Name: Wielobarwna mikroskopia lokalizacyjna białek jednobłonowych w organellach żywych komórek ssaków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-30T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Poznaj wielobarwną mikroskopię lokalizacyjną białek jednobłonowych w organellach żywych komórek ssaków. Ta metoda umożliwia precyzyjne określenie pozycji białek z rozdzielczością około 18 nm.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy chcieliby podziękować grupie Biofizyki i Jacobowi Piehlerowi z Uniwersytetu w Osnabrück za ciągłe wsparcie, Władysławowi Kohlowi za pomoc techniczną i przygotowanie materiału, a także zarządowi CellNanOs za dostarczenie mikroskopów do użytku. Projekt został sfinansowany przez SFB 944.

<ol><li>Appelhans, T., Richter, C., Wilkens, V., Hess, S., Piehler, J., Busch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+organization+of+mitochondrial+microcompartments+revealed+by+combining+tracking+and+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Nanoscale organization of mitochondrial microcompartments revealed by combining tracking and localization microscopy.</a> Nano Letters. 12 (2), 610-616 (2012).</li>
<li>Appelhans, T., Busch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Molecule+Tracking+and+Localization+of+Mitochondrial+Protein+Complexes+in+Live+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Single Molecule Tracking and Localization of Mitochondrial Protein Complexes in Live Cells.</a> Methods Mol Biol. 1567, 273-291 (2017).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li>
<li>Gould, T. J., Verkhusha, V. V., Hess, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+biological+structures+with+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging biological structures with fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Nat Protoc. 4 (3), 291-308 (2009).</li>
<li>Pennacchietti, F., Gould, T. J., Hess, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Probe+Photophysics+in+Localization-Based+Superresolution+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">The Role of Probe Photophysics in Localization-Based Superresolution Microscopy.</a> Biophys J. 113 (9), 2037-2054 (2017).</li>
<li>Wegel, E., Göhler, A., Lagerholm, B. C., Wainman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cellular+structures+in+super-resolution+with+SIM%2C+STED+and+Localisation+Microscopy%3A+A+practical+comparison%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison.</a> Scientific reports. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/srep27290?WT.feed_name=subjects_physical-sciences ">https://www.nature.com/articles/srep27290?WT.feed_name=subjects_physical-sciences </a> (2016).</li>
<li>Pellett, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-color+STED+microscopy+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Two-color STED microscopy in living cells.</a> Biomedical Optics Express. 2 (8), (2011).</li>
<li>Ishigaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STED+super-resolution+imaging+of+mitochondria+labeled+with+TMRM+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">STED super-resolution imaging of mitochondria labeled with TMRM in living cells.</a> Mitochondrion. 28, 79(2016).</li>
<li>Liss, V., Barlag, B., Nietschke, M., Hensel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-labelling+enzymes+as+universal+tags+for+fluorescence+microscopy%2C+super-resolution+microscopy+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Self-labelling enzymes as universal tags for fluorescence microscopy, super-resolution microscopy and electron microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 17740(2015).</li>
<li>Sergé, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+multiple-target+tracing+to+probe+spatiotemporal+cartography+of+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes.</a> Nat Methods. 5 (8), (2008).</li>
<li>Appelhans, T., Busch, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+mitochondrial+membrane+proteins+in+specific+sub-organelle+membrane+locations%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+reviews%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of mitochondrial membrane proteins in specific sub-organelle membrane locations.</a> Biophysical reviews. 9 (4), 345-352 (2017).</li>
<li>Wilmes, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triple-color+super-resolution+imaging+of+live+cells%3A+resolving+submicroscopic+receptor+organization+in+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%22%5BJournal%5D)">Triple-color super-resolution imaging of live cells: resolving submicroscopic receptor organization in the plasma membrane.</a> Angewandte Chemie. 51 (20), 4868-4871 (2012).</li>
<li>Niewidok, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+imaging+reveals+dynamic+biphasic+partition+of+RNA-binding+proteins+in+stress+granules%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule imaging reveals dynamic biphasic partition of RNA-binding proteins in stress granules.</a> J Cell Biol. , (2018).</li>
<li>Wurm, C. A., Jakobs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+protein+distributions+define+two+sub-compartments+of+the+mitochondrial+inner+membrane+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Differential protein distributions define two sub-compartments of the mitochondrial inner membrane in yeast.</a> FEBS Lett. 580 (24), 5628-5634 (2006).</li>
<li>Schmidt, R., Wurm, C. A., Punge, A., Egner, A., Jakobs, S., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+cristae+revealed+with+focused+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial cristae revealed with focused light.</a> Nano Lett. 9 (6), 2508-2510 (2009).</li>
<li>Kukat, C., Wurm, C. A., Spahr, H., Falkenberg, M., Larsson, N. G., Jakobs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+reveals+that+mammalian+mitochondrial+nucleoids+have+a+uniform+size+and+frequently+contain+a+single+copy+of+mtDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy reveals that mammalian mitochondrial nucleoids have a uniform size and frequently contain a single copy of mtDNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13534-13539 (2011).</li>
<li>Beinlich, F., Drees, C., Piehler, J., Busch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shuttling+of+PINK1+between+Mitochondrial+Microcompartments+Resolved+by+Triple-Color+Superresolution+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Shuttling of PINK1 between Mitochondrial Microcompartments Resolved by Triple-Color Superresolution Microscopy.</a> ACS chemical biology. 10 (9), 1970-1976 (2015).</li>
<li>Shim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+fluorescence+imaging+of+organelles+in+live+cells+with+photoswitchable+membrane+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (35), 13978-13983 (2012).</li>
<li>Sbalzarini, I., Mezzacasa, A., Helenius, A., Koumoutsakos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Organelle+Shape+on+Fluorescence+Recovery+after+Photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Effects of Organelle Shape on Fluorescence Recovery after Photobleaching.</a> Biophysical Journal. 89 (3), 1482-1492 (2005).</li>
<li>Reits, E., Neefjes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+fixed+to+FRAP%3A+measuring+protein+mobility+and+activity+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells.</a> Nature Cell Biology. 3 (6), E145-E147 (2001).</li>
<li>Goehring, N., Chowdhury, D., Hyman, A., Grill, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRAP+Analysis+of+Membrane-Associated+Proteins%3A+Lateral+Diffusion+and+Membrane-Cytoplasmic+Exchange%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">FRAP Analysis of Membrane-Associated Proteins: Lateral Diffusion and Membrane-Cytoplasmic Exchange.</a> Biophysical Journal. 99 (8), 2443-2452 (2010).</li>
<li>Bacia, K., Haustein, E., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+correlation+spectroscopy%3A+principles+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+protocols%22%5BJournal%5D)">Fluorescence correlation spectroscopy: principles and applications.</a> Cold Spring Harbor protocols. 2014 (7), 709-725 (2014).</li>
<li>Sukhorukov, V., Dikov, D., Busch, K., Strecker, V., Wittig, I., Bereiter-Hahn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+protein+mobility+in+mitochondrial+membranes+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta%22%5BJournal%5D)">Determination of protein mobility in mitochondrial membranes of living cells.</a> Biochimica et biophysica acta. 1798 (11), 2022-2032 (2010).</li>
<li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cell+transfection%3A+the+present+and+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Anal Bioanal Chem. 397 (8), 3173-3178 (2010).</li>
<li>Graham, F. L., van der Eb, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+technique+for+the+assay+of+infectivity+of+human+adenovirus+5+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA.</a> Virology. 52 (2), 456-467 (1973).</li>
<li>Wedeking, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporally+Controlled+Reorganization+of+Signaling+Complexes+in+the+Plasma+Membrane+of+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporally Controlled Reorganization of Signaling Complexes in the Plasma Membrane of Living Cells.</a> Small. 11 (44), 5912-5918 (2015).</li>
<li>Mironov, S. L., Ivannikov, M. V., Johansson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5BCa2%2B%5Di+signaling+between+mitochondria+and+endoplasmic+reticulum+in+neurons+is+regulated+by+microtubules.+From+mitochondrial+permeability+transition+pore+to+Ca2%2B-induced+Ca2%2B+release%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">[Ca2+]i signaling between mitochondria and endoplasmic reticulum in neurons is regulated by microtubules. From mitochondrial permeability transition pore to Ca2+-induced Ca2+ release.</a> J Biol Chem. 280 (1), 715-721 (2005).</li>
<li>Poot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+morphology+and+function+with+novel+fixable+fluorescent+stains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial morphology and function with novel fixable fluorescent stains.</a> J Histochem Cytochem. 44 (12), 1363-1372 (1996).</li>
<li>Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/nmeth1171">Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells (vol 5, pg 159).</a> Nature Methods. 5 (5), 455(2008).</li>
<li>Elmokadem, A., Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+Drift+Correction+for+Superresolution+Localization+Microscopy+with+Bayesian+Inference%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Optimal Drift Correction for Superresolution Localization Microscopy with Bayesian Inference.</a> Biophys J. 109 (9), 1772-1780 (2015).</li>
<li>Barlag, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+molecule+super-resolution+imaging+of+proteins+in+living+Salmonella+enterica+using+self-labelling+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Single molecule super-resolution imaging of proteins in living Salmonella enterica using self-labelling enzymes.</a> Sci Rep. 6, 31601(2016).</li>
<li>Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+inclined+thin+illumination+enables+clear+single-molecule+imaging+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells.</a> Nature Methods. 5 (2), 159-161 (2008).</li>
<li>Mortensen, K. I., Churchman, L. S., Spudich, J. A., Flyvbjerg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+localization+analysis+for+single-molecule+tracking+and+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimized localization analysis for single-molecule tracking and super-resolution microscopy.</a> Nat Methods. 7 (5), 377-381 (2010).</li>
<li>Jin, S., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINK1-+and+Parkin-Mediated+Mitophagy+at+a+Glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">PINK1- and Parkin-Mediated Mitophagy at a Glance.</a> Journal of Cell Science. 125, 795-799 (2013).</li>
<li>Yamano, K., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINK1+is+degraded+through+the+N-end+rule+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">PINK1 is degraded through the N-end rule pathway.</a> Autophagy. 9 (11), 1758-1758 (2013).</li>
<li>Wiedemann, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Machinery+for+protein+sorting+and+assembly+in+the+mitochondrial+outer+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Machinery for protein sorting and assembly in the mitochondrial outer membrane.</a> Nature. 424 (6948), 565-571 (2003).</li>
<li>Thompson, R., Larson, D., Webb, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+Nanometer+Localization+Analysis+for+Individual+Fluorescent+Probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Precise Nanometer Localization Analysis for Individual Fluorescent Probes.</a> Biophysical Journal. 82 (5), 2775-2783 (2002).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym artykule zaprezentowano technikę dwukolorowej lokalizacji pojedynczych cząsteczek ruchomych białek błonowych. Zgodnie z protokołem, białka błonowe są łączone z samoznakującymi się białkami, które reagują z barwnikami rodaminy TMR i SiR sprzężonymi z odpowiednimi substratami. Barwniki rodaminowe są jasne i fotostabilne, a tym samym pozwalają na powtarzalne obrazowanie1. Aby zapewnić pomyślne wyniki, należy pamiętać o kilku warunkach i krytycznych tematach.
Po pierw...

Celem tego protokołu jest dostarczenie metody obrazowania do lokalizacji i śledzenia pojedynczych białek błonowych wewnątrz żywych komórek. Nazywamy tę metodę Mikroskopią Śledzenia i Lokalizacji (TALM)1,2. Podobnie jak stochastyczna mikroskopia rekonstrukcji optycznej (STORM)3 i mikroskopia lokalizacji fotoaktywacji fluorescencji ((F)PALM)4,5, TALM jest techniką lokalizacji fluorescencji opartą na pojedynczej cząsteczce. Różni się jednak tym, że ruchliwość białek błonowych w połączeniu z powtarzającym się obrazowaniem tej samej znakowanej cząsteczki w różnych pozycjach ujawnia mikroprzedział, który jest dostępny dla białka ruchomego. Innymi słowy, możliwe lokalizacje białka są ustalane przez architekturę organelli i ruchliwość białka1. Metoda ta jest komplementarna z różnymi innymi technikami superrozdzielczości6,7,8, ponieważ ujawnia mapy lokalizacji i trajektorii poprzez obrazowanie białek ruchomych. Znakowanie opiera się na użyciu genetycznie modyfikowanych białek fuzyjnych, które same w sobie nie są fluorescencyjne. Te białka fuzyjne są samoznakującymi się enzymami, które reagują kowalencyjnie z substratem sprzężonym z barwnikiem. Ta procedura ma tę zaletę, że stopień etykietowania może być kontrolowany przez ilość dodanego substratu. Ponadto pozwala na zmianę barwy fluorescencji, w zależności od wybranego barwnika sprzężonego. Dostępnych jest kilka samoetykietujących się znaczników enzymatycznych9. Kolejną zaletą stosowania samoznakujących się znaczników enzymatycznych jest to, że sprzężone barwniki są zwykle bardziej stabilne i jaśniejsze niż białka fluorescencyjne1, a zatem poszczególne białka mogą być rejestrowane dłużej i dokładniej, dopóki nie zostaną wybielone. Pozwala to na rejestrację trajektorii ruchomych białek i ekstrakcję współczynników dyfuzji10,11.
Tutaj pokazujemy wykonalność TALM z mitochondrialnymi białkami błonowymi, ale może być również stosowany do innych białek błony wewnątrz- i zewnątrzkomórkowej, w tym różnych typów komórek12,13. Pokazujemy, że wielokolorowy TALM pozwala na jednoczesne rozróżnianie białek w różnych podprzedziałach w uzupełnieniu do istniejących technik mikroskopii fluorescencyjnej o wysokiej rozdzielczości14,15,16. TALM jest kompatybilny z obrazowaniem żywych komórek17. Fotofizyka wybranych rodamin Tetramethylrhodamine (TMR) i Silicon-Rhodamien (SiR), a w szczególności ich jasność i stabilność, pozwala na rejestrację pojedynczych białek błonowych w wielu ramkach, zapewniając mapy lokalizacji (i trajektorii). Jednak TALM jest ograniczony do lokalizacji rozpuszczalnych białek o wysokich współczynnikach dyfuzji, ponieważ rozmycie ruchu jest zbyt wysokie, a zebrane fotony na klatkę są zbyt niskie, aby zapewnić prawidłową lokalizację. Poza tym TALM wymaga mniejszej mocy wzbudzenia niż na przykład mikroskopia STORM lub STED (Stimulated Emission Depletion)6,7, co zmniejsza efekty fototoksyczne. Jest to ważne, ponieważ stres fototoksyczny często wpływa na morfologię organellarów18, a tym samym na analizę mobilności19. Podsumowując, przedstawiamy wielobarwny TALM w żywych komórkach jako technikę, która wypełnia lukę między metodami mikroskopii lokalizacyjnej STORM/STED/(F)PALM a technikami analizującymi ruchliwość białek, takimi jak odzyskiwanie fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP)20,21, spektroskopia korelacji fluorescencji (FCS)22, oraz spektroskopia korelacji krzyżowej fluorescencji (FCCS)11,23.

<table><tbody><tr><td>Kwas (2-(4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynylo)-etanosulfonowy, 1 M) (HEPES)</td><td>Biochrom</td><td>#1104E</td><td></td></tr><tr><td>DC1: Dichroidalny rozdzielacz wiązki&nbsp;</td><td>Chroma</td><td>640 dcxr</td><td>NC506031</td></tr><tr><td>DC2: Lustro polichroiczne, rozdzielacz wiązki</td><td>Chroma</td><td>zt405/488/561/640rpc</td><td>wycofane</td></tr><tr><td>z produkcji Dulbecco&acute; s Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) 1x (bez Ca & Mg)</td><td>Sigma-Aldrich & Co.</td><td></td><td></td>#RNBF8311</tr><tr><td>Earle&acute; s MEM bez czerwieni fenolowej, bez L-Glutaminy i bez NaHCO3 zawierającego 1% FBS, 0,1% HEPES, 0,1% NEAA, 0,1% Alanylo-L-Glutaminy i 34,78% wodorowęglanu sodu (NaHCO3 0,75 g / l)</td><td></td><td></td> <td>Podłoże obrazowe</td></tr><tr><td>Earle&acute; s minimum niezbędne podłoże (MEM) z czerwienią fenolową, zawierające 1% płodowej surowicy bydlęcej Superior (FBS), 0,1% HEPES (kwas 2-(4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynylo)-etanosulfonowy, 1 M) i 0,1% aminokwasów endogennych (NEAA)</td><td></td><td></td><td>Pożywka wzrostowa</td></tr><tr><td>EF: Czteropasmowy filtr emisyjny</td><td>AHF analysentechnik</td><td>F72-866</td><td>Brightline HC 446 nm/523 nm/600 nm/677 nm</td></tr><tr><td>Kamera EMCCD</td><td>Andor</td><td>Andor iXON 897</td><td></td></tr><tr><td>Filtr emisyjny QuadView kostki filtracyjne, pomarańczowy</td><td>AHF analysentechnik</td><td>F39-637</td><td>pasmo przepustowe 582 - 619 nm</td></tr><tr><td>Filtr emisyjny Kostki filtracyjne QuadView, czerwone</td><td>Pasmo przepustowe Chroma</td><td></td><td>655 - 725 nm (HQ 690/70)</td></tr><tr><td>FBS (Surowica bydlęca) superior</td><td>Biochrom</td><td>S0615</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki fluorescencyjne: TetraSpeck&trade; Mikrosfery, 0,1 i mikro; m, fluorescencyjny niebieski/zielony/pomarańczowy/ciemnoczerwony</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T7279</td><td>mikrosfery fluorescencyjne</td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Biochrom</td><td>#0951C</td><td></td></tr><tr><td>Komórki HeLa&nbsp;</td><td>DSMZ</td><td>ACC-57</td><td>Komórki raka szyjki macicy od pacjentki Henrietta Lacks</td></tr><tr><td>Hela cells CI::p aGFP, stabilny</td><td>Muster et al., PLOSOne 2010</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hela cells CV g::Halo7-Tag, stabilny</td><td>Appelhans et al., NanoLett 2012</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hela cells Tom20::Halo7-Tag, stabilny</td><td>Appelhans et al., NanoLett 2012</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rozdzielacz obrazu</td><td>Fotometria</td><td>Dual-View </td><td>Emisja rozdzielacza obrazu</td>QV2</tr><tr><td>Oprogramowanie do przetwarzania obrazu&nbsp;</td><td>ImageJ2 / Fiji</td><td>freeware</td><td></td></tr><tr><td>Olejek immersyjny - ImmersolTM 518 F (ne = 1.518, ve = 45)</td><td>Carl Zeiss Jena GmbH</td><td>444960-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>Odwrócony mikroskop epifluorescencyjny</td><td>Olympus IX-71/73/83</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laser 561 nm, 200 mW</td><td>CrystaLaser</td><td>CL-561-200</td><td>emisja 561 nm</td></tr><tr><td>Laser 642 nm, 140 mW</td><td>Omicron</td><td>Luxx-642-140</td><td>emisja 642 nm</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>wersja R2013a</td><td></td></tr><tr><td>MEM z Earle's Balanced Salt Solution 2,2 g/L NaHCO3, stabilna glutamina bez PR</td><td>Biochrom</td><td>FG-0385</td><td></td></tr><tr><td>MEM z Earle's Balanced Salt Solution z 2,2 g/L NaHCO3, stabilna glutamina, Phenolred</td><td>Biochrom</td><td>FG-0325</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker&reg; Deep Red FM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>M22426</td><td>barwnik</td></tr><tr><td>MitoTracker&reg; Zielony barwnik FM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>M7514</td><td></td></tr><tr><td>Wielomodowa polaryzacja optyczna utrzymująca światłowód jednomodowy</td><td>Pointsource/Qioptiq</td><td></td><td>KineFLEX</td></tr><tr><td>NHS-PEG-MAL, Rapp Polymer&nbsp;</td><td>Rapp Polymere GmbH T&uuml; </td><td>Szkiełko nakrywkowe</td>Bingen <td></td> Powłoka</tr><tr><td>endogenne aminokwasy (NEAA)</td><td>Biochrom</td><td>#0802E</td><td></td></tr><tr><td>PEG 800 (Glikol polietylenowy) 10 %</td> <td>Carl Roth GmbH</td><td>Nr art 0263.1</td><td>Powłoka szkiełka nakrywkowego</td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Biochrom</td><td>#0122E</td><td></td></tr><tr><td>Plazmid do ekspresji PINK1-Halo7-Tag</td><td>Beinlich i wsp., ACS Chemical Biology 2015</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lizyna (1,2 mg/ml)</td><td>Sigma-Aldrich & Co.</td><td>kot. No.P9155</td><td>powłoka szkiełka nakrywkowego</td></tr><tr><td>RGD Peptyd (Ac-CGRGDS-COOH)</td><td>System rdzeniowy Diagnostix GmbH,</td><td>powłoka szkiełka nakrywkowego Gernsheim</td><td></td> / motyw receptora Intergrin</tr><tr><td>Rodamina krzemowa połączona z HaloTag&reg;-Ligand (SiRHTL)&nbsp;</td><td>osobisty prezent od Kaia Johnsona</td><td></td>, <td>barwnik,</td></tr><tr><td>wtyczka do analizy oprogramowania</td><td>, napisana samodzielnie: C. P. Richter, Biophysik Osnabr&uuml; ck</td><td>SLIMFAST 16g</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametylorodamina / SNAP-Cell&reg; TMR-Star połączony z SNAP-Ligand (TMRstar)&nbsp;</td><td>Biolab Nowej Anglii &reg;</td><td>Barwnik S9105S</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametylorodamina związana z HaloTag&reg;-Ligand (TMRHTL)&nbsp;</td><td>Kondensator Promega</td><td>G8251</td><td>barwnik</td></tr><tr><td>TIRF</td><td>Olympus</td><td>Cell^TIRF MITICO System</td><td>Kondensator TIRF</td></tr><tr><td>Oprogramowanie sterujące mikroskopem TIRF</td><td>Olympus cellSens 1.12</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Obiektyw TIRF</td> Obiektyw olejowy <td>Olympus</td><td>150x (ND 1,45; Olympus UAPO)</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna/EDTA 10x</td><td>Biochrom</td><td>#0266</td><td></td></tr><tr><td>Woda H2O 99,5 % Rotipuran&reg; Niska zawartość organiczna&nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>Art. Nie. Zobacz materiał HN57.1</td><td></td></tr></tbody></table>

wielobarwna mikroskopia lokalizacyjna białek jednobłonowych w organellach żywych komórek ssaków

Multi-color Localization Microscopy of Single Membrane Proteins in Organelles of Live Mammalian Cells

Wiedza na temat lokalizacji białek w podkompartmentach komórkowych jest kluczowa dla zrozumienia ich specyficznej funkcji. W tym miejscu przedstawiamy technikę super-rozdzielczości, która pozwala na określenie mikrokompartmentów, które są dostępne dla białek, poprzez generowanie map lokalizacji i śledzenia tych białek. Co więcej, za pomocą wielokolorowej mikroskopii lokalizacyjnej uzyskuje się jednocześnie profile lokalizacji i śledzenia białek w różnych podprzedziałach. Technika ta jest specyficzna dla żywych komórek i opiera się na powtarzalnym obrazowaniu pojedynczych ruchomych białek błonowych. Interesujące nas białka są genetycznie łączone ze specyficznymi, tak zwanymi znacznikami samoznakującymi. Te znaczniki są enzymami, które reagują z substratem w sposób kowalencyjny. Sprzężone z tymi podłożami są barwniki fluorescencyjne. Reakcja białek znakowanych enzymatycznie z substratami znakowanymi fluorescencyjnie prowadzi do powstania znakowanych białek. W tym przypadku tetrametylorodamina (TMR) i rodamina krzemu (SiR) są stosowane jako barwniki fluorescencyjne przyłączone do substratów enzymów. Wykorzystując stężenia substratów w zakresie od pM do nM, uzyskuje się znakowanie substechiometryczne, które daje wyraźne sygnały. Sygnały te są zlokalizowane z precyzją ~15–27 nm. Technika ta pozwala na wielokolorowe obrazowanie pojedynczych cząsteczek, przy czym liczba kolorów jest ograniczona dostępnymi barwnikami przepuszczalnymi dla błony oraz repertuarem enzymów samoznakujących. Pokazujemy wykonalność techniki, określając lokalizację kinazy 1 indukowanej enzymem kontroli jakości (Pten) (PINK1) w różnych przedziałach mitochondrialnych podczas jej przetwarzania w stosunku do innych białek błonowych. Test na prawdziwe fizyczne interakcje między różnie znakowanymi pojedynczymi białkami za pomocą pojedynczej cząsteczki FRET lub co-tracking jest jednak ograniczony, ponieważ niskie stopnie znakowania zmniejszają prawdopodobieństwo znakowania dwóch sąsiednich białek w tym samym czasie. Chociaż technika ta jest skuteczna w obrazowaniu białek w przedziałach błonowych, w większości przypadków nie jest właściwe określanie lokalizacji wysoce ruchomych rozpuszczalnych białek.

Wielokolorowe obrazowanie i analiza kolokalizacji mogą pomóc w określeniu suborganellowej lokalizacji białek. Wykazaliśmy to wcześniej w przypadku cytozolowej fosfatazy i homologu tensyny, PINK1, która zajmuje różne lokalizacje submitochondrialne ze względu na przetwarzanie przez proteazy mitochondrialne17. PINK1 jest istotnym czynnikiem gwarantującym funkcjonalność mitochondriów34,35. Aby określić lokaliza...

Tutaj prezentujemy protokół wielokolorowej lokalizacji pojedynczych białek błonowych w organellach żywych komórek. Do przyłączania fluoroforów stosuje się białka samoznakujące. Białka, znajdujące się w różnych przedziałach błonowych tych samych organelli, mogą być lokalizowane z precyzją ~18 nm.

Wielobarwna mikroskopia lokalizacyjna białek jednobłonowych w organellach żywych komórek ssaków

Knowledge about the localization of proteins in cellular subcompartments is crucial to understand their specific function. Here, we present a ...

Technika ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania w procesach regulacyjnych, takie jak rola dynamiki i organizacji białek w adaptacji funkcjonalnej. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją wykonać w żywych komórkach, ujawniając w ten sposób dynamikę białek na poziomie pojedynczej cząsteczki. Chociaż metoda ta została pierwotnie wdrożona w celu zapewnienia wglądu w czasoprzestrzenną organizację białek błonowych mitochondriów, można ją również zastosować do innych organelli i innych białek błonowych.Technikę zademonstruje Timo Appelhans, doktorant z mojego laboratorium. Po transfekcji i przygotowaniu próbek komórek i mikroskopu zgodnie z protokołem tekstowym, zamontuj przygotowaną próbkę za pomocą koralików fluorescencyjnych w uchwycie próbki między pierścieniem PTFE a czerwonym gumowym pierścieniem. Uruchom mikroskop, wszystkie komponenty sprzętowe i całe oprogramowanie potrzebne do mikroskopii.Użyj świeżej, niestrzępiącej się chusteczki spryskanej izopropanolem, aby wyczyścić soczewkę obiektywu i spód szkiełka nakrywkowego. Następnie umieść kroplę olejku immersyjnego na źrenicy soczewki obiektywu. Następnie umieść uchwyt na próbkę z próbką kulki na stoliku mikroskopu tak, a

multi-color-localization-microscopy-single-membrane-proteins

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Mikroskopia poklatkowa markerów autofagii znakowanych fluorescencyjnie umożliwia monitorowanie dynamicznej odpowiedzi autofagii z wysoką rozdzielczością czasową. Korzystając ze specyficznych markerów autofagii i organelli w kombinacji 3 różnych kolorów, możemy śledzić wkład białka w tworzenie autofagosomów w solidnym kontekście przestrzennym i czasowym.

Obrazowanie na żywych komórkach wczesnych zdarzeń autofagii: omegasomy i nie tylko

Pokazujemy użycie mikroskopii lokalizacji fotoaktywacji fluorescencji (FPALM) do jednoczesnego obrazowania wielu typów fluorescencyjnie znakowanych cząsteczek w komórkach. Opisane techniki pozwalają na lokalizację od tysięcy do setek tysięcy pojedynczych białek znakowanych fluorescencyjnie, z precyzją do dziesiątek nanometrów w pojedynczych komórkach.

Jednoczesne wielobarwne obrazowanie struktur biologicznych z fluorescencyjną mikroskopią lokalizacji fotoaktywacji

Tutaj prezentujemy protokół do przeprowadzenia analizy ilościowej poziomu asocjacji plazmato-błonowej dla fluorescencyjnie oznakowanego białka związanego obwodowo. Metoda opiera się na obliczeniowej dekompozycji błonowej i cytoplazmatycznej składowej sygnału obserwowanej w komórkach znakowanych markerem fluorescencyjnym błony plazmatycznej.

Oznaczanie partycjonowania błony plazmatycznej dla białek związanych obwodowo

Ten artykuł zawiera przewodnik krok po kroku do badania dynamiki lokalizacji subkomórkowej białek i monitorowania zmian morfologicznych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej o wysokiej rozdzielczości u Bacillus subtilis i Staphylococcus aureus.

Mikroskopia fluorescencyjna żywych komórek w celu zbadania lokalizacji białek subkomórkowych i zmian morfologii komórek u bakterii

Konwencjonalne koniugaty BODIPY mogą być używane do mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek żywych komórek (SMLM) poprzez wykorzystanie ich przejściowo tworzących, przesuniętych ku czerwieni dimerów stanu podstawowego. Przedstawiamy zoptymalizowany protokół SMLM do śledzenia i rozpoznawania subkomórkowych obojętnych lipidów i kwasów tłuszczowych w żywych komórkach ssaków i drożdży w nanoskopowej skali długości.

Konwencjonalne koniugaty BODIPY do mikroskopii superrozdzielczej żywych komórek i śledzenia pojedynczych cząsteczek

Ten protokół przedstawia proces propagacji, różnicowania i barwienia hodowanych komórek SH-SY5Y oraz pierwotnych neuronów hipokampa szczura do wizualizacji i analizy ultrastruktury mitochondriów za pomocą mikroskopii stymulowanego zubożenia emisji (STED).

Wykorzystanie obrazowania STED na żywych komórkach do wizualizacji ultrastruktury wewnętrznej błony mitochondrialnej w modelach komórek neuronalnych

Ten protokół opisuje mechanizm użycia światła korelacyjnego i mikroskopii elektronowej do wizualizacji interakcji mitochondriów i lizosomów znakowanych odpowiednio mEosEM i APEX2.

Dwukolorowa korelacyjna mikroskopia świetlna i elektronowa do wizualizacji interakcji między mitochondriami a lizosomami

Ten artykuł szczegółowo opisuje, jak tworzyć próbki do śledzenia pojedynczego białka w dwuwarstwach lipidowych wspieranych w stałych. Wyjaśnia to także prosty mikroskop fluorescencyjny o czułości na pojedynczą cząsteczkę i szybkim płynności. Na koniec przedstawiamy procedurę wyodrębniania trajektorii pojedynczych białek.

Śledzenie pojedynczych białek w dwuwarstwach lipidowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Protokół ten opisuje ekspresję i ilościową liczbę podjednostek receptorów acetylocholinowych neuronów za pomocą linii komórkowej Neuro-2a ssaków. Znaczniki fluorescencyjne wrażliwe na pH oraz mikroskopia konfokalna umożliwiają precyzyjną ocenę lokalizacji receptorów w błonie plazmatycznej w porównaniu do tych wyrażanych w neutralnych pH-przedziałach wewnątrzkomórkowych, ułatwiając badania transportu nAChR i modulacji farmakologicznej.

Lokalizacja błony plazmatycznej i wewnątrzkomórkowych receptorów nikotynowej acetylocholiny za pomocą obrazowania ilościowego w komórkach ssaków

Protokół ten opisuje znakowanie pojedynczych przeciwciał (SAL) w celu rozwiązywania nanoskalowej organizacji przestrzennej białek błony plazmatycznej. Wykorzystując skumulowane interakcje przeciwciał-epitop na poziomie pojedynczych cząsteczek, błonowy SAL (mSAL) mapuje lokalne rozkłady epitopów, jednocześnie rejestrując zachowanie wiązania przeciwciał w natywnym środowisku komórkowym.

Mikroskopia lokalizacyjna pojedyncząsteczkowych białek błonowych z wykorzystaniem znakowania pojedynczych przeciwciał

Poznaj wielobarwną mikroskopię lokalizacyjną białek jednobłonowych w organellach żywych komórek ssaków. Ta metoda umożliwia precyzyjne określenie pozycji białek z rozdzielczością około 18 nm.

Wielobarwna mikroskopia lokalizacyjna białek jednobłonowych w organellach żywych komórek ssaków

Przeglądaj więcej filmów