Name: Generacja pierwszych sercopodobnych progenitorów serca i kardiomiocytów komorowych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Poznaj skalowalną metodę generowania progenitorów sercowych i kardiomiocytów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu Activin A i Id1. Technika ta umożliwia produkcję komórek o zdefiniowanym pochodzeniu pola sercowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy członkom laboratorium Colas za pomocne dyskusje i krytyczne recenzje manuskryptu. Badanie to było wspierane przez granty NIH/NIEHS R44ES023521-02 i CIRM DISC2-10110 dla dr Colasa.

1. Przygotowanie i infekcja wirusa Id1
<ol>
	<li>Wygeneruj lentiwirusa z nadekspresją Id1 poprzez kotransfekcję pCMVDR8.74, pMD2.G i pCDH-EF1-Id1-PGK-PuroR (Addgene: plasmid #107735) do komórek HEK293T. Zebrać cząsteczki wirusa, przefiltrować, oczyścić z supernatantu i przechowywać w temperaturze -80 °C, jak w Kitamura i wsp. (2003)19. Alternatywnie, wyprodukuj lentiwirusa Id1 komercyjnie, wysyłając pCDH-EF1-Id1-PGK-PuroR do dostawcy produkującego lentiwirusa. 
	Uwaga: Należy przestrzegać przepisów bezpieczeństwa lentiwirusowego i standardowych protokołów operacyjnych. 
	Uwaga: WAŻNE: Optymalne miano wirusa powinno wynosić co najmniej 108 do 109 jednostek transdukcyjnych/ml (TU/ml).</li>
	<li>Przed zakażeniem pokryj jedną studzienkę z 96-dołkowej płytki 50 μl odczynnika powlekającego, zwykle galaretowatą mieszaniną białek wydzielaną przez komórki mięsaka myszy Engelbreth-Holm-Swarm (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Dysocjuj jedną studzienkę pluripotencjalnych komórek macierzystych hodowanych na płytce 6-dołkowej, dodając 1 ml PBS bez Ca2+ i Mg2+ oraz z 0,5 mM EDTA. 
	UWAGA: Czas dysocjacji waha się od 3 do 10 minut. Gdy więcej niż 80% komórek zostanie oderwanych od spodu płytki, przejdź do następnego kroku.</li>
	<li>Zawiesinę komórkową zebrać sterylną pipetą do plastikowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Zneutralizować odczynnik dysocjacyjny za pomocą 5 ml Ca2+ i Mg2+ zawierających PBS.</li>
	<li>Komórki osadu przez odwirowanie (200 x g przez 3 min).</li>
	<li>Usunąć supernatant i delikatnie przesunąć probówkę, aby usunąć osad.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki z komórkami macierzystymi.</li>
	<li>Zliczaj komórki za pomocą automatycznego licznika komórek zgodnie z instrukcjami dostawcy.</li>
	<li>Umieść 20 000 żywotnych komórek w każdym basenie powlekanym (płytka 96-dołkowa) w 50 μl pożywki z komórek macierzystych uzupełnionej inhibitorem szlaku 2 μM RHO / ROCK (patrz tabele 1 i 2).</li>
	<li>Po 24 godzinach należy monitorować przyłączanie komórek i zastąpić pożywkę 100 μl pożywką z komórek macierzystych uzupełnioną inhibitorem szlaku 2 μM RHO/ROCK i bromkiem heksadimetryny o stężeniu 6 ng/ml (patrz tabele 1 i 2), na godzinę przed zakażeniem lentiwirusowym. 
	UWAGA: Komórki powinny być mocno przymocowane do dolnej części płytki.</li>
	<li>Rozmrozić lentiwirusa Id1 na lodzie.</li>
	<li>Dodać 3 μl oczyszczonego lentiwirusa do studzienki (miano wirusa powinno wynosić od 10 8 do 109 TU/ml), a następnie przenieść płytkę z powrotem do inkubatora do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO2 , 20 % O2 ).</li>
	<li>24 godziny po zakażeniu wirusowym dodać 100 μl świeżej pożywki z komórek macierzystych do zakażonych komórek.</li>
	<li>48 godzin po zakażeniu lentiwirusowym zastąpić pożywkę zawierającą wirusa 200 μl świeżej pożywki z komórek macierzystych uzupełnionej 1 μg/ml puromycyny.</li>
	<li>Codziennie odświeżaj pożywkę z 200 μl pożywki z komórkami macierzystymi uzupełnionymi o 1 μg/ml puromycyny.</li>
	<li>Gdy hodowle osiągną 80% konfluencji, zdysocjuj komórki za pomocą 200 μl PBS bez Ca2+ i Mg2+ + 0,5 mM EDTA (dla jednego dołka na 96-dołkowej płytce).</li>
	<li>Zebrać zawiesinę komórek do probówki wirówkowej.</li>
	<li>Zneutralizować odczynnik dysocjacyjny za pomocą 5 ml Ca2+ i Mg2+ zawierających PBS.</li>
	<li>Komórki osadu przez odwirowanie (200 x g przez 3 min).</li>
	<li>Usunąć supernatant i delikatnie przesunąć probówkę, aby usunąć osad.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki z komórkami macierzystymi uzupełnionymi inhibitorem szlaku 2 μM RHO/ROCK.</li>
	<li>Przenieść wszystkie komórki (1 ml) do powlekanego dołka na 12-dołkowej płytce.</li>
	<li>Po 24 godzinach monitorować przyłączenie komórek do studzienki i zastąpić pożywkę 1 ml pożywki z komórkami macierzystymi uzupełnionymi inhibitorem szlaku 2 μM RHO/ROCK i bromkiem heksadimetryny 6 ng/ml na godzinę przed transdukcją.</li>
	<li>Rozmrozić lentiwirusa Id1 na lodzie.</li>
	<li>Dodać 5 μl oczyszczonego wirusa do studzienki (płytka 12-dołkowa).</li>
	<li>24 godziny po zakażeniu lentiwirusowym zastąpić pożywkę zawierającą wirusa 1 ml świeżej pożywki z komórek macierzystych uzupełnionej 3 μg/ml puromycyny.</li>
	<li>48 godzin po zakażeniu lentiwirusowym zastąp pożywkę zawierającą wirusa 1 ml świeżej pożywki z komórek macierzystych uzupełnionej 6 μg/ml puromycyny.</li>
	<li>Gdy hodowle osiągną 80% konfluencji, zdysocjuj komórki za pomocą 500 μl PBS bez Ca2+ i Mg2+ oraz z 0,5 mM EDTA (dla jednego dołka na 12-dołkowej płytce).</li>
	<li>Przenieść połowę (250 μl) zawiesiny komórkowej do jednego dołka 6-dołkowej płytki pokrytej odczynnikiem powlekającym, zawierającej 2 ml pożywki z komórek macierzystych uzupełnionej inhibitorem szlaku 2 μM RHO/ROCK.</li>
	<li>Użyj drugiej połowy (250 μl) próbki do ekstrakcji RNA i qRT-PCR w celu określenia poziomów ekspresji Id1 za pośrednictwem lentiwirusa, jak w Colas et al. (2012)4. 
	UWAGA: WAŻNE: Jeśli poziomy ekspresji mRNA Id1 są niższe niż 0,005-krotność poziomów ekspresji GAPDH (patrz Tabela 3 dla starterów qRT-PCR), powtarzaj proces infekcji zgodnie z powyższym opisem, aż poziomy ekspresji Id1 przekroczą próg.</li>
</ol>
2. Konserwacja hPSCId1
<ol>
	<li>Hoduj hPSCId1 w powlekanych płytkach 6-dołkowych i hoduj w 3 ml na studzienkę pożywki z komórek macierzystych uzupełnionej 6 μg/ml puromycyny.</li>
	<li>Gdy hPSCId1 osiągną 80% konfluencji, komórki pasażują jako agregaty (stosunek podziału 1:6) za pomocą bezenzymatycznego odczynnika dysocjacyjnego zgodnie z wytycznymi dostawcy i rosną w 3 ml na studzienkę pożywki z komórek macierzystych uzupełnionej 6 μg / ml puromycyny.</li>
</ol>
3. Przygotowanie hPSCId1 do różnicowania
<ol>
	<li>Pokryć 12-dołkową płytkę 500 μl odczynnika powlekającego na każde zagłębienie.</li>
	<li>Gdy hPSCId1 osiągną 90% konfluencji, zdysocjuj komórki, dodając 1 ml PBS bez Ca2+ i Mg2+ oraz z 0,5 mM EDTA na studzienkę przez 5-10 minut. Sprawdzaj proces dysocjacji co minutę, a gdy 80% komórek zostanie zdysocjowanych od płytki, przejdź do następnego kroku.</li>
	<li>Zebrać zawiesinę komórek do probówki wirówkowej.</li>
	<li>Zneutralizować odczynnik dysocjacyjny za pomocą 5 ml Ca2+ i Mg2+ zawierających PBS.</li>
	<li>Komórki osadu przez odwirowanie (200 x g przez 3 min).</li>
	<li>Usunąć supernatant i delikatnie przesunąć probówkę, aby usunąć osad.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 2 ml pożywki z komórek macierzystych uzupełnionej inhibitorem szlaku 2 μM RHO/ROCK.</li>
	<li>Zliczanie komórek za pomocą automatycznego licznika komórek.</li>
	<li>Umieść 300 000 komórek na studzience w 1 ml pożywki z komórek macierzystych uzupełnionej inhibitorem szlaku 2 μM RHO / ROCK i 6 μg / ml puromycyny, a następnie przenieś płytkę do inkubatora do hodowli tkankowej.</li>
	<li>Codziennie odświeżaj pożywkę za pomocą 2 ml pożywki z komórkami macierzystymi uzupełnionymi 6 μg/ml puromycyny, aż kultury osiągną 90% zgrywkę. W tym momencie rozpocznij różnicowanie serca (następny krok).</li>
</ol>
4. Różnicowanie hPSCId1 na pierwsze progenitory serca podobne do pola serca (FHF-L CPs)
<ol>
	<li>W przypadku formy płytki 12-dołkowej należy rozpocząć różnicowanie (dzień 0) poprzez zastąpienie pożywki z komórek macierzystych 1,5 ml pożywki indukcyjnej (Tabela 1) uzupełnionej aktywiną A (100 ng/ml) (patrz Tabela 2 dla zalecanych objętości i stężeń aktywiny A dla różnych formatów płytek).</li>
	<li>W dniu 1 (24 godziny po rozpoczęciu różnicowania) zastąp pożywkę 2 ml pożywki indukcyjnej bez aktywiny A (na dołek 12-dołkowej płytki).</li>
	<li>W dniu 3 zastąp pożywkę 2 ml pożywki indukcyjnej bez aktywiny A (na dołek płytki 12-dołkowej).</li>
	<li>W 5 dniu zbierz FHF-L CP do kriokonserwacji (następny krok). 
	UWAGA: WAŻNE: W tym momencie preferowana jest kriokonserwacja, ponieważ umożliwia oddzielenie generacji progenitorów serca od późniejszej produkcji kardiomiocytów i biobankowanie dużych partii komórek. Należy pamiętać, że alternatywnie, CP FHF-L dnia 5 można przenieść na świeżo pokrytą płytkę w celu kontynuowania różnicowania, należy zapoznać się z krokami 5.1–5.5, aby przejść CP FHF-L, a następnie przejść do kroku 6.5 w celu rozróżnienia.</li>
</ol>
5. Kriokonserwacja CP FHF-L
<ol>
	<li>Odessać wszystkie pożywki z dołków zawierających CP FHF-L dnia 5 i szybko dodać 1 ml ciepłego (37 °C) 1x odczynnika dysocjacyjnego zawierającego enzym (patrz tabela materiałów). Umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych.</li>
	<li>Po upływie 1 minuty potrząśnij płytką w inkubatorze na boki.</li>
	<li>Po 2 minutach (czas całkowity) wyjąć płytkę z inkubatora i dodać 1 ml 10% pożywki FBS.</li>
	<li>Delikatnie pipetować komórki w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 5 ml, aby ułatwić odłączanie komórek od płytki.</li>
	<li>Zebrać zawiesinę komórek do probówki wirówkowej i komórek osadu przez odwirowanie przy 200 x g przez 3 minuty</li>
	<li>Ponownie zawiesić osad komórkowy w 2 ml odczynnika do kriokonserwacji.</li>
	<li>Zliczanie komórek za pomocą automatycznego licznika komórek.</li>
	<li>Dodaj odczynnik do kriokonserwacji (patrz tabela materiałów) w wystarczającej objętości, aby kriokonserwować komórki w żądanym stężeniu (zwykle 5–10 x 106 komórek/ml).</li>
	<li>Przenieść komórki do fiolek do kriokonserwacji i umieścić fiolki w urządzeniu chłodzącym (1 °C/min) i umieścić urządzenie chłodzące w zamrażarce o temperaturze -80 °C na noc.</li>
	<li>Po 24 godzinach przenieść zamrożone fiolki do ciekłego azotu w celu długotrwałego przechowywania. 
	UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.</li>
</ol>
6. Różnicowanie FHF-L CP w kardiomiocyty podobne do komorowych
<ol>
	<li>Przenieś zamrożone fiolki FHF-L CP z dnia 5 z magazynu ciekłego azotu do pojemnika na suchy lód.</li>
	<li>Umieścić fiolki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 2 do 3 minut, aż do całkowitego rozmrożenia zawiesiny komórek. 
	UWAGA: WAŻNE: Proces rozmrażania jest wrażliwy na czas. Wystawianie komórek na działanie pożywki do krioprezerwacji przez zbyt długi czas (tj. 10 minut) zmniejszy żywotność komórek.</li>
	<li>Przenieść komórki do probówki wirówkowej o pojemności 15 lub 50 ml, w zależności od liczby rozmrożonych fiolek.</li>
	<li>Dozować kroplami (5 kropli co 30 sekund) wstępnie podgrzane (37 °C) podłoża kardiogenne (Tabela 1) do roztworu komórkowego. Kontynuuj ten proces, aż zostanie osiągnięty stosunek pożywki do kriokonserwacji 1:3 do pożywki kardiogennej. W tym momencie należy zwiększyć szybkość dodawania pożywki kardiogenicznej, aż do osiągnięcia stosunku pożywki do pożywki kardiopekcyjnej 1:10. 
	UWAGA: WAŻNE: Szybkie zmiany osmolarności zwiększą śmierć komórki podczas procesu rozmrażania; Dlatego zdecydowanie zaleca się dodawanie kroplami pożywek kardiogennych, jak opisano powyżej.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę komórek i komórki osadu przez odwirowanie (200 x g przez 3 min).</li>
	<li>Usunąć supernatant i delikatnie przesunąć probówkę wirówkową, aby usunąć osad komórkowy.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki za pomocą pożywki kardiogennej uzupełnionej inhibitorem szlaku 2 μM RHO/ROCK. 
	Uwaga: Żywotność komórek może się różnić w zależności od rozmrożenia i ogólnie rzecz biorąc, żywotność > 65% przewiduje dobrą wydajność posiewu.</li>
	<li>Rozcieńczyć skoncentrowaną zawiesinę komórkową pożywką kardiogenną uzupełnioną inhibitorem szlaku 2 μM RHO/ROCK w celu uzyskania pożądanego stężenia komórek do posiewu (patrz Tabela 2 dla różnych formatów płytek). 
	UWAGA: WAŻNE: Należy pamiętać, że skuteczność różnicowania serca może się zmniejszyć, jeśli komórki są rozsiewane zbyt rzadko.</li>
	<li>Komórki nasienne na talerzu.</li>
	<li>Przechowywać płytkę w kapturze do hodowli tkankowej przez 20 minut przed przeniesieniem do inkubatora do hodowli tkankowych.</li>
	<li>W 6 dniu różnicowania monitoruj przyczepienie komórek. 
	UWAGA: Komórki progenitorowe serca są kriokonserwowane w 5 dniu różnicowania. 24 godziny po rozmrożeniu komórki byłyby w 6 dniu różnicowania. 
	UWAGA: Obecność pływających (martwych) komórek jest powszechna.</li>
	<li>W 7 dniu odessać 50% pożywki i zastąpić ją taką samą ilością świeżej pożywki kardiogennej. 
	UWAGA: Dodanie inhibitora szlaku RHO/ROCK do pożywek kardiogennych nie jest konieczne po tym punkcie.</li>
	<li>Zastąp 50% pożywki pożywką kardiogenną co drugi dzień.</li>
	<li>Zwróć uwagę na spontaniczne dudnienie, które pojawia się między 11 a 13 dniem.</li>
	<li>W dniu 15 określ ilościowo skuteczność różnicowania serca za pomocą immunofluorescencji za pomocą DAPI (barwienie jądra) i ACTC1 (marker pan-sercowy).</li>
</ol>
7. Przechodzenie i utrzymywanie kardiomiocytów komorowych
UWAGA: Do 14-16 dnia powinna zostać uzyskana monowarstwa spontanicznie kurczących się kardiomiocytów przypominających komory. W tym momencie sugeruje się dysocjację i ponowne płytki kardiomiocytów w celu homogenizacji kultury i zapobieżenia odłączaniu się komórek od płytki.
<ol>
	<li>Odessać wszystkie podłoża z dołków i szybko dodać 1 ml wstępnie podgrzanego (37 °C) 1x odczynnika dysocjacyjnego zawierającego enzymy. 
	UWAGA: 1x Objętości odczynnika dysocjacyjnego zawierającego enzymy różnią się w zależności od formatu płytki, ale powinny całkowicie pokrywać dno powierzchni studzienki.</li>
	<li>Przenieść płytkę do inkubatora do hodowli tkankowych.</li>
	<li>Delikatnie potrząsaj płytką z boku na bok co 2 minuty wewnątrz inkubatora, aby przyspieszyć proces odłączania.</li>
	<li>Po 5–15 minutach, gdy od 80% do 100% komórek zostanie oderwanych od dna płytki, wyjmij płytkę z inkubatora i zahamuj 1x aktywność odczynnika dysocjacyjnego zawierającego enzym, dodając równą objętość 10% pożywki FBS. 
	UWAGA: Czas inkubacji z dysocjacją zawierającą 1x enzym dla tego procesu będzie się różnić w zależności od partii.</li>
	<li>Zebrać zawiesinę komórek do probówki wirówkowej.</li>
	<li>Wymieszaj zawiesinę komórek z pipetą i policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek.</li>
	<li>Rozcieńczyć zawiesinę komórkową do pożądanego stężenia komórek (patrz Tabela 2 dla różnych formatów płytek) pożywką konserwacyjną uzupełnioną inhibitorem szlaku 2 μM RHO/ROCK.</li>
	<li>Po wysianiu kardiomiocytów na płytkę, rozprowadź komórki równomiernie i pozwól komórkom przyczepić się przez 10–20 minut przed przeniesieniem płytki do inkubatora do hodowli tkankowych.</li>
	<li>24 godziny po ponownym poszyciu, monitoruj przyłączanie i odzyskiwanie komórek. 
	UWAGA: Obecność pływających (martwych) komórek jest powszechna. 48–72 h po ponownym posiewie kardiomiocyty powinny wznowić spontaniczny skurcz</li>.
	<li>Aby utrzymać posiew kardiomiocytów, należy zastąpić 50% pożywki pożywką podtrzymującą co drugi dzień, aż do użycia kardiomiocytów podobnych do komór do kolejnych eksperymentów.</li>
</ol>

<ol><li>Chong, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic-stem-cell-derived+cardiomyocytes+regenerate+non-human+primate+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts.</a> Nature. 510, 273-277 (2014).</li>
<li>Kodo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPSC-derived+cardiomyocytes+reveal+abnormal+TGF-beta+signalling+in+left+ventricular+non-compaction+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+cell+biology%22%5BJournal%5D)">iPSC-derived cardiomyocytes reveal abnormal TGF-beta signalling in left ventricular non-compaction cardiomyopathy.</a> Nature cell biology. 18, 1031-1042 (2016).</li>
<li>Kim, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+arrhythmogenic+right+ventricular+dysplasia+with+patient-specific+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs.</a> Nature. 494, 105-110 (2013).</li>
<li>Colas, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+microRNA+screening+identifies+let-7+and+mir-18+as+regulators+of+germ+layer+formation+during+early+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Whole-genome microRNA screening identifies let-7 and mir-18 as regulators of germ layer formation during early embryogenesis.</a> Genes & development. 26, 2567-2579 (2012).</li>
<li>Cunningham, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Id+genes+are+essential+for+early+heart+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Id genes are essential for early heart formation.</a> Genes & development. , (2017).</li>
<li>McKeithan, W. L., Colas, A. R., Bushway, P. J., Ray, S., Mercola, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum-free+generation+of+multipotent+mesoderm+%28Kdr%2B%29+progenitor+cells+in+mouse+embryonic+stem+cells+for+functional+genomics+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+stem+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Serum-free generation of multipotent mesoderm (Kdr+) progenitor cells in mouse embryonic stem cells for functional genomics screening.</a> Current protocols in stem cell biology. , Chapter 1, Unit 1F 13(2012).</li>
<li>McKeithan, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+platform+for+assessment+of+congenital+and+drug-induced+arrhythmia+with+hipsc-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+physiology%22%5BJournal%5D)">An automated platform for assessment of congenital and drug-induced arrhythmia with hipsc-derived cardiomyocytes.</a> Frontiers in physiology. 8, 766(2017).</li>
<li>Sharma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+of+tyrosine+kinase+inhibitor+cardiotoxicity+with+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+translational+medicine%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening of tyrosine kinase inhibitor cardiotoxicity with human induced pluripotent stem cells.</a> Science translational medicine. 9, (2017).</li>
<li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24930130">Chemically defined generation of human cardiomyocytes.</a> Nature methods. 11, 855-860 (2014).</li>
<li>Kattman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-specific+optimization+of+activin%2Fnodal+and+BMP+signaling+promotes+cardiac+differentiation+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines.</a> Cell stem cell. 8, 228-240 (2011).</li>
<li>Laflamme, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocytes+derived+from+human+embryonic+stem+cells+in+pro-survival+factors+enhance+function+of+infarcted+rat+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts.</a> Nature biotechnology. 25, 1015-1024 (2007).</li>
<li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+temporal+modulation+of+canonical+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 1848-1857 (2012).</li>
<li>Willems, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule-mediated+TGF-beta+type+II+receptor+degradation+promotes+cardiomyogenesis+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Small molecule-mediated TGF-beta type II receptor degradation promotes cardiomyogenesis in embryonic stem cells.</a> Cell stem cell. 11, 242-252 (2012).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cardiovascular+progenitor+cells+develop+from+a+KDR%2B+embryonic-stem-cell-derived+population%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+ embryonic-stem-cell-derived population.</a> Nature. 453, 524-528 (2008).</li>
<li>Palpant, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+high-purity+cardiac+and+endothelial+derivatives+from+patterned+mesoderm+using+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Generating high-purity cardiac and endothelial derivatives from patterned mesoderm using human pluripotent stem cells.</a> Nature protocols. 12, 15-31 (2017).</li>
<li>DeLaughter, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+resolution+of+temporal+gene+expression+during+heart+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell resolution of temporal gene expression during heart development.</a> Developmental cell. 39, 480-490 (2016).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+genetics+of+hypoplastic+left+heart+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+genetics%22%5BJournal%5D)">The complex genetics of hypoplastic left heart syndrome.</a> Nature genetics. 49, 1152-1159 (2017).</li>
<li>Corrado, D., Link, M. S., Calkins, H. <a target="_blank" href="http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMra1509267">Arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy.</a> New England journal of medicine. 376, 1489-1490 (2017).</li>
<li>Kitamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrovirus-mediated+gene+transfer+and+expression+cloning%3A+powerful+tools+in+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+hematology%22%5BJournal%5D)">Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics.</a> Experimental hematology. 31, 1007-1014 (2003).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Aby skutecznie różnicować, postępuj zgodnie z instrukcjami podanymi powyżej. Ponadto w tym miejscu podkreślamy kluczowe parametry, które mają duży wpływ na wyniki różnicowania. Przed rozpoczęciem różnicowania należy obserwować następujące trzy parametry morfologiczne: morfologię łodygi hPSCId1, wysokie zagęszczenie komórek i wysoką konfluencję (>90%) kultury w dniu 0. W związku z tym optymalne warunki różnicowania najlepiej tworzy się poprzez posiewanie zdysocjowanychhPSCs Id1 jako pojedynczych komó...

Produkcja na dużą skalę ludzkich komórek macierzystych i kardiomiocytów pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) jest warunkiem wstępnym dla terapii opartych na komórkach macierzystych1, modelowanie choroby2,3 oraz szybka charakterystyka nowych szlaków regulujących różnicowanie serca4,5,6 oraz fizjologia7,8. Chociaż wiele badań9,10,11,12,13,14,15 wcześniej opisywały wysoce skuteczne protokoły różnicowania serca na podstawie hPSC, żadne z nich nie zajmowało się pochodzeniem powstających kardiomiocytów w polu serca, pomimo identyfikacji znaczące różnice molekularne między kardiomiocytami komorowymi lewej (pierwsze pole serca) i prawą (drugie pole serca)16 oraz istnienie wrodzonych chorób serca specyficznych dla pola serca; np. zespół niedorozwoju lewego serca<klasa SUP="xref">17 lub arytmogenna dysplazja prawej komory<klasa SUP="XREF">18. W związku z tym generowanie komórek progenitorowych serca i kardiomiocytów o określonym pochodzeniu z pola serca z hPSC staje się koniecznością w celu zwiększenia ich znaczenia jako narzędzi terapeutycznych i modelowania choroby.
Ten protokół opiera się na konstytutywnej nadekspresji Id1, niedawno zidentyfikowanej klasy<sup="xref">5 pierwszej wskazówki określającej pole serca, która w połączeniu z Activiną A jest zarówno konieczna, jak i wystarczająca do zainicjowania kardiogenezy w hPSC. Warto zauważyć, że Cunningham i wsp. (2017)5 pokazują, że progenitory indukowane przez Id1 specyficznie wyrażają pierwsze markery pola serca (HCN4, TBX5), ale nie drugie (SIX2, ISL1), gdy ulegają różnicowaniu serca. Ponadto autorzy pokazują również, że transgeniczne zarodki myszy pozbawione całej rodziny genów Id (Id1-4) rozwijają się bez tworzenia przodków pierwszego pola serca, podczas gdy bardziej przyśrodkowe i tylne komórki progenitorowe serca (drugie pole serca) mogą nadal powstawać, co sugeruje, że białka Id są niezbędne do zainicjowania pierwszej kardiogenezy pola serca in vivo. Dogodnie, progenitorzy indukowani przez Id1 mogą być kriokonserwowane i spontanicznie różnicować się w kardiomiocyty wykazujące cechy podobne do komorowych, w tym ekspresję markerów specyficznych dla komór (IRX4, MYL2) i komorowych potencjałów czynnościowych.
Tutaj opisujemy prostą i skalowalną metodę generowania pierwszych komórek progenitorowych serca podobnych do pola serca (FHF-L) i kardiomiocytów komorowych z nadekspresji hPSC Id1. Ważną cechą tego protokołu jest możliwość oddzielenia generacji progenitorów serca od późniejszej produkcji kardiomiocytów za pomocą wygodnego etapu kriokonserwacji. Podsumowując, protokół ten szczegółowo opisuje niezbędne kroki w celu (1) wygenerowania hPSC z nadekspresją Id1, (2) wygenerowania komórek progenitorowych serca FHF-L z hPSC, (3) kriokonserwacji powstałych komórek progenitorowych oraz (4) wznowienia różnicowania progenitorów serca FHF-L i wygenerowania wysoce wzbogaconych (>70-90%) kardiomiocytów przypominających komory.

<table><tbody><tr><td>Przeciwciało ACTC1</td><td>Sigma</td><td>A7811</td><td></td></tr><tr><td>Activin A</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>Hu Recom Activin A</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyk Przeciwgrzybiczy (Anty-Anty)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Suplement B27</td><td>Suplement Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>B27 w/o - insulina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1895601</td><td></td></tr><tr><td>Suplement witaminy B27 bez witaminy A</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12587001</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało CDH5</td><td>R& D Systems</td><td>AF938</td><td></td></tr><tr><td>CryoStor CS10</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>7930</td><td>Odczynnik do kriokonserwacji</td></tr><tr><td>DMEM o wysokiej zawartości glukozy</td><td>Mediatech</td><td>10-013-CV&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DPBS z Ca & Mg</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>VWR</td><td>89510-186</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw potencjału membranowego FluoVolt&nbsp; &nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F10488</td><td>Aby uzyskać informacje na temat optycznego pozyskiwania potencjału czynnościowego, zapoznaj się z McKeithan i in. 2017</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Gibco</td><td>10828010</td> Matrigel, Growth Factor Reduced Corning 356231 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Coating</td></tr><tr><td>reagent mTeSR1</td> media kit <td>Stem Cell Technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>PBS w/o Ca & Mg</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Puromycyna&nbsp;</td><td>Acros</td><td>227422500</td><td></td></tr><tr><td>ReLeSR</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5872</td><td>Bezenzymatyczny odczynnik dysocjacyjny</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało TAGLN</td><td>Abcam</td><td>ab14106</td><td></td></tr><tr><td>Thiazovivin</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>72254</td><td>Inhibitor szlaku RHO/ROCK</td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12605 -010</td><td>1X odczynnik dysocjacyjny zawierający enzym</td></tr><tr><td>Pakiety mieszanek roztworów Tyrodes&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T2145-10X1L</td> <td>(Aby uzyskać informacje na temat optycznego potencjału czynnościowego, patrz McKeithan i in. 2017)</td></tr></tbody></table>

generacja pierwszych sercopodobnych progenitorów serca i kardiomiocytów komorowych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Generation of First Heart Field-like Cardiac Progenitors and Ventricular-like Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Generowanie dużych ilości funkcjonalnych ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych, pochodzących z komórek progenitorowych serca i kardiomiocytów o określonym pochodzeniu z pola serca, jest warunkiem wstępnym dla terapii kardiologicznych opartych na komórkach i modelowania chorób. Niedawno wykazaliśmy, że geny Id są zarówno niezbędne, jak i wystarczające do określenia pierwszych komórek progenitorowych pola serca podczas rozwoju kręgowców. Ten protokół różnicowania wykorzystuje te odkrycia i wykorzystuje nadekspresję Id1 w połączeniu z aktywiną A jako silne sygnały określające do wytworzenia pierwszych progenitorów podobnych do pola serca (FHF-L). Co ważne, uzyskane w ten sposób komórki progenitorowe skutecznie różnicują się (~70–90%) w kardiomiocyty przypominające komory. Tutaj opisujemy szczegółową metodę 1) generowania hPSC z nadekspresją Id1 i 2) różnicowania skalowalnych ilości kriokonserwowalnych progenitorów FHF-L i kardiomiocytów podobnych do komór.

Generowanie linii hPSCId1s 
hPSC są zakażane lentiwirusem pośredniczącym w nadekspresji Id1 (Rysunek 1A). Po wygenerowaniu hPSCId1 ekspresję transgenu określa się za pomocą qRT-PCR (Rysunek 1B). Do różnicowania należy wykorzystać wyłącznie linie hPSCId1 wykazujące poziom mRNA Id1 przekraczający 0,05-kr...

Tutaj opisujemy skalowalną metodę, wykorzystującą prostą kombinację Activiny A i nadekspresji Id1 za pośrednictwem lentiwirusa, do generowania pierwszych komórek progenitorowych serca podobnych do pola serca i kardiomiocytów komorowych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Generacja pierwszych sercopodobnych progenitorów serca i kardiomiocytów komorowych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

The generation of large amounts of functional human pluripotent stem cells-derived cardiac progenitors and cardiomyocytes of defined heart field origin is ...

Główną zaletą tej prostej techniki jest generowanie komórek progenitorowych serca i kardiomiocytów o określonym pochodzeniu i podtypach pola serca. Z kolei uzyskane komórki mogą być wykorzystywane w szerokim zakresie zastosowań badawczych, w tym w podstawowej biologii rozwojowej, terapii komórkowej opartej na dowodu słuszności koncepcji oraz badaniach modelowania chorób serca. Procedurę zademonstrują Sean Spiering i Michael Yu z mojego laboratorium.Na początek pokryj wystarczającą ilość studzienek 96-dołkowej płytki 50 mikrolitrami odczynnika powlekającego, aby pomieścić kolejne etapy wysiewu komórek i infekcji wirusowej, a następnie dodaj jeden mililitr odczynnika dysocjacyjnego do dołka w sześciodołkowej płytce, aby odłączyć wysiane pluripotencjalne komórki macierzyste. Następnie za pomocą sterylnej pipety przenieś zawiesinę komórek do 15-mililitrowej plastikowej probówki wirówkowej. W probówce dodaj pięć mililitrów PBS zawierającego wapń i magnez, aby zneutralizować odczynnik dysocjacyjny.Następnie odwiruj komórki 200 razy g przez trzy minuty. Po odwirowaniu wyrzucić supernatant, a następnie delikatnie przesunąć probówkę, aby osad został usunięty. Następnie rozpuść osad komórkow

generation-first-heart-field-like-cardiac-progenitors-ventricular

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opracowaliśmy protokół indukcji kardioblastów bezpośrednio z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych utrzymywanych w ściśle określonych warunkach z użyciem małych cząsteczek, co umożliwia pozyskanie dużej ilości ludzkich progenitorów serca oraz funkcjonalnych kardiomiocytów do regeneracji układu sercowo-naczyniowego.

Efektywne otrzymywanie prekursorów kardiologicznych i kardiomiocytów ludzkich z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem indukcji małocząsteczkowej

Pluripotencjalne komórki macierzyste, zarówno embrionalne, jak i indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPS), stanowią cenne źródło ludzkich zróżnicowanych komórek, w tym kardiomiocytów. Tutaj skupimy się na indukcji komórek iPS w sercu, pokazując, jak wykorzystać je do uzyskania funkcjonalnych ludzkich kardiomiocytów za pomocą protokołu opartego na ciałach embrionalnych.

Generowanie ludzkich kardiomiocytów: protokół różnicowania od indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych bez karmienia

Artykuł opisuje szczegółową metodologię skutecznego różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w kardiomiocyty poprzez selektywne modulowanie szlaku Wnt, a następnie analizę markerów referencyjnych za pomocą cytometrii przepływowej w celu oceny jednorodności i tożsamości populacji.

Wysoka skuteczność różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do kardiomiocytów i charakterystyka za pomocą cytometrii przepływowej

W tym protokole zostanie zilustrowane pochodzenie komórek progenitorowych serca zarówno z mysich, jak i ludzkich embrionalnych komórek macierzystych. Główną strategią w tym protokole jest wzbogacenie komórek progenitorowych serca za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu fluorescencyjnych reporterów zmodyfikowanych w embrionalnych liniach komórek macierzystych.

Wyprowadzenie komórek progenitorowych serca z embrionalnych komórek macierzystych

Prezentujemy trzy nowatorskie i bardziej efektywne protokoły różnicowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych na kardiomiocyty, komórki śródbłonka i komórki mięśni gładkich oraz metodę dostarczania, która poprawia wszczepianie przeszczepionych komórek poprzez połączenie iniekcji komórek z dostarczaniem cytokin za pośrednictwem łatki.

Pluripotencjalne komórki serca pochodzące z komórek macierzystych do naprawy mięśnia sercowego

Elektrofizjologiczna charakterystyka kardiomiocytów pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC-CMs) jest kluczowa dla modelowania chorób serca i określania odpowiedzi na leki. Protokół ten dostarcza informacji niezbędnych do dysocjacji i płytki hPSC-CM na matrycach wieloelektrodowych, pomiaru ich potencjału pola oraz metody analizy odstępów QT i RR.

Analiza elektrofizjologiczna ludzkich kardiomiocytów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC-CM) przy użyciu macierzy wieloelektrodowych (MEA)

Celem tej metody jest generowanie in vitro komórek progenitorowych serca specyficznych dla pola serca w celu zbadania specyfikacji komórek progenitorowych i właściwości funkcjonalnych, a także generowanie komórek serca specyficznych dla komory do modelowania chorób serca.

Wytwarzanie in vitro komórek progenitorowych serca specyficznych dla pola serca

Tutaj prezentujemy protokół do solidnego generowania i rozbudowy ludzkich kardiomiocytów z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej pacjenta.

Wytwarzanie i ekspansja ludzkich kardiomiocytów z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej pacjenta

Tutaj opisujemy protokół do efektywnego tworzenia istotnych dla rozwoju organoidów ludzkiego serca (hHO) przy użyciu ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez samoorganizację. Protokół opiera się na sekwencyjnej aktywacji sygnałów rozwojowych i wytwarza wysoce złożone, funkcjonalnie istotne tkanki ludzkiego serca.

Generowanie samoorganizujących się organoidów ludzkiego serca pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych

Prezentowany tutaj jest zestaw protokołów do generowania i kriokonserwacji sferoid serca (CS) z ludzkich pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych, hodowanych w wysokoprzepustowym, wielowymiarowym formacie. Ten trójwymiarowy model funkcjonuje jako solidna platforma do modelowania chorób, wysokoprzepustowych badań przesiewowych i zachowuje swoją funkcjonalność po krioprezerwacji.

Generowanie, wysokoprzepustowe badania przesiewowe i biobankowanie indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych sferoid serca pochodzących z komórek macierzystych

Poznaj skalowalną metodę generowania progenitorów sercowych i kardiomiocytów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu Activin A i Id1. Technika ta umożliwia produkcję komórek o zdefiniowanym pochodzeniu pola sercowego.

Generacja pierwszych sercopodobnych progenitorów serca i kardiomiocytów komorowych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal

Generacja pierwszych sercopodobnych progenitorów serca i kardiomiocytów komorowych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Przeglądaj więcej filmów