Ex vivo Obrazowanie wapnia do wizualizacji reakcji mózgu na sygnalizację endokrynologiczną u Drosophila

Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie endokrynologii, a także w dziedzinie neuronauki, takie jak nasze badania mające na celu przegląd reakcji mózgu na sygnały endokrynologiczne. Główną zaletą tej techniki jest to, że można badać bezpośredni wpływ sygnałów endokrynologicznych na mózg oddzielony od innych tkanek. Aby rozpocząć tę procedurę, użyj kleszczy, aby podrapać dolną środkową część plastikowego naczynia hodowlanego, aby stworzyć wgniecenie ułatwiające montaż brzusznego zwoju mózgu larwy po sekcji.

Za pomocą wykałaczki umieść małą kroplę kleju superglue po obu stronach wgniecenia i przymocuj pręt wolframowy do kleju. Następnie, używając małego kawałka kleju wielokrotnego użytku przypominającego szpachlę, wykonaj okrągłą ścianę otaczającą wgłębienie. Aby wypreparować mózg larwy, 90 do 120 godzin po złożeniu jaj zbierz larwy i umyj je co najmniej trzy razy wodą destylowaną, aby usunąć przylegające resztki jedzenia.

Następnie umieść larwę na kwadratowym półtoracalowym szkiełku zegarkowym wypełnionym lodowatym PBS. Użyj kleszczy, aby delikatnie chwycić środkową część larwy. Użyj innej pary kleszczy, aby delikatnie chwycić i pociągnąć haczyki do ust, aby oddzielić przednią część larwy zawierającej mózg od reszty ciała.

Następnie przytrzymaj przedni koniec kleszczami i odwróć larwę na lewą stronę. Usuń obce tkanki przyczepione do mózgu, takie jak wyimaginowane dyski, ciała tłuszczowe i gruczoł pierścieniowy. Delikatnie oddziel mózg od części ustnych.

Następnie nanieść 200 mikrolitrów PBS na wnętrze przygotowanego wcześniej w komorze obrazowania pierścienia klejącego. Delikatnie zassać wypreparowany mózg za pomocą PBS do pipety Pasteura i przenieść go do komory obrazowania. W komorze obrazowania chwyć włókna mięśniowe wystające ze zwojów brzusznych i delikatnie włóż mózg do wgłębienia pod drutem wolframowym.

Następnie pociągnij drut wolframowy lekko do góry, aby ustawić mózg we właściwej pozycji do obrazowania. Aby uzyskać obrazy fluorescencji wapnia, umieść komorę obrazowania zawierającą eksplant mózgu pod mikroskopem. Opuść soczewkę obiektywu, aż dotknie PBS, a przy jasnym oświetleniu pola ustaw mózg i ustaw go w ostrości.

Przełącz się na światło fluorescencyjne i dostosuj ostrość do komórek oznaczonych sukcesem GCaMP. Rozpocznij akwizycję z szybkością 250 ms/klatkę, w rozdzielczości 512 x 512 pikseli w trybie chłodzenia wodą. Następnie dostosuj czas ekspozycji, aby uzyskać wartości fluorescencji w zakresie dynamicznym kamery CCD, ale nie mniejsze niż 1000 dowolnych jednostek z 16-bitowymi obrazami.

Po określeniu parametrów obrazowania wykonuj obrazy przez minutę przed podaniem peptydu, aby wykryć natężenie sygnału wyjściowego. Następnie należy bezpośrednio nałożyć peptyd testowy, pipetując 100 mikrolitrów przygotowanego roztworu peptydu do kąpieli larwalnej. Rejestruj pomyślną emisję GCaMP przez kilka minut.

Aby przeanalizować dane, otwórz oprogramowanie analityczne i użyj pierwszej klatki, która znajdowała się przed zastosowaniem peptydów, jako obrazu referencyjnego. Następnie wybierz Wtyczki, TurboReg. Wybierz plik obrazu szeregowego jako źródło, a obraz referencyjny jako element docelowy.

Następnie sprawdź Sztywny korpus i Dokładny odpowiednio dla metody przetwarzania i jakości. Następnie kliknij przycisk Batch (Partia), aby rozpocząć przetwarzanie obrazu. Wybierz wiele obszarów zainteresowania za pomocą Analizy, Narzędzi, Menedżera zwrotu z inwestycji w zasobniku obrazów.

Następnie zmierz intensywność pikseli, klikając Więcej, Multi Measure, OK w oknie Menedżer ROI. W tym eksperymencie mózg typu dzikiego był narażony na CCHa2, grelinę i nocyceptynę, podczas gdy mózg z mutacją receptora CCHa2 był narażony na CCHa2. Sygnały GCaMP6 w komórkach produkujących insulinę wykryto za pomocą mikroskopii konfokalnej z prędkością 250 ms/klatkę, a oto nieruchome obrazy wybranych punktów czasowych.

Wykreślono stosunek zmiany intensywności ROI do wyjściowej intensywności sygnału w każdym punkcie czasowym. Zwroty akcji były ustawiane na ciałach komórek, które zostały wykryte w tej samej płaszczyźnie ogniskowej. Linie ciągłe wskazują średnią z pięciu do 10 próbek, a linie przerywane oznaczają górną i dolną granicę błędu standardowego średniej.

Zacienione obszary wskazują zmienność sygnałów w eksperymentach. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu godziny, jeśli jest odpowiednio uformowana. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o szybkim przygotowaniu próbki mózgu, aby uniknąć jej uszkodzenia.

Procedurę tę można połączyć z genetyką, aby uzyskać odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak specyficzność receptorów. System zastosowany w tym protokole jest łatwy w przygotowaniu i wielokrotnego użytku. W związku z tym protokół ten będzie przydatny do, np. badań przesiewowych.

Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom z dziedziny endokrynologii i neurobiologii do zbadania sieci hormonalnych, które kontrolują funkcję mózgu u Drosophila.