Name: Prosta i powtarzalna metoda przygotowania próbek błonowych ze świeżo wyizolowanych mikronaczyń mózgu szczura (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Poznaj metodę izolacji mikronaczyń mózgu szczura do badań biochemicznych bariery krew-mózg. Technika umożliwia analizę białek z pojedynczych zwierząt, co wspiera badania neurofarmakologiczne i fizjologię BBB.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez granty z National Institutes of Health (R01-NS084941) i Arizona Biomedical Research Commission (ADHS16-162406) dla PTR. WA otrzymała wcześniejsze wsparcie w postaci nominacji przeddoktorskiej do grantu szkoleniowego National Institutes of Health (T32-HL007249).

Wszystkie procedury opisane poniżej zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) i są zgodne z wytycznymi National Institutes of Health (NIH) i Animal Research: Reporting In Vivo Experiments (ARRIVE). Przebieg proceduralny protokołu jest przedstawiony w Rysunek 1.
1. Przygotowanie do procedury
<ol>
	<li>Przygotuj bufor mikronaczyń mózgowych (BMB). Zacznij od zważenia 54,66 g D-mannitolu, 1,90 g EGTA i 1,46 g zasady 2-amino-2-(hydroksymetylo)-1,3-propanodiolu (tj. Tris) do czystej zlewki. Dodaj 1,0 l wody dejonizowanej. Wymieszać składniki bufora BMB za pomocą mieszadła magnetycznego. Po dokładnym wymieszaniu roztworu dostosuj pH do 7,4 za pomocą 1,0 M HCl.</li>
	<li>Przygotuj 26% roztwór dekstranu (MW 75 000) (w/v) przed znieczuleniem zwierząt. Przygotuj roztwór dekstranu zgodnie z opisem w poniższych krokach. 
	UWAGA: Niezwykle ważne jest przygotowanie tego roztworu z wyprzedzeniem, ponieważ dekstran może rozpuścić się w buforze wodnym po około 1,5-2 godzinach.
	<ol>
		<li>Odważyć sproszkowany dekstran (26 g na 100 ml buforu) do czystej zlewki.</li>
		<li>Odmierz odpowiednią objętość BMB i przelej do osobnej, czystej zlewki.</li>
		<li>Powoli wlewać BMB do zlewki zawierającej sproszkowany dekstran. Ręcznie wymieszaj sproszkowany dekstran podczas nalewania BMB za pomocą szklanego pręta do mieszania.</li>
		<li>Bezpośrednio przed użyciem należy dostosować pH do 7,4 za pomocą 1,0 M HCl. 
		UWAGA: Typowa izolacja mikronaczyń mózgowych od 12 pojedynczych szczurów Sprague-Dawley (samce lub samice; w wieku 3 miesięcy; 200-250 g każdy) wymaga 200 ml roztworu dekstranu (tj. 52 g dekstranu w 200 ml BMB).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Ekstrakcja tkanki mózgowej od szczurów Sprague-Dawley
<ol>
	<li>Po pożądanym leczeniu eksperymentalnym znieczulić szczury Sprague-Dawley za pomocą ketaminy (50 mg/kg; 2,5 ml/kg i.p.) i ksylazyny (10 mg/ml; 2,5 mL/kg I,p.). Rozcieńczyć ketaminę i ksylazynę w 0,9% soli fizjologicznej do końcowych stężeń odpowiednio 20 mg/ml i 4,0 mg/ml. Eutanazja zwierząt przez ścięcie głowy przy użyciu zaostrzonej gilotyny zgodnie z wytycznymi IACUC. Tę samą procedurę należy zastosować zarówno dla samców, jak i samic szczurów Sprague-Dawley.</li>
	<li>Wytnij skórę z czaszki szczura, wykonując pojedyncze poprzeczne cięcie za pomocą nożyczek chirurgicznych.</li>
	<li>Za pomocą rongeurs ostrożnie usuń płytkę czaszki i odsłoń mózg.</li>
	<li>Usuń mózg za pomocą szpatułki. Odłącz mózg i umieść izolowaną tkankę mózgową w stożkowej probówce o pojemności 50 ml zawierającej 5 ml BMB. Bezpośrednio przed użyciem dodać 1,0 μl koktajlu inhibitorów proteazy na 1,0 ml buforu BMB.</li>
</ol>
3. Przetwarzanie mózgu
<ol>
	<li>Przenieś tkankę mózgową z rurki stożkowej o pojemności 50 ml na czystą szalkę Petriego.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy delikatnie przetocz mózg na bibułę filtracyjną o średnicy 12,5 cm, aby usunąć zewnętrzne opony mózgowe, które są luźno przylegające do kory mózgowej. Delikatnie dociśnij tkankę mózgową do bibuły filtracyjnej i ponownie zwiń tkankę. Na tym etapie często obracaj bibułę filtracyjną.</li>
	<li>Oddziel splot naczyniówkowy od półkul mózgowych za pomocą kleszczy. 
	UWAGA: Splot naczyniówkowy pojawia się jako przezroczysta błoniasta tkanka zlokalizowana na powierzchni komór mózgowych.</li>
	<li>Delikatnie spłaszcz tkankę mózgową i usuń pozostałe opony mózgowe i opuszki węchowe za pomocą kleszczy.</li>
	<li>Umieść tkankę mózgową kory mózgowej w schłodzonym szklanym moździerzu. Do moździerza dodać 5,0 ml koktajlu inhibitorów proteazy zawierających BMB.</li>
	<li>Za pomocą górnego homogenizatora energetycznego homogenizuj tkankę mózgową za pomocą 15 ruchów w górę iw dół przy 3,700 obr./min. Przeprowadzić homogenizację za pomocą 10 ml moździerza i młynka do chusteczek higienicznych. Pomiędzy homogenizacją każdej pojedynczej próbki należy oczyścić tłuczek przy użyciu 70% etanolu. 
	UWAGA: Pociągnięcia homogenizacji powinny być spójne pod względem tempa i wielkości.</li>
	<li>Wlać homogenat do oznakowanych probówek wirówkowych.</li>
</ol>
4. Etapy wirowania
<ol>
	<li>Dodać 8,0 ml 26% roztworu dekstranu do każdej oznakowanej probówki wirówkowej zawierającej homogenat mózgu.</li>
	<li>Odwrócić probówkę dwukrotnie, a następnie dokładnie odwirować próbkę. Przeprowadź wirowanie każdej próbki pod różnymi kątami, aby zapewnić dokładne wymieszanie roztworu homogenatu mózgu z 26% roztworem dekstranu.</li>
	<li>Odwirować próbki o masie 5 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: W przypadku niektórych analiz przydatne jest porównanie mikronaczyń mózgowych z miąższem mózgu. Jeżeli wymagana jest ocena ekspresji białka w miąższu mózgu, supernatant z tego etapu wirowania (tj. frakcja miąższowa mózgu) może zostać pobrany i przechowywany w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.</li>
	<li>Usunąć supernatant za pomocą aspiratora próżniowego i szklanej pipety Pasteura. 
	UWAGA: Należy zachować ostrożność, aby nie naruszyć pelletu. W przeciwnym razie ilość pobranych mikronaczyń mózgowych zostanie zmniejszona, co znacznie zmniejszy wydajność białka z tej procedury.</li>
	<li>Zawiesić osad w 5,0 ml koktajlu inhibitorów proteazy zawierających BMB (tj. 1,0 μl koktajlu inhibitorów proteazy na 1,0 ml buforu BMB). Zwiruj granulkę, aby zapewnić dokładne wymieszanie.</li>
	<li>Dodać 8,0 ml 26% dekstranu do każdej probówki wirówkowej i odwirować zgodnie z opisem w krokach 4.1-4.2 niniejszego protokołu.</li>
	<li>Odwirować próbki o masie 5 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Za pomocą kolby próżniowej i szklanej pipety odessać supernatant i upewnić się, że osad zawierający mikronaczynia mózgowe nie został naruszony. 
	UWAGA: Nadmiar materiału, który przylgnął do ścianki rury, nie zawiera mikronaczyń i należy go dokładnie oczyścić i usunąć.</li>
	<li>Powtórz kroki od 4.5 do 4.8 dodatkowo dwa razy.</li>
	<li>Po zakończeniu 4 etapów wirowania dekstranu dodaj 5,0 ml BMB do każdej granulki i odwiruj, aby ponownie zawiesić próbkę. 
	UWAGA: Po wykonaniu kroku 4.10 można pobrać całe mikronaczynia do analizy lokalizacji białek. Można to osiągnąć, pobierając 50 μl podwielokrotności ponownie zawieszonych osadów mikronaczyniowych i rozsmarowując je na szklanym szkiełku mikroskopowym. Mikronaczynia są następnie podgrzewane w temperaturze 95 °C przez 10 minut na bloku grzewczym, a następnie utrwalane w lodowatym etanolu przez dodatkowe 10 minut. Preparaty można następnie przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będą one potrzebne do badań obrazowych.</li>
</ol>
5. Ultrawirowanie w celu przygotowania próbek całkowitych błon mikronaczyniowych mózgu
<ol>
	<li>Przenieść próbki do homogenizatora ze schłodzonym szkłem.</li>
	<li>Za pomocą górnego homogenizatora energetycznego homogenizuj tkankę mózgową za pomocą 8-10 ruchów w górę iw dół przy 3,000 obr./min. Homogenizację przeprowadza się za pomocą 10 ml moździerza i tłuczka do tkanek młynka. Wyczyść tłuczek przy użyciu 70% etanolu po homogenizacji każdej pojedynczej próbki.</li>
	<li>Przenieść próbki do czystych probówek ultrawirówek. Ponumeruj i zważ każdą pojedynczą probówkę. Zrównoważyć i sparować probówki przed załadowaniem do wirnika ultrawirówki. 
	UWAGA: Całe ważenie i parowanie probówek ultrawirówkowych musi być przeprowadzane z założonymi nasadkami, aby zapewnić dokładny pomiar masy probówek.</li>
	<li>Odwirować próbki o masie 150 000 x g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Używając kolby próżniowej i szklanej pipety Pasteura, odessać supernatant, uważając, aby nie naruszyć osadu z membrany kapilarnej.</li>
	<li>W zależności od wielkości granulki dodaj odpowiednią objętość bufora do przechowywania, który składa się z wody dejonizowanej i BMB w stosunku 1:1 (v/v). Zazwyczaj pelety są ponownie zawieszane w 400-500 μl bufora magazynowego. Dodać koktajl inhibitorów proteazy do buforu magazynującego w proporcji 1,0 μl na 1,0 ml buforu do przechowywania.</li>
	<li>Wirować próbki w celu ponownego zawieszenia osadu w buforze magazynowym.</li>
	<li>Za pomocą szklanej pipety Pasteura przenieś próbki z membrany kapilarnej do oznakowanej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Przepuścić próbkę przez strzykawkę igłową 5 razy, aby upewnić się, że próbka jest dokładnie wymieszana i że nie ma żadnych agregatów komórkowych.</li>
	<li>Próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu, gdy będą one potrzebne do analizy. 
	UWAGA: Zawartość białka w każdej próbce błony mikronaczynia mierzy się metodą Bradforda.</li>
</ol>

<ol><li>Rolfe, D. F., Brown, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+energy+utilization+and+molecular+origin+of+standard+metabolic+rate+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals.</a> Physiol Rev. 77 (3), 731-758 (1997).</li>
<li>Brzica, H., Abdullahi, W., Ibbotson, K., Ronaldson, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Transporters+in+Central+Nervous+System+Drug+Delivery+and+Blood-Brain+Barrier+Protection%3A+Relevance+to+Treatment+of+Stroke%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cent+Nerv+Syst+Dis%22%5BJournal%5D)">Role of Transporters in Central Nervous System Drug Delivery and Blood-Brain Barrier Protection: Relevance to Treatment of Stroke.</a> J Cent Nerv Syst Dis. 9, 1179573517693802(2017).</li>
<li>Ronaldson, P. T., Davis, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+transporters%3A+promoting+blood-brain+barrier+repair+in+response+to+oxidative+stress+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Targeting transporters: promoting blood-brain barrier repair in response to oxidative stress injury.</a> Brain Res. 1623, 39-52 (2015).</li>
<li>Witt, K. A., Mark, K. S., Hom, S., Davis, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+hypoxia-reoxygenation+on+rat+blood-brain+barrier+permeability+and+tight+junctional+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of hypoxia-reoxygenation on rat blood-brain barrier permeability and tight junctional protein expression.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 285 (6), H2820-H2831 (2003).</li>
<li>McCaffrey, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occludin+oligomeric+assemblies+at+tight+junctions+of+the+blood-brain+barrier+are+altered+by+hypoxia+and+reoxygenation+stress%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Occludin oligomeric assemblies at tight junctions of the blood-brain barrier are altered by hypoxia and reoxygenation stress.</a> J Neurochem. 110 (1), 58-71 (2009).</li>
<li>Lochhead, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+increases+blood-brain+barrier+permeability+and+induces+alterations+in+occludin+during+hypoxia-reoxygenation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress increases blood-brain barrier permeability and induces alterations in occludin during hypoxia-reoxygenation.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 30 (9), 1625-1636 (2010).</li>
<li>Lucke-Wold, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bryostatin-1+Restores+Blood+Brain+Barrier+Integrity+following+Blast-Induced+Traumatic+Brain+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Bryostatin-1 Restores Blood Brain Barrier Integrity following Blast-Induced Traumatic Brain Injury.</a> Mol Neurobiol. 52 (3), 1119-1134 (2015).</li>
<li>Campos, C. R., Ocheltree, S. M., Hom, S., Egleton, R. D., Davis, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nociceptive+inhibition+prevents+inflammatory+pain+induced+changes+in+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Nociceptive inhibition prevents inflammatory pain induced changes in the blood-brain barrier.</a> Brain Res. , 6-13 (2008).</li>
<li>Ronaldson, P. T., Demarco, K. M., Sanchez-Covarrubias, L., Solinsky, C. M., Davis, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factor-beta+signaling+alters+substrate+permeability+and+tight+junction+protein+expression+at+the+blood-brain+barrier+during+inflammatory+pain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factor-beta signaling alters substrate permeability and tight junction protein expression at the blood-brain barrier during inflammatory pain.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 29 (6), 1084-1098 (2009).</li>
<li>Seelbach, M. J., Brooks, T. A., Egleton, R. D., Davis, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+inflammatory+hyperalgesia+modulates+morphine+delivery+to+the+brain%3A+a+role+for+P-glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Peripheral inflammatory hyperalgesia modulates morphine delivery to the brain: a role for P-glycoprotein.</a> J Neurochem. 102 (5), 1677-1690 (2007).</li>
<li>Ronaldson, P. T., Finch, J. D., Demarco, K. M., Quigley, C. E., Davis, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+pain+signals+an+increase+in+functional+expression+of+organic+anion+transporting+polypeptide+1a4+at+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Exp+Ther%22%5BJournal%5D)">Inflammatory pain signals an increase in functional expression of organic anion transporting polypeptide 1a4 at the blood-brain barrier.</a> J Pharmacol Exp Ther. 336 (3), 827-839 (2011).</li>
<li>Pop, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+brain+injury+alters+the+blood-brain+barrier+phenotype+in+parallel+with+beta-amyloid+and+cognitive+changes+in+adulthood%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Early brain injury alters the blood-brain barrier phenotype in parallel with beta-amyloid and cognitive changes in adulthood.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 33 (2), 205-214 (2013).</li>
<li>Thompson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia%2Freoxygenation+stress+signals+an+increase+in+organic+anion+transporting+polypeptide+1a4+%28Oatp1a4%29+at+the+blood-brain+barrier%3A+relevance+to+CNS+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Hypoxia/reoxygenation stress signals an increase in organic anion transporting polypeptide 1a4 (Oatp1a4) at the blood-brain barrier: relevance to CNS drug delivery.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 34 (4), 699-707 (2014).</li>
<li>Tome, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P-glycoprotein+traffics+from+the+nucleus+to+the+plasma+membrane+in+rat+brain+endothelium+during+inflammatory+pain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">P-glycoprotein traffics from the nucleus to the plasma membrane in rat brain endothelium during inflammatory pain.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 36 (11), 1913-1928 (2016).</li>
<li>Slosky, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetaminophen+modulates+P-glycoprotein+functional+expression+at+the+blood-brain+barrier+by+a+constitutive+androstane+receptor-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Acetaminophen modulates P-glycoprotein functional expression at the blood-brain barrier by a constitutive androstane receptor-dependent mechanism.</a> Mol Pharmacol. 84 (5), 774-786 (2013).</li>
<li>Artus, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Wnt%2Fplanar+cell+polarity+signaling+pathway+contributes+to+the+integrity+of+tight+junctions+in+brain+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">The Wnt/planar cell polarity signaling pathway contributes to the integrity of tight junctions in brain endothelial cells.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 34 (3), 433-440 (2014).</li>
<li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+exposure+to+ethanol+downregulates+tight+junction+proteins+through+the+protein+kinase+Calpha+signaling+pathway+in+human+cerebral+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Ther+Med%22%5BJournal%5D)">Long-term exposure to ethanol downregulates tight junction proteins through the protein kinase Calpha signaling pathway in human cerebral microvascular endothelial cells.</a> Exp Ther Med. 14 (5), 4789-4796 (2017).</li>
<li>Abdullahi, W., Brzica, H., Ibbotson, K., Davis, T. P., Ronaldson, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+morphogenetic+protein-9+increases+the+functional+expression+of+organic+anion+transporting+polypeptide+1a4+at+the+blood-brain+barrier+via+the+activin+receptor-like+kinase-1+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Bone morphogenetic protein-9 increases the functional expression of organic anion transporting polypeptide 1a4 at the blood-brain barrier via the activin receptor-like kinase-1 receptor.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 37 (7), 2340-2345 (2017).</li>
<li>Mesev, E. V., Miller, D. S., Cannon, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ceramide+1-Phosphate+Increases+P-Glycoprotein+Transport+Activity+at+the+Blood-Brain+Barrier+via+Prostaglandin+E2+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Ceramide 1-Phosphate Increases P-Glycoprotein Transport Activity at the Blood-Brain Barrier via Prostaglandin E2 Signaling.</a> Mol Pharmacol. 91 (4), 373-382 (2017).</li>
<li>Betz, A. L., Csejtey, J., Goldstein, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hexose+transport+and+phosphorylation+by+capillaries+isolated+from+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Hexose transport and phosphorylation by capillaries isolated from rat brain.</a> Am J Physiol. 236 (1), C96-C102 (1979).</li>
<li>Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. M., Decleves, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+drug+transporters+at+the+blood-brain+barrier+using+an+optimized+isolated+rat+brain+microvessel+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy.</a> Brain Res. 1134 (1), 1-11 (2007).</li>
<li>McCaffrey, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+junctions+contain+oligomeric+protein+assembly+critical+for+maintaining+blood-brain+barrier+integrity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Tight junctions contain oligomeric protein assembly critical for maintaining blood-brain barrier integrity in vivo.</a> J Neurochem. 103 (6), 2540-2555 (2007).</li>
<li>Brzica, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+liver+and+kidney+expression+of+sulfate+anion+transporter+sat-1+in+rats+exhibits+male-dominant+gender+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">The liver and kidney expression of sulfate anion transporter sat-1 in rats exhibits male-dominant gender differences.</a> Pflugers Arch. 457 (6), 1381-1392 (2009).</li>
<li>Ronaldson, P. T., Bendayan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+viral+envelope+glycoprotein+gp120+produces+oxidative+stress+and+regulates+the+functional+expression+of+multidrug+resistance+protein-1+%28Mrp1%29+in+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">HIV-1 viral envelope glycoprotein gp120 produces oxidative stress and regulates the functional expression of multidrug resistance protein-1 (Mrp1) in glial cells.</a> J Neurochem. 106 (3), 1298-1313 (2008).</li>
<li>Pustylnikov, S., Sagar, D., Jain, P., Khan, Z. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+C-type+lectins-mediated+host-pathogen+interactions+with+dextran%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Pharm+Sci%22%5BJournal%5D)">Targeting the C-type lectins-mediated host-pathogen interactions with dextran.</a> J Pharm Pharm Sci. 17 (3), 371-392 (2014).</li>
<li>Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development%2C+maintenance+and+disruption+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier.</a> Nat Med. 19 (12), 1584-1596 (2013).</li>
<li>Abdullahi, W., Davis, T. P., Ronaldson, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Expression+of+P-glycoprotein+and+Organic+Anion+Transporting+Polypeptides+at+the+Blood-Brain+Barrier%3A+Understanding+Transport+Mechanisms+for+Improved+CNS+Drug+Delivery%3F%5BTitle%5D)+AND+%22AAPS+J%22%5BJournal%5D)">Functional Expression of P-glycoprotein and Organic Anion Transporting Polypeptides at the Blood-Brain Barrier: Understanding Transport Mechanisms for Improved CNS Drug Delivery?</a> AAPS J. 19 (4), 931-939 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W artykule opisano prostą i skuteczną metodę przygotowania próbek białek błonowych z mikronaczyń świeżo wyizolowanych z tkanki mózgowej szczura. W literaturze opisano kilka podejść do izolacji mikronaczyń mózgowych szczurów i/lub wytwarzania preparatów błonowych z izolowanego mikrokrążenia 13,20,21,22,24. Chociaż opisany powyżej protokół izolacji mikronaczyń j...

Bariera krew-mózg (BBB) istnieje na styku ośrodkowego układu nerwowego (OUN) z krążeniem ogólnoustrojowym i odgrywa istotną rolę w utrzymaniu homeostazy mózgu. W szczególności bariera krew-mózg działa w celu precyzyjnego kontrolowania stężeń substancji rozpuszczonych w płynie zewnątrzkomórkowym mózgu i skutecznego dostarczania tych składników odżywczych, które są wymagane przez tkankę mózgową do zaspokojenia znacznych wymagań metabolicznych klasy CNS<sup="xref">1. Role te oznaczają, że bariera krew-mózg, która istnieje głównie na poziomie komórki śródbłonka mikronaczyniowego, musi posiadać dyskretne mechanizmy, które umożliwiają niektórym substancjom dostęp do miąższu mózgu, zapewniając jednocześnie, że potencjalnie szkodliwe ksenobiotyki nie mogą się kumulować. Rzeczywiście, komórki śródbłonka mikronaczyniowego mózgu nie są fenestrowane i wykazują ograniczoną pinocytozę, co zapewnia brak nieselektywnej przepuszczalności2. Dodatkowo, komórki śródbłonka mikronaczyń mózgowych wyrażają białka połączeń ścisłych i przylegających, które działają w celu utworzenia fizycznej "pieczęci" między sąsiednimi komórkami śródbłonka i znacznie ograniczają parakomórkową dyfuzję substancji krwiopochodnych do miąższu mózgu. Rzeczywiście, selektywna przepuszczalność substancji endogennych i egzogennych wymaga funkcjonalnej ekspresji transporterów wychwytu i odpływu3. Ogólnie rzecz biorąc, połączenia szczelne, połączenia przylegające i transportery współpracują ze sobą, aby utrzymać unikalne właściwości barierowe BBB.
BBB to dynamiczna bariera, która reaguje na bodźce fizjologiczne, patofizjologiczne i farmakologiczne. Na przykład wykazano, że stres związany z hipoksją/reoksygenacją moduluje ekspresję krytycznych białek połączeń ścisłych (tj. okludyny, zonulae occluden-1 (ZO-1)), co wiąże się ze zwiększoną przepuszczalnością parakomórkową dla markerów naczyniowych, takich jak sacharoza4,5,6. Podobne obserwacje zostały poczynione w BBB w kontekście urazowego uszkodzenia mózgu7 i obwodowego bólu zapalnego8,9. Te same choroby mogą również modulować mechanizmy transportowe w BBB10,11,12,13,14. Rzeczywiście, uszkodzenie spowodowane niedotlenieniem/reoksygenacją zwiększa funkcjonalną ekspresję polipeptydu 1a4 transportującego anion organiczny (Oatp1a4) w BBB, co może prowadzić do znacznego wzrostu transportu z krwi do mózgu określonych substratów transportowych Oatp, takich jak taurocholat i atorwastatyna13. Właściwości BBB mogą być również zmieniane przez samą farmakoterapię, mechanizm, który może stanowić podstawę zarówno do głębokich zmian w skuteczności leku w mózgu, jak i do interakcji między lekami. Na przykład paracetamol celuje w mechanizmy sygnalizacji receptora jądrowego w komórkach śródbłonka mikronaczyniowego mózgu, zwiększa funkcjonalną ekspresję krytycznego transportera wypływu glikoproteiny P (P-gp) i modyfikuje zależne od czasu analgezje nadawane przez morfinę, opioidowy lek przeciwbólowy i ustalony substrat transportowy P-gp15. Dokładne zrozumienie zmian bariery krew-mózg, które mogą być wywołane przez choroby lub leki, wymaga również identyfikacji i scharakteryzowania specyficznych mechanizmów regulacyjnych, które kontrolują te modyfikacje. Rzeczywiście, dyskretne szlaki sygnałowe zostały zidentyfikowane w komórkach śródbłonka mikronaczyniowego mózgu, które kontrolują ekspresję molekularną białek połączeń ścisłych16,17 i transporters15,18,19. Podsumowując, obserwacje te wskazują, że złożone szlaki molekularne są zaangażowane w regulację ścisłych połączeń i transporterów BBB zarówno w zdrowiu, jak i chorobie.
Znaczącym wyzwaniem w badaniu BBB jest bezwzględny wymóg prostej i skutecznej metody izolacji mikronaczyń z tkanki mózgowej pochodzącej od zwierząt doświadczalnych i późniejszego przygotowania próbek błonowych. Próbki te muszą być przygotowane w taki sposób, aby były zarówno wzbogacone w komórki śródbłonka mikronaczyniowego mózgu, jak i ograniczone w obecności innych typów komórek. W ciągu ostatnich kilku lat w literaturze naukowej opisano wiele metodologii izolacji mikrokrążenia z mózgu gryzoni13,20,21,22. W artykule opisano prostą, solidną i powtarzalną metodę izolacji mikronaczyń z mózgu szczura oraz przygotowania próbek wzbogaconych błoną śródbłonkową, które można wykorzystać do analizy ekspresji białek. Zaletą tego protokołu izolacji mikronaczyń jest możliwość uzyskania preparatów próbek o wysokiej jakości i wystarczającej wydajności białka od pojedynczego zwierzęcia doświadczalnego. Umożliwia to uwzględnienie zmienności między zwierzętami w ekspresji białek. Taki postęp w tym protokole znacznie poprawił solidność badań nad barierą krew-mózg, ponieważ można teraz uniknąć przeszacowania (lub niedoszacowania) prawdziwej wielkości zmian białka w BBB. Dodatkowo, włączenie wielu etapów wirowania z dekstranem umożliwia lepsze wzbogacenie mikronaczyń w próbkach eksperymentalnych, ułatwiając jednocześnie usuwanie niepożądanych składników komórkowych, takich jak neurony.

<table><tbody><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#P8340</td><td>Składnik buforu mikronaczyń mózgowych</td></tr><tr><td>D-mannitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#M4125</td><td>Składnik buforu mikronaczyń mózgowych</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#E3889</td><td>Składnik buforu mikronaczyń mózgowych</td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#T1503</td><td>Składnik bufora mikronaczyń mózgowych</td></tr><tr><td>Dekstran (MW 75,000)</td><td>Spectrum Chemical Mftg Corp</td><td>#DE125</td><td>Dekstran stosowany w etapach wirowania w celu oddzielenia mikronaczyń od miąższu mózgu</td></tr><tr><td>Zetamin</td><td>MWI Animal Health</td><td>#501072</td><td>Znieczulenie ogólne</td></tr><tr><td>Ksylazyna</td><td>Western Medical Supply</td><td>#5530</td><td>Znieczulenie ogólne</td></tr><tr><td>0,9% roztwór soli</td> fizjologicznej <td>Western Medical Supply</td><td>N/A</td><td>Znieczulenie ogólne Rozcieńczalnik</td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna (średnica 12,5 cm)</td><td>VWR</td><td>#28320-100</td><td>Służy do usuwania opon mózgowych z tkanek mózgowych</td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe</td><td>Sarstedt</td><td>#60.540.386</td><td>Jednorazowe probówki używane do etapów wirowania dekstranu</td></tr><tr><td>Pierce&trade; Coomassie Plus (Bradford) Test</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#23236</td><td>Pomiar stężenia białka w preparatach membranowych</td></tr><tr><td>Wheaton Overhead Power Homogenizer</td><td>DWK Life Sciences</td><td>#903475</td><td>Wymagany do homogenizacji próbek</td></tr><tr><td>10,0 ml szklany moździerz i tłuczek do mielenia tkanek</td><td>DWK Life</td> <td>Sciences#358039</td><td>Wymagany do homogenizacji próbek</td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#H1758</td><td>Wymagane do regulacji pH</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#23210</td><td>Wzorzec białka do testu Bradforda</td></tr><tr><td>Standardowe kleszcze</td><td>Narzędzia Fine Science Tools</td><td>#91100-12</td><td>Używany do preparacji tkanki mózgowej</td></tr><tr><td>Friedman-Pearson Rongeurs</td><td>Fine Science Tools</td><td>#16020-14</td><td>Używany do otwierania czaszki w celu wyizolowania mózgu</td></tr><tr><td>Stożkowe probówki wirówkowe o pojemności 50 ml</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#352070</td><td>Służy do pobierania tkanki mózgowej po izolacji</td></tr><tr><td>Szklane pipety Pasteura</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#13-678-20C</td><td>Służy do aspiracji resztek komórkowych po spinach dekstranu</td></tr><tr><td>Etanol, bezwodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#459836</td><td>Służy do czyszczenia młynka do tkanek; rozcieńczony do 70% wodą</td></tr> <tr><td>destylowanąProbówki do ultrawirówek</td><td>Beckman-Coulter</td><td>#41121703</td><td>Służy do ultrawirowania próbek</td></tr></tbody></table>

prosta i powtarzalna metoda przygotowania próbek błonowych ze świeżo wyizolowanych mikronaczyń mózgu szczura

A Simple and Reproducible Method to Prepare Membrane Samples from Freshly Isolated Rat Brain Microvessels

Bariera krew-mózg (BBB) to dynamiczna tkanka barierowa, która reaguje na różne bodźce patofizjologiczne i farmakologiczne. Takie zmiany wynikające z tych bodźców mogą znacznie modulować dostarczanie leków do mózgu, a co za tym idzie, powodować znaczne wyzwania w leczeniu chorób ośrodkowego układu nerwowego (OUN). Wiele zmian bariery krew-mózg, które wpływają na farmakoterapię, dotyczy białek, które są zlokalizowane i ulegają ekspresji na poziomie komórek śródbłonka. Rzeczywiście, taka wiedza na temat fizjologii BBB w zdrowiu i chorobie wzbudziła znaczne zainteresowanie badaniami nad tymi białkami błonowymi. Z punktu widzenia badań podstawowych oznacza to zapotrzebowanie na prostą, ale solidną i powtarzalną metodę izolacji mikronaczyń krwionośnych z tkanki mózgowej pobranej od zwierząt doświadczalnych. W celu przygotowania próbek błonowych ze świeżo wyizolowanych mikronaczyń konieczne jest, aby preparaty próbek były wzbogacone w komórki śródbłonka, ale ograniczone w obecności innych typów komórek jednostki nerwowo-naczyniowej (tj. astrocytów, mikrogleju, neuronów, perycytów). Dodatkową korzyścią jest możliwość przygotowania próbek od pojedynczych zwierząt w celu uchwycenia prawdziwej zmienności ekspresji białek w populacji eksperymentalnej. W tym manuskrypcie przedstawiono szczegółowe informacje dotyczące metody stosowanej do izolacji mikronaczyń mózgowych szczurów i przygotowania próbek błonowych. Wzbogacanie mikronaczyń z otrzymanych próbek uzyskuje się poprzez zastosowanie czterech etapów wirowania, w których dekstran jest zawarty w buforze próbki. Protokół ten może być łatwo dostosowany przez inne laboratoria do ich własnych specyficznych zastosowań. Wykazano, że próbki wygenerowane za pomocą tego protokołu dostarczają solidnych danych eksperymentalnych z eksperymentów analizy białek, które mogą znacznie pomóc w zrozumieniu odpowiedzi BBB na bodźce fizjologiczne, patofizjologiczne i farmakologiczne.

Przebieg eksperymentalny izolacji mikronaczyń mózgu szczura oraz przygotowania próbek błon mikronaczyniowych przedstawiono na Rysunku 1. Zastosowanie opisanej tutaj procedury pozwala na pomyślną izolację nienaruszonych mikronaczyń z mózgu szczura (Rysunek 2A). Naczynia te uzyskano po zakończeniu wirowania z dekstranem, bezpośrednio przed rozpoczęciem ultrawirowania w celu przygotowania próbek błon (tj. po zakończeniu kroku 4.10)....

Tutaj opisana jest metoda izolacji mikronaczyń mózgowych szczurów i przygotowania próbek błonowych. Protokół ten ma wyraźną zaletę polegającą na wytwarzaniu wzbogaconych próbek mikronaczyń o akceptowalnej wydajności białka od poszczególnych zwierząt. Próbki można następnie wykorzystać do solidnych analiz białek w śródbłonku mikronaczyniowym mózgu.

Prosta i powtarzalna metoda przygotowania próbek błonowych ze świeżo wyizolowanych mikronaczyń mózgu szczura

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic barrier tissue that responds to various pathophysiological and pharmacological stimuli. Such changes resulting ...

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie mikronaczyń mózgowych z mózgu szczura do badań biochemicznych mających na celu zrozumienie charakterystyki molekularnej bariery krew-mózg ssaków. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu fizjologii bariery krew-mózg i neurofarmakologii, takie jak regulacja, lokalizacja i ekspresja białek połączeń ścisłych i endogennych transporterów w zdrowiu i chorobie. Główną zaletą tej techniki jest to, że możemy wyizolować wystarczającą liczbę wysokiej jakości mikronaczyń od pojedynczego zwierzęcia, biorąc pod uwagę naturalną zmienność ekspresji białka między poszczególnymi zwierzętami.Technikę tę zademonstruje Bianca Reilly, wybitna studentka studiów licencjackich z mojego laboratorium. Po eutanazji i odcięciu głowy szczura Sprague-Dawley zgodnie z protokołem tekstowym, użyj nożyczek chirurgicznych, aby wyciąć skórę z czaszki szczura, wykonując pojedyncze cięcie poprzeczne. Za pomocą rongeurs ostrożnie usuń płytkę czaszki i odsłoń mózg.Następnie za pomocą szpatułki usuń narząd. Odłącz mózg i umieść izolowaną tkankę mózgową w 50-mililitrowej stożkowej rurce z pięcioma mililitrami BMB i 5,0 mikrolitrami koktajlu inhibitorów pro

a-simple-reproducible-method-to-prepare-membrane-samples-from-freshly

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Dożylnie wstrzyknąć albuminę znakowaną fluoroforem, która przechodzi przez uszkodzoną barierę krew-mózg, docierając do mózgu.

Przygotowanie skrawków mózgu szczura do analizy integralności bariery krew-mózg za pomocą mikroskopii elektronowej

Ten film przedstawia izolację mikronaczyń z mózgu szczura za pomocą kombinacji wirowania gradientu gęstości i enzymatycznego trawienia. Wyizolowane mikronaczynia można hodować w kolbie hodowlanej wstępnie pokrytej matrycą kolagenu i fibronektyny w celu uzyskania kolonii komórek śródbłonka.

Hodowla komórek śródbłonka z mikronaczyń mózgu szczura: procedura izolacji i hodowli komórek śródbłonka z mikronaczyń mózgu szczura

Ten film pokazuje izolację nienaruszonych naczyń z mózgu myszy, które tworzą barierę krew-mózg (BBB) wraz z neuronami i komórkami glejowymi. Wyizolowane naczynia mogą być wykorzystane jako model in vitro do zbadania ich roli w utrzymaniu homeostazy mózgu.

Izolowanie naczyń mózgowych myszy: protokół izolowania nienaruszonych naczyń z próbki mózgu myszy

Ten film demonstruje metodę izolowania i hodowli mikrogleju z mózgów szczurów. Polega ona na oddzieleniu mikrogleju od innych komórek neuronalnych i nieneuronalnych za pomocą płytek pokrytych przeciwciałem monoklonalnym specyficznym dla mikrogleju.

Izolacja i hodowla mikrogleju z mózgów szczurów przy użyciu pożywek bez surowicy

Ten film pokazuje proces izolowania mikronaczyń mózgowych od szczurów poddanych eutanazji. Obejmuje preparację mózgu, oczyszczanie tkanki i trawienie mechaniczne, a następnie wielokrotne wirowanie w celu wyizolowania czystej frakcji mikronaczyń.

Metoda izolacji jednostek nerwowo-naczyniowych z mózgu szczura

Ten film pokazuje dysocjację zamrożonej tkanki mózgowej szczura na zawiesinę jednokomórkową przy użyciu trawienia enzymatycznego i mechanicznego rozcierania. Przygotowane komórki są utrwalane i przepuszczane etanolem do dalszych zastosowań, takich jak cytometria przepływowa lub analiza ekspresji genów.

Uzyskiwanie zawiesiny jednokomórkowej z zamrożonej tkanki mózgowej szczura

Celem niniejszego badania było sprawdzenie odtwarzalności modelu BBB in vitro z udziałem syngenicznej kohodowli komórek śródbłonka i astrocytów na szczurach. Monowarstwa komórek śródbłonka charakteryzowała się wysoką przepuszczalnością TEER i niską przepuszczalnością LY. Oceniano ekspresję specyficznych białek TJ, funkcjonalne odpowiedzi na stan zapalny oraz funkcjonalność transporterów i receptorów.

Tworzenie modelu in vitro bariery krew-mózg szczura (BBB): skupienie się na nieprzepuszczalności bariery krew-mózg i transporcie za pośrednictwem receptorów

Opisujemy protokół pozwalający na oczyszczenie przedziału naczyniowego mózgu myszy. Izolowane naczynia mózgowe obejmują komórki śródbłonka połączone ścisłymi połączeniami i otoczone ciągłą blaszką podstawną, perycyty, komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych, a także okołonaczyniowe błony astroglejowe.

Oczyszczanie naczyń mózgowych myszy

Pokazane są tutaj protokoły (1) świeżo izolowania nienaruszonych "rurek" śródbłonka mózgu oraz (2) jednoczesnych pomiarów śródbłonka wapnia i potencjału błonowego podczas hiperpolaryzacji pochodzącej ze śródbłonka. Co więcej, metody te pozwalają na farmakologiczne dostrojenie wapnia w komórkach śródbłonka i sygnalizacji elektrycznej jako indywidualnych lub interaktywnych zmiennych eksperymentalnych.

Jednoczesne pomiary wewnątrzkomórkowego potencjału wapnia i błony w świeżo wyizolowanym i nienaruszonym śródbłonku mózgowym myszy

Opisujemy procedury przetwarzania tkanki mózgowej nowonarodzonego szczura w celu uzyskania wysokiej rozdzielczości mikrofotografii elektronowej do analizy morfometrycznej rozmieszczenia pęcherzyków synaptycznych na zakończeniach nerwowych. Mikrofotografie uzyskane tymi metodami mogą być również wykorzystane do badania morfologii wielu innych składników komórkowych i ich wymiarowych relacji strukturalnych.

Przygotowanie tkanki mózgowej nowonarodzonego szczura do ultrastrukturalnej analizy morfometrycznej rozmieszczenia pęcherzyków synaptycznych na zakończeniach nerwowych

Przedstawiamy protokół ekstrakcji mysich perycytów mózgowych. Protokół ten, oparty na ekstrakcji perycytów zorientowanej na wzbogacanie bez antybiotyków, jest cennym narzędziem do badań in vitro, zapewniając wysoką czystość i wysoką wydajność, zmniejszając w ten sposób liczbę wykorzystywanych zwierząt doświadczalnych.

Wysokowydajna metoda izolowania perycytów mózgowych od myszy

Poznaj metodę izolacji mikronaczyń mózgu szczura do badań biochemicznych bariery krew-mózg. Technika umożliwia analizę białek z pojedynczych zwierząt, co wspiera badania neurofarmakologiczne i fizjologię BBB.

Prosta i powtarzalna metoda przygotowania próbek błonowych ze świeżo wyizolowanych mikronaczyń mózgu szczura

Przeglądaj więcej filmów