Prosta i powtarzalna metoda przygotowania próbek błonowych ze świeżo wyizolowanych mikronaczyń mózgu szczura
7 maja 2018
Tutaj opisana jest metoda izolacji mikronaczyń mózgowych szczurów i przygotowania próbek błonowych. Protokół ten ma wyraźną zaletę polegającą na wytwarzaniu wzbogaconych próbek mikronaczyń o akceptowalnej wydajności białka od poszczególnych zwierząt. Próbki można następnie wykorzystać do solidnych analiz białek w śródbłonku mikronaczyniowym mózgu.
Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie mikronaczyń mózgowych z mózgu szczura do badań biochemicznych mających na celu zrozumienie charakterystyki molekularnej bariery krew-mózg ssaków. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu fizjologii bariery krew-mózg i neurofarmakologii, takie jak regulacja, lokalizacja i ekspresja białek połączeń ścisłych i endogennych transporterów w zdrowiu i chorobie. Główną zaletą tej techniki jest to, że możemy wyizolować wystarczającą liczbę wysokiej jakości mikronaczyń od pojedynczego zwierzęcia, biorąc pod uwagę naturalną zmienność ekspresji białka między poszczególnymi zwierzętami.
Technikę tę zademonstruje Bianca Reilly, wybitna studentka studiów licencjackich z mojego laboratorium. Po eutanazji i odcięciu głowy szczura Sprague-Dawley zgodnie z protokołem tekstowym, użyj nożyczek chirurgicznych, aby wyciąć skórę z czaszki szczura, wykonując pojedyncze cięcie poprzeczne. Za pomocą rongeurs ostrożnie usuń płytkę czaszki i odsłoń mózg.
Następnie za pomocą szpatułki usuń narząd. Odłącz mózg i umieść izolowaną tkankę mózgową w 50-mililitrowej stożkowej rurce z pięcioma mililitrami BMB i 5,0 mikrolitrami koktajlu inhibitorów proteazy. Aby przetworzyć tkankę, przenieś ją na czystą szalkę Petriego.
Następnie, za pomocą kleszczy, delikatnie przetocz mózg na bibułę filtracyjną o średnicy 12,5 centymetra, aby usunąć zewnętrzne opony mózgowe, które są luźno przylegające do kory mózgowej. Na tym etapie należy upewnić się, że cała tkanka oponowa została usunięta z próbki tkanki mózgowej. Opony mózgowe można uwidocznić jako przezroczystą błoniastą tkankę, którą można łatwo oderwać od tkanki mózgowej.
Delikatnie dociśnij tkankę mózgową do bibuły filtracyjnej i ponownie zwiń tkankę, często obracając bibułę filtracyjną na tym etapie. Następnie za pomocą kleszczy oddziel splot naczyniówkowy od półkul mózgowych. Następnie delikatnie ponownie spłaszcz tkankę mózgową i użyj kleszczy, aby usunąć opuszki węchowe przylegające do istoty białej.
Umieść tkankę mózgową kory mózgowej w schłodzonym szklanym moździerzu. Następnie dodaj pięć mililitrów BMB z koktajlem inhibitorów proteazy. Za pomocą górnego homogenizatora włóż tłuczek do moździerza i homogenizuj tkankę mózgową za pomocą 15 ruchów w górę iw dół przy 3,700 obr./min.
Następnie wlej homogenat do oznakowanych probówek wirówkowych. Pomiędzy próbkami użyj 70% etanolu do czyszczenia tłuczka. Aby przeprowadzić wirowanie, dodaj 8,0 mililitrów 26% roztworu dekstranu do każdej oznakowanej probówki wirówkowej zawierającej homogenat mózgu.
Odwróć probówkę dwukrotnie, a następnie dokładnie zwiruj próbkę. Przeprowadź wirowanie każdej próbki pod różnymi kątami, aby zapewnić dokładne wymieszanie roztworu homogenatu mózgu z 26% roztworem dekstranu. Odwirować próbki w temperaturze 5 000 g i temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 15 minut.
Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 5,0 mililitrach BMB z koktajlem inhibitorów proteazy. Następnie wymieszaj granulkę, aby zapewnić dokładne wymieszanie. Następnie dodaj 8,0 mililitrów 26% dekstranu do każdej probówki wirówki i wiruj, jak pokazano.
Następnie ponownie odwirować próbki. Za pomocą kolby próżniowej i szklanej pipety odessać supernatant i upewnić się, że osad zawierający mikronaczynie mózgowe nie został uszkodzony. Zawiesić osad w BMB z inhibitorem proteazy, a następnie 26%dekstranem jeszcze dwa razy.
Po końcowym odwirowaniu dodaj 5,0 mililitrów BMB do każdej granulki i wiruj, aby ponownie zawiesić próbkę. Korzystając z protokołu zademonstrowanego w tym filmie, przeprowadzono udaną izolację nienaruszonych mikronaczyń z mózgu szczura. Na tym obrazie mikronaczynie jest barwione przy użyciu przeciwciała przeciwko Oatp1a4, transporterowi, który ulega dobrej ekspresji na błonie plazmatycznej komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu.
Jak wykazano w przypadku western blot, preparaty błonowe z mikronaczyń pobranych od samic szczurów Sprague-Dawley zostały wzbogacone w PECAM-1, znany również jako CD31, białko markerowe mikrokrążenia mózgu. Podczas optymalizacji tego protokołu zaobserwowano wzbogacenie PECAM w próbkach membranowych przygotowanych przy użyciu dwóch i czterech etapów wirowania dekstranu. Jak określono za pomocą testu białka Bradforda i wymieniono w tej tabeli, preparaty membranowe zazwyczaj dają stężenia białka w zakresie od 5,0 miligramów na mililitr do 10,0 miligramów na mililitr.
Wartości białka zostały określone na podstawie krzywej standardowej, która została wygenerowana przy użyciu BSA jako wzorca. Pokazany tutaj jest western blot dla białka transportowego BBB Glut1. Wykryto wyraźne pojedyncze prążki o stężeniu 54 kilodaltonów dla tego wysoce eksprymowanego białka BBB w każdej próbce błonowej.
Ten wykres ilustruje wyższą ekspresję Glut1 na BBB u samców i samic szczurów. Nie zaobserwowano różnicy w ekspresji ATPazy sodowo-potasowej między samcami i samicami. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch do 2 1/2 godziny, jeśli jest wykonywana prawidłowo.
Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o przechowywaniu wszystkich próbek na lodzie przez cały czas trwania protokołu oraz o zachowaniu ostrożności podczas zasysania supernatantu z osadu mikronaczynia po etapach wirowania. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak analiza koimmunoprecypitacji, na próbkach mikronaczyń, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak asocjacja różnych białek w tym samym kompleksie białkowym na barierze krew-mózg. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się fizjologią bariery krew-mózg i neurofarmakologią do zbadania charakterystyki molekularnej bariery krew-mózg w zdrowiu i w modelach chorób neurologicznych u gryzoni.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyizolować wysokiej jakości mikronaczynia z mózgu szczura do własnych badań biologii bariery krew-mózg w zdrowiu i chorobie.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia protokół izolacji mikronaczyń mózgowych szczura w celu zbadania bariery krew-mózg (BBB). Metoda ta umożliwia wysokiej jakości analizy białek z poszczególnych osobników, co ułatwia badanie białek połączeń ścisłych oraz transporterów związanych z neurofarmakologią i fizjologią.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Analiza białek
- Fizjologia bariery krew-mózg
Wstęp
- Bariera krew-mózg odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu homeostazy ośrodkowego układu nerwowego.
- Zrozumienie charakterystyki molekularnej BBB może dostarczyć cennych informacji dla badań nad chorobami neurologicznymi.
- Metoda ta uwzględnia zmienność ekspresji białek pomiędzy poszczególnymi szczurami.
- Wzbogacone próbki mikronaczyń są niezbędne dla rozwoju badań neurofarmakologicznych.
Cel badania
- Wyizolowanie mikro naczyń mózgowych z mózgów szczurów do badań biochemicznych.
- Analiza komponentów molekularnych związanych z BBB w różnych warunkach fizjologicznych.
- Ocena ekspresji i regulacji specyficznych białek związanych z funkcją BBB.
Zastosowane metody
- Główna platforma obejmuje techniki chirurgiczne, a następnie homogenizację i wirowanie tkanki mózgowej.
- Model biologiczny składa się ze szczurów Sprague-Dawley, co umożliwia indywidualną analizę charakterystyki mikronaczyniowej.
- Nie wspomniano o przepływie pracy multiomicznej.
- Kluczowe etapy obejmują resekcję tkanki, homogenizację oraz wielokrotne cykle wirowania w celu wyizolowania mikronaczyni.
- Wydajność białka i stopień oczyszczania są oceniane za pomocą techniki Western blotting oraz testu białkowego Bradforda.
Główne wyniki
- Nienaruszone mikronaczynia zostały pomyślnie wyizolowane i poddane charakterystyce pod kątem ekspresji białek.
- Potwierdzono wzbogacenie preparatów mikronaczyniowych w PECAM-1 (CD31) oraz Glut1.
- Stężenia białek po zakończeniu procedury wynosiły zazwyczaj od 5 do 10 mg/mL.
- Zaobserwowano istotną różnicę w ekspresji Glut1 pomiędzy szczurami samcami a samicami.
Wnioski
- Niniejsze badanie dostarcza niezawodnej metody izolacji mikronaczyń mózgowych, torując drogę do przyszłych badań nad barierą krew-mózg.
- Protokół ten pogłębia zrozumienie dynamiki neurofarmakologicznej oraz fizjologii BBB.
- Zdobyta wiedza może przyczynić się do opracowania lepszych podejść terapeutycznych w schorzeniach neurologicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Izolowanie mikronaczyń mózgowych umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka w przypadku celów terapeutycznych leków w OUN poprzez dostarczenie próbek wzbogaconych w komórki śródbłonka, które odzwierciedlają zmienność fizjologiczną. Metoda ta wspiera walidację celów oraz rozwój testów do badań przenikania przez barierę krew-mózg, zwiększając wiarygodność predykcyjną w identyfikacji związków wiodących. Powtarzalne przygotowanie błon z pojedynczych zwierząt usprawnia dopasowanie biomarkerów translacyjnych oraz selekcję portfolio w badaniach i rozwoju neurofarmakologii.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie specyficznych dla śródbłonka celów, takich jak transportery i białka połączeń ścisłych, w systemie istotnym dla przebiegu choroby.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalną izolację mikronaczyń od poszczególnych szczurów, co pozwala uchwycić zmienność międzyosobniczą w ekspresji celów.
- Wartość strategiczna: Wspiera testowanie hipotez i biologiczną redukcję ryzyka w odniesieniu do celów w OUN przed optymalizacją wiodących związków.
Przesiew i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie próbek błon odpowiednich do ilościowej analizy ekspresji i funkcji białek BBB.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalną wydajność białek (5–10 mg/mL), co umożliwia standaryzację ilości wejściowych w kampaniach przesiewowych.
- Wartość strategiczna: Ułatwia przygotowanie testów do oceny wpływu związków na cele endotelialne w formacie skalowalnym.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Zachowuje istotność w kontekście choroby poprzez izolację mikronaczyń z modeli gryzoni w celu badania reakcji BBB na bodźce farmakologiczne.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną z wykorzystaniem dopasowanych systemów biologicznych.
- Wartość strategiczna: Wspiera decyzje o dalszym rozwoju w oparciu o analizę ryzyka poprzez potwierdzenie oddziaływania na cel w obrębie BBB.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum odkryć – od walidacji celu po ocenę przedkliniczną – poprzez dostarczanie próbek wzbogaconych w komórki śródbłonka do badań mechanistycznych.
- Biologia odkrywcza: Wspomaga wyjaśnianie szlaków sygnałowych i potwierdzanie celów poprzez wzbogacanie markerów mikro naczyniowych, takich jak PECAM-1 i Glut1.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalnych próbek z mierzalną ilością białek do badań przesiewowych związków oraz testów zaangażowania celu.
- Analityka: Umożliwia odczyty metodą Western blot i testem Bradforda w celu porównania ekspresji białek w różnych warunkach i u obu płci.
- Badania translacyjne: Łączy się z pracami przedklinicznymi poprzez wykorzystanie mikro naczyniów mózgu szczura jako systemu istotnego dla choroby w badaniach nad terapeutykami celującymi w BBB.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnie wykorzystywalną platformę izolacji dla wielu projektów ukierunkowanych na dostarczanie leków do OUN i modulację BBB.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w walidacji celów BBB.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność dzięki zdefiniowanym etapom wirowania i wzbogacania opartego na dekstranie.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez dostarczenie danych specyficznych dla śródbłonka, co redukuje biologiczne ryzyko na późnych etapach programów CNS.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o zwalidowaną ekspresję w mikronaczyniach mózgowych.
Kwestie wdrożeniowe
- Wymaga doświadczenia w zakresie neuroanatomii i obchodzenia się z tkankami w celu izolacji mikro naczyń mózgowych bez zanieczyszczeń.
- Wymaga dostępu do sprzętu do homogenizacji, wirówek zdolnych do osiągnięcia 5,000 g w temperaturze 4°C oraz infrastruktury do przygotowania dekstranu.
- Wymaga standaryzacji przetwarzania próbek między zespołami w celu zachowania spójności uzysku i czystości białka.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania metody przy jej stosowaniu u innych gatunków lub w modelach chorób innych niż mózg szczura.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak konieczność utrzymywania próbek w lodzie oraz unikania naruszenia osadu podczas aspiracji nadsączu.
