Name: Analiza obliczeniowa linii zarodkowej Caenorhabditis elegans w celu zbadania rozmieszczenia jąder, białek i cytoszkieletu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Poznaj zautomatyzowaną analizę linii zarodkowej Caenorhabditis elegans w celu badania rozmieszczenia jąder, białek i cytoszkieletu. Ta metoda skraca czas analizy, zwiększa liczbę próbek i eliminuje błędy ludzkie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Monash Microimaging za wsparcie techniczne. Niektóre szczepy zostały dostarczone przez Caenorhabditis Genetics Center, które jest finansowane przez Biuro Programów Infrastruktury Badawczej NIH (P40 OD010440). Prace te były wspierane przez Monash University Biomedicine Discovery Fellowship, NHMRC Project Grant (GNT1105374), NHMRC Senior Research Fellowship (GNT1137645) oraz stypendium veski innovation fellowship: VIF 23 dla Rogera Pococka.

1. Przygotowanie i hodowla robaków
Uwaga: Zapoznaj się z Tabelą Materiałów, aby uzyskać wszystkie informacje o produkcie.
<ol>
	<li>OP50 Kultura Escherichia coli: hodowla bakterii OP50 w bulionie lizogenicznym (LB) (1% trypton, 0,5% drożdże, 0,5% NaCl, pH 7,0) przez noc w temperaturze 37 °C bez antybiotyków.</li>
	<li>Wysiewaj 400 μl bakterii OP50 na płytki pożywki wzrostowej nicieni (NGM) (1,5 g NaCl, 8,5 g agaru, 1,25 g peptonu, 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 5 mg / ml cholesterolu w etanolu, 1 ml 1 MMgSO4 i 25 ml 1 M buforu KPO4) i susz bakterie na powietrzu przez 48 godzin.</li>
	<li>Zbierać robaki na wysiewanych płytkach NGM i inkubować w temperaturze 15 °C lub 20 °C.
	<ol>
		<li>W celu analizy dorosłej hermafrodytycznej linii zarodkowej należy pobrać dobrze odżywione robaki L4 na trawnik bakteryjny i inkubować przez noc w temperaturze 20 °C.</li>
		<li>W celu oceny liczby plemników u hermafrodytów należy inkubować robaki L4 w temperaturze 20 °C przez 12 godzin, aż robaki osiągną poziom L4/dorosłego osobnika. Aby zsynchronizować robaki z etapem L4, przygotuj jaja, zbierając dorosłe robaki z dużą ilością jaj w roztworze wybielacza (1 M NaOH i wybielacz w stosunku 1:1). Pozwól jajom się wykluć i wybierz zwierzęta L4 do eksperymentu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować teflonowe szkiełka mikroskopowe, umieszczając 25 μl roztworu poli-L-lizyny na szkiełku podstawowym i dobrze rozprowadzając roztwór za pomocą końcówki do pipety. Po usunięciu nadmiaru poli-L-lizyny ręcznikiem papierowym, pozostawić szkiełka do wyschnięcia na powietrzu i inkubować szkiełka w temperaturze 65 °C przez 15 - 20 minut.</li>
</ol>
2. Sekcja i barwienie linii zarodkowej6,13
<ol>
	<li>Umieść 10 μl 0,01% tetraizolu (środka znieczulającego) na szkiełku nakrywkowym o średnicy 22 mm × 22 mm i wybierz do niego jednodniowe dorosłe robaki.</li>
	<li>Wyciąć robaka na ogonie, gdy zostanie uspokojony za pomocą strzykawki (5 ml) i igły (24" x 1"), i upewnić się, że linia zarodkowa nie jest uszkodzona. 
	UWAGA: Sekcję należy przeprowadzić, zanim robak zostanie całkowicie sparaliżowany, tak aby podciśnienie w robaku i ruch robaka wspomagały wyrzucenie linii zarodkowej. W celu oceny nasienia należy podjąć środki ostrożności, aby nie uszkodzić spermateki przez igłę podczas sekcji. Unikaj dotykania igły linii zarodkowej, z wyjątkiem punktu rozwarstwienia za spermateką. W przypadku przerwania komory linii zarodkowej lub zaobserwowania jakiejkolwiek wydzieliny z linii zarodkowej, linia zarodkowa nie powinna być wykorzystywana do analizy.</li>
	<li>Umieścić odwrócone szkiełko nakrywkowe na szkiełku pokrytym poli-L-lizyną, utrzymując rozciętą linię zarodkową na szkiełku.</li>
	<li>Usuń nadmiar płynu spod szkiełka nakrywkowego, umieszczając papierową wieżę w rogu szkiełka nakrywkowego, a następnie umieść szkiełko w ciekłym azocie na 1 minutę. Szybko usuń szkiełko nakrywkowe za pomocą igły z liniami zarodkowymi na szkiełku.</li>
	<li>Przenieść szkiełka do metanolu o temperaturze -20 °C przez 30 - 60 s w komorze, a następnie inkubować przez 30 minut w świeżo przygotowanym roztworze utrwalającym (1x sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS) zawierająca 0,08 M HEPES pH 6,9, 1,6 mMMgSO4, 0,8 mM glikolu etylenowego-bis(eter beta-aminoetylowy)-N,N,N',N'--tetraoctowy (EGTA) i 3,7% paraformaldehydu) w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyj szkiełka, umieszczając je w komorze zawierającej 1x PBS, pH 7,4 z 0,1% Tween-20 na 10 minut. Powtórz ten krok raz.</li>
	<li>Zablokować linie zarodkowe za pomocą 30 μl roztworu blokującego (30% koziej surowicy przygotowanej przez dodanie 900 μl koziej surowicy do 1700 μl destylowanegoH2Oi 300 μL 10x PBS) w wilgotnej komorze przygotowanej przez umieszczenie mokrego ręcznika papierowego w plastikowym pudełku w temperaturze pokojowej na 30 min.</li>
	<li>Do każdej próbki dodać 50 μl roztworu przeciwciała REC-8 przygotowanego w 30% surowicy koziej w stosunku 1:300. Inkubować przez noc w temperaturze 4°C.</li>
	<li>Umyj szkiełka, umieszczając je w komorze zawierającej 1x PBS z 0,1% Tween-20 na 10 minut. Powtórz ten krok raz i usuń nadmiar płynu, kładąc ręcznik papierowy w rogu szkiełka.</li>
	<li>Przygotuj roztwór przeciwciała drugorzędowego, rozcieńczając sprzężone przeciwciało drugorzędowe z zielonym fluoroforem (długość fali emisji 488 nm) (1:1000), falloidyną (barwienie aktyną, 1:4000) i DAPI (barwienie DNA, 1:4000) w 30% normalnej surowicy koziej.</li>
	<li>Dodać 50 μl roztworu przeciwciał drugorzędowych do szkiełka.</li>
	<li>Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyj szkiełka dwukrotnie, umieszczając je w komorze zawierającej 1x PBS z 0,1% Tween-20 na 10 minut. Zetrzyj nadmiar płynu.</li>
	<li>Dodać 30 μl odczynnika utrwalającego na szkiełko podstawowe i umieścić na nim szkiełko nakrywkowe o średnicy 12 mm2 x 1,5 μm i wysuszyć szkiełka w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
</ol>
3. Mikroskopia konfokalna
<ol>
	<li>Włącz mikroskop konfokalny, lasery, skaner rezonansowy i oprogramowanie mikroskopu konfokalnego. Umieść szkiełka z zabarwionymi liniami zarodkowymi na uchwycie szkiełek nad obiektywem 63X.</li>
	<li>Zlokalizuj linię zarodkową, skup się na górnej części linii zarodkowej i oznacz ją za pomocą oprogramowania mikroskopu konfokalnego. Podobnie skup się na dolnej części linii zarodkowej i zaznacz ją, aby ustalić całkowitą grubość linii zarodkowej.</li>
	<li>Zobrazuj całą linię zarodkową, definiując grubość każdego wycinka do 0,5 μm. Zaznacz całą linię zarodkową i rozpocznij akwizycję. Zeskanuj każdy wycinek 8 razy i uśrednij wartości, aby poprawić jakość obrazu. Skaner rezonansowy pozwoli na szybkie skanowanie, aby uniknąć wybielania podczas obrazowania. Jeśli mikroskop nie jest wyposażony w skaner rezonansowy, zmniejsz liczbę skanów do czterech, aby uniknąć wybielania.</li>
</ol>
4. Analiza liczby i rozmieszczenia jąder po obrazowaniu
Uwaga: Patrz Rysunek Uzupełniający 1, aby zobaczyć zrzuty ekranu używanych narzędzi i przycisków programowych.
<ol>
	<li>Zaimportuj obraz do Imaris 8.4.1 lub nowszej wersji oprogramowania.</li>
	<li>Zdefiniuj region mitotyczny, strefę przejściową, region mejotyczny, region oocytów i spermatekę linii zarodkowej, identyfikując morfologię jądrową w każdym regionie.</li>
	<li>Użyj przycisku funkcyjnego powierzchni (rysunek uzupełniający 1A) w oprogramowaniu, aby wybrać obszar zainteresowania.</li>
	<li>Anuluj kreatora automatycznego tworzenia powierzchni i ręcznie narysuj obszar zainteresowania na pierwszym i ostatnim wycinku obrazu ze stosu trójwymiarowego.</li>
	<li>Kliknij przycisk Utwórz powierzchnię. 
	UWAGA: Oprogramowanie automatycznie otworzy stosy między pierwszym a ostatnim stosem.</li>
	<li>Zamaskuj wszystkie kanały z wyjątkiem DAPI, klikając przycisk Maskuj kanał (Rysunek uzupełniający 1B-C).</li>
	<li>Zdefiniuj parametry wielkości jądra za pomocą przycisku funkcji punktowej (rysunek uzupełniający 1A). Dla obszaru mitotycznego zdefiniuj średnicę XY równą 2 μm, pozostawiając niezdefiniowaną średnicę Z. Dla strefy przejściowej należy zdefiniować średnicę XY równą 2 μm i średnicę Z jako 1,5 μm. (Rysunek uzupełniający 1D). 
	UWAGA: Rozwiąż problemy ze średnicami zgodnie z powiększeniem i specyfikacją mikroskopu. W przypadku obecnego protokołu zastosowany obiektyw wynosił 63X i zapewniał dodatkowe 1,70-krotne powiększenie podczas obrazowania. Jeśli obiektyw zmieni się, na przykład 40X, średnice powinny zostać odpowiednio zmienione. Rozwiązywanie problemów należy wykonywać z liniami zarodkowymi typu dzikiego, aby ustalić prawidłowe parametry. Region mitotyczny ramienia linii zarodkowej typu dzikiego ma około 250 jąder. Aby osiągnąć tę wartość, należy zmodyfikować średnicę. Użyj co najmniej 15 linii zarodkowych, aby określić optymalną wartość średnicy. Podobne podejście powinno być stosowane do kalibracji strefy przejściowej (150 - 170 jąder) i regionu mejotycznego (600 - 700 jąder).</li>
	<li>Ogranicz wykrywalność plamek, określając minimalny próg (rysunek uzupełniający 1E). Użyj barwionych linii zarodkowych typu dzikiego DAPI, aby ustalić minimalny próg poprzez zwiększanie minimalnego trójwymiarowego progu renderowania, aż pierwsza plamka pojawi się poza linią zarodkową.</li>
	<li>Zapisz obraz i uzyskaj liczbę jąder z tabeli wygenerowanej automatycznie przez oprogramowanie. Eksportuj obrazy jako pliki TIF.</li>
</ol>
5. Analiza po obrazowaniu w celu oceny liczby plemników i chromosomów
<ol>
	<li>Wykonaj renderowanie trójwymiarowe, wybierając spermatekę jako obszar zainteresowania. Aby wykryć każdy plemnik, zdefiniuj średnicę plamki w zakresie od 0,75 do 1,0 μm dla osi X i Y, podczas gdy średnica Z pozostaje niezdefiniowana. Użyj przycisku funkcyjnego spotów, jak pokazano na rysunku uzupełniającym 1.</li>
	<li>Odejmij tło, zaznaczając pole odejmij tło i korzystając z wartości korekcji tła obliczonych przez oprogramowanie (Rysunek uzupełniający 1D). 
	UWAGA: Oprogramowanie Imaris najpierw wybiera punkty o wysokiej intensywności, dlatego efekt tła jest minimalny, o ile istnieje znaczna różnica między obszarem zainteresowania a tłem. Drugą metodą jest ręczne zdefiniowanie korekcji tła, gdzie można podać odpowiednie wartości dla tła. Ręczna korekcja tła będzie odpowiednia, jeśli intensywność niezależnych próbek wymaga porównania.</li>
	<li>Dostosuj trójwymiarowy próg renderowania, aby wykryć wszystkie plemniki barwione DAPI w spermatece (rysunek uzupełniający 1E).</li>
	<li>W przypadku zliczania chromosomów należy zdefiniować średnicę plamki <0,75 μm dla osi X i Y przed opracowaniem modeli trójwymiarowych.</li>
	<li>Zapisz obraz i wyeksportuj go jako plik TIF.</li>
</ol>
6. Analiza po obrazowaniu w celu rekonstrukcji cytoszkieletu linii zarodkowej
<ol>
	<li>Zidentyfikuj obszar zainteresowania w linii zarodkowej i zamaskuj wszystkie kanały z wyjątkiem falloidyny, klikając przycisk Maskuj kanały.</li>
	<li>Zdefiniuj szczegół powierzchni o wielkości 0,25 μm za pomocą przycisku funkcyjnego powierzchni (rysunek uzupełniający 1). 
	Uwaga: Oznacza to, że każde 0,25 μm zostanie przekształcone w modele trójwymiarowe. Szczegółowość powierzchni może być stała dla dowolnego obszaru linii zarodkowej, w którym na każde 0,25 μm zostanie utworzony trójwymiarowy model powierzchni. Jednak w przypadku obszaru oocytów szczegółowość powierzchni można zwiększyć do 0,35 - 0,5 μm ze względu na obecność dobrze zdefiniowanych włókien aktynowych w tym regionie.</li>
	<li>Odejmij tło, zaznaczając pole odejmij tło i używając wartości korekcji tła obliczonych przez oprogramowanie (rysunek uzupełniający 1D).</li>
	<li>Dostosuj próg renderowania trójwymiarowego w zależności od konstrukcji wymagającej analizy (rysunek uzupełniający 1E).</li>
	<li>Zapisz wywołany obraz trójwymiarowy i wyeksportuj jako plik TIF.</li>
</ol>

<ol><li>Hubbard, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+germ+line%3A+a+model+for+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans germ line: a model for stem cell biology.</a> Dev Dyn. 236 (12), 3343-3357 (2007).</li>
<li>Joshi, P. M., Riddle, M. R., Djabrayan, N. J., Rothman, J. H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20419785">Caenorhabditis elegans as a model for stem cell biology.</a> Dev Dyn. 239 (5), 1539-1554 (2010).</li>
<li>Kershner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+stem+cells+and+their+regulation+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Germline stem cells and their regulation in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Adv Exp Med Biol. 786, 29-46 (2013).</li>
<li>Byrd, D. T., Knobel, K., Affeldt, K., Crittenden, S. L., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DTC+niche+plexus+surrounds+the+germline+stem+cell+pool+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A DTC niche plexus surrounds the germline stem cell pool in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 9 (2), 88372(2014).</li>
<li>Kimble, J., Crittenden, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controls+of+germline+stem+cells%2C+entry+into+meiosis%2C+and+the+sperm%2Foocyte+decision+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Controls of germline stem cells, entry into meiosis, and the sperm/oocyte decision in Caenorhabditis elegans.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 405-433 (2007).</li>
<li>Hansen, D., Hubbard, E. J., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-pathway+control+of+the+proliferation+versus+meiotic+development+decision+in+the+Caenorhabditis+elegans+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Multi-pathway control of the proliferation versus meiotic development decision in the Caenorhabditis elegans germline.</a> Dev Biol. 268 (2), 342-357 (2004).</li>
<li>Crittenden, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+RNA-binding+protein+controls+germline+stem+cells+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A conserved RNA-binding protein controls germline stem cells in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 417 (6889), 660-663 (2002).</li>
<li>Eckmann, C. R., Crittenden, S. L., Suh, N., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GLD-3+and+control+of+the+mitosis%2Fmeiosis+decision+in+the+germline+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">GLD-3 and control of the mitosis/meiosis decision in the germline of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 168 (1), 147-160 (2004).</li>
<li>Schumacher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+repression+of+C.+elegans+p53+by+GLD-1+regulates+DNA+damage-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Translational repression of C. elegans p53 by GLD-1 regulates DNA damage-induced apoptosis.</a> Cell. 120 (3), 357-368 (2005).</li>
<li>McMullen, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macro-level+modeling+of+the+response+of+C.+elegans+reproduction+to+chronic+heat+stress%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">Macro-level modeling of the response of C. elegans reproduction to chronic heat stress.</a> PLoS Comput Biol. 8 (1), 1002338(2012).</li>
<li>Hubbard, E. J., Korta, D. Z., Dalfo, D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22872476">Physiological control of germline development.</a> Adv Exp Med Biol. 757, 101-131 (2013).</li>
<li>Wolke, U., Jezuit, E. A., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin-dependent+cytoplasmic+streaming+in+C.+elegans+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Actin-dependent cytoplasmic streaming in C. elegans oogenesis.</a> Development. 134 (12), 2227-2236 (2007).</li>
<li>Jones, A. R., Francis, R., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GLD-1%2C+a+cytoplasmic+protein+essential+for+oocyte+differentiation%2C+shows+stage-+and+sex-specific+expression+during+Caenorhabditis+elegans+germline+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">GLD-1, a cytoplasmic protein essential for oocyte differentiation, shows stage- and sex-specific expression during Caenorhabditis elegans germline development.</a> Dev Biol. 180 (1), 165-183 (1996).</li>
<li>Hasegawa, E., Karashima, T., Sumiyoshi, E., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+CPB-3+interacts+with+DAZ-1+and+functions+in+multiple+steps+of+germline+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">C. elegans CPB-3 interacts with DAZ-1 and functions in multiple steps of germline development.</a> Dev Biol. 295 (2), 689-699 (2006).</li>
<li>Austin, J., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((glp-1+is+required+in+the+germ+line+for+regulation+of+the+decision+between+mitosis+and+meiosis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">glp-1 is required in the germ line for regulation of the decision between mitosis and meiosis in C. elegans.</a> Cell. 51 (4), 589-599 (1987).</li>
<li>Berry, L. W., Westlund, B., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ-line+tumor+formation+caused+by+activation+of+glp-1%2C+a+Caenorhabditis+elegans+member+of+the+Notch+family+of+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Germ-line tumor formation caused by activation of glp-1, a Caenorhabditis elegans member of the Notch family of receptors.</a> Development. 124 (4), 925-936 (1997).</li>
<li>Fox, P. M., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Germline+Stem+Cell+Differentiation+Following+Loss+of+GLP-1+Notch+Activity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Analysis of Germline Stem Cell Differentiation Following Loss of GLP-1 Notch Activity in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 201 (1), 167-184 (2015).</li>
<li>Pasierbek, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Caenorhabditis+elegans+cohesion+protein+with+functions+in+meiotic+chromosome+pairing+and+disjunction%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">A Caenorhabditis elegans cohesion protein with functions in meiotic chromosome pairing and disjunction.</a> Genes and Development. 15 (11), 1349-1360 (2001).</li>
<li>Klass, M., Wolf, N., Hirsh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+male+reproductive+system+and+sexual+transformation+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of the male reproductive system and sexual transformation in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Dev Biol. 52 (1), 1-18 (1976).</li>
<li>Korta, D. Z., Tuck, S., Hubbard, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S6K+links+cell+fate%2C+cell+cycle+and+nutrient+response+in+C.+elegans+germline+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">S6K links cell fate, cell cycle and nutrient response in C. elegans germline stem/progenitor cells.</a> Development. 139 (5), 859-870 (2012).</li>
<li>Laband, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+segregation+occurs+by+microtubule+pushing+in+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Chromosome segregation occurs by microtubule pushing in oocytes.</a> Nat Commun. 8 (1), 1499(2017).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Celem tego protokołu jest poprawa dokładności i skrócenie czasu wymaganego do analizy linii zarodkowej. Po standardowym przygotowaniu wypreparowanych linii zarodkowych przygotowuje się trójwymiarowy model jąder linii zarodkowej metodą renderowania komputerowego. Umożliwiając obserwację rozmieszczenia jąder linii zarodkowej w przestrzeni, renderowanie trójwymiarowe oblicza liczbę jąder w określonych regionach linii zarodkowej. Kluczowym aspektem naszej metody jest dokładne określenie parametrów wielkości i kształtu jąder....

Zachowanie szlaków sygnałowych u ssaków sprawia, że C. elegans jest doskonałym modelem do badania wielu procesów biologicznych1,2. W naszym laboratorium wykorzystujemy linię zarodkową C. elegans do badania rozwoju komórek macierzystych, apoptozy i ekspresji genów. Podczas gdy linia zarodkowa jest strukturą trójwymiarową, wiele badań jest dwuwymiarowych ze względu na czasochłonny i pracochłonny charakter analizy trójwymiarowej. Jest wysoce prawdopodobne, że analiza dwuwymiarowa może błędnie przedstawiać zdarzenia in vivo w linii zarodkowej. Dorosły hermafrodyta C. elegans ma dwa ramiona linii zarodkowej, z których każde mieści somatyczną komórkę dystalnego wierzchołka (DTC), która utrzymuje dystalne komórki rozrodcze w stanie niezróżnicowanym3,4. Te komórki rozrodcze zaczynają się różnicować, gdy oddalają się od DTC, uciekając przed jego wpływem, i stają się oocytami i plemnikami, gdy docierają do bliższego końca linii zarodkowej. Podczas tego procesu jądra komórek rozrodczych przechodzą mitozę, zanim przejdą w mejozę5,6. Produkcja plemników jest zakończona w stadium larwalnym 4 (L4) rozwoju, po którym oocyty są wytwarzane w wieku dorosłym. Plemniki są przechowywane w spermatece, gdzie zapładniają oocyty w celu wytworzenia zarodków.
Istnieje wiele czynników genetycznych i środowiskowych, które mogą wpływać na rozwój linii zarodkowej u C. elegans, powodując zmiany w liczbie jąder, liczbie zdarzeń apoptotycznych, dynamice chromosomów oraz ekspresji białek i/lub lokalizacji7,8,9,10,11. Analiza tych zdarzeń wymaga identyfikacji każdego etapu różnicowania w oparciu o morfologię i rozmieszczenie jądrów. Dokładna ręczna analiza tych parametrów przy dużej wielkości próbki jest pracochłonna i czasochłonna. Aby obejść te wady i umożliwić spójność analizy, opracowaliśmy zautomatyzowaną metodę trójwymiarowego badania linii zarodkowej C. elegans pod kątem liczenia jąder, rozmieszczenia jąder, ekspresji białek i struktury cytoszkieletu. Łącząc mikroskopię konfokalną z trójwymiarowym renderingiem, wygenerowaliśmy parametry rozmiaru i kształtu do identyfikacji każdego etapu różnicowania się komórek rozrodczych. Ponadto metoda ta umożliwia zliczanie jąder rozrodczych i plemników oraz ocenę liczby chromosomów w każdym oocycie.
Jedną z kluczowych struktur w linii zarodkowej jest cytoszkielet, który zapewnia stabilność przedziału linii zarodkowej, wspomaga przepływ cytoplazmatyczny i ochronę jąder linii zarodkowej12. Korzystając z renderowania komputerowego, przeprowadziliśmy trójwymiarową rekonstrukcję cytoszkieletu linii zarodkowej i zidentyfikowaliśmy wyraźne cechy cytoszkieletu w linii zarodkowej. W tym miejscu opisujemy krok po kroku protokół, aby zilustrować, w jaki sposób analiza obliczeniowa w połączeniu z obrazowaniem konfokalnym umożliwia kompleksową analizę linii zarodkowej C. elegans.
Proponujemy szybką metodę trójwymiarowej analizy linii zarodkowej C. elegans (Rysunek 1). Za pomocą analizy trójwymiarowej możliwe jest badanie trójwymiarowego rozkładu jąder linii zarodkowej (ryc. 2 i ryc. 3), automatycznego zliczania komórek (ryc. 2), rekonstrukcji cytoszkieletu linii zarodkowej (ryc. 3), rozmieszczenia białek (ryc. 4) oraz oceniania liczby plemników w spermatece i chromosomów w oocytach (ryc. 5). Metoda ta nie tylko umożliwia łatwą i dokładną ocenę ilościową linii zarodkowej, ale także identyfikuje fizjologicznie istotne fenotypy.

<table><tbody><tr><td>C. elegans szczepy: typ dziki (N2, Bristol), rnp-8(tm2435) I/hT2[bli-4(e937) let-?( q782) qIs48] (I;III), cpb-3(bt17) I, glp-1 (e2141) III&nbsp; </td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OP50 Escherichia coli bakterie</td><td>Domowe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>płytki z pożywką do wzrostu nicieni (NGM)</td><td>Domowy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>poliklonalny królik anty-REC-8&nbsp;</td><td>SDIX</td><td>29470002</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488 sprzężone przeciwciało wyhodowane u kozy</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A-21236</td><td></td></tr><tr><td>Barwnik cytoszkieletu falloidyna&nbsp;</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A-12380</td><td></td></tr><tr><td>DAPI&nbsp;</td><td>Thermofisher Naukowy&nbsp;</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lizyna&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5899</td><td></td></tr><tr><td>Tetramisol&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5899</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>1M bufor HEPES, pH 7,4&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G0887</td><td></td></tr><tr><td>10X PBS pH 7,4&nbsp;</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1389</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>37% roztwór paraformaldehydu</td><td>Merck Millipore</td><td>1040031000</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik utrwalający Fluoroshield&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6182</td><td></td></tr><tr><td>Etanol&nbsp;</td><td>Milipore&nbsp;</td><td></td><td></td>1009832511</tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>20&deg; C & 25&deg; Inkubator&nbsp;</td><td>Mikroskop świetlny dowolnej marki</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Mikroskop</td> konfokalny dowolnej marki<td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>Dowolna marka (Leica, Zeiss)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Komputer wyposażony w kombinezon Imaris w wersji 8.4.1 lub nowszej, pełna licencja na korzystanie z oprogramowania i oprogramowania Matlab.</td>Sól fizjologiczna buforowana <td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phospho, pH 7,4</td><td>Domowe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>szkiełka mikroskopowe teflonowe&nbsp;</td><td>Tekdon&nbsp;</td><td>&nbsp; Numer katalogowy: 941-322-8288</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza obliczeniowa linii zarodkowej caenorhabditis elegans w celu zbadania rozmieszczenia jąder, białek i cytoszkieletu

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Linia zarodkowa Caenorhabditis elegans (C. elegans) jest używana do badania kilku biologicznie ważnych procesów, w tym rozwoju komórek macierzystych, apoptozy i dynamiki chromosomów. Chociaż linia zarodkowa jest doskonałym modelem, analiza jest często dwuwymiarowa ze względu na czas i pracę wymaganą do analizy trójwymiarowej. Głównymi odczytami w takich badaniach są liczba/położenie jąder i rozmieszczenie białek w linii zarodkowej. W tym miejscu przedstawiamy metodę przeprowadzania automatycznej analizy linii zarodkowej przy użyciu mikroskopii konfokalnej i podejść obliczeniowych w celu określenia liczby i położenia jąder w każdym regionie linii zarodkowej. Nasza metoda analizuje również rozmieszczenie białek linii zarodkowej, co umożliwia trójwymiarowe badanie ekspresji białek w różnych tłach genetycznych. Co więcej, nasze badanie pokazuje różnice w architekturze cytoszkieletu w różnych regionach linii zarodkowej, które mogą spełniać określone wymagania dotyczące rozwoju przestrzennego. Wreszcie, nasza metoda umożliwia automatyczne zliczanie plemników w spermatece każdej linii zarodkowej. Podsumowując, nasza metoda umożliwia szybką i powtarzalną analizę fenotypową linii zarodkowej C. elegans.

Rysunek 1 przedstawia czas wymagany do trójwymiarowej analizy linii zarodkowej. Hermafrodyty w stadium L4 inkubowane w 20 °C poddano sekcji w celu wyizolowania linii zarodkowych, a następnie barwiono DAPI, falloidyną oraz przeciwciałami przeciwko białkom linii zarodkowej. Obrazy linii zarodkowych wykonano przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Barwienie i mikroskopia konfokalna wymagają około 24 h. Analiza obliczeniowa całej linii zarodkowej zajmuje od 10 do 15...

Prezentujemy zautomatyzowaną metodę trójwymiarowej rekonstrukcji linii zarodkowej Caenorhabditis elegans. Nasza metoda określa liczbę i położenie każdego jądra w linii zarodkowej oraz analizuje rozmieszczenie białek linii zarodkowej i strukturę cytoszkieletu.

Analiza obliczeniowa linii zarodkowej Caenorhabditis elegans w celu zbadania rozmieszczenia jąder, białek i cytoszkieletu

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Ogólnym celem tej metody jest zautomatyzowanie analizy linii zarodkowej Caenorhabditis elegans w celu zbadania jej jąder, białek i rozmieszczenia cytoszkieletu. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie C.Elegans dotyczące liczby jąder i plemników, rozmieszczenia jąder i struktury cytoszkieletu linii zarodkowej. Głównymi zaletami tej techniki jest skrócenie czasu analizy, zwiększenie wielkości próby i wyeliminowanie błędu ludzkiego związanego z analizą ręczną.Aby zobrazować próbki, umieść szkiełka z barwionymi liniami zarodkowymi w uchwycie szkiełka powyżej obiektywu 63X mikroskopu konfokalnego i zlokalizuj linię zarodkową. Ustaw ostrość na górnej części linii zarodkowej i zaznacz ją za pomocą oprogramowania mikroskopu konfokalnego. Po ustaleniu całkowitej grubości linii zarodkowej określ grubość każdego wycinka do 0,5 mikrometra i zaznacz całą linię zarodkową.Następnie rozpocznij akwizycję, skanując każdy wycinek osiem razy i uśredniając wartości, aby poprawić jakość obrazu. Po uzyskaniu wszystkich obrazów zaimportuj obrazy do odpowiedniego oprogramowania do analizy obrazów i użyj narzędzia funkcji powierzchni, aby wybrać region mitotyczny. Pojawi się obraz dystalnego końca linii zarodkowej.Anuluj kreatora automatycznego tworzenia powierzchni i ręcznie narysuj interesujący obszar wokół obszaru mitotycznego na pierwszym i ostatnim wycinku obrazu ze stosu trójwymiarowego. Kliknij Utwórz powierzchnię, a następnie Kanał maski, aby zamaskować wszystkie kanały z wyjątkiem kanału DAPI. Za pomocą narzędzia funkcji punktowej zdefiniuj parametry rozmiaru obszaru mitotycznego o średnicy XY wynoszącej dwa mikrometry i o niezdefiniowanej średnicy Z.Kliknij opcję Odejmij tło, aby odjąć tło. Aby zdefiniować minimalny próg, zwiększ minimalny próg renderowania 3D na linii zarodkowej typu dzikiego wybarwionej DAPI, aż pierwsza plamka pojawi się poza linią zarodkową, a następnie wygeneruj model 3D dla każdego regionu. Po zapisaniu obrazów kliknij tabelę, aby wyświetlić liczbę jąder wygenerowaną automatycznie przez oprogramowanie i wyeksportować obrazy jako pliki TIFF.Dla strefy przejściowej utwórz powierzchnię, jak wyjaśniono wcześniej. Następnie kliknij Mask Channel (Kanał maski), aby zamaskować wszystkie kanały z wyjątkiem kanału DAPI. Za pomocą funkcji punktowej zdefiniuj średnicę XY wynoszącą dwa mikrometry i średnicę Z wynoszącą 1,5 mikrometra, a następnie kliknij przycisk odejmij tło, aby odjąć tło.Aby zdefiniować minimalny próg, zwiększ minimalny próg renderowania 3D na linii zarodkowej typu dzikiego wybarwionej DAPI, aż pierwsza plamka pojawi się poza linią zarodkową, a następnie wygeneruj model 3D dla każdego regionu. Po zapisaniu obrazów kliknij tabelę, aby wyświetlić liczbę jąder wygenerowaną automatycznie przez oprogramowanie i wyeksportować obrazy jako pliki TIFF. Aby ocenić liczbę plemników, wybierz spermatekę jako obszar zainteresowania, jak pokazano dla regionów jąder, i użyj narzędzia funkcji punktowej, aby zdefiniować średnicę XY w zakresie od 0,75 do jednego mikrometra z niezdefiniowaną średnicą Z, aby wykryć każdy plemnik.Zaznacz pole Odejmowanie tła i użyj wartości korekcji tła obliczonych przez oprogramowanie, aby odjąć tło. Następnie dostosuj próg renderowania 3D, aby wykryć wszystkie plemniki barwione DAPI w spermatece. Do zliczania chromosomów w oocytach wybierz oocyty i zdefiniuj średnicę XY jako mniejszą niż 0,75 mikrometra, a następnie określ próg przed opracowaniem modeli 3D.Następnie zapisz obrazy do eksportu jako pliki TIFF. W celu rekonstrukcji linii zarodkowej cytoszkieletu zidentyfikuj interesujący nas obszar mitotyczny w linii zarodkowej i utwórz maskę powierzchniową, jak pokazano wcześniej. Kliknij opcję Maskuj kanały, aby zamaskować wszystkie kanały z wyjątkiem kanału falloidyny, a następnie użyj narzędzia funkcji powierzchni, aby zdefiniować szczegół powierzchni o wielkości 0,25 mikrometra.Po odjęciu tła dostosuj próg renderowania 3D, aby zapisać wywołany obraz 3D do eksportu jako plik TIFF. Rozkład jąder zależy od stopnia różnicowania. Na przykład w obszarze mitotycznym wewnętrzna aktyna pojawia się jako stała masa, na której zorganizowane są jądra.W linii zarodkowej typu dzikiego region mitotyczny zawiera około 250 jąder i jest ciasno upakowany jądrami w porównaniu z resztą linii zarodkowej. Jednak gdy jądra oddalają się od dystalnego końca, pojawiają się bliżej obwodu linii zarodkowej, przy czym zmiana dystrybucji zaczyna się w strefie przejściowej i kończy, gdy jądra wchodzą w trzeci etap profazy w mejjozie. W strefie przejściowej aktyna wewnętrzna linii zarodkowej przyjmuje bardziej cylindryczną strukturę, stając się pustym cylindrem, gdy dociera do pachytenu.Druga warstwa aktyny pokrywa warstwę wewnętrzną, nadając kształt linii zarodkowej. Ten cylinder w strukturze aktyny cylindra znika w kierunku obszaru oocytu, w którym to momencie aktyna pojawia się jako grube włókna pokrywające oocyty. W spermatece aktyna również tworzy grube wiązki błonnika, chociaż włókna te wydają się być upakowane bliżej siebie niż w okolicy oocytów.Trójwymiarowe odwzorowanie bliższego końca linii zarodkowej, jak pokazano, ujawnia średnio 151 plemników w każdej spermatece. Po opanowaniu analiza ta może zostać zakończona w ciągu 10 minut na linię zarodkową. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o zdefiniowaniu parametrów analizy zgodnie z powiększeniem celu użytego do wizualizacji linii zarodkowej w eksperymencie.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić automatyczną analizę linii zarodkowej i zbadać strukturę cytoszkieletu oraz ocenić liczbę jąder w linii zarodkowej.

computational-analysis-caenorhabditis-elegans-germline-to-study

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Zarodek C. elegans jest potężnym systemem do badania biologii komórki i rozwoju. Przedstawiamy protokół obrazowania na żywo zarodków C. elegans z wykorzystaniem optyki DIC lub fluorescencji, przy użyciu powszechnie dostępnych mikroskopów epifluorescencyjnych oraz oprogramowania otwartoźródłowego.

Obrazowanie zarodków C. elegans przy użyciu mikroskopu epifluorescencyjnego i oprogramowania otwartoźródłowego

Łatwość utrzymania i propagacji nicieni C. elegans sprawia, że są one doskonałym organizmem modelowym. Możliwość synchronizacji nicieni pozwala na pracę ze znaczną liczbą osobników w tym samym stadium rozwojowym, co ułatwia badanie konkretnego procesu u wielu zwierząt.

Podstawowe metody pracy z Caenorhabditis elegans: Synchronizacja i obserwacja

Tutaj pokazano, jak śledzić i określać ilościowo procesy rozwojowe u C. elegans. Przedstawione metody oparte są na narzędziach open-source, które można łatwo wdrożyć. Pokazano, jak rekonstruować modele 3D w kształcie komórki, jak ręcznie śledzić struktury subkomórkowe i jak analizować korowy przepływ skurczowy.

Śledzenie i ilościowe określanie procesów rozwojowych u C. elegans przy użyciu narzędzi open source

Prezentujemy metodę obrazowania immunofluorescencyjnego opartą na przestrzennej i czasowej lokalizacji aktywnego ERK w wypreparowanej gonadzie C. elegans. Opisany tutaj protokół może być dostosowany do wizualizacji dowolnego białka sygnalizacyjnego lub strukturalnego w gonadzie C. elegans, pod warunkiem, że dostępny jest odpowiedni odczynnik przeciwciała.

Analiza przestrzenna i czasowa aktywnego ERK w linii rozrodczej C. elegans

Przezroczyste jelito C. elegans może służyć jako "komora tkankowa in vivo" do badania biogenezy błony wierzchołkowej i światła na poziomie pojedynczej komórki i subkomórkowej podczas tubulingenezy wielokomórkowej. Protokół ten opisuje, w jaki sposób połączyć standardowe znakowanie, genetykę utraty funkcji/RNAi i podejścia mikroskopowe w celu przeanalizowania tych procesów na poziomie molekularnym.

Jelito C. elegans jako model morfogenezy światła międzykomórkowego i biogenezy błony spolaryzowanej in vivo na poziomie pojedynczej komórki: znakowanie przez barwienie przeciwciałami, analiza utraty funkcji RNAi i obrazowanie

To badanie przedstawia ilościowe pomiary wielkości i lokalizacji synaptycznej, morfologii mięśni i kształtu mitochondriów u C. elegans przy użyciu swobodnie dostępnych narzędzi do przetwarzania obrazów. Takie podejście pozwala przyszłym badaniom nad C. elegans na ilościowe porównanie zakresu zmian strukturalnych tkanek i organelli w wyniku mutacji genetycznych.

Ilościowe podejścia do badania struktur komórkowych i morfologii organelli u Caenorhabditis elegans

Ta praca opisuje protokół o średniej przepustowości, który umożliwia jednoczesne obrazowanie 3D poklatkowe embriogenezy u zarodków 80-100 C. elegans w ciągu jednej nocy. Dodatkowo dołączone są narzędzia do przetwarzania i wizualizacji obrazu, które usprawniają analizę danych. Połączenie tych metod z niestandardowymi szczepami reporterowymi umożliwia szczegółowe monitorowanie embriogenezy.

Metoda obrazowania półwysokoprzepustowego i zestaw narzędzi do wizualizacji danych do analizy rozwoju embrionalnego C. elegans

Ten protokół demonstruje użycie testu ligacji zbliżeniowej do badania interakcji białko-białko in situ w linii zarodkowej C. elegans.

Wykrywanie in situ składania kompleksów rybonukleoproteinowych w linii zarodkowej C. elegans przy użyciu testu ligacji zbliżeniowej

To badanie przedstawia protokoły dla dwóch półautomatycznych metod analizy aktywności lokomotorycznej u robaków C. elegans complex I disease gas-1(fc21), a mianowicie ZebraLab (test o średniej przepustowości) i WormScan (test o wysokiej przepustowości) i dostarcza analizy porównawczej wśród szerokiego wachlarza metod badawczych do ilościowego określenia zachowania nicieni i zintegrowanej funkcji nerwowo-mięśniowej.

Analiza porównawcza metod eksperymentalnych do ilościowego określania aktywności zwierząt w modelach choroby mitochondrialnej Caenorhabditis elegans

To jest powszechnie stosowana metoda do sekcji gonad C. elegans, po której następuje pęknięcie zamrażające, która wytwarza próbki linii zarodkowej do immunofluorescencji poprzez barwienie przeciwciał, lub do prostego barwienia DAPI w celu wizualizacji DNA. Protokół ten okazał się skuteczny w przypadku studentów studiów licencjackich w laboratorium badawczym i w ramach badań licencjackich opartych na kursach.

C. elegans (C. elegans) Rozwarstwienie gonad i pęknięcie zamrażające do barwienia immunofluorescencyjnego i DAPI

Tutaj przedstawiamy instrukcje dotyczące skutecznego wykorzystania SegElegans, systemu głębokiego uczenia, który opracowaliśmy do automatycznego segmentowania pojedynczych robaków na mikroskopii szerokopolowej, do późniejszego wykorzystania w oprogramowaniu do analizy obrazów, takiego jak ImageJ. Oferujemy możliwości korzystania z systemu zarówno online, jak i offline.

Automatyczna analiza obrazów fluorescencyjnych C. elegans z użyciem SegElegans

Poznaj zautomatyzowaną analizę linii zarodkowej Caenorhabditis elegans w celu badania rozmieszczenia jąder, białek i cytoszkieletu. Ta metoda skraca czas analizy, zwiększa liczbę próbek i eliminuje błędy ludzkie.

Analiza obliczeniowa linii zarodkowej Caenorhabditis elegans w celu zbadania rozmieszczenia jąder, białek i cytoszkieletu

Przeglądaj więcej filmów