Ocena żywotności konsorcjum bakterii syntetycznych na granicy faz gospodarz-mikroorganizm w jelitach in vitro

Model ten jest kolejnym krokiem w ustawianiu mikrokierunków gospodarza dla górnych odcinków przewodu pokarmowego. Pozwala na rozwiązywanie problemów badań mechanistycznych i oferuje wiele możliwości dla przemysłu spożywczego, farmaceutycznego i nutraceutycznego, a także toksykologii. Główną zaletą tej techniki jest to, że łączy ona model układu pokarmowego z mikrointerfejsem gospodarza, w tym złożoną społecznością drobnoustrojów.

Jest bardzo przydatny i jest również bardzo elastyczny. Metodologię tę można zastosować przy użyciu innych typów komórek w celu oceny żywotności patogenu i późniejszych informacji. Zmiany mogą być również wykorzystane do wspomagania zdolności kolonizacyjnej mieszanin probiotycznych i ostatecznie potencjalnego wpływu bakterii na krążenie ogólnoustrojowe.

Na początek przeprowadź autoklaw pożywki, a następnie dodaj pięć mikrogramów na mililitr hemu i jeden mikrogram na mililitr menadionu. Dozuj dziewięć mililitrów pożywki do probówek Hungate i zamknij probówki gumowym korkiem i aluminiową nakrętką. Następnie przepłucz rurki mieszaniną 90% azotu i 10% dwutlenku węgla.

Za pomocą strzykawki pobrać jeden mililitr pożywki beztlenowej i przenieść ją do 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej. Wybierz pojedyncze kolonie każdego gatunku bakterii i ponownie zawieś je w pożywce. Następnie przenieś kolonie do beztlenowego zmodyfikowanego BHI i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 48 godzin.

Po inkubacji użyj przefiltrowanego, wysterylizowanego PBS, aby rozcieńczyć kultury do 10 do piątych komórek na mililitr. Następnie użyj cytometrii przepływowej z barwieniem jodkiem propidyny w kolorze cyber green, aby zmierzyć liczbę komórek. Ocena składu i żywotności społeczności mikrobiomu jest niezbędna do uniknięcia stronniczości w naszym eksperymencie.

Usuń pożywkę do hodowli komórkowych z kolb, a następnie użyj pięciu mililitrów PBS bez wapnia lub magnezu, aby raz umyć komórki. Dodaj dwa mililitry roztworu EDTA trypsyny do komórek. Rozprowadzić roztwór, delikatnie przesuwając kolbę.

Następnie usuń 1,5 mililitra roztworu trypsyny i inkubuj kolbę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut. Po sprawdzeniu pod mikroskopem, czy komórki uległy odłączeniu, dodać pięć mililitrów uzupełnionej pożywki do hodowli komórek do kolby w celu dezaktywacji trypsyny i pipetować w górę iw dół, aby uzyskać jednorodną zawiesinę pojedynczej komórki. Natychmiast zmieszać 50 mikrolitrów podwielokrotności zawiesiny komórek ze sterylnym 0,4% roztworem błękitu trypanowego w proporcji 1:1 objętość do objętości dla komórek KCO2 dla 1:5 objętość do objętości dla HT29MTX.

Wymieszać przez pipetowanie i załadować zawiesinę do komory liczącej przed policzeniem komórek pod mikroskopem. Po przygotowaniu KCO2 i HT29MTX zawiesin komórkowych zgodnie z protokołem tekstowym, homogenizować zawiesiny i dodać odpowiednią objętość komórek KCO2 i HT29MTX do wstępnie napełnionego sterylnego pojemnika z uzupełnioną pożywką do hodowli komórkowych. Wstępnie inkubowaną pożywkę odessać od wierzchołkowej strony wcześniej przygotowanej komory.

Delikatnie wymieszaj zawiesinę komórek przez pipetowanie i przenieś 1,5 mililitra do komory wierzchołkowej wkładek komory, mieszając zawiesinę komórek co jeden do trzech dołków, aby zapewnić stałą homogenizację. Delikatnie przesuwaj płytki do przodu i do tyłu, a następnie od prawej do lewej, aby równomiernie rozprowadzić komórki w studzience. Przenieś płytki do inkubatora i powtórz ruch płytek.

Osadzanie komórek musi odbywać się przy stałej homogenizacji zawiesiny komórek, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie w studni. Aby zmierzyć integralność bariery nabłonkowej przed rozpoczęciem ASA, upewnij się, że sprzęt poziomu jest w pełni naładowany przed rozpoczęciem pomiarów. Odłącz sprzęt poziomu od zasilania i przykryj plastikową torbą do autoklawu.

Zrób otwór w torbie, aby wprowadzić elektrodę do portu wejściowego w mierniku. Następnie spryskaj worek 70% etanolem przed przeniesieniem sprzętu poziomu do komory przepływowej. Aby zdezynfekować elektrodę, zanurz końcówki elektrod w 70% etanolu na 15 minut.

Pozostaw końcówki do wyschnięcia na powietrzu przez 15 sekund, a następnie użyj pożywki do hodowli komórkowych, aby przepłukać elektrodę. Pozwól, aby ogniwa osiągnęły temperaturę pokojową wewnątrz komory przepływowej. Upewnij się, że miernik jest odłączony od ładowarki, a następnie ustaw przełącznik trybu w pozycji Ohm i włącz wyłącznik zasilania.

Zmierz rezystancję ogniwa, zanurzając elektrodę krótszą końcówką we wkładce, a dłuższą końcówką wyjmując ją ze studzienki. Trzymaj elektrodę pod kątem 90 stopni do wkładki płytki. Aby zasymulować trawienie doustne, przenieś trzy mililitry społeczności bakteryjnej do sterylnej probówki o pojemności 50 mililitrów i wymieszaj z trzema mililitrami symulowanego płynu ślinowego lub SSF.

Dodaj 75 jednostek na mililitr alfa-amylazy z ludzkiej śliny typu 9A i dwa gramy na litr mucyny z żołądka świni typu 2. Inkubować mieszaninę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 100 obr./min przez dwie minuty. Zbierz dwumililitrową próbkę do ekstrakcji DNA i kwantyfikacji cytometrii przepływowej.

Aby zasymulować trawienie żołądkowe, dodaj cztery mililitry symulowanego płynu żołądkowego lub SGF do trzech mililitrów bakterii. Użyj jednego molowego HCl, aby w razie potrzeby dostosować pH do trzech. Inkubować próbkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i prędkości 100 obr./min przez dwie minuty.

Następnie zbierz próbkę o wielkości dwóch mililitrów. W przypadku trawienia w jelicie cienkim dodaj do bakterii cztery mililitry symulowanego płynu jelitowego lub SIF. W razie potrzeby użyj wodorotlenku sodu, aby dostosować pH.

Następnie inkubować próbkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 100 obr./min przez dwie minuty. I zbierz próbkę o wielkości dwóch mililitrów. Po umyciu i dostosowaniu gęstości komórek trawienia jelita cienkiego zgodnie z protokołem tekstowym, usuń pożywkę wierzchołkową z systemu transwell i dodaj 1,5 mililitra zawiesiny bakteryjnej.

Współhodowlę systemu w ogólnych warunkach hodowli komórkowej przez dwie godziny. Po inkubacji zmierz wartości poziomów, aby ocenić integralność bariery nabłonkowej, jak pokazano wcześniej w filmie. Dodaj 0,5 mililitra 10-milimolowej n-acetylocysteiny i HPSS, aby rozpuścić śluz wytwarzany przez HT29MTX i odzyskać przylegające bakterie.

Inkubować płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę pod mieszaniem. Odzyskaj NAC HPSS w probówce mikrowirówkowej i użyj jednego mililitra DPBS do dwukrotnego umycia komórek. Dodaj 0,5 mililitra 0,5% triton-x100 na wierzch monowarstw i rozerwij komórki przez pipetowanie.

Następnie szybko odzyskaj płyn w wirze przez jedną minutę. Szybkość ma kluczowe znaczenie, aby uniknąć uszkodzenia komórek bakteryjnych przez detergent. Próbki należy przeanalizować zgodnie z protokołem tekstowym.

Jak podano tutaj, liczba nienaruszonych komórek z poszczególnych szczepów wynosiła około 10 do ośmiu komórek na mililitr przed utworzeniem syntetycznej społeczności, podczas gdy wielogatunkowy mikrokosmos zawierał ponad 90% żywotnych komórek podczas tworzenia społeczności. Na podstawie oceny ilościowej żywych i martwych organizmów żywotność bakterii zmniejsza się po każdym etapie trawienia w wyniku kwaśnego pH podczas pasażu żołądkowego oraz biosoli zawartych w płynach trawiennych jelita cienkiego. Trudne warunki trawienia żołądka i jelita cienkiego mogą przekształcić bakterie w żywe, ale nie w komórkach hodowlanych, które są żywymi bakteriami, które ani nie rosną, ani się nie dzielą.

Jak pokazano na tym rysunku, żywe komórki odzyskane z błony śluzowej są oznaczone kolorem niebieskim na wykresie cytometrii przepływowej. Jednak nie zaobserwowano wzrostu, gdy te próbki śluzu były powlekane. Frakcją, w której bakterie wykazują wyższe wskaźniki żywotności, są szczątki komórkowe, które ujawnia się podczas liczenia płytek.

Liczba kolonii może być zmienna, ale obecność bakterii aktywnych metabolicznie stwierdza się w mniej rozcieńczonych próbkach. Po tym rozwoju technika ta może być wykorzystywana przez badaczy z dziedziny nutrigenomiki lub farmakomikrobiomii do mikrokosmicznego badania gospodarza. Zgodnie z tym protokołem można wykonać inne techniki, takie jak transkryptom lub analiza metaboliczna, aby odpowiednio uzyskać mechanistyczne zrozumienie udanego procesu kolonizacji.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak stworzyć złożony model in vitro reprezentatywny dla procesów trawiennych, w tym wzajemnych oddziaływań między komórkami gospodarza a resztą mikrobiomu. Nie zapominaj, że praca z bakteriami chorobotwórczymi może być niezwykle niebezpieczna i ważne jest, aby wziąć pod uwagę środki ostrożności w zakresie bezpieczeństwa biologicznego.