Name: Ex vivo Obrazowanie wapnia do wizualizacji reakcji mózgu na sygnalizację endokrynologiczną u Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 49 s
Description: Poznaj metodę obrazowania wapnia ex vivo w mózgu Drosophila do badania odpowiedzi neuronów na sygnały endokrynologiczne. Technika umożliwia analizę aktywacji neuronalnej i badanie hormonalnych sieci mózgowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Grants-in-Aid for Scientific Research (15K07147, 17K07419) od JSPS (dla Hiroshi Ishimoto, Hiroko Sano), Inamori Foundation Research Grant (dla HI) oraz Program of the Joint Usage/Research Center for Developmental Medicine, w Instytucie Embriologii Molekularnej i Genetyki, Kumamoto University (do HS). Dziękujemy dr Azusa Kamikouchi i panu Daichi Yamada za pomoc w korzystaniu z systemu obrazowania.

1. Przygotowanie eksplantatów mózgu larw
<ol>
	<li>Zrób komorę obrazowania. 
	UWAGA: Stabilny zapis wymaga, aby eksplantaty mózgu były na uwięzi. W tym przypadku w systemie obrazowania Ca2+ zastosowano tanią, ręcznie wykonaną komorę obrazowania.
	<ol>
		<li>Za pomocą kleszczy podrap dolną środkową część plastikowej płytki hodowlanej (35 mm x 10 mm), aby zrobić wgniecenie w brzusznym zwoju mózgu larwy, ułatwiając montaż (krok 1.3, <silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
		<li>Za pomocą wykałaczki umieść małą kroplę superglue po obu stronach wgniecenia i przymocuj pręt wolframowy (średnica 0,125 mm, długość od 6 do 7 mm) do kleju.</li>
		<li>Używając małego kawałka kleju wielokrotnego użytku przypominającego szpachlę, wykonaj okrągłą ściankę (o średnicy 10 mm i wysokości 3 mm) otaczającą wgniecenie (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). 
		UWAGA: Przestrzeń wewnątrz ściany zostanie później wypełniona solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS; 0,14 M NaCl, 0,0027 M KCl, 0,01 M PO43-, pH 7,4 ± 0,05 w 25 °C).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie dla zwierząt 
	UWAGA: W przypadku obrazowania wapnia wskaźnik wapnia, GCaMP6s, jest wyrażany w typie komórki będącej przedmiotem zainteresowania, co jest zwykle osiągane przy użyciu kombinacji specyficznych tkankowo GAL4 i UAS-GCaMP6s. Aby zapewnić, że sygnał jest przekazywany przez receptor kandydujący, GCaMP6s ulega również ekspresji w zmutowanym wadliwym receptorze.
	<ol>
		<li>Gdy wymagane są porównania eksperymentalne dla różnych genotypów, takich jak dziki typ i mutanty, badaj larwy w teście wieku, aby uniknąć wahań poziomu ekspresji GCaMP6 i różnic fizjologicznych spowodowanych etapami rozwoju.</li>
		<li>Muchy rodzicielskie (po 30 much każdej płci) należy przechowywać w fiolce hodowlanej zawierającej standardowy pokarm dla much przez 8 godzin, aby umożliwić składanie jaj na powierzchni pokarmu. Hodowla larw w masie w 12-godzinnym cyklu jasno-ciemnym w temperaturze 25 °C i wilgotności względnej 60–70 %.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozwarstwienie mózgu larwy
	<ol>
		<li>Po 90-120 godzinach od złożenia jaj (AEL) należy zebrać larwy i umyć je co najmniej 3 razy wodą destylowaną, aby usunąć przylegające resztki jedzenia.</li>
		<li>Umieść larwę na kwadratowym 1,5-calowym szkiełku zegarkowym wypełnionym lodowatym PBS. 
		UWAGA: Następne dwa kroki są wykonywane w tym szkiełku zegarkowym pod mikroskopem preparacyjnym.</li>
		<li>Użyj kleszczy, aby delikatnie chwycić środkową część larwy. Użyj innych kleszczy, aby chwycić haczyki do ust i delikatnie pociągnij haczyki do ust, aby oddzielić przednią część larwy zawierającej mózg od reszty ciała. 
		UWAGA: Alternatywnie można użyć nożyczek chirurgicznych.</li>
		<li>Przytrzymaj przedni koniec kleszczami i odwróć larwę na lewą stronę. Usuń obce tkanki przyczepione do mózgu, takie jak dyski wyobrażeniowe, ciała tłuszczowe i gruczoł pierścieniowy. Delikatnie oddziel mózg od aparatu gębowego.</li>
		<li>Nanieść 200 μl PBS na wnętrze pierścienia wykonanego z kleju wielokrotnego użytku przypominającego szpachlę w komorze obrazowania. Delikatnie zassać wypreparowany mózg za pomocą PBS do pipety Pasteura, a następnie przenieść go do komory obrazowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieszczanie mózgu w komorze obrazowania
	<ol>
		<li>Użyj kleszczy, aby chwycić włókna mięśniowe wystające z zwojów brzusznych. Delikatnie włóż mózg do wgłębienia pod drutem wolframowym.</li>
		<li>Używając innych kleszczy, pociągnij drut wolframowy lekko do góry, aby umieścić mózg w odpowiedniej pozycji do obrazowania (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Akwizycja obrazów fluorescencyjnych Ca2+
UWAGA: Eksplantaty mózgu zanurzone w PBS są obrazowane za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w soczewkę obiektywową z 20-krotnym zanurzeniem w wodzie (nie dotyczy = 0,5). PBS nie aktywuje komórek w mózgu. Jeśli potrzebne są obrazy w osi Z, soczewka obiektywu jest montowana za pomocą ruchomego obiektywu aktywowanego piezoelektrycznie. Głowica konfokalna z obracającym się dyskiem służy do zwiększenia rozdzielczości czasowej. W przypadku obrazowania przy słabym oświetleniu na mikroskopie zamontowana jest kamera ze sprzężeniem ładunku zwielokrotnionym elektronami. Obrazowanie fluorescencji GCaMP6s (wzbudzenie/emisja: 488/509 nm) wymaga lasera o długości fali 488 nm do wzbudzenia z dichroicznym rozdzielaczem wiązki i filtrem emisyjnym (np. filtr pasmowoprzepustowy 528 ± 38 nm).
<ol>
	<li>Umieść komorę obrazowania zawierającą eksplantat mózgu pod mikroskopem.</li>
	<li>Opuść soczewkę obiektywu, aż dotknie PBS. W świetle jasnego pola ustaw mózg i ustaw go w ostrości. Przełącz na światło fluorescencyjne i dostosuj ostrość na komórkach oznaczonych GCaMP6s. 
	UWAGA: Podstawowa zielona fluorescencja GCaMP6s powinna być widoczna.</li>
	<li>Akwizycja rozpoczyna się z szybkością 250 ms/klatkę w rozdzielczości 512 × 512 pikseli w trybie chłodzonym wodą za pomocą odpowiedniego oprogramowania do akwizycji (np. μManager). Dostosuj czas ekspozycji, aby uzyskać wartości fluorescencji w zakresie dynamicznym kamery CCD, ale nie mniejsze niż 1000 (dowolne jednostki), z obrazami 16-bitowymi (zakres dynamiczny 0-65 535). 
	UWAGA: Należy użyć krótkiego czasu naświetlania, aby zminimalizować fotowybielanie GCaMP6s. Czas ekspozycji powinien być zoptymalizowany w każdym eksperymencie, ponieważ zależy od poziomów ekspresji GCaMP6 i czułości systemu detekcji. W naszym eksperymencie z użyciem dilp2>GCaMP6s było to 100 ms. Gdy dla danej głębokości obrazowania wymagane są przekroje z, można uzyskać kilka obrazów przekroju z w zależności od czasu ekspozycji i interwałów klatek. Jeśli kamera ma wystarczającą rozdzielczość przestrzenną, rozmiar binningu (liczba rejestrów na chipie, które zostaną połączone w jeden piksel cyfrowy) powinien zostać zwiększony, aby skrócić czas naświetlania.</li>
	<li>Po określeniu parametrów obrazowania należy wykonywać zdjęcia przez 1 minutę przed podaniem peptydu, aby wykryć wyjściowe natężenie sygnału (F0).</li>
	<li>Zastosować peptyd testowy; w tym celu rozpuścić 100 μl roztworu peptydu w PBS i pipetować go bezpośrednio do kąpieli larwalnej w celu uzyskania optymalnego stężenia. 
	UWAGA: Roztwór peptydu należy wstrzykiwać powoli (np. z szybkością przepływu 20 μl/s) do roztworu kąpieli za pomocą pipety. Niepowiązany syntetyczny peptyd rozpuszczony w PBS stosuje się jako kontrolę ujemną.</li>
	<li>Rejestruj emisję GCaMP6s przez kilka minut.</li>
</ol>
3. Analiza danych
Uwaga: Dane obrazowania są analizowane w trybie offline za pomocą ImageJ. Podczas obrazowania poklatkowego pipetowanie powoduje ruch mózgu larwy. W związku z tym aberracje pozycyjne obrazów seryjnych powinny zostać skorygowane przed analizą. Korekcję można wykonać za pomocą wtyczki ImageJ, TurboReg w następujący sposób.
<ol>
	<li>Otwórz oprogramowanie analityczne i użyj pierwszej klatki (przed nałożeniem peptydu) jako obrazu referencyjnego.</li>
	<li>Wybierz Wtyczki | Rejestracja | TurboReg.</li>
	<li>Wybierz plik obrazu szeregowego jako źródło i obraz referencyjny jako element docelowy.</li>
	<li>Sprawdź opcję Sztywny korpus (równoległe przemieszczenie i obrót obrazów) i Dokładny ("Szybki" to zgrubna, ale szybka analiza) odpowiednio dla metody przetwarzania i jakości.</li>
	<li>Kliknij przycisk Partia, aby rozpocząć przetwarzanie obrazu.</li>
	<li>Wybieranie wielu regionów zainteresowania (ROI) przy użyciu opcji Analizuj | Narzędzia | Menedżer zwrotu z inwestycji w ImageJ.</li>
	<li>Zmierz intensywność pikseli, klikając Więcej | Wiele środków | OK w oknie Menedżer ROI.</li>
	<li>Obliczyć ΔF/F0 = (F - F0)/F0, gdzie F to intensywność ROI w momencie bodźca, a F0 to intensywność w oknie czasowym bezpośrednio przed określonym zdarzeniem eksperymentalnym (np. 30 klatek poprzedzających początek bodźca).</li>
	<li>Powtórz eksperyment, używając wielu próbek mózgu, przeprowadzając przetwarzanie statystyczne w celu uzyskania średniej i błędu standardowego średniej (SEM) w każdym punkcie czasowym.</li>
</ol>

<ol><li>Morton, G. J., Schwartz, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptin+and+the+central+nervous+system+control+of+glucose+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Leptin and the central nervous system control of glucose metabolism.</a> Physiological Reviews. 91 (2), 389-411 (2011).</li>
<li>Stanley, S., Wynne, K., McGowan, B., Bloom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormonal+regulation+of+food+intake%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Hormonal regulation of food intake.</a> Physiological Reviews. 85 (4), 1131-1158 (2005).</li>
<li>Goodman, W. G., Cusson, M. The juvenile hormones. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780123847492100081">Insect Endocrinology</a>. Gilbert, L. I. , Academic Press. 310-365 (2012).</li>
<li>Lafont, R., Dauphin-Villemant, C., Warren, J. T., Rees, H. Ecdysteroid chemistry and biochemistry. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780123847492100044">Insect Endocrinology</a>. Gilbert, L. I. , Academic Press. 106-176 (2012).</li>
<li>Smith, W., Rybczynski, R. Protothoracicotropic hormone. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780123847492100019">Insect Endocrinology</a>. Gilbert, L. I. , Academic Press. 1-62 (2012).</li>
<li>Claeys, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+neuropeptide+and+peptide+hormone+receptors%3A+current+knowledge+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Vitamins+and+Hormones%22%5BJournal%5D)">Insect neuropeptide and peptide hormone receptors: current knowledge and future directions.</a> Vitamins and Hormones. 73, 217-282 (2005).</li>
<li>Gade, G., Goldsworthy, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+peptide+hormones%3A+a+selective+review+of+their+physiology+and+potential+application+for+pest+control%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Management+Science%22%5BJournal%5D)">Insect peptide hormones: a selective review of their physiology and potential application for pest control.</a> Pest Management Science. 59 (10), 1063-1075 (2003).</li>
<li>Adams, M. D., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10731132">The genome sequence of Drosophila melanogaster.</a> Science. 287 (5461), 2185-2195 (2000).</li>
<li>Park, D., Veenstra, J. A., Park, J. H., Taghert, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+peptidergic+cells+in+Drosophila%3A+where+DIMM+fits+in%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mapping peptidergic cells in Drosophila: where DIMM fits in.</a> PLoS One. 3 (3), 1896(2008).</li>
<li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8381210">Inositol trisphosphate and calcium signalling.</a> Nature. 361 (6410), 315-325 (1993).</li>
<li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+signal-to-noise+Ca%282%2B%29+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).</li>
<li>Rulifson, E. J., Kim, S. K., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ablation+of+insulin-producing+neurons+in+flies%3A+growth+and+diabetic+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ablation of insulin-producing neurons in flies: growth and diabetic phenotypes.</a> Science. 296 (5570), 1118-1120 (2002).</li>
<li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Nassel, D. R., Kubrak, O. I., Liu, Y., Luo, J., Lushchak, O. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+that+regulate+insulin+producing+cells+and+their+output+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Factors that regulate insulin producing cells and their output in Drosophila.</a> Frontiers in Physiology. 4, 252(2013).</li>
<li>Sano, H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26020940">The Nutrient-Responsive Hormone CCHamide-2 Controls Growth by Regulating Insulin-like Peptides in the Brain of Drosophila melanogaster.</a> PLoS Genetics. 11 (5), 1005209(2015).</li>
<li>Tsao, C. K., Ku, H. Y., Lee, Y. M., Huang, Y. F., Sun, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+Term+Ex+Vivo+Culture+and+Live+Imaging+of+Drosophila+Larval+Imaginal+Discs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Long Term Ex Vivo Culture and Live Imaging of Drosophila Larval Imaginal Discs.</a> PLoS One. 11 (9), 0163744(2016).</li>
<li>Sabado, V. aN., Nagoshi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+Resolution+Fluorescence+Live+Imaging+of+Drosophila+Circadian+Clocks+in+Larval+Brain+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. 131, e57015(2018).</li>
<li>Apostolopoulou, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caffeine+Taste+Signaling+in+Drosophila+Larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Caffeine Taste Signaling in Drosophila Larvae.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 193(2016).</li>
<li>Cao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+targeted+optical+electrophysiology+in+intact+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genetically targeted optical electrophysiology in intact neural circuits.</a> Cell. 154 (4), 904-913 (2013).</li>
<li>Nikolaev, V. O., Bunemann, M., Hein, L., Hannawacker, A., Lohse, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+single+chain+cAMP+sensors+for+receptor-induced+signal+propagation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Novel single chain cAMP sensors for receptor-induced signal propagation.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (36), 37215-37218 (2004).</li>
<li>Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+pHluorins+for+optical+measurements+of+presynaptic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity.</a> Biophysical Journal. 79 (4), 2199-2208 (2000).</li>
<li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+minimal+hemolymph-like+solution%2C+HL3.1%2C+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurogenetics%22%5BJournal%5D)">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> Journal of Neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisana tutaj metoda obrazowaniaCa2+ jest użytecznym systemem do badania funkcji hormonów w mózgu. In vivo mózg otrzymuje hormony z różnych narządów dokrewnych. Ponadto mózg stale odbiera wznoszące się informacje sensoryczne, co powoduje spontaniczną aktywację neuronów. Ten system ex vivo eliminuje takie szumy i zapewnia lepszy stosunek sygnału do szumu niż obrazowanie in vivo . W tym systemie cząsteczki mogą być testowane pojedynczo lub w połączeniu. Oprócz hormonów peptydowych, do ...

Komunikacja między narządami jest ewolucyjnie zachowaną strategią utrzymania homeostazy w celu radzenia sobie ze zmianami środowiskowymi. U ludzi różne hormony sąuwalniane z gruczołów dokrewnych do krążenia. Wiele z tych hormonów celuje w podwzgórze mózgu, które reguluje procesy metaboliczne i podstawowe zachowania, takie jak karmienie1,2. Wiele hormonów odkryto przy użyciu modeli ssaków. Jednak mechanizmy ich działania, zwłaszcza sieci międzynarządowe, w których uczestniczą, pozostają w dużej mierze niejasne.
Drosophila melanogaster stała się użytecznym modelem do badania komunikacji między narządami. U owadów wiele procesów fizjologicznych jest kontrolowanych przez hormony. Wczesne badania skupiające się na wzroście i metamorfozie wykorzystywały duże owady. W tych badaniach usunięcie lub przeszczepienie określonych narządów przewidywało istnienie międzynarządowych cząsteczek sygnałowych; później hormon juweniliczny (JH), hormon protorakotropowy (PTTH) i ekdyzon zostały oczyszczone biochemicznie3,4,5. Uważa się, że duża rodzina międzykomórkowych peptydów sygnałowych bierze udział w różnych zdarzeniach fizjologicznych podczas cyklu życia owadów6,7. Większość z tych peptydów działa na receptory sprzężone z białkiem G (GPCR), chociaż konkretne GPCR były początkowo trudne do zidentyfikowania przy użyciu konwencjonalnych metod. Publikacja sekwencji całego genomu Drosophila 8 była przełomem, który umożliwił identyfikację bioaktywnych peptydów Drosophila na podstawie ich homologii do tych występujących u innych owadów. Ponadto zidentyfikowano receptory dla kilku peptydów na podstawie GPCR przewidywanych w genomie za pomocą testów wiązania ligandów GPCR opartych na hodowli komórkowych. Następnie, analizy ekspresji pozwoliły przewidzieć szlaki między narządami wywoływane przez te peptydy i receptory. Warto zauważyć, że wiele z domniemanych receptorów peptydowych ulega ekspresji w mózgu, co sugeruje, że mózg jest głównym celem hormonów peptydowych9. Co więcej, zaawansowane narzędzia genetyczne u Drosophila przyczyniły się do identyfikacji fizjologicznych ról kombinacji peptyd-GPCR. Na przykład binarne systemy transkrypcyjne oparte na GAL4 i LexA umożliwiają knockdown lub nadekspresję genów w sposób kontrolowany przestrzennie i czasowo. GAL4, czynnik transkrypcyjny zidentyfikowany u drożdży, wiąże się ze specyficzną sekwencją cis-regulatorową zwaną sekwencją aktywacji upstream (UAS). W systemie GAL4/UAS linia sterująca zapewnia specyficzną tkankowo lub specyficzną dla etapu ekspresję GAL4, a linia odpowiadająca przenosi UAS przed genem będącym przedmiotem zainteresowania lub konstruktem w celu sterowania ekspresją shRNA. System LexA/LexAop opiera się na podobnym mechanizmie. Analizy fenotypowe zwierząt z peptydowym knockdownem specyficznym dla tkanek i GPCR-knockdown mogą ujawnić informacje na temat trybu i miejsca działania sygnalizacji peptyd-GPCR. Jednak wnioski, do których można dojść wyłącznie na podstawie danych genetycznych, są ograniczone. Z drugiej strony, gdy domniemany cel określonego hormonu peptydowego zostanie zawężony do typu tkanki lub komórki, obrazowanie wapnia ex vivo w eksplantatach narządów może być wykorzystane do wyjaśnienia komunikacji między narządami, w której pośredniczy sygnalizacja peptyd-GPCR. Po aktywacji GPCR sprzężonego z Gq, wewnątrzkomórkowe stężenie Ca2 + jest zwiększone z powodu uwolnienia Ca2 + z klasy ER10. W mózgu aktywacja neuronalna podnosi również wewnątrzkomórkowy poziom Ca2+. Takie wzrosty Ca2+ mogą być wykryte przez czujnik wapnia GCaMP, który ulega zmianom konformacyjnym w obecności Ca2+, co skutkuje emisją fluorescencji11.
W tym artykule opisana jest metoda obrazowania wapnia z wykorzystaniem eksplantatów mózgu Drosophila. Aby przetestować zdolność peptydu do aktywacji określonych neuronów, peptyd testowy nakłada się na eksplantat mózgu wyrażający GCaMP, a zmiany fluorescencji są monitorowane za pomocą mikroskopii konfokalnej. Udział GPCR jest następnie potwierdzany przez wykonanie tego samego testu przy użyciu zmutowanego mózgu pozbawionego GPCR. To połączenie obrazowania i genetyki dostarcza precyzyjnych informacji na temat komunikacji między narządami za pomocą peptydów-GPCR. Omówiono również możliwe modyfikacje i zastosowania tego protokołu.

<table><tbody><tr><td>Pręt wolframowy</td><td>A-M systems, Sequim, WA, USA</td><td>717000</td><td></td></tr><tr><td>Blu Tack</td><td>Bostik, Paryż, Francja</td><td>3049100</td><td>Kleje wielokrotnego użytku podobne do szpachli</td></tr><tr><td>Szkiełko zegarka, kwadrat, 1 5/8 w</td><td>Carolina Biological Supply Company, Burlington, NC, USA</td><td>742300</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>TAKARA Bio Inc., Kusatsu, Shiga, Japonia</td><td>T900</td><td>Fosforanowane sole buforowe</td></tr><tr><td>CCHa2</td><td>SCRUM Inc., Tokio, Japonia</td><td></td><td>Peptyd syntetyzowany w kusku</td></tr><tr><td>Ghrerin</td><td>Peptide institute Inc., Osaka, Japonia</td><td>4372-s</td><td></td></tr><tr><td>Nociceptin</td><td>Peptide institute Inc., Osaka, Japonia</td><td>4313-v</td><td></td></tr><tr><td>Axio Imager A2</td><td>Carl Zeiss, Oberkochen, Niemcy</td><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Axio Imager A2</td></tr><tr><td>Obiektyw W N-Achroplan 20x/0,5 M27</td><td>Carl Zeiss, Oberkochen, Niemcy</td><td>420957-9900-000</td> soczewka <td>obiektywowa zanurzająca w wodzie</td></tr><tr><td>P-725 Skaner obiektywowy PIFOC o dużym zasięgu przesuwu</td><td>Physik Instrumente GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Niemcy</td><td>Nie dotyczy</td> Skaner konfokalny <td>aktywowany piezoelektrycznie</td></tr><tr><td>Skaner konfokalny CSU-W1</td><td>Yokogawa Electric Corporation, Tokio, Japonia</td><td>CSU-W1</td><td>głowica konfokalna z wirującym</td></tr><tr><td>dyskiem ImagEM C9100-13</td><td>Hamamatsu Photonics, Sizuoka, Japonia</td><td>Kamera C9100-13</td><td>EM-CCD</td></tr><tr><td>OBIS 488 nm LS 60 mW</td><td>Koherent, Santa Clara, CA, USA</td><td>1178770</td><td>Laser 488 nm</td></tr><tr><td>488/568/647 nm Rozdzielacz wiązki Yokogawa</td><td>Semrock, Rochester, NY, USA</td><td>Di01-T405/488/568/647-13x15x0,5</td><td>dichroiczny rozdzielacz wiązki</td></tr><tr><td>528/38 nm Jednozakresowy filtr pasmowo-przepustowy BrightLine</td><td>Semrock, Rochester, NY, USA</td><td>FF01-528/ Filtr emisji 38-25</td><td></td></tr> <tr><td>i mikro; Kierownik</td><td>Open Imaging, Inc.</td><td>Nie</td><td>dotyczy https://micro-manager.org</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>U. S. National Institutes of Health</td><td>Nie dotyczy</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr> <tr><td>TurboReg</td><td>Philippe Th&eacute; venaz, Grupa Obrazowania Biomedycznego, Szwajcarski Federalny Instytut Technologii Lozanna</td><td>N/A</td><td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/</td></tr></tbody></table>

ex vivo obrazowanie wapnia do wizualizacji reakcji mózgu na sygnalizację endokrynologiczną u drosophila

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Komunikacja między narządami za pomocą sygnalizacji endokrynologicznej, na przykład z peryferii do mózgu, jest niezbędna do utrzymania homeostazy. Jako zwierzę modelowe do badań endokrynologicznych, Drosophila melanogaster, który dysponuje zaawansowanymi narzędziami genetycznymi i informacjami o genomie, jest coraz częściej wykorzystywany. W artykule opisano metodę obrazowania wapnia eksplantatów mózgu Drosophila. Metoda ta umożliwia wykrycie bezpośredniej sygnalizacji hormonu do mózgu. Powszechnie wiadomo, że wiele hormonów peptydowych działa poprzez receptory sprzężone z białkiem G (GPCR), których aktywacja powoduje wzrost wewnątrzkomórkowego stężeniaCa2+. Aktywacja neuronalna podnosi również wewnątrzkomórkowy poziom Ca2 +, zarówno z napływu Ca2 +, jak i uwalniania Ca2 + przechowywanego w retikulum endoplazmatycznym (ER). Czujnik wapnia, GCaMP, może monitorować te zmianyCa2+. W tej metodzie GCaMP ulega ekspresji w neuronach będących przedmiotem zainteresowania, a mózg larwy wykazującej ekspresję GCaMP jest preparowany i hodowany ex vivo. Peptyd testowy jest następnie nakładany na eksplantat mózgu, a zmiany fluorescencyjne w GCaMP są wykrywane za pomocą mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem wyposażonego w kamerę CCD. Za pomocą tej metody można przetestować dowolną cząsteczkę rozpuszczalną w wodzie, a różne zdarzenia komórkowe związane z aktywacją neuronalną można zobrazować za pomocą odpowiednich wskaźników fluorescencyjnych. Ponadto, modyfikując komorę obrazowania, metoda ta może być stosowana do obrazowania innych narządów Drosophila lub narządów innych zwierząt.

Zastosowano ten protokół do zbadania aktywacji komórek produkujących insulinę (IPC) w mózgu pod wpływem hormonu peptydowego CCHa2. Komórki IPC w mózgu typu dzikiego oznakowano wskaźnikiem GCaMP6s, wykorzystując kombinację dilp2-GAL412 (dar od dr. Rulifsona) oraz UAS-GCaMP6s13 (dar od dr Kima). Eksplanty mózgów larwalnych poddano działaniu syntetycznego peptydu CCHa2, a fluorescencję GCaMP6s rejestrowano w czasie rzeczywisty...

Ten artykuł opisuje protokół obrazowania ex vivo wapnia mózgu Drosophila. W tej metodzie do buforu można zastosować naturalne lub syntetyczne związki, aby przetestować ich zdolność do aktywacji określonych neuronów w mózgu.

Ex vivo Obrazowanie wapnia do wizualizacji reakcji mózgu na sygnalizację endokrynologiczną u Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie endokrynologii, a także w dziedzinie neuronauki, takie jak nasze badania mające na celu przegląd reakcji mózgu na sygnały endokrynologiczne. Główną zaletą tej techniki jest to, że można badać bezpośredni wpływ sygnałów endokrynologicznych na mózg oddzielony od innych tkanek. Aby rozpocząć tę procedurę, użyj kleszczy, aby podrapać dolną środkową część plastikowego naczynia hodowlanego, aby stworzyć wgniecenie ułatwiające montaż brzusznego zwoju mózgu larwy po sekcji.Za pomocą wykałaczki umieść małą kroplę kleju superglue po obu stronach wgniecenia i przymocuj pręt wolframowy do kleju. Następnie, używając małego kawałka kleju wielokrotnego użytku przypominającego szpachlę, wykonaj okrągłą ścianę otaczającą wgłębienie. Aby wypreparować mózg larwy, 90 do 120 godzin po złożeniu jaj zbierz larwy i umyj je co najmniej trzy razy wodą destylowaną, aby usunąć przylegające resztki jedzenia.Następnie umieść larwę na kwadratowym półtoracalowym szkiełku zegarkowym wypełnionym lodowatym PBS. Użyj kleszczy, aby delikatnie chwycić środkową część larwy. Użyj innej pary kleszczy, aby delikatnie chwycić i pociągnąć haczyki do ust, aby oddzielić przednią część larwy zawierającej mózg od reszty ciała.Następnie przytrzymaj przedni koniec kleszczami i odwróć larwę na lewą stronę. Usuń obce tkanki przyczepione do mózgu, takie jak wyimaginowane dyski, ciała tłuszczowe i gruczoł pierścieniowy. Delikatnie oddziel mózg od części ustnych.Następnie nanieść 200 mikrolitrów PBS na wnętrze przygotowanego wcześniej w komorze obrazowania pierścienia klejącego. Delikatnie zassać wypreparowany mózg za pomocą PBS do pipety Pasteura i przenieść go do komory obrazowania. W komorze obrazowania chwyć włókna mięśniowe wystające ze zwojów brzusznych i delikatnie włóż mózg do wgłębienia pod drutem wolframowym.Następnie pociągnij drut wolframowy lekko do góry, aby ustawić mózg we właściwej pozycji do obrazowania. Aby uzyskać obrazy fluorescencji wapnia, umieść komorę obrazowania zawierającą eksplant mózgu pod mikroskopem. Opuść soczewkę obiektywu, aż dotknie PBS, a przy jasnym oświetleniu pola ustaw mózg i ustaw go w ostrości.Przełącz się na światło fluorescencyjne i dostosuj ostrość do komórek oznaczonych sukcesem GCaMP. Rozpocznij akwizycję z szybkością 250 ms/klatkę, w rozdzielczości 512 x 512 pikseli w trybie chłodzenia wodą. Następnie dostosuj czas ekspozycji, aby uzyskać wartości fluorescencji w zakresie dynamicznym kamery CCD, ale nie mniejsze niż 1000 dowolnych jednostek z 16-bitowymi obrazami.Po określeniu parametrów obrazowania wykonuj obrazy przez minutę przed podaniem peptydu, aby wykryć natężenie sygnału wyjściowego. Następnie należy bezpośrednio nałożyć peptyd testowy, pipetując 100 mikrolitrów przygotowanego roztworu peptydu do kąpieli larwalnej. Rejestruj pomyślną emisję GCaMP przez kilka minut.Aby przeanalizować dane, otwórz oprogramowanie analityczne i użyj pierwszej klatki, która znajdowała się przed zastosowaniem peptydów, jako obrazu referencyjnego. Następnie wybierz Wtyczki, TurboReg. Wybierz plik obrazu szeregowego jako źródło, a obraz referencyjny jako element docelowy.Następnie sprawdź Sztywny korpus i Dokładny odpowiednio dla metody przetwarzania i jakości. Następnie kliknij przycisk Batch (Partia), aby rozpocząć przetwarzanie obrazu. Wybierz wiele obszarów zainteresowania za pomocą Analizy, Narzędzi, Menedżera zwrotu z inwestycji w zasobniku obrazów.Następnie zmierz intensywność pikseli, klikając Więcej, Multi Measure, OK w oknie Menedżer ROI. W tym eksperymencie mózg typu dzikiego był narażony na CCHa2, grelinę i nocyceptynę, podczas gdy mózg z mutacją receptora CCHa2 był narażony na CCHa2. Sygnały GCaMP6 w komórkach produkujących insulinę wykryto za pomocą mikroskopii konfokalnej z prędkością 250 ms/klatkę, a oto nieruchome obrazy wybranych punktów czasowych.Wykreślono stosunek zmiany intensywności ROI do wyjściowej intensywności sygnału w każdym punkcie czasowym. Zwroty akcji były ustawiane na ciałach komórek, które zostały wykryte w tej samej płaszczyźnie ogniskowej. Linie ciągłe wskazują średnią z pięciu do 10 próbek, a linie przerywane oznaczają górną i dolną granicę błędu standardowego średniej.Zacienione obszary wskazują zmienność sygnałów w eksperymentach. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu godziny, jeśli jest odpowiednio uformowana. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o szybkim przygotowaniu próbki mózgu, aby uniknąć jej uszkodzenia.Procedurę tę można połączyć z genetyką, aby uzyskać odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak specyficzność receptorów. System zastosowany w tym protokole jest łatwy w przygotowaniu i wielokrotnego użytku. W związku z tym protokół ten będzie przydatny do, np. badań przesiewowych.Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom z dziedziny endokrynologii i neurobiologii do zbadania sieci hormonalnych, które kontrolują funkcję mózgu u Drosophila.

ex-vivo-calcium-imaging-for-visualizing-brain-responses-to-endocrine

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opisujemy uznaną technikę pomiaru i analizy odpowiedzi wapniowych wywołanych zapachami w płacie antennym żywych Drosophila melanogaster.

Obrazowanie wapniowe odpowiedzi wywołanych zapachami w płacie antennym Drosophila

Ten film opisuje obrazowanie in vivo wapnia w neuronach Drosophila za pomocą GCaMP. Prezentowany klip protokołu pokazuje, jak rejestrować zmiany we fluorescencji GCaMP z neuronów ciała grzyba podczas eksperymentu kondycjonowania węchowego.

Drosophila In Vivo (Drosophila) in vivo (Drosophila) Obrazowanie wapnia: metoda funkcjonalnego obrazowania aktywności neuronalnej

Ten film demonstruje metodę obrazowania wapnia in vivo za pomocą synaptycznie zlokalizowanych czujników wapnia u muszek. Przedstawia etapy przygotowania muszek do mikroskopii, przeprowadzania kondycjonowania węchowego i wizualizacji napływu wapnia wywołanego zapachem.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia za pomocą synaptycznie zlokalizowanych czujników wapnia u Drosophila melanogaster

Źródło: Ishimoto, H. et. al.,, Obrazowanie wapnia ex vivo do wizualizacji reakcji mózgu na sygnalizację endokrynologiczną u Drosophila. J. Vis. exp. (2018) Ten film przedstawia obrazowanie wapnia do badaniaDrosophila reakcje mózgu na neuropeptydy. Neurony wyrażające fluorescencyjny wskaźnik wapnia ujawniają wewnątrzkomórkową dynamikę wapnia i funkcjonalne odpowiedzi na cząsteczki sygnałowe.

Obrazowanie wapnia ex vivo w celu zbadania reakcji mózgu Drosophila na neuropeptydy

Źródło: Lark, A. R., et. al., Podejście do funkcjonalnego obrazowania mózgu in vivo oparte na bioluminescencyjnym wskaźniku wapnia GFP-aequorin. J. Vis. exp. (2016)Ten film przedstawia obrazowanie dynamiki wapnia w czasie rzeczywistym za pomocą Greena bioluminescencja białka fluorescencyjnego i aequoryny w głębokich strukturach mózgu .

Obrazowanie bioluminescencyjne do badania stanów przejściowych wapnia w strukturach mózgu Drosophila

Przednie nogi i trąbka Drosophila zawierają bogaty repertuar smakowych neuronów czuciowych. W tym artykule przedstawiono metodę wykorzystującą obrazowanie wapnia do pomiaru fizjologicznych odpowiedzi neuronów czuciowych w przedniej nodze i trąbce żywych much po egzogennym zastosowaniu feromonu smakowego.

Pomiar fizjologicznych reakcji neuronów czuciowych Drosophila na feromony lipidowe za pomocą obrazowania wapnia na żywo

Tutaj prezentujemy nowatorskie podejście do obrazowania Ca2+ za pomocą bioluminescencyjnego reportera. Podejście to wykorzystuje stopiony konstrukt GFP-aequorin, który wiąże się z Ca2+ i emituje światło, eliminując potrzebę wzbudzenia światła. Co istotne, metoda ta pozwala na długie, ciągłe obrazowanie, dostęp do głębokich struktur mózgu i wysoką rozdzielczość czasową.

In vivo (in vivo) Funkcjonalne obrazowanie mózgu oparte na bioluminescencyjnym wskaźniku wapnia GFP-aequorin

Ten artykuł opisuje adaptowalny protokół ex vivo do wizualizacji Ca2+ podczas aktywacji jaj u Drosophila.

Obrazowanie wapnia u Drosophila podczas aktywacji jaj

Tutaj prezentujemy protokół, za pomocą którego można wizualizować wapń pre- i/lub postsynaptyczny w kontekście uczenia się i zapamiętywania Drosophila. Obrazowanie wapnia in vivo przy użyciu synaptycznie zlokalizowanych czujników wapnia jest połączone z klasycznym paradygmatem warunkowania węchowego, dzięki czemu można określić plastyczność synaptyczną leżącą u podstaw tego typu uczenia się asocjacyjnego.

Optyczne obrazowanie wapnia in vivo plastyczności synaptycznej indukowanej uczeniem się u Drosophila melanogaster

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania ex vivo wapnia u dorosłych Drosophila wykazujących ekspresję GCaMP6 w celu monitorowania aktywności epileptiformalnej. Protokół stanowi cenne narzędzie do badania zdarzeń moczowych u dorosłych Drosophila poprzez obrazowanie wapnia ex vivo, co pozwala na zbadanie potencjalnych mechanizmów padaczki na poziomie komórkowym.

Ex vivo Obrazowanie wapnia w modelu padaczki Drosophila

Przedstawiamy protokoły obrazowania wapnia dla larwalnego neuronu węchowego Drosophila , wykorzystując miejscowy klej tkankowy do unieruchomienia. Ta metoda zwiększa stabilność, ułatwiając wiarygodne eksperymenty in vivo i ex-vivo . Niestandardowe skrypty R analizują sygnały wapnia, zapewniając efektywną platformę do szczegółowych badań neurofizjologicznych.

Obrazowanie wapnia in vivo i ex vivo neuronu obwodu węchowego u larwy Drosophila melanogaster w trzecim stadium

Poznaj metodę obrazowania wapnia ex vivo w mózgu Drosophila do badania odpowiedzi neuronów na sygnały endokrynologiczne. Technika umożliwia analizę aktywacji neuronalnej i badanie hormonalnych sieci mózgowych.

Ex vivo Obrazowanie wapnia do wizualizacji reakcji mózgu na sygnalizację endokrynologiczną u Drosophila

Przeglądaj więcej filmów