Tłumienie sygnalizacji pro-fibrotycznej nasila przeprogramowanie fibroblastów embrionalnych myszy w indukowane kardiomiocyty za pośrednictwem czynników

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie przeprogramowania serca, takie jak określenie, jakie szlaki promują lub naprawiają kardiomiogenezę. Główną zaletą tej techniki jest to, że możemy generować funkcjonalne indukowane kardiomiocyty, z wyższą wydajnością niż wcześniej opublikowane metody. Ta chemiczna choroba serca powoduje utratę kardiomiocytów i upośledzenie funkcji serca.

Dlatego ta technika może pomóc w wysokiej naprawie, przekształcając fibroblasty w funkcjonalne indukowane kardiomiocyty. Aby rozpocząć produkcję retrowirusa, hoduj komórki Platinum E lub PE w pożywce PE. Uzupełnij go markerami selekcyjnymi w naczyniu o średnicy 10 cm, w dwustopniowej szafce o poziomie bezpieczeństwa biologicznego.

Co dwa dni przechodź komórki w rozcieńczeniu od jednego do czterech lub od jednego do piątego. Na dzień przed planowaną transfekcją wysiewaj komórki PE w 10 ml pożywki wzrostowej w naczyniu hodowlanym o średnicy 10 cm, a następnie delikatnie kołysz szalkami w przód iw tył. Ostrożnie umieść naczynia w inkubatorze, aby umożliwić równomierne rozłożenie komórek, i inkubuj przez 24 godziny.

W dniu transfekcji dodaj koktajl GHMT2M do probówki o pojemności 1,5 ml. Następnie dodaj 360 mikrolitrów zredukowanej pożywki surowicy do oddzielnej probówki o pojemności 1,5 ml. Następnie dodaj 36 mikrolitrów odczynnika do transfekcji do zredukowanej pożywki surowicy i delikatnie przesuń probówkę, aby wymieszać.

Inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Odczynnik do transfekcji użyty na tym etapie wiąże się z tworzywem sztucznym. Aby uniknąć skuteczności transfekcji, należy uważać, aby odczynnik do transfekcji pipetować bezpośrednio do zredukowanej pożywki surowicy i unikać dotykania końcówki pipety do ścianki probówki.

Następnie dodać zredukowaną mieszaninę odczynników do transfekcji pożywki surowicy do probówki zawierającej koktajl DNA GHMT2M. Delikatnie przesuń probówkę, aby wymieszać i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Na koniec dodaj kroplami mieszaninę reakcji transfekcji do komórek PE.

Delikatnie obracaj naczyniem przez 10 do 15 sekund. Inkubować transfekowane komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 16 do 20 godzin. Teraz pokryj naczynia o grubości 60 mm kolagenem i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej dwie godziny.

Następnie dozuj świeżo rozmrożone mysie fibroblasty embrionalne lub MEF do naczyń pokrytych kolagenem. I dodaj pożywkę wzrostową do końcowej objętości 4 ml na naczynie 60 MM. Delikatnie kołysz naczyniami i umieść je w inkubatorze.

Podczas powlekania MEF-ów ważne jest, aby komórki były pokryte równomiernie. Unikaj wirowania naczyń, może to spowodować nierówne poszycie. Zamiast tego delikatnie kołysz naczyniem w przód iw tył i ostrożnie umieść je w inkubatorze.

24 godziny po transfekcji komórek PE użyj strzykawki o pojemności 30 ml, aby zebrać pożywkę retrowirusową wytworzoną przez komórki. Przełóż pierwszą kolekcję pożywki retrowirusowej przez filtr o wielkości nalewania 45 mikrometrów do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Następnie dodaj 10 ml świeżej pożywki wzrostowej na ściankę naczynia, uważając, aby nie przesunąć komórek PE.

Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez kolejne 24 godziny. Następnie dodaj 7,2 mikrolitra 10 mg na mililitr odczynnika transdukcji bromku heksydyny metryny do stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej supernatant wirusowy. Teraz odessaj pożywkę z MEF i dodaj 4 ml świeżo zebranej pożywki retrowirusowej do naczynia.

Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. 48 godzin po transfekcji komórek PE, zbierz pożywkę retrowirusową i wykonaj transdukcję dokładnie w taki sam sposób, jak w przypadku pierwszego pobrania. Wyrzuć komórki PE po drugim pobraniu pożywki retrowirusowej i dodaj 10% wybielacza do wszystkich materiałów mających kontakt z pożywką retrowirusową.

Po inkubacji należy odessać pożywkę retrowirusową z MEF i dodać 4 ml pożywki ICM, zawierającej 05 mikromolowy inhibitor receptora TGF Beta typu 1. Co dwa dni zmieniaj podłoże ICM, aż do dalszego użycia. Aby rozpocząć barwienie immunologiczne, odessać pożywkę ICM od 14 dnia przeprogramowane MEF.

Następnie umyj komórki raz 1 ml 1X lodowatego PBS, na dołek 12-dołkowej płytki. Następnie odessać PBS, dodać 500 mikrolitrów 2% paraformaldehydu w celu utrwalenia komórek i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po odessaniu paraformaldehydu należy trzykrotnie przemyć komórki 1 ml PBS.

Po zassaniu PBS dodać 500 mikrolitrów 02%Triton X 100 i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Po aspiracji Triton X 100 zablokuj komórki 500 mikrolitrami 10% surowicy końskiej przez 30 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie odessać surowicę końską i dodać 500 mikrolitrów rozcieńczonego przeciwciała pierwszorzędowego. Inkubować przez godzinę w temperaturze pokojowej. Po odessaniu przeciwciała pierwszorzędowego przemyć trzykrotnie 1 ml PBS.

Po ostatnim przepłukaniu PBS dodać 500 mikrolitrów rozcieńczonego przeciwciała drugorzędowego. Zawiń płytkę w folię i inkubuj w ciemności przez godzinę w temperaturze pokojowej. Na koniec odessać przeciwciało drugorzędowe i przemyć trzykrotnie 1 ml PBS.

Zawiń płytkę w folię i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza do momentu zakończenia obrazowania. Metoda ta wykazuje wysoką skuteczność konwersji MEF do kardiomiocytów. Reprezentatywna analiza cytometrii przepływowej, dodając dziewiąty dzień po transdukcji, pokazuje aktywowaną ekspresję sercowej troponiny T w około 70% komórek.

Podobnie, ekspresję sercowej alfa-aktyniny obserwuje się w około 55% komórek, w porównaniu z kontrolą transdukcji GFP. Dodatkowo, barwienie immunologiczne markerów sercowych, wykonane dwa tygodnie po transdukcji, pokazuje, że większość komórek wykazuje ekspresję troponiny I, alfa-aktyniny i troponiny T. Białko połączenia szczelinowego Cx43 wykryto również wzdłuż obwodu ICM. Co więcej, znakowanie ICM alfa-aktyniną lub troponiną T i Cx43 ujawnia tworzenie się połączeń szczelinowych między sąsiednimi komórkami.

Transdukcja GHMT2M i leczenie A83O1 przeprogramowuje część MEF w komórki bijące do ósmego dnia. W dniu 11 obserwuje się około 10000 komórek bijących na centymetr kwadratowy. Spontaniczne stany przejściowe wapnia są wykrywane w bijących kardiomiocytach.

Dodanie agonisty receptorów beta-adrenergicznych, izoproterenolu, znacznie zwiększa częstość występowania spontanicznych stanów przejściowych wapnia. W przeciwieństwie do tego, wyniszczenie blokera kanału wapniowego typu L, nifedypiny, znacznie zmniejsza częstość występowania przejściowych zaburzeń wapnia. Po obejrzeniu tego filmu należy dobrze zrozumieć, jak przeprogramować fibroblasty w funkcjonalne, indukowane kardiomiocyty z wysoką wydajnością.

Zgodnie z tym protokołem, inne metody, w tym sekwencjonowanie RNA i sekwencjonowanie chipów, mogą być wykorzystane do udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak globalna ekspresja genów i status chromatyny, które są zmieniane podczas przeprogramowania serca. Nie zapominaj, że praca z retrowirusem może być niebezpieczna. Podczas wykonywania tego protokołu należy zawsze stosować środki ostrożności, takie jak praca w szafie bezpieczeństwa biologicznego na poziomie drugim, noszenie środków ochrony osobistej i właściwe usuwanie wszystkich odpadów retrowirusowych.