Wzbogacenie i charakterystyka mikrośrodowisk immunologicznych i nieimmunologicznych guza w ustalonych podskórnych guzach myszy

Ogólnym celem tej techniki jest zapewnienie metody jednoczesnego profilowania zarówno frakcji komórek immunologicznych, jak i nowotworowych, przyczyniających się do mikrośrodowiska immunologicznego guzów litych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie onkologii immunologicznej, takie jak to, jakie seryjne zmiany immunologiczne i nieimmunologiczne zachodzą w guzie po danym leczeniu. Główną zaletą tej techniki jest to, że ułatwia ona skuteczne wzbogacanie składników immunologicznych i nieimmunologicznych guza, umożliwiając dokładne profilowanie stanu immunologicznego guza.

Ogólnym celem tej metody jest skuteczne profilowanie mikrośrodowiska immunologicznego guza i identyfikacja zmian wywołanych leczeniem. Po spryskaniu myszy 70% etanolem, aby zapobiec zanieczyszczeniu włosów, chirurgicznie usuń guzy podskórne, uważając, aby guzy były wolne od jakiejkolwiek zanieczyszczającej tkanki. Następnie umieść każdy guz w 1,8 mililitra podstawowej pożywki RPMI 1640 bez płodowej surowicy bydlęcej w indywidualnych dołkach 24-dołkowej płytki na lodzie.

Kiedy wszystkie guzy zostaną zebrane, użyj nożyczek, aby pociąć próbki na mniej niż jeden milimetr sześcienny kawałki i dodaj 200 mikrolitrów świeżo przygotowanego 10-krotnego koktajlu dysocjacyjnego zawierającego kolagenazę-1, kolagenazę-4 i DNazę po jednym do każdej studzienki. Po jednej godzinie w temperaturze 37 stopni Celsjusza, w wytrząsarce orbitalnej z prędkością od 60 do 100 obr./min, zneutralizuj reakcję za pomocą jednego mililitra pożywki RPMI 1640 uzupełnionej 5% FBS i dwoma milimolowymi EDTA i użyj zmodyfikowanej końcówki pipety o pojemności jednego mililitra, aby przenieść każdą próbkę zawiesiny guza do pojedynczych 50-mililitrowych stożkowych probówek zwieńczonych indywidualnymi sitkami o średnicy 40 mikrometrów. Za pomocą 10-mililitrowego tłoka strzykawki mechanicznie zdezagreguj kawałki guza przez sitka, okresowo przepłukując każde sitko dwoma mililitrami pożywki RPMI 1640 plus 5% FBS, aż sitka oczyszczą się z guza.

Kiedy wszystkie guzy zostaną zdysocjowane, dodaj pożywkę do każdej probówki w razie potrzeby, aby doprowadzić wszystkie próbki do tej samej objętości i granulować komórki przez odwirowanie. Następnie użyj pięciomililitrowej pipety serologicznej, aby ponownie zawiesić granulki w dwóch mililitrach pożywki uzupełnionej FBS na probówkę. Aby oddzielić frakcje komórek immunologicznych i nowotworowych, dodaj trzy mililitry pożywki o gradiencie gęstości na dno jednej 15-mililitrowej stożkowej probówki na próbkę i powoli ułóż dwa mililitry zawiesiny komórek nowotworowych z boku każdej probówki na każdym gradiencie.

Należy upewnić się, że zawiesiny komórek nowotworowych są dobrze wymieszane przed nałożeniem warstw, że zawiesiny komórek są powoli pipetowane po boku probówek i że probówki są obsługiwane ostrożnie, aby zapobiec mieszaniu się warstw. Oddziel komórki przez wirowanie w gradiencie gęstości i ostrożnie zbierz górną pożywkę i warstwy leukocytów naciekające guz do jednej nowej 15-mililitrowej probówki na próbkę. Odrzuć pozostałe podłoże gradientu gęstości i ponownie zawieś granulki guza w dwóch mililitrach pożywki plus FBS na probówkę.

Następnie odwirować wszystkie próbki i ponownie zawiesić leukocyty naciekające guz w 200 mikrolitrach, a komórki nowotworowe w dwóch mililitrach pożywki plus FBS na probówkę na lodzie. Aby pokryć komórki, oznacz jedną 96-dołkową płytkę dolną w kształcie litery U dla każdego panelu barwienia immunologicznego oraz dodatkową płytkę do zliczania komórek i podwielokrotnie zawiesiny pojedynczych komórek na każdą z płytek panelu barwiącego i płytkę wapienną. Umyj komórki dwa razy 200 mikrolitrami PBS Dulbecco na próbkę i zablokuj komórki 50 mikrolitrami bloku FC na studzienkę przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Pod koniec inkubacji blokującej dodaj 50 mikrolitrów 2X stężonego zewnątrzkomórkowego przeciwciała ukierunkowanego i możliwej do naprawienia mieszaniny barwienia żywotności do każdej studzienki na 30-minutową inkubację w ciemności. Pod koniec inkubacji barwienia przemyć próbki dwukrotnie buforem FACS i ponownie zawiesić granulki w 200 mikrolitrach roztworu utrwalającego i przepuszczalnego przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, chroniąc przed światłem. Następnego dnia zebrać komórki przez odwirowanie, a następnie przepłukać 200 mikrolitrami buforu przepuszczalnego na studzienkę.

Oznacz komórki 100 mikrolitrami wewnątrzkomórkowego panelu barwienia przeciwciał w buforze permeabilizacji na 30-minutową inkubację w ciemności, a następnie kolejne płukanie buforem permeabilizacji. Następnie ponownie przemyć komórki buforem FACS i ponownie zawiesić próbki w 300 mikrolitrach świeżego buforu FACS w celu ich analizy za pomocą cytometrii przepływowej. Trawienie guza, jak wykazano, z lub bez wzbogacenia pożywki gradientem gęstości, daje około 70 do 90% żywotną populację całych komórek nowotworowych, ocenianą za pomocą cytometrii przepływowej.

Wzbogacenie pożywki gradientem gęstości sprzyja ponad dwukrotnemu wzrostowi frakcji leukocytów naciekającej nowotwór CD45 w porównaniu z niewzbogaconym trawieniem guza, a także licznymi podzbiorami komórek odpornościowych powszechnie obserwowanymi w badaniach mikrośrodowiska immunologicznego. Frakcja komórek nowotworowych CD45 ujemna może być również profilowana pod kątem wielu cech guza, takich jak ogólna żywotność guza lub apoptoza, zdolność proliferacji i ekspresja różnych markerów immunosupresyjnych. Aby określić, w jaki sposób podzbiory immunologiczne szpiku i limfocytów różnią się w pojedynczym guzie litym, guz można podzielić na cztery równe części w taki sposób, aby każda sekcja zawierała w przybliżeniu równe obszary wewnątrznowotworowe, a także równe części skórne i otrzewnowe.

Każdy fragment może być następnie trawiony oddzielnie i analizowany, jak wykazano, pod kątem obecności różnych populacji komórek odpornościowych. Po opanowaniu tej techniki można wykonać w ciągu czterech do 8 godzin, w zależności od liczby posiadanych próbek. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pracować szybko, ale wydajnie, aby zachować żywotność komórek.

Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy dysocjacji i separacji obejmują techniki, których trudno jest się nauczyć za pomocą samego tekstu pisanego. Po tej procedurze można wykonać cytometrię przepływową, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące tego, jak zmieniają się populacje komórkowe w guzie, zarówno pod względem liczebności, jak i fenotypu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak oddzielić i przeanalizować zarówno immunologiczne, jak i nieimmunologiczne składniki ustalonego podskórnego guza myszy przy użyciu zademonstrowanych technik trawienia i separacji gradientu gęstości.