Wzbogacenie i charakterystyka mikrośrodowisk immunologicznych i nieimmunologicznych guza w ustalonych podskórnych guzach myszy
7 czerwca 2018
Tutaj opisujemy metodę rozdzielania i wzbogacania składników mikrośrodowiska immunologicznego i nieimmunologicznego guza w ustalonych guzach podskórnych. Technika ta pozwala na oddzielną analizę nacieków immunologicznych guza i nieimmunologicznych frakcji guza, co może pozwolić na kompleksową charakterystykę mikrośrodowiska immunologicznego guza.
Ogólnym celem tej techniki jest zapewnienie metody jednoczesnego profilowania zarówno frakcji komórek immunologicznych, jak i nowotworowych, przyczyniających się do mikrośrodowiska immunologicznego guzów litych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie onkologii immunologicznej, takie jak to, jakie seryjne zmiany immunologiczne i nieimmunologiczne zachodzą w guzie po danym leczeniu. Główną zaletą tej techniki jest to, że ułatwia ona skuteczne wzbogacanie składników immunologicznych i nieimmunologicznych guza, umożliwiając dokładne profilowanie stanu immunologicznego guza.
Ogólnym celem tej metody jest skuteczne profilowanie mikrośrodowiska immunologicznego guza i identyfikacja zmian wywołanych leczeniem. Po spryskaniu myszy 70% etanolem, aby zapobiec zanieczyszczeniu włosów, chirurgicznie usuń guzy podskórne, uważając, aby guzy były wolne od jakiejkolwiek zanieczyszczającej tkanki. Następnie umieść każdy guz w 1,8 mililitra podstawowej pożywki RPMI 1640 bez płodowej surowicy bydlęcej w indywidualnych dołkach 24-dołkowej płytki na lodzie.
Kiedy wszystkie guzy zostaną zebrane, użyj nożyczek, aby pociąć próbki na mniej niż jeden milimetr sześcienny kawałki i dodaj 200 mikrolitrów świeżo przygotowanego 10-krotnego koktajlu dysocjacyjnego zawierającego kolagenazę-1, kolagenazę-4 i DNazę po jednym do każdej studzienki. Po jednej godzinie w temperaturze 37 stopni Celsjusza, w wytrząsarce orbitalnej z prędkością od 60 do 100 obr./min, zneutralizuj reakcję za pomocą jednego mililitra pożywki RPMI 1640 uzupełnionej 5% FBS i dwoma milimolowymi EDTA i użyj zmodyfikowanej końcówki pipety o pojemności jednego mililitra, aby przenieść każdą próbkę zawiesiny guza do pojedynczych 50-mililitrowych stożkowych probówek zwieńczonych indywidualnymi sitkami o średnicy 40 mikrometrów. Za pomocą 10-mililitrowego tłoka strzykawki mechanicznie zdezagreguj kawałki guza przez sitka, okresowo przepłukując każde sitko dwoma mililitrami pożywki RPMI 1640 plus 5% FBS, aż sitka oczyszczą się z guza.
Kiedy wszystkie guzy zostaną zdysocjowane, dodaj pożywkę do każdej probówki w razie potrzeby, aby doprowadzić wszystkie próbki do tej samej objętości i granulować komórki przez odwirowanie. Następnie użyj pięciomililitrowej pipety serologicznej, aby ponownie zawiesić granulki w dwóch mililitrach pożywki uzupełnionej FBS na probówkę. Aby oddzielić frakcje komórek immunologicznych i nowotworowych, dodaj trzy mililitry pożywki o gradiencie gęstości na dno jednej 15-mililitrowej stożkowej probówki na próbkę i powoli ułóż dwa mililitry zawiesiny komórek nowotworowych z boku każdej probówki na każdym gradiencie.
Należy upewnić się, że zawiesiny komórek nowotworowych są dobrze wymieszane przed nałożeniem warstw, że zawiesiny komórek są powoli pipetowane po boku probówek i że probówki są obsługiwane ostrożnie, aby zapobiec mieszaniu się warstw. Oddziel komórki przez wirowanie w gradiencie gęstości i ostrożnie zbierz górną pożywkę i warstwy leukocytów naciekające guz do jednej nowej 15-mililitrowej probówki na próbkę. Odrzuć pozostałe podłoże gradientu gęstości i ponownie zawieś granulki guza w dwóch mililitrach pożywki plus FBS na probówkę.
Następnie odwirować wszystkie próbki i ponownie zawiesić leukocyty naciekające guz w 200 mikrolitrach, a komórki nowotworowe w dwóch mililitrach pożywki plus FBS na probówkę na lodzie. Aby pokryć komórki, oznacz jedną 96-dołkową płytkę dolną w kształcie litery U dla każdego panelu barwienia immunologicznego oraz dodatkową płytkę do zliczania komórek i podwielokrotnie zawiesiny pojedynczych komórek na każdą z płytek panelu barwiącego i płytkę wapienną. Umyj komórki dwa razy 200 mikrolitrami PBS Dulbecco na próbkę i zablokuj komórki 50 mikrolitrami bloku FC na studzienkę przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Pod koniec inkubacji blokującej dodaj 50 mikrolitrów 2X stężonego zewnątrzkomórkowego przeciwciała ukierunkowanego i możliwej do naprawienia mieszaniny barwienia żywotności do każdej studzienki na 30-minutową inkubację w ciemności. Pod koniec inkubacji barwienia przemyć próbki dwukrotnie buforem FACS i ponownie zawiesić granulki w 200 mikrolitrach roztworu utrwalającego i przepuszczalnego przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, chroniąc przed światłem. Następnego dnia zebrać komórki przez odwirowanie, a następnie przepłukać 200 mikrolitrami buforu przepuszczalnego na studzienkę.
Oznacz komórki 100 mikrolitrami wewnątrzkomórkowego panelu barwienia przeciwciał w buforze permeabilizacji na 30-minutową inkubację w ciemności, a następnie kolejne płukanie buforem permeabilizacji. Następnie ponownie przemyć komórki buforem FACS i ponownie zawiesić próbki w 300 mikrolitrach świeżego buforu FACS w celu ich analizy za pomocą cytometrii przepływowej. Trawienie guza, jak wykazano, z lub bez wzbogacenia pożywki gradientem gęstości, daje około 70 do 90% żywotną populację całych komórek nowotworowych, ocenianą za pomocą cytometrii przepływowej.
Wzbogacenie pożywki gradientem gęstości sprzyja ponad dwukrotnemu wzrostowi frakcji leukocytów naciekającej nowotwór CD45 w porównaniu z niewzbogaconym trawieniem guza, a także licznymi podzbiorami komórek odpornościowych powszechnie obserwowanymi w badaniach mikrośrodowiska immunologicznego. Frakcja komórek nowotworowych CD45 ujemna może być również profilowana pod kątem wielu cech guza, takich jak ogólna żywotność guza lub apoptoza, zdolność proliferacji i ekspresja różnych markerów immunosupresyjnych. Aby określić, w jaki sposób podzbiory immunologiczne szpiku i limfocytów różnią się w pojedynczym guzie litym, guz można podzielić na cztery równe części w taki sposób, aby każda sekcja zawierała w przybliżeniu równe obszary wewnątrznowotworowe, a także równe części skórne i otrzewnowe.
Każdy fragment może być następnie trawiony oddzielnie i analizowany, jak wykazano, pod kątem obecności różnych populacji komórek odpornościowych. Po opanowaniu tej techniki można wykonać w ciągu czterech do 8 godzin, w zależności od liczby posiadanych próbek. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pracować szybko, ale wydajnie, aby zachować żywotność komórek.
Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy dysocjacji i separacji obejmują techniki, których trudno jest się nauczyć za pomocą samego tekstu pisanego. Po tej procedurze można wykonać cytometrię przepływową, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące tego, jak zmieniają się populacje komórkowe w guzie, zarówno pod względem liczebności, jak i fenotypu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak oddzielić i przeanalizować zarówno immunologiczne, jak i nieimmunologiczne składniki ustalonego podskórnego guza myszy przy użyciu zademonstrowanych technik trawienia i separacji gradientu gęstości.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia metodę separacji i wzbogacania komponentów immunologicznego i nieimmunologicznego mikrośrodowiska guza w uformowanych guzach podskórnych. Technika ta umożliwia analizę nacieku immunologicznego oraz nieimmunologicznych frakcji guza, co ułatwia kompleksową charakterystykę immunologicznego mikrośrodowiska nowotworu.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Onkologia
- Immunologia
- Biologia komórki
Wstęp
- Zrozumienie immunologicznego mikrośrodowiska guza ma kluczowe znaczenie dla leczenia nowotworów.
- Profilowanie komponentów immunologicznych i nieimmunologicznych może ujawnić zmiany wywołane leczeniem.
- Obecne metody mogą nie oddzielać tych komponentów w sposób efektywny.
- Niniejsze badanie wprowadza nowatorską technikę pozwalającą na dokładniejszą analizę.
Cel badania
- Zapewnienie metody jednoczesnego profilowania frakcji komórek odpornościowych i nowotworowych.
- Identyfikacja zmian w mikrośrodowisku guza po zastosowaniu leczenia.
- Udoskonalenie zrozumienia immunologicznych stanów nowotworu.
Zastosowane metody
- Spryskanie myszy 70% etanolem w celu zapobiegania kontaminacji.
- Chirurgiczne usunięcie guzów podskórnych z unikaniem zanieczyszczenia tkanek.
- Umieszczenie guzów w pożywce RPMI 1640 na lodzie w celu przeprowadzenia analizy.
- Wykorzystanie płytki 24-dołkowej do przetwarzania poszczególnych guzów.
Główne wyniki
- Technika ta skutecznie wzbogaca immunologiczne i nieimmunologiczne komponenty guza.
- Umożliwia dokładne profilowanie stanu immunologicznego guza.
- Ułatwia identyfikację zmian wywołanych leczeniem.
- Dostarcza informacji na temat dynamiki mikrośrodowiska guza.
Wnioski
- Metoda ta stanowi znaczący postęp w analizie mikrośrodowiska nowotworowego.
- Może ona pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie immunoonkologii.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tej technice w celu uzyskania głębszych informacji.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Dokładna charakterystyka immunologicznego mikrośrodowiska guza jest niezbędna do oceny skuteczności immunoterapii w modelach przedklinicznych. Metoda ta umożliwia oddzielenie i wzbogacenie frakcji immunologicznych oraz nieimmunologicznych guza, co wspiera powtarzalne profilowanie zmian indukowanych leczeniem. Rozwiązuje ona kluczowy problem na etapie odkrywania leków poprzez zwiększenie wydajności i żywotności komórek immunologicznych do późniejszej analizy metodą cytometrii przepływowej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez izolację leukocytów naciekających guz do analizy fenotypowej i funkcjonalnej.
- Wartość operacyjna: Zwiększa wydajność uzyskiwania komórek odpornościowych CD45+ ponad dwukrotnie w porównaniu do standardowego trawienia, co poprawia wykrywalność rzadkich subpopulacji.
- Pewność prognostyczna: Wspiera walidację celu poprzez zachowanie żywotności komórkowej i umożliwienie oceny markerów immunosupresyjnych we frakcji guza.
Przesiew i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Pozwala na otrzymanie żywotnych zawiesin pojedynczych komórek odpowiednich do wielobarwnego barwienia przeciwciałami oraz ilościowego oznaczania subpopulacji immunologicznych metodą cytometrii przepływowej.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje dysocjację guza oraz separację opartą na gęstości, co redukuje zmienność między próbkami i operatorami.
- Gotowość do analizy: Umożliwia przygotowanie wzbogaconych frakcji immunologicznych i nowotworowych do spójnego immunofenotypowania i testów funkcjonalnych w procesach przesiewowych nowych leków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Umożliwia profilowanie przestrzenne heterogeniczności immunologicznej poprzez oddzielną digestię kwadrantów guza, co wspiera badania korelacji biomarkerów.
- Znaczenie modeli przedklinicznych: Ułatwia ocenę nowych immunoterapii poprzez ilościowe określanie zmian w populacjach mieloidalnych i limfocytach wywołanych leczeniem.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Pozwala na równoległą analizę żywotności komórek nowotworowych, apoptozy, proliferacji oraz ekspresji markerów immunosupresyjnych wraz z profilowaniem immunologicznym.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w cykl badań w obszarze biologii odkrywczej, umożliwiając profilowanie immunologiczne przed etapami identyfikacji wiodących związków oraz walidacji przedklinicznej, poprzez dostarczanie zestandaryzowanych, żywotnych frakcji komórek pochodzących z guza.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez izolowanie komponentów immunologicznych i nowotworowych do niezależnej analizy.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalnych, ilościowych wyników analizy komórek odpornościowych, co umożliwia porównywanie różnych warunków terapeutycznych w badaniach przesiewowych w obszarze immunoonkologii.
- Analityka: Pozwala na otrzymanie zawiesin pojedynczych komórek kompatybilnych z cytometrią przepływową, charakteryzujących się wysoką żywotnością (70–90%) i zwiększonym wzbogaceniem w komórki odpornościowe dla szczegółowej analizy fenotypowej.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki badań odkrywczych z ciągłością przedkliniczną, umożliwiając podłużny monitoring immunologiczny w obrębie poszczególnych guzów.
- Zastosowanie w organizacji: Ustanawia standaryzowany protokół dysocjacji i separacji, który można zastosować w wielu modelach guzów podskórnych oraz interwencjach terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Poprawia pewność prognostyczną w walidacji celów poprzez zmniejszenie niejednoznaczności mechanistycznej w interakcjach między układem odpornościowym a guzem.
- Wartość operacyjna: Zwiększa powtarzalność i skalowalność przetwarzania guzów dzięki określonym etapom dysocjacji enzymatycznej i separacji w gradiencie gęstości.
- Wartość strategiczna: Wspiera lepsze podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go), dostarczając mierzalne odpowiedzi komórek odpornościowych i nowotworowych na terapie eksperymentalne.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów do immunoterapii z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o głębokie profilowanie mikrośrodowiska immunologicznego.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w technikach aseptycznego pobierania guza, trawienia enzymatycznego oraz wirowania w gradiencie gęstości.
- Procedura zależy od dostępu do inkubatorów orbitalnych, wirówek, sitek oraz aparatury do cytometrii przepływowej w celu przeprowadzenia dalszych analiz.
- Niezbędna jest standaryzacja działań między zespołami, aby zapewnić spójny czas dysocjacji guza, oczyszczanie sitek oraz warstwowanie gradientu w celu zapobiegania mieszaniu się próbek.
- W ramach adaptacji metody należy rozważyć optymalizację stężenia enzymu i czasu inkubacji dla różnych typów guzów, dbając o zachowanie żywotności komórek.
- Ograniczenia praktyczne obejmują konieczność starannego rozbicia mechanicznego, aby uniknąć zapchania sitka, oraz znaczenie niezwłocznego przetwarzania próbek w celu zachowania ich żywotności.
