Zoptymalizowany test zarysowań do testowania migracji komórek in vitro za pomocą zautomatyzowanej kamery optycznej
8 sierpnia 2018
Tutaj opisujemy procedurę testowania migracji komórek in vitro za pomocą automatycznego mikroskopu optycznego. Test zarysowania jest szeroko stosowany, w którym zamknięcie rysy następuje przez określony czas. Mikroskop optyczny umożliwia niezawodne i tanie wykrywanie migracji komórek.
Główną zaletą tej techniki jest to, że można oglądać komórki w czasie rzeczywistym w automatycznym mikroskopie optycznym. Implikacje tego leczenia rozciągają się na terapię przewlekłych ran lub raka, w przypadku których migracja odgrywa kluczową rolę w tych chorobach. Zacznij od dwukrotnego przemycia zlewającej się kultury komórek HaCaT pięcioma mililitrami sterylnego PBS wolnego od magnezu i wapnia na pranie.
Następnie inkubuj komórki z jednym mililitrem trypsyny w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć do ośmiu minut. Po potwierdzeniu oderwania pod mikroskopem świetlnym należy zatrzymać reakcję enzymatyczną z dziewięcioma mililitrami pożywki hodowlanej uzupełnionej FBS. I rozcieńczyć komórki do 7,5 razy 10 do czwartej komórki na 250 mikrolitrów pożywki plus stężenie FBS.
Następnie wysiewaj 250 mikrolitrów komórek do każdej studzienki 48-dołkowej płytki do hodowli tkankowej z okrągłym dnem i delikatnie przesuwaj płytkę z boku na bok, aby upewnić się, że komórki są równomiernie rozmieszczone na dnie studzienki. Następnie przenieś płytkę do inkubatora do hodowli komórkowych. Gdy kultury osiągną zbieżność od 90 do 95%, zastąp supernatant w każdym dołku 250 mikrolitrami świeżo przygotowanej pożywki uzupełnionej 10 mikrogramami na mililitr mitomycyny C i umieść płytkę z powrotem w inkubatorze na kolejne dwie godziny.
Pod koniec inkubacji przemyj komórki 250 mikrolitrami PBS i dodaj 250 mikrolitrów świeżego PBS do każdej studzienki. Następnie użyj końcówki mikropipety o pojemności 200 mikrolitrów, aby wykonać jedno pionowe zadrapanie w każdej monowarstwie komórki. Gdy wszystkie monowarstwy zostaną zarysowane, zastąp PBS w każdej studzience 250 mikrolitrami z interesującym nas bodźcem peptydowym i zamontuj płytkę w systemie kamer optycznych z nienaruszoną pokrywą.
Aby skonfigurować kamerę optyczną, otwórz okno pobierania i wybierz gojenie się ran. Wybierz typ płyty i odznacz nieużywane studzienki. Następnie kliknij włącz i kliknij prawym przyciskiem myszy jedno z dołków, aby dostosować ostrość do położenia komórek.
Ustaw przedział czasu dla obrazów w obszarze Interwał obrazu i ustaw liczbę powtórzeń, aby dopasować je do żądanego okresu. Następnie należy wybrać odpowiedni typ analizy. Następnie kliknij start, aby rozpocząć obrazowanie komórek.
Kiedy pojawia się rana, komórki skóry zaczynają się namnażać i migrować przez łożysko rany, aby zamknąć ranę, proces, który można zaobserwować za pomocą kamery optycznej. Po 48-godzinnej inkubacji leczenie czynnikiem wzrostu śródbłonka powoduje prawie 95% zamknięcie rany, w porównaniu do 38% zamknięcia w nieleczonych studzienkach kontrolnych oraz 33 i 62% zamknięcia odpowiednio w kulturach laktoferyny i laktoferrycyny. Procent zamknięcia rany określony na podstawie zmian szerokości szczeliny od początkowego zadrapania można również wykreślić dla każdego bodźca wzrostowego.
Ten film opisuje prosty i skuteczny protokół badania migracji keratynocytów przez rysę wykonaną w monowarstwie zdrowych komórek. Chociaż komórki użyte w tym teście to komórki HaCaT, metodę można również zastosować do innych linii komórkowych, grzybów, a nawet bakterii, o ile przylegają one do dna płytki mikromiareczkowej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje procedurę badania migracji komórek in vitro z wykorzystaniem zautomatyzowanego mikroskopu z kamerą optyczną. Testy z zadrapaniem (scratch assay) zostały przedstawione jako niezawodna metoda obserwacji migracji komórek w czasie.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Mikroskopia
- Techniki in vitro
Wstęp
- Test rysy (scratch assay) jest powszechnie stosowaną techniką badania migracji komórek.
- Zautomatyzowane mikroskopy optyczne umożliwiają obserwację komórek w czasie rzeczywistym.
- Zrozumienie migracji komórek ma kluczowe znaczenie w terapiach ran przewlekłych i nowotworów.
- Metoda ta jest kosztowo efektywna i niezawodna w wykrywaniu ruchu komórek.
Cel badania
- Wykazanie niezawodnej metody oceny migracji komórek.
- Zbadanie znaczenia migracji komórek w leczeniu ran przewlekłych i terapii nowotworowej.
- Wykorzystanie zautomatyzowanej mikroskopii optycznej do analizy w czasie rzeczywistym.
Zastosowane metody
- Przemywanie konfluencyjnych kultur komórek HaCaT roztworem PBS.
- Inkubowanie komórek z trypsyną w celu ich odszczepienia.
- Zatrzymanie reakcji enzymatycznej za pomocą pożywki hodowlanej.
- Rozcieńczenie zawiesiny komórek do określonego stężenia w celu przeprowadzenia analizy.
Główne wyniki
- Osiągnięto obserwację migracji komórek w czasie rzeczywistym.
- Metoda okazała się skuteczna w monitorowaniu zamykania się obszaru zarysowania.
- Wyniki mogą dostarczyć informacji dla strategii terapeutycznych w leczeniu ran przewlekłych oraz nowotworów.
- Zautomatyzowana mikroskopia zwiększa wiarygodność ocen migracji.
Wnioski
- Zautomatyzowany mikroskop optyczny jest cennym narzędziem do badania migracji komórek.
- Technika ta może przyczynić się do postępów w badaniach nad gojeniem ran przewlekłych oraz terapiami nowotworowymi.
- Dalsze badania mogą rozszerzyć zakres jej zastosowań w różnych kontekstach biologicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Testy migracji komórek są kluczowe dla oceny kandydatów terapeutycznych w gojeniu ran i onkologii, jednak tradycyjne testy zarysowania (scratch assays) są obarczone artefaktami krawędziowymi oraz wąskimi gardłami wynikającymi z manualnej analizy. Niniejszy zoptymalizowany protokół rozwiązuje problemy z powtarzalnością poprzez eliminację kationowej akumulacji komórek oraz integrację zautomatyzowanego obrazowania, co umożliwia uzyskanie spójnych, ilościowych odczytów migracji. Podejście to wspiera wczesną walidację celów oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez dostarczanie wiarygodnych danych w czasie rzeczywistym na temat związków pro- i antymigracyjnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez ilościowe określanie zmian w migracji w odpowiedzi na bodźce, takie jak laktoferyna lub czynniki wzrostu.
- Wartość operacyjna: Redukuje zmienność wynikającą z ręcznej analizy zarysowań oraz wahań temperatury dzięki zastosowaniu zautomatyzowanego obrazowania optycznego.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie zestandaryzowanych, ilościowych wskaźników gojenia ran z identycznych obszarów zadrapań w czasie.
- Wartość operacyjna: Eliminuje pracochłonne cykliczne obrazowanie i analizę, zwiększając przepustowość podczas przesiewowych badań związków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wykorzystuje istotne w kontekście chorobowym keratynocyty HaCaT do modelowania migracji nabłonka, co wspiera dostosowanie biomarkerów translacyjnych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ciągłość analizy od etapu odkrycia do oceny przedklinicznej dzięki powtarzalnym, zautomatyzowanym przepływom pracy.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, wspierając testowanie hipotez we wczesnej fazie odkrywania oraz umożliwiając ilościową identyfikację związków wiodących poprzez mierzalne hamowanie lub stymulację migracji.
- Biologia odkrywcza: Wspiera wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez izolację migracji jako zmiennej zależnej w odpowiedzi na działanie peptydów lub cytokin.
- Przesiewy: Dostarcza powtarzalnych, ilościowych wyników (np. % zamknięcia rany), które umożliwiają porównania między bibliotekami związków lub wariantami białek.
- Analityka: Generuje szeregi czasowe danych o migracji, odpowiednie do porównań statystycznych i modelowania zależności dawka-odpowiedź.
- Badania translacyjne: Nawiązuje do znaczenia przedklinicznego poprzez wykorzystanie ludzkich keratynocytów w kontekście gojenia ran.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku, zautomatyzowaną platformę do testów migracji w wielu projektach i dla różnych typów komórek.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: zwiększa pewność predykcyjną poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w testach migracji.
- Wartość operacyjna: zwiększa standaryzację i skalowalność dzięki zautomatyzowanemu obrazowaniu i spójnemu przygotowaniu zadrapań.
- Wartość strategiczna: usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez dostarczenie wiarygodnych, ilościowych danych o migracji na wczesnym etapie procesu.
- Wpływ na portfolio: umożliwia priorytetyzację związków z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o zwalidowane efekty migracyjne.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w hodowli komórkowej i stosowania technik sterylnych podczas przygotowywania monowarstw.
- Zależy od zautomatyzowanych systemów kamer optycznych z funkcjami analizy i rejestracji poklatkowej (time-lapse).
- Wymaga standaryzacji szerokości rysy oraz czasu pomiaru we wszystkich studzienkach w celu uzyskania porównywalnych danych.
- Wymaga optymalizacji etapów płukania w PBS, aby zapobiec powstawaniu artefaktów brzegowych w różnych liniach komórkowych.
- Ograniczona do komórek adherentnych, które mogą przytwierdzać się do dna płytek mikrotitracyjnych.
