzienkę na płytce sześciodołkowej w trzech powtórzeniach dla każdego stanu i inkubuj komórki w inkubatorze z 5% dwuprocentowym dwutlenkiem węgla przez dwa dni, aby przygotować się do transfekcji. Po dwóch dniach dodać 150 mikrolitrów pożywki wolnej od surowicy Opti-MEM do probówki o pojemności pięciu ml, a następnie dodać pięć mikrolitrów odczynnika do transfekcji. Dobrze wymieszaj przez inwersję i inkubuj przez pięć minut.

Następnie dodaj 100 mikrolitrów pożywki wolnej od surowicy Opti-MEM do nowej probówki o pojemności pięciu ml, a następnie dodaj 16 nanomoli siRNA SRC-2. Następnie dodaj 100 mikrolitrów pożywki wolnej od surowicy Opti-MEM do probówki o pojemności pięciu ml, a następnie dodaj 16 nanomoli kontrolnych siRNA. Po inkubacji połączyć rozcieńczony odczynnik do transfekcji z siRNA SRC-2 i dobrze wymieszać, pipetując do przodu i do tyłu.

Następnie połączyć rozcieńczony odczynnik do transfekcji z kontrolnym siRNA i dobrze wymieszać, pipetując do przodu i do tyłu. Następnie inkubuj kompleksy przez pięć minut. Podczas tej inkubacji odessać pożywkę hES i dodać jeden mililitr pożywki do zmiany do każdej studzienki.

Po pięciu minutach inkubacji odwirować kompleksy przy 500x G przez dwie minuty, aby zebrać roztwór. Następnie dodaj 250 mikrolitrów kompleksów odczynników do transfekcji siRNA do każdej studzienki zawierającej komórki i pożywkę i wymieszaj przez delikatne kołysanie, a następnie inkubuj w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla przez pięć godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po pięciu godzinach odessać pożywkę i zmienić na pożywkę hES i kontynuować inkubację przez dwa dni w ramach przygotowań do testu decydualizacji in vitro.

Po 48-godzinnej transfekcji i przed rozpoczęciem testu decydualizacji in vitro, należy pobrać komórki transfekowane siRNA i siRNA siRNA w dniu zerowym. Najpierw odessać podłoże i przemyć jednym ml PBS na studzienkę. Następnie usuń PBS i dodaj 300 mikrolitrów buforu do lizy RNA na studzienkę i inkubuj przez trzy minuty.

Po trzech minutach inkubacji zebrać komórki w buforze do lizy RNA do probówki o pojemności 1,5 ml w celu późniejszej analizy. Następnie przygotuj pożywkę EPC, podając odpowiednią objętość pożywki decydualizacyjnej i dodaj 10 nanomolowych estradioli, jeden mikromolowy octan medroksyprogesteronu i 50 mikromolowy cykliczny monofosforan adenozyny w 50-mililitrowej probówce. Na pozostały dzień sześciu dołków dodaj dwa mililitry pożywki EPC do każdej studzienki i inkubuj komórki w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez sześć dni, zmieniając pożywkę EPC co 48 godzin.

Po szóstym dniu zbierz kontrolne granulki siRNA i szóstego dnia SRC-2 siRNA transfekowane w buforze do lizy RNA do dalszej analizy przy użyciu PCR w czasie rzeczywistym. Indukcja decydualizacji przez octan medroksyprogesteronu estrogenu i cykliczny monofosforan adenozyny powoduje przegrupowanie komórek zrębu cytoszkieletu z wydłużonych komórek fibroblastów do zaokrąglonych komórek nabłonka. Barwienie falloidyną komórek zrębu endometrium dodatkowo ujawnia aktywną reorganizację cytoszkieletu włókien charakterystyczną dla decydualizacji hES.

W hES traktowanym nośnikiem komórki zachowują wygląd fibroblastyczny, podczas gdy w komórkach leczonych EPC hES wyglądał jak nabłonkowy. Aby potwierdzić skuteczność testu decydualizacji in vitro, oceniano poziomy transkryptów mRNA markerów decydualizacji prolaktyny i białka wiążącego insulinopodobny czynnik wzrostu-1 w okresie 6 dni. Po zdziesiątkowaniu ludzkich komórek zrębu endometrium poziomy prolaktyny i IGFBP1 wzrosły w sposób zależny od czasu.

Zależny od czasu wzrost wydzielanej prolaktyny został również potwierdzony poprzez badanie pożywek do hodowli tkankowych hES metodą ELISA. Specyficzny dla genu wpływ knockdownu na zmiany komórkowe i molekularne decydualizacji ludzkich komórek zrębu endometrium oceniano w szóstym dniu hodowli po 48-godzinnej transfekcji siRNA, z kontrolną lub koaktywatorem receptora steroidowego 2 siRNA. Kontrolna transfekowana siRNA hES wykazała zmiany komórkowe i molekularne, zgodne z prawidłową decydualizacją, w tym brukową zmianę morfologiczną i zwiększone poziomy transkryptów markerów decydualizacji PRL i IGFBP1.

W knockdown siRNA SRC-2 hES pozostał fibroblastyczny w wyglądzie w porównaniu z kontrolnym transfekowanym siRNA hES i wykazywał znacznie obniżone poziomy transkryptów PRL i IGFBP1. Poziomy transkryptów SRC-2 były znacznie zmniejszone w transfekowanym siRNA SRC-2 hES w porównaniu z kontrolnym siRNA, co wskazuje na przydatność tej metody do wyciszania genów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyizolować pierwotne komórki zrębu z biopsji endometrium w celu decydualizacji in vitro i knockdown określonego genu zainteresowania za pomocą transfekcji siRNA.