Name: Wzbogacenie i charakterystyka mikrośrodowisk immunologicznych i nieimmunologicznych guza w ustalonych podskórnych guzach myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-07T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Odkryj metodę wzbogacania i analizy mikrośrodowiska immunologicznego oraz nieimmunologicznego guza w podskórnych guzach myszy. Technika ta umożliwia szczegółowe profilowanie frakcji komórek odpornościowych i nowotworowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

JMN dziękuje za wsparcie finansowe od National Institute of General Medical Sciences (T32GM088129) oraz National Institute of Dental & Craniofacial Research (F31DE026682) należących do National Institutes of Health. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health. Projekt ten był również wspierany przez Cytometry and Cell Sorting Core w Baylor College of Medicine dzięki finansowaniu z NIH (P30 AI036211, P30 CA125123 i S10 RR024574) oraz pomocy eksperta Joela M. Sederstroma.

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) Baylor College of Medicine.
1. Zbieranie i trawienie nowotworów
UWAGA: Czas potrzebny na zbiór to ~3 - 5 min/guz, a czas potrzebny na przetwarzanie to ~1 h + 2 - 3 min/guz.
<ol>
	<li>Poddaj myszy eutanazji przez wdychanie dwutlenku węgla i spryskaj każdą mysz 70% etanolem przed zbiorem, aby zapobiec zanieczyszczeniu włosów. Chirurgicznie usuń guzy podskórne od myszy i upewnij się, że guzy są wolne od jakiejkolwiek zanieczyszczającej tkanki (tj. włosów, skóry, otrzewnej itp.). Umieść każdy guz w 1,8 ml podłoża bazowego RPMI-1640 bez płodowej surowicy bydlęcej (FBS) na 24-dołkowej płytce. W przypadku większych zbiorów utrzymuj talerze w chłodnym miejscu na lodzie, aby zachować żywotność komórek. 
	UWAGA: Jeśli wymagana jest sterylność, wszystkie wycięcia guza będą musiały zostać wykonane w komorze bezpieczeństwa biologicznego ze sterylnymi narzędziami chirurgicznymi (tj. nożyczkami, kleszczami itp.), a także wszelkie dalsze kroki. Guzy o najdłuższej średnicy między 0,5 - 1 cm są optymalne, a większe lub mniejsze guzy będą wymagały skalowania odczynników.</li>
	<li>Użyj nożyczek, aby pociąć guzy na mniej niż 1 mm3 kawałki w każdym dołku.</li>
	<li>Przygotuj 10-krotny koktajl trawienny, rozpuszczając kolagenazę I w stężeniu 10 mg/ml, kolagenazę IV w stężeniu 2,500 U/ml i DNazę I w stężeniu 200 U/ml w pożywce zasadowej RPMI-1640 (bez FBS). 
	UWAGA: Koktajl na trawienie można przygotować dzień wcześniej i przechowywać w temperaturze -20 °C; Nie zaleca się jednak długotrwałego przechowywania, ponieważ enzymy po rozpuszczeniu z czasem tracą aktywność.</li>
	<li>Dodaj 200 μl 10x koktajlu dysocjacyjnego zawierającego kolagenazę I, kolagenazę IV i DNazę I do każdej studzienki z 1 mm3 kawałkami.</li>
	<li>Pozostawić próbki do trawienia przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, lekko wstrząsając przy 60–100 obr./min za pomocą wytrząsarki orbitalnej. 
	UWAGA: Podniesienie temperatury do 37 °C podczas trawienia enzymatycznego może spowodować aktywację komórek odpornościowych.</li>
	<li>Po 1 godzinie zneutralizować reakcję, dodając do każdej studzienki 1 ml pożywki RPMI-1640 uzupełnionej 5% FBS i 2 mM EDTA.</li>
	<li>Pipetować trawienie guza i pozostałe kawałki guza do sitka do komórek o wielkości 40 μm umieszczonego na górze probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. 
	UWAGA: Odetnij końcówkę końcówki pipety o pojemności 1 ml, aby ułatwić przenoszenie trawienia guza do sitka.</li>
	<li>Użyj tłoka strzykawki o pojemności 10 ml, aby mechanicznie zdezagregować kawałki guza przez sitko. Okresowo płukać sitko 2 ml uzupełnionej pożywki RPMI-1640 (zawierającej 5% FBS) i powtarzać, aż sitko komórkowe będzie wolne od guza. 
	UWAGA: Około 4 - 10 ml całkowitej pożywki powinno wystarczyć do odpowiedniego przepłukania sitka guza. 
	UWAGA: Umieść próbki na lodzie do momentu zakończenia tego etapu dla wszystkich próbek, aby zachować żywotność komórek.</li>
	<li>Ustaw każdą probówkę wirówkową o pojemności 50 ml do tej samej objętości za pomocą uzupełnionej pożywki RPMI-1640. 
	UWAGA: Regulacja objętości ma kluczowe znaczenie dla równoważenia wirówki. Pominięcie tego kroku może spowodować uszkodzenie wirówki lub obrażenia ciała.</li>
	<li>Zawiesiny komórek odwirować (5 min, 805 x g, 4 °C), odrzucić supernatanty i ponownie zawiesić w 2 ml uzupełnionej pożywki RPMI-1640. 
	UWAGA: W wyniku wirowania może powstać agregat komórek, który jest trudny do ponownego zawieszenia. Użyj pipety serologicznej o pojemności 5 ml i szybko wymieszaj, aby ją rozdrobnić przed kontynuowaniem.</li>
</ol>
2. Rozdział frakcji immunologicznej i nowotworowej
UWAGA: Czas potrzebny na ten krok to około 1 godziny.
<ol>
	<li>Dodać 3 ml pożywki o gradiencie gęstości na dno probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Przygotuj i oznacz wystarczającą ilość probówek dla każdego guza.</li>
	<li>Ułóż 2 ml zawiesiny komórek nowotworowych na pożywce o gradiencie gęstości, pipetując powoli bok probówki, aby zapobiec mieszaniu się dwóch warstw.</li>
	<li>Ostrożnie umieścić warstwowe probówki w wirówce i wirować przez 20 minut w temperaturze 805 x g, 20 °C, bez hamulca. 
	UWAGA: Niezwykle ważne jest, aby sprawdzić prawidłowe wyważenie i upewnić się, że podczas wirowania nie jest używany hamulec. Jakiekolwiek zakłócenie tego procesu spowoduje wymieszanie warstw, a pełne odzyskanie próbki będzie trudne.</li>
	<li>Ostrożnie przenieś warstwę leukocytów naciekających guz (TIL) i górną warstwę pożywki do nowej probówki o pojemności 15 ml za pomocą pipety transferowej. Wyrzuć całą pozostałą pożywkę o gradiencie gęstości i ponownie zawieś osad guza na dnie probówki w 2 ml uzupełnionego RPMI-1640. 
	UWAGA: Po odwirowaniu będą widoczne cztery warstwy od góry do dołu, które odpowiednio odpowiadają: pożywce, TIL, pożywce o gradiencie gęstości i osadowi komórek nowotworowych. Zobacz Rysunek 2A dla przykładu różnych warstw.</li>
	<li>Odwirować zarówno TIL, jak i próbki guza w oddzielnych probówkach (5 min, 805 x g, 4 °C) i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Ponownie zawiesić próbkę TIL w 200 μl, a osad nowotworowy w 2 ml uzupełnionej pożywki RPMI-1640. Przechowywać na lodzie, aby zachować żywotność.</li>
</ol>
3. Poszycie i barwienie
Uwaga: Czas potrzebny na posiew to 30 s/guz; czas potrzebny na barwienie powierzchni to 1 h; czas potrzebny na barwienie wewnątrzkomórkowe to 40 minut; czas potrzebny na analizę cytometrii przepływowej to 1 - 4 min/guz.
<ol>
	<li>Przygotuj i oznacz 96-dołkową płytkę dolną w kształcie litery U dla każdego panelu barwienia immunologicznego oraz dodatkową płytkę do liczenia komórek. 
	UWAGA: Zazwyczaj przygotowuje się w sumie trzy płytki: płytkę panelową skoncentrowaną na limfocytach, płytkę panelową skoncentrowaną na szpiku i płytkę do zliczania komórek.</li>
	<li>Zawiesiny jednokomórkowe należy rozdzielić na każdą z płytek panelu barwiącego, a określoną objętość na płytkę policzniową. 
	UWAGA: Płytka zliczająca służy do obliczania całkowitej liczby komórek dodanych do każdego panelu barwienia, umożliwiając w ten sposób dokładne zliczanie populacji komórek. Cytometr przepływowy z możliwością pobierania próbek na płytkach 96-dołkowych i analizy objętościowej może podać liczbę komórek na μl w każdej próbce, a tym samym obliczyć liczbę komórek dodanych do każdego panelu barwienia. Płytki zliczające można pobrać następnego dnia po utrwaleniu przez noc w temperaturze 4 °C, przepłukaniu buforem FAC (sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) z 2% FBS) i ponownym umieszczeniu w ustalonej objętości buforu FAC.</li>
	<li>Przepłukać komórki dwukrotnie 200 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (DPBS) firmy Dulbecco na próbkę, odwirowując (5 min, 805 x g, 4 °C) i odrzucając supernatant między każdym płukaniem w celu usunięcia wolnego FBS.</li>
	<li>Dodać 50 μl bloku Fc, wymieszać próbki za pomocą pipety wielokanałowej i inkubować przez 20 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Dodać 50 μl 2x skoncentrowanego zewnątrzkomórkowego przeciwciała ukierunkowanego i możliwej do utrwalenia mieszaniny barwienia żywotności, wymieszać za pomocą pipety wielokanałowej i inkubować przez 30 minut w ciemności w temperaturze pokojowej lub 4 °C. 
	UWAGA: Dokładne warunki barwienia przeciwciała zależą od instrukcji producenta. Wszystkie rozcieńczenia barwienia muszą być w DPBS, bez dodatku FBS, aby zapobiec nasyceniu możliwego do utrwalenia barwnika żywotności. Prosimy o zapoznanie się z Tabelą materiałów/sprzętu w celu uzyskania informacji na temat optymalnych rozcieńczeń panelu barwiącego użytego w tym manuskrypcie. Przeciwciało i dający się utrwalić roztwór barwiący o żywotności przygotowuje się w stężeniu 2x, aby zapewnić końcowe stężenie barwiące 1x w 100 μl całkowitej objętości barwienia po dodaniu do bloku Fc.</li>
	<li>Przepłukać próbki dwukrotnie buforem FAC przez odwirowanie (5 min, 805 x g, 4 °C) i odrzucenie supernatantów między każdym płukaniem.</li>
	<li>Zawiesić ponownie w 200 μl 1x roztworu utrwalającego/przepuszczalnego i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem. 
	UWAGA: W tym momencie eksperyment można przerwać na noc: próbki należy chronić przed światłem w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Następnego dnia odwirować płytki (5 min, 805 x g, 4 °C) i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Przepłukać raz 200 μl 1x buforu permeabilizacyjnego, odwirować (5 min, 805 x g, 4 °C) i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Dodać 100 μL 1x skoncentrowany wewnątrzkomórkowy panel do barwienia przeciwciał przygotowany w 1x buforze permeabilizacyjnym i inkubować przez 30 minut w ciemności w temperaturze RT lub 4 °C (zależy to od zaleceń producenta dotyczących barwienia).</li>
	<li>Przepłukać raz 1x buforem permeabilizacyjnym (5 min, 805 x g, 4 °C), wyrzucić supernatant i przepłukać po raz drugi buforem FAC (PBS z 2% FBS).</li>
	<li>Zawiesić próbki w 300 μl buforu FAC (PBS z 2% FBS), przenieść próbki do probówek do cytometrii przepływowej i przeprowadzić analizę cytometrii przepływowej.</li>
</ol>

<ol><li>Fouad, Y. A., Aanei, C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5446472/">Revisiting the hallmarks of cancer.</a> American Journal of Cancer Research. 7 (5), 1016-1036 (2017).</li>
<li>Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. -X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+and+adaptive+immune+cells+in+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment.</a> Nature Immunology. 14 (10), 1014-1022 (2013).</li>
<li>Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tumor+microenvironment+and+its+role+in+promoting+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth.</a> Oncogene. 27 (45), 5904-5912 (2008).</li>
<li>Chiou, V. L., Burotto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudoprogression+and+Immune-Related+Response+in+Solid+Tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Pseudoprogression and Immune-Related Response in Solid Tumors.</a> Journal of Clinical Oncology. 33 (31), 3541-3543 (2015).</li>
<li>Menon, S., Shin, S., Dy, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+Cancer+Immunotherapy+in+Solid+Tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Advances in Cancer Immunotherapy in Solid Tumors.</a> Cancers. 8 (12), 106(2016).</li>
<li>Denkert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-Associated+Lymphocytes+As+an+Independent+Predictor+of+Response+to+Neoadjuvant+Chemotherapy+in+Breast+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Tumor-Associated Lymphocytes As an Independent Predictor of Response to Neoadjuvant Chemotherapy in Breast Cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 28 (1), 105-113 (2010).</li>
<li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+effects+of+ablative+radiation+on+local+tumor+require+CD8%2B+T+cells%3A+changing+strategies+for+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Therapeutic effects of ablative radiation on local tumor require CD8+ T cells: changing strategies for cancer treatment.</a> Blood. 114 (3), 589-595 (2009).</li>
<li>Stakheyeva, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+immune+component+of+tumor+microenvironment+in+the+efficiency+of+cancer+treatment%3A+perspectives+for+the+personalized+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Design%22%5BJournal%5D)">Role of the immune component of tumor microenvironment in the efficiency of cancer treatment: perspectives for the personalized therapy.</a> Current Pharmaceutical Design. 23, (2017).</li>
<li>Gerner, M. Y., Kastenmuller, W., Ifrim, I., Kabat, J., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histo-Cytometry%3A+A+Method+for+Highly+Multiplex+Quantitative+Tissue+Imaging+Analysis+Applied+to+Dendritic+Cell+Subset+Microanatomy+in+Lymph+Nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Histo-Cytometry: A Method for Highly Multiplex Quantitative Tissue Imaging Analysis Applied to Dendritic Cell Subset Microanatomy in Lymph Nodes.</a> Immunity. 37 (2), 364-376 (2012).</li>
<li>Bayne, L. J., Vonderheide, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+Flow+Cytometric+Analysis+of+Immune+Cell+Subsets+in+Tumor-Bearing+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Multicolor Flow Cytometric Analysis of Immune Cell Subsets in Tumor-Bearing Mice.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), (2013).</li>
<li>Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+murine+small+intestine+leukocyte+isolation+for+global+immune+phenotype+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis.</a> Journal of Immunological Methods. 405, 97-108 (2014).</li>
<li>Casadevall, A., Fang, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rigorous+Science%3A+A+How-To+Guide%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Rigorous Science: A How-To Guide.</a> mBio. 7 (6), 01902-01916 (2016).</li>
<li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CyTOF+supports+efficient+detection+of+immune+cell+subsets+from+small+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">CyTOF supports efficient detection of immune cell subsets from small samples.</a> Journal of Immunological Methods. 415, 1-5 (2014).</li>
<li>Kay, A. W., Strauss-Albee, D. M., Blish, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+Mass+Cytometry+%28CyTOF%29+for+Functional+and+Phenotypic+Analysis+of+Natural+Killer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Application of Mass Cytometry (CyTOF) for Functional and Phenotypic Analysis of Natural Killer Cells.</a> Methods Mol. Biol. 1441, 13-26 (2016).</li>
<li>Pachynski, R. K., Scholz, A., Monnier, J., Butcher, E. C., Zabel, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Tumor-infiltrating+Leukocyte+Subsets+in+a+Subcutaneous+Tumor+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

TIME składa się z różnorodnych i złożonych składników komórkowych i molekuł. Najnowsze dowody sugerują, że dokładna charakterystyka tego środowiska może zapewnić lepsze zrozumienie sukcesu lub niepowodzenia leczenia, a nawet może pomóc w identyfikacji mechanizmów oporności terapeutycznej. Na przykład zwiększenie poziomu wewnątrz guza różnych komórek immunosupresyjnych (tj. MDSC, komórek regulatorowych T itp.) może złagodzić efektorową odpowiedź immunologiczną i znieść efekty immunoterapeutyczne. Z drugi...

Tłumiący CZAS został niedawno uznany za cechę charakterystyczną raka i jest znany z tego, że odgrywa znaczącą rolę w rozwoju, progresji i ochronie nowotworów litych, a także łagodzi ich podatność na immunoterapię1. TIME składa się z licznych podzbiorów komórkowych i fenotypów, z których wszystkie zapewniają krytyczny wgląd w stan immunologiczny guza. Te podzbiory immunologiczne mogą być dalej stratyfikowane na komórki pochodzenia limfocytowego lub szpikowego, które razem stanowią większość wrodzonych i nabytych odpowiedzi immunologicznych2,3. Ostatnie postępy w dziedzinie immunoterapii nowotworów wykazały, że strategie immunoterapeutyczne (tj. inhibitory immunologicznych punktów kontrolnych, limfocyty T chimerycznego receptora antygenowego itp.) mogą potencjalnie wywołać trwałe regresje raka; Pozostają one jednak stosunkowo nieskuteczne w przypadku nowotworów litych<klasa SUP="xref">4,<klasa SUP="XREF">5. Wiele grup wykazało krytyczną przeszkodę, jaką TIME może odegrać dla powodzenia leczenia6,7, a zatem pozostaje potrzeba dokładnej oceny nowych immunoterapii w warunkach przedklinicznych, w szczególności koncentrując się na ich zdolności do modulowania lub przezwyciężania TIME8.
Obecne wysiłki mające na celu scharakteryzowanie CZASU zazwyczaj wykorzystują mikroskopię lub cytometrię przepływową wraz ze strategiami znakowania przeciwciał w celu identyfikacji podzbiorów komórek odpornościowych i ich cech9,10. Te dwie strategie dostarczają wyjątkowo różnych informacji, ponieważ mikroskopia umożliwia przestrzenną ocenę podzbiorów komórkowych, a cytometria przepływowa zapewnia wysoką przepustowość i szerszą kwantyfikację zmian komórkowych. Pomimo ostatnich ulepszeń w immunohistochemii fluorescencyjnej multipleksów, optymalizujących systemy obrazowania spektralnego, które obecnie mogą obsługiwać do 7 parametrów, ograniczony rozmiar panelu utrudnia profilowanie immunologiczne na szerokim poziomie, a zatem technika ta jest często zarezerwowana dla bardziej ukierunkowanych analiz. W rezultacie cytometria przepływowa pozostaje jedną z najczęściej stosowanych technik profilowania immunologicznego. Pomimo jego powszechnego zastosowania w charakterystyce TIME, metody stosowane do przetwarzania i barwienia są dość zmienne. Najczęściej protokoły wykorzystują enzym dysocjujący guz (tj. kolagenazy, DNazę itp.) i ręczne metody dysocjacji w celu uzyskania zawiesin pojedynczych komórek, a następnie barwienie i analizę przeciwciał7. Pomimo korzyści płynących z każdej metody, liczne grupy wykazały dużą zmienność, którą można wywołać za pomocą tych technik11. To sprawia, że porównania między badaniami profilowania mikrośrodowiska guza są niezwykle trudne, nawet w przypadku oceny tego samego mysiego modelu guza. Co więcej, metody te dają ograniczony potencjał do niezależnej oceny składników nacieku komórkowego guza i układu immunologicznego guza, ponieważ oba składniki są przeplatane po trawieniu. Ilość próbki ogranicza następnie barwienie i analizę wielopanelową, co staje się głównym problemem przy próbie scharakteryzowania rzadkich podzbiorów immunologicznych (tj. limfocytów T specyficznych dla nowotworu)12. Nowsze techniki, takie jak cytometria masowa lub cytometria według czasu przelotu (CyTOF), umożliwiają wielowymiarową analizę fenotypową podzbiorów komórkowych, przy czym niektóre systemy obsługują projekty paneli o więcej niż 42 niezależnych parametrach13. Pomimo ogromnej mocy technologii CyTOF w profilowaniu immunologicznym, pozostaje ona ograniczona ze względu na koszty, wiedzę analityczną i dostęp do sprzętu. Ponadto wiele protokołów CyTOF zaleca oczyszczanie podzbiorów immunologicznych w celu poprawy stosunku sygnału do szumu14, a zatem sugerujemy, że nasza metoda wzbogacania może być stosowana przed analizą CyTOF w celu poprawy jakości danych.
Tutaj opisujemy metodę trawienia i analizy mikrośrodowiska guza, która obejmuje separację nacieków immunologicznych guza. Celem tej metody jest umożliwienie niezależnego, wysokoprzepustowego profilowania nacieku immunologicznego guza i frakcji komórkowych guza w celu szerszej charakterystyki mikrośrodowiska guza. Korzystając z tej metody, dodatkowo pokazujemy znaczenie przeprowadzenia analizy całego guza, ponieważ stwierdzono, że podskórny model guza litego ma znaczną przestrzenną heterogeniczność immunologiczną. Ogólnie rzecz biorąc, metoda ta może dokładniej i bardziej spójnie porównywać próbki, ponieważ wzbogaca o podzbiory komórek odpornościowych w guzie i pozwala na niezależne profilowanie komórek nowotworowych i frakcji immunologicznych guza.

<table><tbody><tr><td>6 do 12 tygodniowy samiec myszy C57BL/6</td><td>Jackson Laboratory&nbsp;</td><td>Myszy N/A</td><td>używane w naszych badaniach nowotworów</td></tr><tr><td>Linia komórkowa mysiego raka syngenicznego MEER</td><td>Pozyskana od współpracownika&nbsp;</td><td>N/A</td><td>E6/E7 Antygen HPV wyrażający linię komórkową mysiego nabłonka raka migdałków&nbsp;</td></tr><tr><td>70% alkohol izopropylowy&nbsp;</td><td>EMD Milipore&nbsp;</td><td>PX1840</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw narzędzi chirurgicznych Mysia</td><td>World Precision Instruments</td><td>MOUSEKIT</td><td>Przede wszystkim potrzebne są tylko nożyczki, pęseta i skalpel.</td></tr><tr><td>Płytka 24-dołkowa&nbsp;</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>T1024</td><td>Lub dowolna 24-dołkowa płaska płyta dolna.</td></tr><tr><td>RPMI-1640 Media</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R0883</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza I&nbsp;</td><td>EMD Milipore</td><td>234153</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza IV</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS004189</td><td></td></tr><tr><td>DNaza I&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11284932001</td><td></td></tr><tr><td>Wolnoobrotowa wytrząsarka orbitalna</td><td>BioExpress (dostawca: Genemate)&nbsp;</td><td>S-3200-LS</td><td>Lub dowolny wytrząsarka orbitalna.&nbsp;</td></tr><tr><td>Inkubator termoregulacyjny</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-255-27</td><td>Lub dowolny inny inkubator termoregulowany</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8192</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>AMRESCO</td><td>E177</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Pipeta i końcówki</td><td>Eppendorf</td><td>13-690-032</td><td>Lub dowolna inna pipeta i końcówki</td></tr><tr><td>40 um Sitka do komórek</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>50 ml probówki wirówkowe</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>C1062-P</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Probówki stożkowe</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>C1012</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Strzykawka Luer-Lok bez igieł</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep Density Gradient Medium</td><td>Pipety transferowe STEMCELL Technologies</td><td>7811</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>P7212</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe płyty dolne w kształcie litery U,</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>D8573</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw barwiących czynnik transkrypcyjny FoxP3&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>00-5523-00</td> Wirówka termoregulowana z <td>buforem i buforem permeabilizacji Fix/permeabilization</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>Attune NxT Cytometr przepływowy</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>N/A</td><td>Do 96-dołkowego zliczania objętościowego komórek&nbsp;</td></tr><tr><td>Oczyszczony szczur Anti-Mouse CD16/CD32 (blok BD Fc myszy)&nbsp; Klon 2.4G2&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>553141</td><td>Fc Block</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Zestaw do naprawy niebieskich barwników martwych komórek, do wzbudzenia UV</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L34962</td><td>Możliwe do naprawienia barwienie</td></tr> żywotności <tr><td>Przeciwciało monoklonalne CD45 (30-F11), APC-eFluor 780</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>47-0451-80</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne beta TCR (H57-597), APC</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17-5961-82</td><td></td></tr><tr><td>CD8-&alfa; Przeciwciało (KT15), PE</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-53473&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne CD4 (GK1.5), PE-cyjanina5</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15-0041-81</td><td></td></tr><tr><td>MHC klasa II (I-A/I-E) Przeciwciało monoklonalne (M5/114.15.2), Alexa Fluor 700</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>56-5321-82</td><td></td></tr><tr><td>CD11c Przeciwciało monoklonalne (N418), PE-cyjanina5</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15-0114-82</td><td></td></tr><tr><td>F4/80 Przeciwciało monoklonalne (BM8), eFluor 450</td><td>Przeciwciało monoklonalne ThermoFisher Scientific</td><td>48-4801-80</td><td></td></tr><tr><td>CD11b (M1/70), APC</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17-0112-81</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne Ly-6G (Gr-1) (RB6-8C5), PE</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12-5931-82</td><td></td></tr><tr><td>CD274 (PD-L1, B7-H1) Przeciwciało monoklonalne (MIH5), PE-cyjanina7</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25-5982-80</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne CD273 (B7-DC) (122), PerCP-eFluor 710</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>46-9972-82</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne Ki-67 (B56), BV711</td><td>BD Biosciences</td><td>563755</td><td></td></tr></tbody></table>

wzbogacenie i charakterystyka mikrośrodowisk immunologicznych i nieimmunologicznych guza w ustalonych podskórnych guzach myszy

Enrichment and Characterization of the Tumor Immune and Non-immune Microenvironments in Established Subcutaneous Murine Tumors

Mikrośrodowisko immunologiczne guza (TIME) zostało ostatnio uznane za krytyczny mediator odpowiedzi na leczenie guzów litych, szczególnie w immunoterapiach. Ostatnie postępy kliniczne w immunoterapii podkreślają potrzebę powtarzalnych metod w celu dokładnego i dokładnego scharakteryzowania guza i związanego z nim nacieku immunologicznego. Trawienie enzymatyczne guza i analiza cytometrii przepływowej pozwalają na szeroką charakterystykę wielu podzbiorów i fenotypów komórek odpornościowych; Jednak głębokość analizy jest często ograniczona przez ograniczenia fluoroforowe dotyczące projektowania paneli i konieczność pobierania dużych próbek guzów w celu obserwacji rzadkich populacji immunologicznych będących przedmiotem zainteresowania. W ten sposób opracowaliśmy skuteczną i wysokoprzepustową metodę oddzielania i wzbogacania nacieku immunologicznego guza od nieimmunologicznych składników nowotworu. Opisana technika trawienia guza i separacji opartej na gęstości odśrodkowej pozwala na oddzielną charakterystykę guza i frakcji nacieku immunologicznego guza oraz zachowuje żywotność komórek, a tym samym zapewnia szeroką charakterystykę stanu immunologicznego guza. Metoda ta została wykorzystana do scharakteryzowania rozległej przestrzennej heterogeniczności immunologicznej w guzach litych, co dodatkowo wskazuje na potrzebę spójnych technik profilowania immunologicznego całego guza. Ogólnie rzecz biorąc, metoda ta zapewnia skuteczną i elastyczną technikę immunologicznej charakterystyki podskórnych litych guzów mysich; W związku z tym narzędzie to może być wykorzystane do lepszego scharakteryzowania cech immunologicznych guza oraz do przedklinicznej oceny nowych strategii immunoterapeutycznych.

Nasze wyniki wykazują istotną korzyść z oddzielenia TIL od nieimmunologicznych składników guza, zgodnie z opisem w protokole. Ponadto, stosując opisaną metodę, wykazaliśmy znaczną heterogenność immunologiczną ugruntowanych guzów litych.
Istotnym problemem wielu technik dysocjacji guzów jest utrata żywotności próbek, najczęściej w wyniku drastycznych warunków trawienia (np. podwyższonych temperatur, niewystarczającej pod...

Tutaj opisujemy metodę rozdzielania i wzbogacania składników mikrośrodowiska immunologicznego i nieimmunologicznego guza w ustalonych guzach podskórnych. Technika ta pozwala na oddzielną analizę nacieków immunologicznych guza i nieimmunologicznych frakcji guza, co może pozwolić na kompleksową charakterystykę mikrośrodowiska immunologicznego guza.

Wzbogacenie i charakterystyka mikrośrodowisk immunologicznych i nieimmunologicznych guza w ustalonych podskórnych guzach myszy

The tumor immune microenvironment (TIME) has recently been recognized as a critical mediator of treatment response in solid tumors, especially for ...

Ogólnym celem tej techniki jest zapewnienie metody jednoczesnego profilowania zarówno frakcji komórek immunologicznych, jak i nowotworowych, przyczyniających się do mikrośrodowiska immunologicznego guzów litych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie onkologii immunologicznej, takie jak to, jakie seryjne zmiany immunologiczne i nieimmunologiczne zachodzą w guzie po danym leczeniu. Główną zaletą tej techniki jest to, że ułatwia ona skuteczne wzbogacanie składników immunologicznych i nieimmunologicznych guza, umożliwiając dokładne profilowanie stanu immunologicznego guza.Ogólnym celem tej metody jest skuteczne profilowanie mikrośrodowiska immunologicznego guza i identyfikacja zmian wywołanych leczeniem. Po spryskaniu myszy 70% etanolem, aby zapobiec zanieczyszczeniu włosów, chirurgicznie usuń guzy podskórne, uważając, aby guzy były wolne od jakiejkolwiek zanieczyszczającej tkanki. Następnie umieść każdy guz w 1,8 mililitra podstawowej pożywki RPMI 1640 bez płodowej surowicy bydlęcej w indywidualnych dołkach 24-dołkowej płytki na lodzie.Kiedy wszystkie guzy zostaną zebrane, użyj nożyczek, aby pociąć próbki na mniej niż jeden milimetr sześcienny kawałki i dodaj 200 mikrolitrów świeżo przygotowanego 10-krotnego koktajlu dysocjacyjnego zawierającego kolagenazę-1, kolagenazę-4 i DNazę po jednym do każdej studzienki. Po jednej godzinie w temperaturze 37 stopni Celsjusza, w wytrząsarce orbitalnej z prędkością od 60 do 100 obr./min, zneutralizuj reakcję za pomocą jednego mililitra pożywki RPMI 1640 uzupełnionej 5% FBS i dwoma milimolowymi EDTA i użyj zmodyfikowanej końcówki pipety o pojemności jednego mililitra, aby przenieść każdą próbkę zawiesiny guza do pojedynczych 50-mililitrowych stożkowych probówek zwieńczonych indywidualnymi sitkami o średnicy 40 mikrometrów. Za pomocą 10-mililitrowego tłoka strzykawki mechanicznie zdezagreguj kawałki guza przez sitka, okresowo przepłukując każde sitko dwoma mililitrami pożywki RPMI 1640 plus 5% FBS, aż sitka oczyszczą się z guza.Kiedy wszystkie guzy zostaną zdysocjowane, dodaj pożywkę do każdej probówki w razie potrzeby, aby doprowadzić wszystkie próbki do tej samej objętości i granulować komórki przez odwirowanie. Następnie użyj pięciomililitrowej pipety serologicznej, aby ponownie zawiesić granulki w dwóch mililitrach pożywki uzupełnionej FBS na probówkę. Aby oddzielić frakcje komórek immunologicznych i nowotworowych, dodaj trzy mililitry pożywki o gradiencie gęstości na dno jednej 15-mililitrowej stożkowej probówki na próbkę i powoli ułóż dwa mililitry zawiesiny komórek nowotworowych z boku każdej probówki na każdym gradiencie.Należy upewnić się, że zawiesiny komórek nowotworowych są dobrze wymieszane przed nałożeniem warstw, że zawiesiny komórek są powoli pipetowane po boku probówek i że probówki są obsługiwane ostrożnie, aby zapobiec mieszaniu się warstw. Oddziel komórki przez wirowanie w gradiencie gęstości i ostrożnie zbierz górną pożywkę i warstwy leukocytów naciekające guz do jednej nowej 15-mililitrowej probówki na próbkę. Odrzuć pozostałe podłoże gradientu gęstości i ponownie zawieś granulki guza w dwóch mililitrach pożywki plus FBS na probówkę.Następnie odwirować wszystkie próbki i ponownie zawiesić leukocyty naciekające guz w 200 mikrolitrach, a komórki nowotworowe w dwóch mililitrach pożywki plus FBS na probówkę na lodzie. Aby pokryć komórki, oznacz jedną 96-dołkową płytkę dolną w kształcie litery U dla każdego panelu barwienia immunologicznego oraz dodatkową płytkę do zliczania komórek i podwielokrotnie zawiesiny pojedynczych komórek na każdą z płytek panelu barwiącego i płytkę wapienną. Umyj komórki dwa razy 200 mikrolitrami PBS Dulbecco na próbkę i zablokuj komórki 50 mikrolitrami bloku FC na studzienkę przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Pod koniec inkubacji blokującej dodaj 50 mikrolitrów 2X stężonego zewnątrzkomórkowego przeciwciała ukierunkowanego i możliwej do naprawienia mieszaniny barwienia żywotności do każdej studzienki na 30-minutową inkubację w ciemności. Pod koniec inkubacji barwienia przemyć próbki dwukrotnie buforem FACS i ponownie zawiesić granulki w 200 mikrolitrach roztworu utrwalającego i przepuszczalnego przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, chroniąc przed światłem. Następnego dnia zebrać komórki przez odwirowanie, a następnie przepłukać 200 mikrolitrami buforu przepuszczalnego na studzienkę.Oznacz komórki 100 mikrolitrami wewnątrzkomórkowego panelu barwienia przeciwciał w buforze permeabilizacji na 30-minutową inkubację w ciemności, a następnie kolejne płukanie buforem permeabilizacji. Następnie ponownie przemyć komórki buforem FACS i ponownie zawiesić próbki w 300 mikrolitrach świeżego buforu FACS w celu ich analizy za pomocą cytometrii przepływowej. Trawienie guza, jak wykazano, z lub bez wzbogacenia pożywki gradientem gęstości, daje około 70 do 90% żywotną populację całych komórek nowotworowych, ocenianą za pomocą cytometrii przepływowej.Wzbogacenie pożywki gradientem gęstości sprzyja ponad dwukrotnemu wzrostowi frakcji leukocytów naciekającej nowotwór CD45 w porównaniu z niewzbogaconym trawieniem guza, a także licznymi podzbiorami komórek odpornościowych powszechnie obserwowanymi w badaniach mikrośrodowiska immunologicznego. Frakcja komórek nowotworowych CD45 ujemna może być również profilowana pod kątem wielu cech guza, takich jak ogólna żywotność guza lub apoptoza, zdolność proliferacji i ekspresja różnych markerów immunosupresyjnych. Aby określić, w jaki sposób podzbiory immunologiczne szpiku i limfocytów różnią się w pojedynczym guzie litym, guz można podzielić na cztery równe części w taki sposób, aby każda sekcja zawierała w przybliżeniu równe obszary wewnątrznowotworowe, a także równe części skórne i otrzewnowe.Każdy fragment może być następnie trawiony oddzielnie i analizowany, jak wykazano, pod kątem obecności różnych populacji komórek odpornościowych. Po opanowaniu tej techniki można wykonać w ciągu czterech do 8 godzin, w zależności od liczby posiadanych próbek. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pracować szybko, ale wydajnie, aby zachować żywotność komórek.Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy dysocjacji i separacji obejmują techniki, których trudno jest się nauczyć za pomocą samego tekstu pisanego. Po tej procedurze można wykonać cytometrię przepływową, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące tego, jak zmieniają się populacje komórkowe w guzie, zarówno pod względem liczebności, jak i fenotypu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak oddzielić i przeanalizować zarówno immunologiczne, jak i nieimmunologiczne składniki ustalonego podskórnego guza myszy przy użyciu zademonstrowanych technik trawienia i separacji gradientu gęstości.

enrichment-characterization-tumor-immune-non-immune-microenvironments

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

W niniejszym raporcie opisujemy protokół izolacji wysoko oczyszczonych populacji leukocytów infiltrujących guzy. Protokół ten został opracowany na podstawie metody firmy Miltenyi Biotech w celu zwiększenia wydajności i czystości izolacji komórek z złożonej tkanki nowotworowej.

Izolacja komórek odpornościowych z guzów pierwotnych

Ten film ilustruje testowanie terapii uzupełniającej lub dodatkowej na modelu mysim z niekompletnie wyciętymi guzami podskórnymi. Mysz z częściowo wyciętym guzem jest leczona przeciwciałem skierowanym przeciwko antycytotoksycznemu białku komórek regulatorowych T, potencjalnie zmniejszając odrost guza i sugerując skuteczną terapię uzupełniającą.

Terapia uzupełniająca w modelu mysim z niecałkowicie wyciętym guzem podskórnym

Ten protokół opisuje metodę szczegółowej oceny podzbiorów leukocytów w mikrośrodowisku guza w modelu guza myszy. Komórki czerniaka B16 z ekspresją chemeryny wszczepiono podskórnie myszom syngenicznym. Komórki z mikrośrodowiska guza zostały następnie wybarwione i przeanalizowane za pomocą cytometrii przepływowej, co pozwoliło na szczegółowe analizy podzbiorów leukocytów.

Ocena podzbiorów leukocytów naciekających nowotwór w podskórnym modelu guza

Dostosowaliśmy przepuszczalną mikroporowatą wkładkę membranową do naśladowania mikrośrodowiska guza (TME). Model składa się z mieszanej hodowli komórek, pozwala na uproszczone generowanie wysoce wzbogaconych pojedynczych populacji komórek bez użycia znakowania fluorescencyjnego lub sortowania komórek oraz pozwala na badanie komunikacji międzykomórkowej w obrębie TME w warunkach normalnych lub stresowych.

Naśladownictwo mikrośrodowiska guza: prosta metoda generowania wzbogaconych populacji komórek i badania komunikacji międzykomórkowej

Tutaj prezentujemy powtarzalną metodę tworzenia ortotopowego mysiego modelu raka płaskonabłonkowego głowy i szyi. Guzy wykazują klinicznie istotne cechy histopatologiczne choroby, w tym martwicę, słabe różnicowanie, przerzuty węzłowe i naciek immunologiczny. U myszy z guzem rozwijają klinicznie istotne objawy, w tym dysfagię, przemieszczenie szczęki i utratę wagi.

Dośluzówkowa inokulacja komórek raka płaskonabłonkowego u myszy w celu profilowania immunologicznego guza i oceny odpowiedzi na leczenie

Ten protokół opisuje chirurgiczne generowanie ortotopowych guzów trzustki i szybkie trawienie świeżo wyizolowanych mysich guzów trzustki. Po trawieniu żywotne populacje komórek odpornościowych można wykorzystać do dalszej analizy, w tym stymulacji ex vivo limfocytów T do wewnątrzkomórkowego wykrywania cytokin za pomocą cytometrii przepływowej.

Generowanie ortotopowych guzów trzustki i charakterystyka ex vivo cytotoksyczności limfocytów T naciekających nowotwór

Tutaj prezentujemy protokół przeszczepu guza do charakterystyki limfocytów naciekanych nowotworem w modelu guza myszy w intruzie naturalnym i pochodzącym z obwodu limfocytach. Specyficzne śledzenie napływu komórek odpornościowych pochodzących od biorcy za pomocą cytometrii przepływowej ujawnia dynamikę zmian fenotypowych i funkcjonalnych tych komórek podczas przeciwnowotworowych odpowiedzi immunologicznych.

Przeszczep guza w celu oceny dynamiki limfocytów T CD8 + naciekających nowotwór u myszy

Opisano standardowy protokół do badania aktywności przeciwnowotworowej i związanej z nią toksyczności IL-1α w syngenicznym mysim modelu HNSCC.

Ocena aktywności przeciwnowotworowej in vivo nanocząstek bezwodnika IL-1α

Protokół przedstawia model immunoterapii nowotworów za pomocą komórkowego szczepienia guza z ekspresją Flt3L czerniaka B16-F10. Protokół ten demonstruje procedury, w tym przygotowanie hodowanych komórek nowotworowych, implantację guza, napromienianie komórek, pomiar wzrostu guza, izolację wewnątrznowotworowych komórek odpornościowych i analizę cytometrii przepływowej.

Eksperymentalny model immunoterapii czerniaka z wykorzystaniem szczepienia przeciwnowotworowego cytokiną krwiotwórczą

Ten protokół opisuje generowanie myszy z ludzkim układem odpornościowym (HIS) do badań immunoonkologicznych. Przedstawiono instrukcje i rozważania dotyczące stosowania tego modelu do testowania ludzkich immunoterapeutyków na ludzkich nowotworach wszczepionych w tym modelu z naciskiem na scharakteryzowanie odpowiedzi ludzkiego układu odpornościowego na guz.

Testowanie immunoterapeutyków przeciwnowotworowych w humanizowanym modelu mysim z ludzkimi nowotworami

Wraz ze wzrostem zainteresowania immunoterapią wnętrznowrzodową, wybór modeli nowotworów, które są dostępne i praktyczne, jest niezbędny. Guzy podskórne są łatwe do ustanowienia, ale trudne do wizualizowania i manipulowania. W tym protokole opisujemy metody generowania guzów śródskórnych, które zapewniają lepszą widoczność i dostępność.

Wszczepienie nowotworu śródskórnego jako solidny model badań nad immunoterapią guzów mysich wewnątrzguzikowych

Odkryj metodę wzbogacania i analizy mikrośrodowiska immunologicznego oraz nieimmunologicznego guza w podskórnych guzach myszy. Technika ta umożliwia szczegółowe profilowanie frakcji komórek odpornościowych i nowotworowych.

Wzbogacenie i charakterystyka mikrośrodowisk immunologicznych i nieimmunologicznych guza w ustalonych podskórnych guzach myszy

Przeglądaj więcej filmów