Generacja pierwszych sercopodobnych progenitorów serca i kardiomiocytów komorowych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Główną zaletą tej prostej techniki jest generowanie komórek progenitorowych serca i kardiomiocytów o określonym pochodzeniu i podtypach pola serca. Z kolei uzyskane komórki mogą być wykorzystywane w szerokim zakresie zastosowań badawczych, w tym w podstawowej biologii rozwojowej, terapii komórkowej opartej na dowodu słuszności koncepcji oraz badaniach modelowania chorób serca. Procedurę zademonstrują Sean Spiering i Michael Yu z mojego laboratorium.

Na początek pokryj wystarczającą ilość studzienek 96-dołkowej płytki 50 mikrolitrami odczynnika powlekającego, aby pomieścić kolejne etapy wysiewu komórek i infekcji wirusowej, a następnie dodaj jeden mililitr odczynnika dysocjacyjnego do dołka w sześciodołkowej płytce, aby odłączyć wysiane pluripotencjalne komórki macierzyste. Następnie za pomocą sterylnej pipety przenieś zawiesinę komórek do 15-mililitrowej plastikowej probówki wirówkowej. W probówce dodaj pięć mililitrów PBS zawierającego wapń i magnez, aby zneutralizować odczynnik dysocjacyjny.

Następnie odwiruj komórki 200 razy g przez trzy minuty. Po odwirowaniu wyrzucić supernatant, a następnie delikatnie przesunąć probówkę, aby osad został usunięty. Następnie rozpuść osad komórkowy w jednym mililitrze pożywki z komórek macierzystych.

Następnie użyj automatycznego licznika komórek, aby policzyć liczbę komórek. Po zakończeniu liczenia należy zasiać 20 000 żywotnych komórek w każdym dołku 96-dołkowej płytki zawierającej 50 mikrolitrów pożywki z komórek macierzystych uzupełnionej dwumikromolowym inhibitorem szlaku RHO / ROCK. Po 24 godzinach monitoruj przyczepienie komórek, a następnie zastąp pożywkę 100 mikrolitrami pożywki z komórek macierzystych na godzinę przed infekcją lentiwirusową.

Następnie rozmrozić lentiwirusa Id1 na lodzie, a następnie dodać trzy mikrolitry oczyszczonego lentiwirusa na dołek. Po dodaniu lentiwirusa przenieś płytkę z powrotem do inkubatora do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. 24 godziny po infekcji wirusowej dodaj 100 mikrolitrów świeżej pożywki z komórek macierzystych do zakażonych komórek.

Po 48 godzinach zastąp pożywkę zawierającą wirusa 200 mikrolitrami świeżej pożywki z komórek macierzystych uzupełnionej jednym mikrogramem na mililitr puromycyny. Każdego dnia zmieniaj pożywkę na świeże 200 mikrolitrów pożywki z komórek macierzystych uzupełnionej jednym mikrogramem na mililitr puromycyny. Rozpocznij proces różnicowania w dniu 0, zastępując pożywkę z komórek macierzystych 1,5 mililitra pożywki indukcyjnej z aktywiną A w 12-dołkowej płytce.

24 godziny po rozpoczęciu różnicowania zastąp pożywkę dwoma mililitrami pożywki indukcyjnej bez Activin A. Trzeciego dnia zastąp dwoma mililitrami pożywki indukcyjnej bez Activin A. Piątego dnia odessać całe podłoże ze studzienki zawierającej CP FHF-L, a następnie natychmiast dodać jeden mililitr ciepłego odczynnika dysocjacyjnego zawierającego enzym do studzienki, następnie inkubować płytkę hodowlaną w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po minucie wstrząśnij płytką wewnątrz inkubatora i wyjmij ją z inkubatora po dwóch minutach, a następnie dodaj jeden mililitr 10% płodowej pożywki zawierającej płodową surowicę bydlęcą do studzienki. Odłączyć komórki od płytki, delikatnie pipetując komórki w górę i w dół.

Następnie przenieś zawiesinę komórkową do probówki wirówkowej i poddaj odwirowaniu. Po odwirowaniu rozpuść osad komórkowy w dwóch mililitrach odczynnika do krioprezerwacji, a następnie policz liczbę komórek. Następnie przenieś komórki w fiolkach do krioprezerwacji i pozostaw fiolki w urządzeniu chłodzącym.

Następnie przenieś urządzenie w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez noc. Po 24 godzinach przenieść fiolki w ciekłym azocie w celu długotrwałego przechowywania. Tuż przed rozmrożeniem FHF-L CPs, pokryj dołki 12-dołkowej płytki dwoma mililitrami odczynnika powlekającego.

Następnie przenieś pięciodniowe FHF-L CP z ciekłego azotu do pojemnika z suchym lodem. Z suchego lodu przenieś fiolkę do łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na dwie minuty, aby zapewnić całkowite rozmrożenie. Po całkowitym rozmrożeniu komórek przenieś je do probówki wirówkowej, a następnie pipetuj 10 kropli wstępnie podgrzanego podłoża kardiogennego co 30 sekund do roztworu komórkowego.

Dodawaj pożywkę kardiogenną, aż stosunek kriokonserwacji i pożywki kardiogennej osiągnie jeden do trzech. Następnie poddaj komórki wirowaniu. Po odwirowaniu usunąć supernatant i ostrożnie strzepnąć probówkę, a następnie rozpuścić osad komórkowy w pożywce kardiogennej uzupełnionej dwumikromolowym inhibitorem szlaku RHO/ROCk.

Zawiesinę komórkową należy dodatkowo rozcieńczyć pożywką kardiogenną, aby osiągnąć pożądane stężenie komórek. Następnie wysiewaj komórki na płytce hodowlanej zawierającej dwa mililitry pożywki kardiogennej. Pozostawić płytkę w kapturze do hodowli tkankowej na 20 minut przed przeniesieniem do inkubatora.

Monitoruj przyłączenie komórek w szóstym dniu różnicowania. Siódmego dnia odessać połowę pożywki kardiogennej i zastąpić ją świeżą pożywką. Od tego momentu należy wymieniać 50% pożywki kardiogennej co drugi dzień, a następnie, w 15. dniu, określić ilościowo różnicowanie serca.

Tutaj poziom ekspresji mRNA Id1 jest oznaczany ilościowo w liniach komórkowych hESC i hPSC. Do różnicowania wykorzystuje się tylko linie hPSC wyrażające mRNA Id1 na poziomach większych niż 0,005-krotność GAPDH. Pokazano tutaj obrazy jasnego pola po różnicowaniu optymalnych, sub-zlewających się i nadmiernie zlewających się hPSC w dniu 0.

Po dalszym różnicowaniu konfluencja komórek osiąga 75% po 24 godzinach. W dniu 3 różnicujące się komórki tworzą klaster, a w dniu 5 komórki pozostają w ściśle połączonych skupiskach o jednorodnej morfologii. W dniu 6 punkty kontroli FHF-L pokrywają ponad 90% powierzchni odwiertów.

W rzeczywistości do 12 dnia kardiomiocyty zaczynają bić i wykazywać skurcze serca. W dalszej części procesu różnicowania po 15 dniu obserwuje się zwiększone poziomy ekspresji mRNA MYL2 i IRX4. Oba białka reprezentują markery specyficzne dla komór w kardiomiocytach.

Tutaj ślad potencjału czynnościowego reprezentuje szybkie prędkości skoku w górę i w dół, a także plateau komorowe. Wskaźniki te były charakterystyczne dla kardiomiocytów podobnych do komór w 25. dniu różnicowania. Podsumowując, wytworzenie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych z nadekspresją Id1 zajmuje około dwóch tygodni, następnie około pięciu dni zajmuje wytworzenie pierwszych komórek progenitorowych podobnych do pola serca i około 10 dni wytworzenie bijących kardiomiocytów podobnych do komór.