Zoptymalizowany test zarysowań do testowania migracji komórek in vitro za pomocą zautomatyzowanej kamery optycznej
August 8th, 2018
Tutaj opisujemy procedurę testowania migracji komórek in vitro za pomocą automatycznego mikroskopu optycznego. Test zarysowania jest szeroko stosowany, w którym zamknięcie rysy następuje przez określony czas. Mikroskop optyczny umożliwia niezawodne i tanie wykrywanie migracji komórek.
Główną zaletą tej techniki jest to, że można oglądać komórki w czasie rzeczywistym w automatycznym mikroskopie optycznym. Implikacje tego leczenia rozciągają się na terapię przewlekłych ran lub raka, w przypadku których migracja odgrywa kluczową rolę w tych chorobach. Zacznij od dwukrotnego przemycia zlewającej się kultury komórek HaCaT pięcioma mililitrami sterylnego PBS wolnego od magnezu i wapnia na pranie.
Następnie inkubuj komórki z jednym mililitrem trypsyny w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć do ośmiu minut. Po potwierdzeniu oderwania pod mikroskopem świetlnym należy zatrzymać reakcję enzymatyczną z dziewięcioma mililitrami pożywki hodowlanej uzupełnionej FBS. I rozcieńczyć komórki do 7,5 razy 10 do czwartej komórki na 250 mikrolitrów pożywki plus stężenie FBS.
Następnie wysiewaj 250 mikrolitrów komórek do każdej studzienki 48-dołkowej płytki do hodowli tkankowej z okrągłym dnem i delikatnie przesuwaj płytkę z boku na bok, aby upewnić się, że komórki są równomiernie rozmieszczone na dnie studzienki. Następnie przenieś płytkę do inkubatora do hodowli komórkowych. Gdy kultury osiągną zbieżność od 90 do 95%, zastąp supernatant w każdym dołku 250 mikrolitrami świeżo przygotowanej pożywki uzupełnionej 10 mikrogramami na mililitr mitomycyny C i umieść płytkę z powrotem w inkubatorze na kolejne dwie godziny.
Pod koniec inkubacji przemyj komórki 250 mikrolitrami PBS i dodaj 250 mikrolitrów świeżego PBS do każdej studzienki. Następnie użyj końcówki mikropipety o pojemności 200 mikrolitrów, aby wykonać jedno pionowe zadrapanie w każdej monowarstwie komórki. Gdy wszystkie monowarstwy zostaną zarysowane, zastąp PBS w każdej studzience 250 mikrolitrami z interesującym nas bodźcem peptydowym i zamontuj płytkę w systemie kamer optycznych z nienaruszoną pokrywą.
Aby skonfigurować kamerę optyczną, otwórz okno pobierania i wybierz gojenie się ran. Wybierz typ płyty i odznacz nieużywane studzienki. Następnie kliknij włącz i kliknij prawym przyciskiem myszy jedno z dołków, aby dostosować ostrość do położenia komórek.
Ustaw przedział czasu dla obrazów w obszarze Interwał obrazu i ustaw liczbę powtórzeń, aby dopasować je do żądanego okresu. Następnie należy wybrać odpowiedni typ analizy. Następnie kliknij start, aby rozpocząć obrazowanie komórek.
Kiedy pojawia się rana, komórki skóry zaczynają się namnażać i migrować przez łożysko rany, aby zamknąć ranę, proces, który można zaobserwować za pomocą kamery optycznej. Po 48-godzinnej inkubacji leczenie czynnikiem wzrostu śródbłonka powoduje prawie 95% zamknięcie rany, w porównaniu do 38% zamknięcia w nieleczonych studzienkach kontrolnych oraz 33 i 62% zamknięcia odpowiednio w kulturach laktoferyny i laktoferrycyny. Procent zamknięcia rany określony na podstawie zmian szerokości szczeliny od początkowego zadrapania można również wykreślić dla każdego bodźca wzrostowego.
Ten film opisuje prosty i skuteczny protokół badania migracji keratynocytów przez rysę wykonaną w monowarstwie zdrowych komórek. Chociaż komórki użyte w tym teście to komórki HaCaT, metodę można również zastosować do innych linii komórkowych, grzybów, a nawet bakterii, o ile przylegają one do dna płytki mikromiareczkowej.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł opisuje procedurę testowania migracji komórek in vitro przy użyciu zautomatyzowanego mikroskopu optycznego. Test rysowania jest podkreślany jako niezawodna metoda obserwacji migracji komórek w czasie.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Biologia komórki
- Mikroskopia
- Techniki in vitro
Tło
- Test rysowania to szeroko stosowana technika badania migracji komórek.
- Zautomatyzowane mikroskopy optyczne umożliwiają obserwację komórek w czasie rzeczywistym.
- Zrozumienie migracji komórek jest kluczowe w terapiach przewlekłych ran i raka.
- Ta metoda jest opłacalna i niezawodna w wykrywaniu ruchu komórek.
Cel badania
- Przedstawienie niezawodnej metody oceny migracji komórek.
- Zbadanie implikacji migracji komórek w leczeniu przewlekłych ran i terapii raka.
- Wykorzystanie zautomatyzowanej mikroskopii optycznej do analizy w czasie rzeczywistym.
Stosowane metody
- Płukanie konfluencyjnych kultur komórek HaCaT za pomocą PBS.
- Inkubacja komórek z trypsyną w celu ich oderwania.
- Zatrzymanie reakcji enzymatycznej za pomocą pożywki hodowlanej.
- Rozcieńczanie komórek do określonego stężenia w celu analizy.
Główne wyniki
- Osiągnięto obserwację migracji komórek w czasie rzeczywistym.
- Metoda okazała się skuteczna w monitorowaniu zamknięcia rys.
- Wyniki mogą wpłynąć na strategie terapeutyczne dla przewlekłych ran i raka.
- Zautomatyzowana mikroskopia poprawia niezawodność ocen migracji.
Wnioski
- Zautomatyzowany mikroskop optyczny jest cennym narzędziem do badania migracji komórek.
- Ta technika może poszerzyć badania w dziedzinie gojenia przewlekłych ran i terapii raka.
- Dalsze badania mogą poszerzyć jej zastosowania w różnych kontekstach biologicznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Cell migration assays are critical for evaluating therapeutic candidates in wound healing and oncology, yet traditional scratch assays suffer from edge artifacts and manual analysis bottlenecks. This optimized protocol addresses reproducibility challenges by eliminating cation-mediated cell accumulation and integrating automated imaging, enabling consistent, quantitative migration readouts. The approach supports early-stage target validation and mechanistic de-risking by providing reliable, real-time data on pro- and anti-migratory compounds.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying migration changes in response to stimuli like lactoferrin or growth factors.
- Operational Value: Reduces variability from manual scratch analysis and temperature fluctuations through automated optical imaging.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, quantitative wound closure metrics from identical scratch sections over time.
- Operational Value: Eliminates labor-intensive image cycling and analysis, improving throughput for compound screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Uses disease-relevant HaCaT keratinocytes to model epithelial migration, supporting translational biomarker alignment.
- Operational Value: Ensures assay continuity from discovery to preclinical evaluation via reproducible, automated workflows.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum, supporting hypothesis testing in early discovery and enabling quantitative lead identification through measurable migration inhibition or stimulation.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by isolating migration as a dependent variable in response to peptide or cytokine treatments.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs (e.g., % wound closure) that allow comparison across compound libraries or protein variants.
- Analytics: Generates time-series migration data suitable for statistical comparison and dose-response modeling.
- Translational Research: Connects to preclinical relevance through use of human keratinocyte cells and wound-healing context.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, automated platform for migration assays across multiple projects and cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in migration assays.
- Operational Value: Enhances standardization and scalability through automated imaging and consistent scratch preparation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing reliable, quantitative migration data early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on validated migration effects.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture and sterile technique for monolayer preparation.
- Dependent on automated optical camera systems with time-lapse and analysis capabilities.
- Necessitates standardization of scratch width and timing across wells for comparable data.
- Involves optimization of PBS washing steps to prevent edge artifacts in different cell lines.
- Limited to adherent cells compatible with microtiter plate bottom attachment.
