Podejście mikroprzepływowe oparte na kropelkach i amplifikacja mikrosferyczno-PCR dla jednoniciowych amplikonów DNA

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w technice kombinatorycznej systemu mikroprzepływowego i dziedzinie biotechnologii molekularnej, takiej jak urządzenia mikroprzepływowe i metoda asymetrii PCR. Głównymi zaletami tej techniki jest wydajne wytwarzanie wysoce zhomogenizowanych mikrosfer oraz produkcja jednoniciowego DNA bez dodatkowych etapów separacji. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku diagnozy lub terapii różnych chorób.

Ponieważ generowanie jednoniciowego DNA ma kluczowe znaczenie dla testów ap-ta-mo-sis, można je wykorzystać do wykrywania i leczenia. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w trójwymiarowy system mikroprzepływowy w MEMS, może być również stosowana do innych systemów stosowanych do wykrywania i leczenia chorób. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności z prawidłowym kontrolowaniem płynów płynących w odwrotnym kierunku.

Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie dla obserwacji powstawania mikrosfer w geometrii skupiającej przepływ i krzepnięcia generowanych mikrosfer. Najpierw przygotuj 20 mililitrów płynnego prepolimeru PDMS, mieszając polimer bazowy i katalizator w stosunku 10 do jednego. Wlej 10 mililitrów płynnego PDMS na przygotowaną formę SU-8 na płytce krzemowej dla górnej części sieci mikroprzepływowej.

W przypadku dolnej płaskiej części wlej tę samą objętość płynnego PDMS na płytkę krzemową bez struktury formy. Umieść dwie płytki krzemowe pokryte ciekłym prepolimerem PDMS na rozgrzanej płycie grzejnej i utwardzaj w temperaturze 75 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie ręcznie oderwij utwardzoną warstwę PDMS od formy SU-8.

Dopasuj okrągłe narzędzie do dziurkowania o średnicy 1,5 milimetra do portu oleju w replikowanej sieci mikroprzepływowej, aby połączyć kanały przepływu w skali mikronowej z próbkami makropłynów. Następnie ręcznie wybij otwór przelotowy. Po trzykrotnym powtórzeniu procesu wykrawania należy wykonać hydrofilową obróbkę powierzchni zarówno na górnej, jak i dolnej warstwie PDMS za pomocą ręcznej obróbki koronowej przez kilka sekund na próbkę.

Ułóż dwie warstwy PDMS poddane obróbce plazmowej i podgrzewaj w temperaturze 90 stopni Celsjusza przez 30 minut na płycie grzejnej w procesie łączenia PDMS z PDMS. Wirować i krótko odwirować standardową jednoniciową sondę DNA znakowaną akrydytem i roztwór podstawowy akryloamidu w proporcji 19 do jednego. Przygotuj pierwszy roztwór, mieszając 25 mikrolitrów 40% roztworu akryloamidu, 10 mikrolitrów jednoniciowego DNA, 10 mikrolitrów buforu 5X TBE i pięć mikrolitrów wody.

Przygotuj roztwór drugi z 50 mikrolitrami 20% nadsiarczanu amonu. Przygotować dwie strzykawki wypełnione pojedynczo roztworem pierwszym i roztworem drugim, a następnie zamontować je na pompie strzykawkowej, aby wprowadzić przepływy roztworu do platformy mikroprzepływowej. Przygotować olej mineralny zmieszany z 0,4% TEMED do zestalenia powierzchni mikrosfery.

Po napełnieniu szklanej butelki olejem mineralnym włóż dwie rurki do portów pneumatycznych i płynów w nakrętce szklanej butelki jako zbiornik mikroprzepływowy. Podłącz rurki między szklaną butelką a portem oleju w urządzeniu mikroprzepływowym. Podłącz rurki do dwóch portów roztworu w urządzeniu mikroprzepływowym, aby dostarczyć dwa roztwory z pomp strzykawkowych.

Następnie włóż rurki do portu wylotowego w celu przeniesienia wytworzonej mikrosfery do zlewki. Następnie ustaw natężenie przepływu pompy strzykawkowej na 0,4 do 0,7 mililitra na godzinę. Wyreguluj ciśnienie sprężonego powietrza w sprężarce za pomocą regulatora.

Umieść szklaną zlewkę z mieszadłem magnetycznym na płycie grzejnej i ustaw prędkość obrotową. Uruchomić pompę strzykawkową i dostarczyć sprężone powietrze wytwarzane przez zewnętrzną sprężarkę do szklanej butelki za pomocą przełącznika on-off zaworu elektromagnetycznego. Za pomocą mikroskopu cyfrowego obserwuj powstawanie mikrosfer w geometrii ogniskowania przepływu i krzepnięcie generowanych mikrosfer w szklanej zlewce.

Obserwacja powstawania mikrosfer jest jednym z najbardziej krytycznych etapów, ponieważ jest to główny proces w tym badaniu mający na celu wytworzenie mikrosfer i układu mikroprzepływowego. Następnie przenieś 100 mikrolitrów mikrosfer do 1,5 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej. Następnie usunąć supernatant przez delikatne odwirowanie i pipetowanie.

Ponownie zawiesić komplementarną cyjaninę-3 zmodyfikowaną sondą, używając 100 mikrolitrów buforu 1X TE, aby osiągnąć końcowe stężenie 100 mikromolowych. Następnie dodaj 100 mikromoli komplementarnej cyjaniny-3 modyfikowanej sondą do sterylnej 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówkowej zawierającej kopolimeryzowane mikrosfery AP. Postukaj kilka razy w probówkę, aby wymieszać i inkubować w temperaturze pokojowej w ciemności przez godzinę.

Po inkubacji odrzucić supernatant i usunąć pozostały bufor poprzez pipetowanie. Następnie spłucz trzykrotnie 500 mikrolitrami buforu TE. Umieść mikrosfery na szkiełku podstawowym o wymiarach 75 na 50 milimetrów i przykryj folią aluminiową przed obrazowaniem.

Uzyskaj około 25 mikrosfer poprzez zliczanie mikroskopowe za pomocą mikroskopu świetlnego o 40-krotnym powiększeniu. Następnie połącz wszystkie odczynniki zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Umieść próbki w termocyklerze i rozpocznij asymetryczny PCR w odpowiednich warunkach.

Pobranie supernatantu po asymetrycznym PCR jest jednym z najbardziej krytycznych kroków, ponieważ jest to główny proces generowania jednoniciowego DNA z mikrosferą. Po amplifikacji dodaj osiem mikrolitrów bufora ładującego 6X do każdej próbki. Załaduj 15 mikrolitrów każdej próbki do 2% żelu agarozowego.

Następnie wykonuj elektroforezę przy napięciu 100 woltów przez 35 minut w buforze 1X TAE. Umieść zhybrydyzowane mikrosfery w uchwycie i przymocuj uchwyt do stolika mikroskopu konfokalnego. Wybierz laser i włącz go w sterowniku lasera.

Wybierz soczewkę obiektywu w sterowaniu mikroskopu. Następnie wybierz żądany filtr dla cyjaniny-3 i kanału w kontrolce konfiguracji. Na koniec rozpocznij eksperyment i obserwuj próbkę.

Wytworzona polimerowa platforma mikroprzepływowa oparta na kropelkach składa się z dwóch warstw PDMS. Do generowania mikrosfer wykorzystuje się trzy rodzaje sieci kanałów mikroprzepływowych, którymi są geometria skupiająca przepływ, kanał serpentynowy do mieszania roztworów pierwszego i drugiego oraz kanał polimeryzacyjny do krzepnięcia mikrosfery. Laboratoryjny pneumatyczny system sterowania ciągłym przepływem oleju mineralnego oraz dwie pompy strzykawkowe do przepływu roztworu zostały wykorzystane do generowania mikrosfer w platformie mikroprzepływowej.

Jeśli mikrosfery są prawidłowo funkcjonalizowane za pomocą pięciokrotnej sondy DNA akrylowego, powinny one skutkować pokryciem aktywności fluorescencyjnej na powierzchni podczas eksperymentu hybrydyzacji, jak pokazano na tych obrazach fluorescencyjnych. Jeśli kopolimeryzacja nie zachodzi prawidłowo, obraz mikrosfery optycznej będzie wykazywał wewnętrzne zanieczyszczenie wewnątrz mikrosfer. Manipulowanie powierzchnią 3D mikrosfer za pomocą oligosondy DNA jest znacznie szybszym procesem, a platforma syntezy mikrosfer w przepływie może zapewnić narzędzie do amplifikacji i oczyszczania jednoniciowego DNA.

Początkowo skopolimeryzowany pięciokrotny AP zapewnia trzypierwszorzędny koniec hydroksylowy do polimeryzacji DNA po wyżarzaniu do jego komplementarnej matrycy. W eksperymencie asymetrycznej PCR zaobserwowano dwuniciowe zanieczyszczenia DNA. Otrzymany jednoniciowy DNA zgromadzony w wyniku mikrosferycznego PCR wykazano przez porównanie z syntetycznymi markerami wielkości za pomocą analizy elektroforezy żelowej.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że wcześniejsza wiedza na temat protokołów i regulacji, które są powszechnie niezbędne do optymalizacji eksperymentów PCR, jest wymagana do uzyskania cyklu amplifikacji, temperatury wyżarzania i sekwencji sondy w tej metodzie. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się diagnostyką i terapią do połączenia dwóch regionów w biotechnologii molekularnej i biomedycynie. Nie zapominaj, że praca z roztworem akrylamidu może być niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek i fartuchów laboratoryjnych.