Name: Zoptymalizowany test zarysowań do testowania migracji komórek in vitro za pomocą zautomatyzowanej kamery optycznej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: Poznaj zoptymalizowany test zarysowań do badania migracji komórek HaCaT in vitro za pomocą zautomatyzowanej kamery optycznej. Ta metoda umożliwia obserwację w czasie rzeczywistym i ma zastosowanie w terapii ran przewlekłych oraz nowotworów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Duńska Rada ds. Niezależnych Badań, Technologii i Produkcji, grant #4005-00029

Eksperymentalny układ nie ma żadnych ograniczeń etycznych i prawnych i został przeprowadzony w porozumieniu z Uniwersytetem w Roskilde. Przegląd konfiguracji eksperymentalnej można zobaczyć na Rysunek 1, a mechanizmy kamery optycznej na Rysunek 2.
1. Przygotowanie
<ol>
	<li>Wykonaj wszystkie kroki w sterylnym stole laminarnym, czyszcząc stół i wszystkie urządzenia 70% etanolem przed rozpoczęciem eksperymentu.</li>
	<li>Umieść kamerę optyczną w konwencjonalnym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 , aby zapewnić optymalne warunki dla komórek.</li>
	<li>Hoduj komórki HaCaT w pożywce DMEM z 10% FBS i 1x antybiotykami (penicyliną i streptomycyną) w kolbie T75.</li>
	<li>Użyj 1 ml 1x trypsyny, aby oderwać komórki i hodować je co 3-4 dni, rozpraszając je w warstwie komórkowej. Przed użyciem podgrzej do temperatury pokojowej.</li>
</ol>
2. Generowanie monowarstwy komórek HaCaT w 48-dołkowej płytce mikromiareczkowej
<ol>
	<li>Usunąć pożywkę z kolby T75 za pomocą pipety Pasteura.</li>
	<li>Przemyć przylegające komórki w kolbie, dodając 5 ml 1x sterylny PBS do kolby T75. 
	nuta: Upewnij się, że PBS jest wolny od wapnia i magnezu.</li>
	<li>Rozprowadzić PBS w obiegu i usunąć go pipetą Pasteura.</li>
	<li>Powtórz kroki 2.2-2.3.</li>
	<li>Dodaj 1 ml 1x trypsyny do kolby i rozprowadź ją w warstwie komórek.</li>
	<li>Inkubować kolbę w temperaturze 37 °C w konwencjonalnym inkubatorze aż do odłączenia komórek (5-8 minut jest wystarczające dla większości linii komórkowych).</li>
	<li>View pod mikroskopem, jeśli komórki są odłączone. Po odłączeniu komórek dodaj 9 ml zwykłej pożywki hodowlanej z 10% FBS, aby dezaktywować 1x trypsynę.</li>
	<li>Policz komórkę za pomocą hemocytometru, licznika redlic lub podobnego. 
	nuta: Błękit trypanowy może być używany do przeglądania martwych komórek. Jednak w 1x trypsyny komórki HaCaT są idealnie okrągłe, gdy żyją.</li>
	<li>Przenieś 7,5 x 104 komórek/basenik w 250 μl 10% pożywki FBS na okrągłodenną 48-dołkową płytkę do hodowli tkankowej (płytka standardowa). 
	Uwaga: Test można również ustawić na płytkach 6-, 12-, 24- lub 96-dołkowych, które można oznaczyć pod mikroskopem optymalnym.</li>
	<li>Delikatnie przesuwaj płytkę z boku na bok, aby upewnić się, że komórki są równomiernie rozmieszczone w studzienkach, w przeciwnym razie komórki zgromadzą się w środku dołków. Sprawdź pod mikroskopem świetlnym, aby upewnić się, że komórka jest równomiernie rozłożona w pożywce</li>
	<li>Umieścić płytkę w konwencjonalnym inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C przez noc lub do momentu, gdy komórki przylgną do dna studzienek.</li>
</ol>
3. Dodawanie bodźców dla efektów migracji
<ol>
	<li>Sprawdź, czy studzienki są zlewające się w 90-95% pod mikroskopem świetlnym.</li>
	<li>Przygotować 10 μg/ml mitomycyny C w odpowiedniej ilości pożywki. 
	nuta: W tym badaniu mitomycynę C utrzymuje się w temperaturze 4 °C w roztworze podstawowym w sstężeniu 1 mg/ml. Mitomicyna C w roztworze może być przechowywana do tygodnia w ciemności w temperaturze 2-8 °C.</li>
	<li>Usuń zużytą pożywkę za pomocą pipety Pasteura z każdej studzienki.</li>
	<li>Dodać 250 μl 5 μg/ml mitomycyny C do każdego dołka.</li>
	<li>Inkubować płytkę przez 2 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Przygotuj bodźce peptydów, rozcieńczając je w odpowiedniej ilości pożywki. 
	nuta: W tym badaniu zarówno ludzka, jak i bydlęca laktoferyna i laktoferrycyna były testowane w stężeniu 25 μg/ml w objętości 250 μl</li>
	<li>Usunąć pożywkę z mitomycyną C za pomocą pipety Pasteura.</li>
	<li>Przemyć studzienki 1x 250 μl 1x PBS (temperatura pokojowa) i usunąć płukanie pipetą Pasteura.</li>
	<li>Dodaj 250 μl 1x PBS i ręcznie zdrap studzienki pionowo za pomocą końcówki do pipety o pojemności 200 μl. Do każdego dołka należy użyć nowej końcówki do pipety.</li>
	<li>Usuń PBS i dodaj 250 μl bodźców peptydowych.</li>
	<li>Zamontuj płytkę w systemie kamery optycznej, regulując po obu stronach płyty. Pozostaw pokrywkę na płytce do mikromiareczkowania. 
	nuta: W razie potrzeby kamera może pracować z otwartą pokrywą.</li>
</ol>
4. Konfiguracja programu dla kamery optycznej na komputerze
<ol>
	<li>Kliknij przycisk Pobierz na pasku zadań po lewej stronie.</li>
	<li>Wybierz funkcję Gojenie ran na pasku zadań po lewej stronie.</li>
	<li>Wybierz typ blachy, klikając poniżej ilustracji Blacha.</li>
	<li>Odznacz nieużywane studnie, zaznaczając je i klikając Włącz w lewym górnym rogu ekranu. 
	nuta: Wszystkie studnie są zaznaczone domyślnie.</li>
	<li>Dostosuj ostrość soczewki na studzienkach, aby dopasować ją do położenia komórek, klikając prawym przyciskiem myszy jedną z studzienek. 
	nuta: Autofokus można również regulować ręcznie, przesuwając pasek w prawo od ilustracji na płycie.</li>
	<li>Ustaw przedział czasu dla obrazów w obszarze Interwał zdjęć (np. (00:30:00)).</li>
	<li>Ustaw liczbę powtórzeń tak, aby pasowała do żądanego okresu (np. 97 powtórzeń).</li>
	<li>Rozpocznij bieg, klikając przycisk Start w prawym dolnym rogu.</li>
</ol>

<ol><li>Frykberg, R. G., Banks, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+the+Treatment+of+Chronic+Wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+wound+care%22%5BJournal%5D)">Challenges in the Treatment of Chronic Wounds.</a> Advances in wound care. 4 (9), 560-582 (2015).</li>
<li>da Silva, L., Carvalho, E., Cruz, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+neuropeptides+in+skin+inflammation+and+its+involvement+in+diabetic+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+opinion+on+biological+therapy%22%5BJournal%5D)">Role of neuropeptides in skin inflammation and its involvement in diabetic wound healing.</a> Expert opinion on biological therapy. 10 (10), 1427-1439 (2010).</li>
<li>Vyas, K. S., Wong, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Biofilm+in+Wounds+as+an+Early+Indicator+for+Risk+for+Tissue+Infection+and+Wound+Chronicity%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Plastic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Detection of Biofilm in Wounds as an Early Indicator for Risk for Tissue Infection and Wound Chronicity.</a> Annals of Plastic Surgery. 76 (1), 127-131 (2016).</li>
<li>Paul, C. D., Mistriotis, P., Konstantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cell+motility%3A+lessons+from+migration+in+confined+spaces%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cancer cell motility: lessons from migration in confined spaces.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (2), 131-140 (2016).</li>
<li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis.</a> Annual review of medicine. 57, 1-18 (2006).</li>
<li>Monsuur, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+study+differences+in+cell+mobility+during+skin+wound+healing+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Methods to study differences in cell mobility during skin wound healing in vitro.</a> Journal of Biomechanics. 49 (8), 1381-1387 (2016).</li>
<li>Tang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+lactoferrin+stimulates+skin+keratinocyte+function+and+wound+re-epithelialization%5BTitle%5D)+AND+%22The+British+journal+of+dermatology%22%5BJournal%5D)">Human lactoferrin stimulates skin keratinocyte function and wound re-epithelialization.</a> The British journal of dermatology. 163 (1), 38-47 (2010).</li>
<li>Ashby, W. J., Zijlstra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Established+and+novel+methods+of+interrogating+two-dimensional+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Established and novel methods of interrogating two-dimensional cell migration.</a> Integrative Biology. 4 (11), 1338-1350 (2012).</li>
<li>Klettner, A., Tahmaz, N., Dithmer, M., Richert, E., Roider, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+aflibercept+on+primary+RPE+cells%3A+toxicity%2C+wound+healing%2C+uptake+and+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Effects of aflibercept on primary RPE cells: toxicity, wound healing, uptake and phagocytosis.</a> British Journal of Ophthalmology. 98 (10), 1448-1452 (2014).</li>
<li>Doyle, W., Shide, E., Thapa, S., Chandrasekaran, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+energy+beverages+on+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Food+and+Chemical+Toxicology%22%5BJournal%5D)">The effects of energy beverages on cultured cells.</a> Food and Chemical Toxicology. 50 (10), 3759-3768 (2012).</li>
<li>Zordan, M. D., Mill, C. P., Riese, D. J., Leary, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+throughput%2C+interactive+imaging%2C+bright-field+wound+healing+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">A high throughput, interactive imaging, bright-field wound healing assay.</a> Cytometry Part A. 79 (3), 227-232 (2011).</li>
<li>Keese, C. R., Wegener, J., Walker, S. R., Giaever, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+wound-healing+assay+for+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Electrical wound-healing assay for cells in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (6), 1554-1559 (2004).</li>
<li>Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+scratch+assay%3A+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).</li>
<li>Räsänen, K., Vaheri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta1+causes+epithelial-mesenchymal+transition+in+HaCaT+derivatives%2C+but+induces+expression+of+COX-2+and+migration+only+in+benign%2C+not+in+malignant+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dermatological+Science%22%5BJournal%5D)">TGF-beta1 causes epithelial-mesenchymal transition in HaCaT derivatives, but induces expression of COX-2 and migration only in benign, not in malignant keratinocytes.</a> Journal of Dermatological Science. 58 (2), 97-104 (2010).</li>
<li>Tochio, T., Tanaka, H., Nakata, S., Hosoya, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fructose-1%2C6-bisphosphate+aldolase+A+is+involved+in+HaCaT+cell+migration+by+inducing+lamellipodia+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dermatological+Science%22%5BJournal%5D)">Fructose-1,6-bisphosphate aldolase A is involved in HaCaT cell migration by inducing lamellipodia formation.</a> Journal of Dermatological Science. 58 (2), 123-129 (2010).</li>
<li>Tomasz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitomycin+C%3A+small%2C+fast+and+deadly+%28but+very+selective%29%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitomycin C: small, fast and deadly (but very selective).</a> Chemistry and Biology. 2 (9), 575-579 (1995).</li>
<li>Stamm, A., Reimers, K., Strauß, S., Vogt, P., Scheper, T., Pepelanova, I. <a target="_blank" href="https://www.degruyter.com/view/j/biomat.2016.17.issue-1-2/bnm-2016-0002/bnm-2016-0002.xml">In vitro wound healing assays - state of the art.</a> BioNanoMaterials. 17 (1-2), 79-87 (2016).</li>
<li>Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+Cell+Migration+and+Invasion+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In vitro Cell Migration and Invasion Assays.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), 1-8 (2014).</li>
<li>Jonkman, J. E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+the+wound+healing+assay+using+live-cell+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adhesion+%26+Migration%22%5BJournal%5D)">An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy.</a> Cell Adhesion & Migration. 8 (5), 440-451 (2016).</li>
<li>Hong, J., Kandasamy, K., Marimuthu, M., Choi, C. S., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+cell-substrate+impedance+sensing+as+a+non-invasive+tool+for+cancer+cell+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Analyst%22%5BJournal%5D)">Electrical cell-substrate impedance sensing as a non-invasive tool for cancer cell study.</a> The Analyst. 136 (2), 237-245 (2011).</li>
<li>Fredborg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+optical+antimicrobial+susceptibility+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Real-time optical antimicrobial susceptibility testing.</a> Journal of Clinical Microbiology. 51 (7), 2047-2053 (2013).</li>
<li>Jenssen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti+herpes+simplex+virus+activity+of+lactoferrin%2Flactoferricin+-+An+example+of+antiviral+activity+of+antimicrobial+protein%2Fpeptide%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Anti herpes simplex virus activity of lactoferrin/lactoferricin - An example of antiviral activity of antimicrobial protein/peptide.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (24), 3002-3013 (2005).</li>
<li>Jenssen, H., Hancock, R. E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+properties+of+lactoferrin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial properties of lactoferrin.</a> Biochimie. 91 (1), 19-29 (2009).</li>
<li>Delva, E., Tucker, D. K., Kowalczyk, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+desmosome%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+perspectives+in+biology%22%5BJournal%5D)">The desmosome.</a> Cold Spring Harbor perspectives in biology. 1 (2), 1-17 (2009).</li>
<li>Ponti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+Distinct+Actin+Networks+Drive+the+Protrusion+of+Migrating+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two Distinct Actin Networks Drive the Protrusion of Migrating Cells.</a> Science. 305 (5691), 1782-1786 (2004).</li>
<li>Canali, C., Spillum, E., Valvik, M., Agersnap, N., Olesen, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCanali%2C+C+%22Whitepaper+a+Digital+Time-Lapse+Bright+Field+Technology+To+Drive+Faster%2C+Higher+Throughput+Bioanalysis%22">Whitepaper a Digital Time-Lapse Bright Field Technology To Drive Faster, Higher Throughput Bioanalysis</a>. , (2016).</li>
<li>Peplow, P. V., Chatterjee, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+influence+of+growth+factors+and+cytokines+in+in+vitro+human+keratinocyte+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">A review of the influence of growth factors and cytokines in in vitro human keratinocyte migration.</a> Cytokine. 62 (1), 1-21 (2013).</li>
<li>Ilina, O., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+collective+cell+migration+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of collective cell migration at a glance.</a> Journal of Cell Science. 122 (18), 3203-3208 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Znaczenie migracji w badaniach nad rozwojem, gojeniem się ran, immunologią i rakiem doprowadziło do powstania kilku różnych metod badania migracji. Migracja może być wyrazem ekspansji lub zamykania luki przez komórki. Najczęściej testowane jest zamknięcie rysy, ponieważ łatwiej jest wyhodować komórki w monowarstwie, a następnie zrobić rysę, niż wyhodować komórki w określonej formie8. Nasze badanie pokazuje zoptymalizowaną metodę ręcznego drapania, ponieważ technika ta jest łatwa do opanowania i ta...

Migracja to ważny proces, który wpływa na kilka aspektów fizjologicznych. W procesie gojenia się ran migracja ułatwia ponowną epitelizację skóry. W niegojących się ranach, takich jak rany przewlekłe, bakterie oportunistyczne powodują zakażenie rany, a otwarte rany są idealne do rozwoju bakterii i tworzenia biofilmu1,2. Biofilm jest jedną z przyczyn rozwoju opornych bakterii, które są jednym z największych zagrożeń dla naszego współczesnego społeczeństwa3. Podczas gojenia się ran komórki odpornościowe nie mogą przeniknąć do biofilmu. W przypadku nowotworów migracja komórek nowotworowych jest kluczowym etapem przerzutów, które są główną przyczyną zgonów pacjentów z guzami litymi4,5. Dlatego tak ważne jest, aby móc badać migracje.
Test scratch jest często używany do testowania migracji komórek, ponieważ jest tani i łatwy do przeprowadzenia na przylegających liniach komórkowych, takich jak fibroblasty, śródbłonki i nabłonkowe linie komórkowe6,7. Obecnie istnieje kilka metod wykonywania zadrapań8 i zgłoszono, że używane są różne materiały, w tym wykałaczki9, skrobaki do komórek10, lasers11 i prądy elektryczne12. Wszystkie metody mają różne zalety i wady, a metodę należy wybrać w zależności od typu komórki, budżetu i narzędzia do analizy. Na przykład, jeśli używany typ ogniwa wymaga powlekania, ręczne usuwanie ciśnienia, np. za pomocą wykałaczki lub końcówki pipety, wpłynie na migrację w obrębie obszaru, należy zastosować inną metodę. W tym badaniu skupimy się na ręcznym skrobaniu.
Wadą ręcznego skrobania jest zmienność rozmiaru, kształtów zadrapań i nagromadzenie komórek na krawędziach rysy. Istnieje wiele protokołów, a często cytowany artykuł zaleca zwiększenie prędkości i/lub dokładne mycie po zadrapaniu13. Ponadto zastosowano kilka metod w celu zminimalizowania proliferacji, ponieważ proliferacji komórek nie można odróżnić od migracji, a zatem może dawać fałszywie dodatnie wyniki migracji. Niektóre zgłoszone metody to głód surowicy poprzedzający scratch14 i zmniejszanie ilości surowicy15. Jednak żadna z tych metod nie może zagwarantować, że nie dojdzie do proliferacji. Dlatego informujemy o wstępnym traktowaniu komórek mitomycyną C, aby zapewnić prawdziwe wyniki migracji. Mitomicyna C jest antybiotykiem, który hamuje syntezę DNA poprzez tworzenie wiązania kowalencyjnego z DNA, co zapobiega rozdzielaniu się DNA16. Poprzez wstępne traktowanie mitomycyną C i mycie PBS przed drapaniem, wykryte zamknięcie szczeliny pokazuje prawdziwą migrację komórek (ryc. 1).
Cechą charakterystyczną wszystkich metod jest potrzeba systemu do analizy procesu migracji17. Powszechną i niedrogą metodą analizy postępów jest użycie mikroskopu pola świetlnego do wykonania zdjęć rysy w określonych punktach czasowych, a następnie analiza zamknięcia luki w obrazie software18,19. Ta metoda jest czasochłonna, zawodna w robieniu zdjęć w tym samym miejscu i ostrości, a ruch z inkubatora do aparatu wymusza cykle zmian temperatury podczas robienia zdjęć. Opracowano inne metody wykrywania migracji poprzez pomiar bieżącego przepływu. Prąd zmienia się, ponieważ komórki zajmują więcej miejsca na płycie, co jest odczytywane jako wzrost impedancji20. Pomiar impedancji nie ma wpływu na środowisko komórek, a zatem metoda jest uważana za nieinwazyjną. Metoda ta opiera się na specjalistycznych płytkach ze złotymi elektrodami, które są drogie, ale umożliwiają wykrycie wielu procesów, takich jak przyleganie komórek, proliferacja, migracja i śmierć komórki. Dużą wadą tej metody jest to, że pomiar impedancji nie wskazuje bezpośrednio na migrację, ponieważ czynniki takie jak temperatura mają duży wpływ na impedancję. Zmiany impedancji mogą być spowodowane kilkoma czynnikami, które nie są sprawdzane przez oprogramowanie, co utrudnia analizę danych. W związku z tym brak wizualizacji wymaga konwencjonalnego mikroskopu świetlnego do weryfikacji migracji.
Aby przezwyciężyć wiele wad dostępnych technik, używamy zautomatyzowanej kamery optycznej działającej w czasie rzeczywistym. Kamera optyczna to system detekcji z mikroskopem o wysokiej przepustowości umieszczonym na małej platformie z obiektywem, jednostką oświetleniową i kamerą cyfrową. Ma wbudowane oprogramowanie, które może między innymi testować migrację i proliferację. Aby wykryć migrację, stosuje się dwa algorytmy do analizy kinetyki wzrostu i migracji komórek, które nazywane są odpowiednio analizą proliferacji i gojenia się ran. Analiza proliferacji opiera się na dwuetapowym algorytmie segmentacji obrazu, który stosuje analizę tekstury w celu wykrycia różnicy między obszarami pokrytymi komórkami (pokazanymi na żółto) a pustymi obszarami tła za pomocą zaawansowanej analizy histogramu. Analiza gojenia się ran opiera się na trzyetapowym algorytmie, który wykrywa monowarstwę komórki, lokalizuje szczelinę rany i określa szerokość szczeliny. Te kroki są wykonywane w punktach czasowych określonych przez użytkownika, a dane są prezentowane jako pokryty obszar, szerokość przerwy i obszar przerwy. Jedną z wielkich zalet tego urządzenia jest to, że umożliwia obrazowanie przylegających komórek przez ciecz ze względu na kąt nachylenia kamery21. Obiektyw aparatu wykonuje obrazy pod kątem, które są rzutowane na stos z pojedynczej płaszczyzny z generowane, aby upewnić się, że zdjęcia są ostre (ilustracja 2). Stosy Z są generowane poprzez scalenie serii zdjęć (np. 40) wykonanych prostopadle do krawędzi rany i w poprzek całej rany. Z-stacks umożliwia uchwycenie głębokości warstwy komórek, a także płaszczyzny ostrości w poprzek rany. Co więcej, serie obrazów można połączyć w kolekcję obrazów wideo za pomocą jednego kliknięcia przycisku.
Demonstrujemy zoptymalizowany protokół wykrywania migracji w linii komórkowej keratynocytów HaCaT. Przetestowaliśmy laktoferynę i jej N-końcowy peptyd, laktoferrycynę, pochodzące od ludzi i krów, aby przeanalizować ich wpływ na migrację, ponieważ wykazano, że cząsteczki te mają liczne zastosowania jako cząsteczki przeciwbakteryjne i modulujące odporność22,23. Cztery związki porównano z nieleczonymi komórkami HaCaT, a jako kontrolę pozytywną zastosowano naskórkowy czynnik wzrostu (EGF).

<table><tbody><tr><td>oCelloScope</td><td>BioSense Solution ApS Kamera</td><td></td><td>optyczna</td></tr><tr><td>Oprogramowanie UniExplorer&nbsp;</td><td>BioSense Solution ApS</td><td></td><td>(8.0.0.7144 (RL3))Komórka</td></tr> <tr><td></td><td></td><td>HaCaT</td><td>Przekazana ze Szpitala Bispebjerg</td></tr><tr><td>DMEM (1x) + GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td>Pożywka dla HaCaT</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td>Płodowa surowica bydlęca</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>D837</td><td>Bez Mg+ i Ca2+</td></tr><tr><td>Pencillin-Streptomycyna</td><td>Sigma</td><td>P0781</td><td>Antybiotyki</td></tr><tr><td>Trypsyna (10x)</td><td>Sigma</td><td>T3924</td><td></td></tr><tr><td>Mitomycyna C</td><td>Tocris</td><td>3258</td><td>Hamuje proliferację</td></tr><tr><td>Płytka mikromiareczkowa</td><td>Greiner Bio-one</td><td>677 180</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Panasonic</td><td></td><td>37&deg; C, 5% CO2</td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>wspomagający</td><td></td><td>T&uuml; rk (0,1 mm)</td></tr><tr><td>Chłopiec do pipet</td><td>Accu-Jet pro</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

zoptymalizowany test zarysowań do testowania migracji komórek in vitro za pomocą zautomatyzowanej kamery optycznej

Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera

Migracja komórek jest ważnym procesem, który wpływa na wiele aspektów zdrowia, takich jak gojenie się ran i rak, dlatego jest kluczowy dla rozwoju metod badania migracji. Test zarysowania od dawna jest najpowszechniejszą metodą in vitro do badania związków o właściwościach anty- i promigracyjnych ze względu na niski koszt i prostą procedurę. Jednak często zgłaszanym problemem testu jest nagromadzenie komórek na krawędzi rysy. Ponadto, aby uzyskać dane z testu, należy wykonać obrazy o różnym narażeniu w okresie czasu dokładnie w tym samym miejscu, aby porównać ruchy migracji. Do opisania zarysowania można użyć różnych programów analitycznych, ale są one pracochłonne, niedokładne i wymuszają cykle zmian temperatury. W tym badaniu demonstrujemy zoptymalizowaną metodę badania efektu migracji, np. z naturalnie występującymi białkami laktoferyną ludzką i bydlęcą oraz ich N-końcowym peptydem laktoferrycyną na linii komórek nabłonkowych HaCaT. Kluczową optymalizacją jest mycie i drapanie w PBS, co eliminuje wspomniane wcześniej gromadzenie się komórek wzdłuż krawędzi. Można to wytłumaczyć usunięciem kationów, które, jak wykazano, mają wpływ na połączenie komórka-komórka keratynocytu. Aby zapewnić dokładne wykrywanie migracji, do protokołu dodano wstępne leczenie mitomycyną C, inhibitorem syntezy DNA. Na koniec demonstrujemy zautomatyzowaną kamerę optyczną, która eliminuje nadmierne cykle temperaturowe, pracę ręczną z analizą zarysowań, jednocześnie poprawiając odtwarzalność i zapewniając analizę identycznych odcinków zadrapania w czasie.

HaCaT to linia komórkowa keratynocytów, jednego z najliczniejszych typów komórek w skórze. W przypadku powstania rany komórki skóry zaczynają proliferować i migrować w stronę łoża rany, aby ją zamknąć (Rysunek 3). Oba te procesy są zatem niezwykle istotne dla prawidłowego gojenia.
Kamera optyczna pozwala na śledzenie obu procesów w czasie rzeczywistym. W przypadku migracji system dostarcza trzy zest...

Tutaj opisujemy procedurę testowania migracji komórek in vitro za pomocą automatycznego mikroskopu optycznego. Test zarysowania jest szeroko stosowany, w którym zamknięcie rysy następuje przez określony czas. Mikroskop optyczny umożliwia niezawodne i tanie wykrywanie migracji komórek.

Zoptymalizowany test zarysowań do testowania migracji komórek in vitro za pomocą zautomatyzowanej kamery optycznej

Cell migration is an important process that influences many aspects of health, such as wound healing and cancer, and it is, therefore, crucial for ...

Główną zaletą tej techniki jest to, że można oglądać komórki w czasie rzeczywistym w automatycznym mikroskopie optycznym. Implikacje tego leczenia rozciągają się na terapię przewlekłych ran lub raka, w przypadku których migracja odgrywa kluczową rolę w tych chorobach. Zacznij od dwukrotnego przemycia zlewającej się kultury komórek HaCaT pięcioma mililitrami sterylnego PBS wolnego od magnezu i wapnia na pranie.Następnie inkubuj komórki z jednym mililitrem trypsyny w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć do ośmiu minut. Po potwierdzeniu oderwania pod mikroskopem świetlnym należy zatrzymać reakcję enzymatyczną z dziewięcioma mililitrami pożywki hodowlanej uzupełnionej FBS. I rozcieńczyć komórki do 7,5 razy 10 do czwartej komórki na 250 mikrolitrów pożywki plus stężenie FBS.Następnie wysiewaj 250 mikrolitrów komórek do każdej studzienki 48-dołkowej płytki do hodowli tkankowej z okrągłym dnem i delikatnie przesuwaj płytkę z boku na bok, aby upewnić się, że komórki są równomiernie rozmieszczone na dnie studzienki. Następnie przenieś płytkę do inkubatora do hodowli komórkowych. Gdy kultury osiągną zbieżność od 90 do 95%, zastąp supernatant w każdym dołku 250 mikrolitrami świeżo przygotowanej pożywki uzupełnionej 10 mikrogramami na mililitr mitomycyny C i umieść płytkę z powrotem w inkubatorze na kolejne dwie godziny.Pod koniec inkubacji przemyj komórki 250 mikrolitrami PBS i dodaj 250 mikrolitrów świeżego PBS do każdej studzienki. Następnie użyj końcówki mikropipety o pojemności 200 mikrolitrów, aby wykonać jedno pionowe zadrapanie w każdej monowarstwie komórki. Gdy wszystkie monowarstwy zostaną zarysowane, zastąp PBS w każdej studzience 250 mikrolitrami z interesującym nas bodźcem peptydowym i zamontuj płytkę w systemie kamer optycznych z nienaruszoną pokrywą.Aby skonfigurować kamerę optyczną, otwórz okno pobierania i wybierz gojenie się ran. Wybierz typ płyty i odznacz nieużywane studzienki. Następnie kliknij włącz i kliknij prawym przyciskiem myszy jedno z dołków, aby dostosować ostrość do położenia komórek.Ustaw przedział czasu dla obrazów w obszarze Interwał obrazu i ustaw liczbę powtórzeń, aby dopasować je do żądanego okresu. Następnie należy wybrać odpowiedni typ analizy. Następnie kliknij start, aby rozpocząć obrazowanie komórek.Kiedy pojawia się rana, komórki skóry zaczynają się namnażać i migrować przez łożysko rany, aby zamknąć ranę, proces, który można zaobserwować za pomocą kamery optycznej. Po 48-godzinnej inkubacji leczenie czynnikiem wzrostu śródbłonka powoduje prawie 95% zamknięcie rany, w porównaniu do 38% zamknięcia w nieleczonych studzienkach kontrolnych oraz 33 i 62% zamknięcia odpowiednio w kulturach laktoferyny i laktoferrycyny. Procent zamknięcia rany określony na podstawie zmian szerokości szczeliny od początkowego zadrapania można również wykreślić dla każdego bodźca wzrostowego.Ten film opisuje prosty i skuteczny protokół badania migracji keratynocytów przez rysę wykonaną w monowarstwie zdrowych komórek. Chociaż komórki użyte w tym teście to komórki HaCaT, metodę można również zastosować do innych linii komórkowych, grzybów, a nawet bakterii, o ile przylegają one do dna płytki mikromiareczkowej.

optimized-scratch-assay-for-vitro-testing-cell-migration-with-an

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Badanie wczesnej migracji komórek śródbłonka (EEC) jest ważne dla zrozumienia patofizjologii niektórych chorób i potencjalnego zidentyfikowania nowych strategii interwencji terapeutycznej. Poniższy protokół opisuje techniki oceny migracji komórek, które zostały dostosowane do badania EWG.

Ocena migracji komórek śródbłonka po ekspozycji na toksyczne chemikalia

Zdolność do migracji jest kluczową funkcją wielu różnych typów komórek, w tym mezenchymalnych komórek zrębowych (MSC). Ilościowe określenie zmian w zdolności migracyjnej po wystąpieniu szkód jest jednak trudne. Protokół ten opisuje łatwy do adaptacji test migracji, który wykorzystuje rygorystyczne statystyki do ilościowego określenia zmian w zdolności migracyjnej MSC po uszkodzeniu.

Optymalizacja testu zadrapań rany w celu wykrycia zmian w migracji mysich mezenchymalnych komórek zrębu po uszkodzeniu przez rozpuszczalny ekstrakt z dymu papierosowego

To badanie przedstawia dwie różne metody analizy inwazji i migracji komórek: test komory Boydena i test gojenia ran oparty na mikroskopie in vitro. Opisano protokoły tych dwóch eksperymentów oraz porównano ich zalety i wady.

Ocena procesu inwazji i migracji komórek: porównanie testu ran drapanych opartego na mikroskopie wideo i testu z komorą Boydena

Migracja komórek jest niezbędna do rozwoju, utrzymania i naprawy tkanek oraz nowotworzenia, a także jest regulowana przez czynniki wzrostu, chemokiny i cytokiny. Protokół ten opisuje test punktowy, dwuwymiarowy, nieograniczony test migracji w celu oceny fenotypu migracyjnego dołączonych, spójnych arkuszy komórkowych w odpowiedzi na sygnały mikrośrodowiskowe.

Wykorzystanie testu punktowego do analizy migracji arkuszy komórek

Ten manuskrypt opisuje, w jaki sposób zmiany przypominające nacięcia wykonane na monowarstwach hodowanych komórek nabłonkowych wygodnie modelują gojenie się ran in vitro, umożliwiając obrazowanie za pomocą konfokalnej lub laserowej mikroskopii skaningowej, i które mogą dostarczyć wysokiej jakości danych ilościowych i jakościowych do badania zarówno zachowania komórek, jak i mechanizmów związanych z migracją.

Mikroskopowe metody oceny migracji komórek nabłonka podczas gojenia się ran in vitro

To badanie skupia się na modelu gojenia ran in vitro (test zadrapań) jako mechanizmie określającym, jak zanieczyszczenia środowiskowe, takie jak arsen, wpływają na migrację komórek. Wyniki pokazują, że ten test in vitro dostarcza szybkich i wczesnych wskazówek dotyczących zmian w migracji komórkowej przed eksperymentami in vivo.

In vitro Test zarysowania w celu wykazania wpływu arsenu na migrację komórek skóry

Obecny protokół opisuje zintegrowaną metodę badania migracji i inwazji komórek rakowych na jednej platformie w czasie rzeczywistym, zapewniając łatwą do odtworzenia i efektywną czasowo opcję badania mobilności i morfologii komórek.

Prosty przepływ pracy migracji/inwazji przy użyciu zautomatyzowanego imagera Live Cell

Tutaj prezentujemy protokół dla testu in vitro z użyciem pierwotnych fibroblastów oraz dla testu in vivo gojenia ran skóry na myszach. Oba testy są prostymi metodami oceny gojenia się ran in vitro i in vivo.

Test migracji zadrapań i komora grzbietowego fałdu skórnego do analizy gojenia się ran in vitro i in vivo

Przedstawiamy opłacalną metodę do testu migracji od razu, która zapewnia nowe podejście do określania migracji komórek bez użycia metod intensywnie wykorzystujących sprzęt. Chociaż w tym protokole wykorzystano fibroblasty, można go dostosować i wykorzystać do badania dodatkowych typów komórek i wpływu na migrację komórek.

Ekonomiczny i elastyczny test migracji zarysowania

Ten protokół zapewnia metodę pierwotnej izolacji mysich limfocytów T i mikroskopii poklatkowej migracji limfocytów T w określonych warunkach środowiskowych z analizą ilościową.

Test migracji in vitro w czasie rzeczywistym dla pierwotnych mysich limfocytów T CD8 +

To badanie przedstawia dwuwymiarowy (2D) test migracji ran drapanych i trójwymiarowy (3D) test kiełkowania sferoidów, wraz z odpowiednimi metodami analizy, w tym ekstrakcją RNA i immunocytochemią, jako odpowiednie testy do badania angiogenezy in vitro.

Badanie angiogenezy na poziomie funkcjonalnym i molekularnym poprzez wykorzystanie testu migracji ran drapanych i testu kiełkowania sferoidalnego

Poznaj zoptymalizowany test zarysowań do badania migracji komórek HaCaT in vitro za pomocą zautomatyzowanej kamery optycznej. Ta metoda umożliwia obserwację w czasie rzeczywistym i ma zastosowanie w terapii ran przewlekłych oraz nowotworów.

Zoptymalizowany test zarysowań do testowania migracji komórek in vitro za pomocą zautomatyzowanej kamery optycznej

Przeglądaj więcej filmów