Name: Podejście mikroprzepływowe oparte na kropelkach i amplifikacja mikrosferyczno-PCR dla jednoniciowych amplikonów DNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-14T13:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 40 s
Description: Poznaj metodę mikroprzepływową opartą na kropelkach i amplifikację mikrosferyczno-PCR do produkcji jednoniciowych amplikonów DNA bez dodatkowej separacji. Technika ta znajduje zastosowanie w diagnostyce i terapii chorób.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie jest wspierane przez projekt zatytułowany "Wspólny Program Badawczy na rzecz Rozwoju Nauki i Technologii Rolnictwa (Projekt nr PJ0011642)" finansowanego przez Administrację Rozwoju Obszarów Wiejskich Republiki Korei. Badania te były również częściowo wspierane przez grant (NRF-2017R1A2B4012253) Programu Badań Podstawowych za pośrednictwem Narodowej Fundacji Badawczej (NRF) finansowany przez Ministerstwo Nauki, ICT i Planowania Przyszłości Republiki Korei. Badania te były również wspierane przez grant (N0000717) programu edukacyjnego na rzecz konwergencji kreatywnej i przemysłowej finansowany przez Ministerstwo Handlu, Przemysłu i Energii Republiki Korei.

1. Produkcja platformy mikroprzepływowej PDMS
<ol>
	<li>Przygotować 20 ml ciekłego prepolimeru PDMS, mieszając polimer bazowy i katalizator w stosunku objętościowym 10:1. Wlać 10 ml płynnego PDMS na przygotowaną formę SU-8 na płytce krzemowej dla górnej części sieci mikroprzepływowej. W przypadku dolnej płaskiej części wlej tę samą objętość płynnego PDMS na płytkę krzemową bez struktury formy. 
	Uwaga: Sieć mikroprzepływowa jest projektowana w programie CAD, a następnie przekształcana w fotomaskę w celu wytworzenia wzorca przy użyciu typowego procesu fotolitografii (patrz rysunki uzupełniające). Ten wzorzec składa się z ujemnej formy fotorezystu SU-8 na wafle krzemowym11.</li>
	<li>Umieścić dwie płytki krzemowe pokryte ciekłym prepolimerem PDMS na płycie grzejnej i utwardzać w temperaturze 75 °C przez 30 minut.
	<ol>
		<li>Ręcznie oderwij utwardzoną warstwę PDMS od formy SU-8. Dopasuj narzędzie do dziurkowania z okrągłymi otworami o średnicy 1,5 mm do portu oleju w replikowanej sieci mikroprzepływowej, aby połączyć kanały przepływu w skali mikronowej z próbkami makropłynów. Ręcznie wybij otwór przelotowy.</li>
		<li>Powtórz ten proces wykrawania trzy razy, aby utworzyć dwa roztwory i port wylotowy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj hydrofilową obróbkę powierzchni zarówno na górnej, jak i dolnej warstwie PDMS za pomocą ręcznej obróbki koronowej12 przez kilka sekund na próbkę.
	<ol>
		<li>Ułóż dwie warstwy PDMS poddane obróbce plazmowej i podgrzewaj w temperaturze 90 °C przez 30 minut za pomocą płyty grzejnej do procesu łączenia PDMS. Dostarczyć wodę pod ciśnieniem za pomocą pompy strzykawkowej do trzech portów wlotowych w celu połączenia strukturalnego i sprawdzenia szczelności wyprodukowanego urządzenia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Produkcja oligomikrosfer poliakrylamidowych
<ol>
	<li>Przygotować mieszaninę kulek wyszczególnioną w tabeli 1.</li>
	<li>Odwirować i krótko odwirować standardową sondę znakowaną akrydytem ssDNA (Ap, 100 μM) i roztwór podstawowy akrylamidu:bis (19:1).</li>
	<li>Przygotować roztwór I, mieszając 25 μl 40% roztworu bis akryloamidu, 10 μl ssDNA (sonda akrylowa), 10 μl 5x buforu TBE (1,1 M Tris; 900 mM boran; 25 mM EDTA) i 5 μL wody. Przygotować roztwór II z 50 μl 20% nadsiarczanu amonu.</li>
	<li>Przygotować dwie strzykawki wypełnione pojedynczo roztworem I i roztworem II i zamontować je na pompie, aby wprowadzić przepływy roztworu do platformy mikroprzepływowej. Przygotować olej mineralny zmieszany z 0,4% TEMED do krzepnięcia powierzchni mikrosfery. 
	Uwaga: TEMED jest dobrze znany jako stabilizator wolnych rodników. Wolne rodniki mogą przyspieszać tempo tworzenia polimerów za pomocą nadsiarczanu amonu (APS) w celu katalizowania polimeryzacji akrylamidu.</li>
	<li>Napełnij szklaną butelkę 4 ml oleju mineralnego, aby uzyskać ciągły przepływ.</li>
	<li>Włóż dwie rurki do dwóch portów w nakrętce szklanej butelki jako zbiornik mikroprzepływowy: port pneumatyczny do wprowadzania sprężonego powietrza do szklanej butelki ze sprężarki powietrza oraz port płynu do dostarczania oleju pod ciśnieniem do sieci mikrokanałów ze szklanej butelki. Podłącz rurki między szklaną butelką a portem oleju w urządzeniu mikroprzepływowym.
	<ol>
		<li>Podłącz rurki do dwóch portów roztworu w urządzeniu mikroprzepływowym, aby dostarczyć dwa roztwory z pomp strzykawkowych. Włóż rurki do portu wylotowego, aby przenieść wytworzoną mikrosferę do zlewki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustawić natężenie przepływu pompy strzykawkowej na 0,4 - 0,7 ml/h. Wyregulować ciśnienie sprężonego powietrza w sprężarce za pomocą regulatora (82 - 116 kPa). Ustaw prędkość obrotową (500 obr./min) mieszadła magnetycznego w szklanej zlewce na płycie grzejnej. Uruchom pompę strzykawkową i dostarcz sprężone powietrze wytwarzane przez zewnętrzną sprężarkę do szklanej butelki za pomocą regulatora ON/OFF zaworu elektromagnetycznego13.</li>
	<li>Za pomocą mikroskopu cyfrowego można obserwować powstawanie mikrosfer w geometrii skupiającej przepływ i krzepnięcie wytworzonych mikrosfer w szklanej zlewce. 
	Uwaga: Wielkość i szybkość produkcji mikrosfery zależą od natężenia przepływu roztworów i ciśnienia wywieranego na przepływ oleju mineralnego (tabela 2).</li>
</ol>
3. Wykonywanie zliczania oligomikrosfer poliakryloamidu
<ol>
	<li>W celu ilościowego oznaczania hemocytometru pobrać niewielką ilość (około 100 μl) wodnego roztworu oligomikrosfer poliakrylamidowych i umieścić na szklanym hemocytometrze, a następnie delikatnie napełnić zawiesinę mikrosfery w studzience komory liczącej. 
	Uwaga: Aby uzyskać więcej informacji, zobacz http://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer.</li>
	<li>Użyj mikroskopu i ręcznego licznika liczenia, aby policzyć mikrosfery w jednym zestawie 16 kwadratów. Następnie przenieś hemocytometr do następnego zestawu komory i kontynuuj liczenie, aż wszystkie cztery zestawy po 16 rogów zostaną policzone.</li>
	<li>Określ średnią liczbę mikrosfer i oblicz liczbę mikrosfer w oryginalnej zawiesinie kulki.</li>
	<li>Przenieś 100 μl mikrosfer do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Usunąć supernatant przez delikatne odwirowanie (400 x g) i pipetowanie.</li>
</ol>
4. Przeprowadzanie hybrydyzacji DNA na powierzchni oligomikrosfery poliakrylamidu
Uwaga: Identyczna sonda DNA z2-grupą 5'-NH zamiast modyfikacji 5'-akrytydu jest dodawana do roztworu I i równolegle testowana pod kątem mikrosfer zawierających Ap. Wyniki hybrydyzacji DNA są pokazane w <silna klasa="xfig">Rysunek 2. Roztwór komplementarnych sond oligonukleotydowych znakowanych Cy3 (cAp) należy umieścić w ciemnym pomieszczeniu.
<ol>
	<li>Zawiesić Cy3-cAp za pomocą 100 μL buforu 1xTE (bufor TE: 10 mM Tris i 1 μM EDTA, pH 8,0) w celu uzyskania końcowego stężenia 100 μM. Na przykład ponownie zawiesić 1 pmol cAp w 100 ml buforu TE i przenieść do probówki mikrowirówki pokrytej folią aluminiową. 
	Uwaga: Sekwencje nici, patrz tabela 3.</li>
	<li>Dodać 100 μM Cy3-cAp do sterylnej probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml zawierającej mikrosfery kopolimeryzowane z Ap.</li>
	<li>Postukaj kilka razy w probówkę, aby wymieszać i inkubować w temperaturze pokojowej w ciemności przez 1 godzinę.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i usunąć pozostały bufor poprzez pipetowanie.</li>
	<li>Przepłukać trzykrotnie 500 μl buforu TE.</li>
	<li>Ponownie zawiesić mikrosfery, delikatnie stukając w probówkę mikrowirówki. Następnie powtórz krok 4.4.</li>
	<li>Umieść mikrokulki na szkiełku podstawowym (75 mm x 50 mm) i przykryj folią aluminiową przed obrazowaniem.</li>
</ol>
5. Asymetryczny PCR do amplifikacji ssDNA
<ol>
	<li>Przygotuj asymetryczną mieszaninę odczynników PCR do amplifikacji ssDNA do analizy. Rozmrozić odczynniki z tabeli 4 na lodzie. Nie przechowywać enzymu polimerazy Taq (50 U/μL) na lodzie, ale raczej przechowywać go w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będzie potrzebny.</li>
	<li>Delikatnie wymieszaj wszystkie odczynniki, a następnie krótko odwiruj probówki o sile 10 000 x g przez 10 sekund.</li>
	<li>Połączyć wszystkie odczynniki zgodnie z opisem w tabeli 4.</li>
	<li>Umieścić próbki w termocyklerze i rozpocząć asymetryczny PCR w następujących warunkach: 25 cykli (95 °C przez 30 s, 52 °C przez 30 s i 72 °C przez 30 s), 85 °C przez 5 minut, trzymać w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
6. Microsphere-PCR do amplifikacji ssDNA
Uwaga: Ta sekcja opisuje protokół amplifikacji ssDNA w probówce reakcyjnej PCR. Reakcje Microsphere-PCR przeprowadzono w 50 μL objętości reakcji. Szczegółowe sekwencje stosowane do amplifikacji ssDNA wymieniono w tabeli 5. W tym przypadku Ap na powierzchni mikrosfer może wyżarzać się do losowych matryc DNA w sposób komplementarny. Jest to bardzo ważny krok w procesie wytwarzania komplementarnych nici DNA (antysensowna nić DNA, <silna klasa="xfig">Rysunek 3). Wydłużone DNA jest używane jako matryca do amplifikacji mikrosferycznej PCR.
<ol>
	<li>Przygotuj mieszaninę odczynników do mikrosfery i PCR. Rozmrozić odczynniki z tabeli 6 na lodzie; jednak nie należy przechowywać enzymu polimerazy Taq na lodzie. Przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będzie potrzebny.</li>
	<li>Delikatnie wymieszaj wszystkie odczynniki, a następnie krótko odwiruj probówki o sile 10 000 x g przez 10 sekund.</li>
	<li>Uzyskaj około ~25 mikrosfer poprzez mikroskopijne liczenie. 
	Uwaga: Liczbę mikrosfer w jednej probówce reakcyjnej oblicza się za pomocą mikroskopu świetlnego o 40-krotnym powiększeniu. Około ~25 mikrosfer jest używanych do amplifikacji mikrosferycznej PCR. Bardziej szczegółowe informacje znajdują się w kroku 3.</li>
	<li>Połączyć wszystkie odczynniki zgodnie z opisem w Tabeli 6.</li>
	<li>Umieścić próbki w termocyklerze i rozpocząć asymetryczny PCR w następujących warunkach: 25 cykli (95 °C przez 30 s, 52 °C przez 30 s i 72 °C przez 30 s), 85 °C przez 5 minut, trzymać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Po amplifikacji dodać 8 μl 6-krotnego buforu ładującego i załadować 15 μl każdej próbki do 2% żelu agarozowego. Następnie należy wykonać elektroforezę pod napięciem 100 V przez 35 minut w buforze 1x TAE (Tris-acetate-EDTA, 40 mM Tris acetate, 1 mM EDTA, pH 8,2).</li>
</ol>
7. Akwizycja mikroskopii konfokalnej
Uwaga: Wyniki hybrydyzacji mikrosfery z sondą DNA są obrazowane pod mikroskopem konfokalnym. Analiza obrazu jest wykonywana za pomocą ImageJ.
<ol>
	<li>Przymocuj zhybrydyzowane mikrosfery do stolika mikroskopu w uchwycie.</li>
	<li>Wybierz laser (laser helowy/neonowy, linia 543 nm) i włącz go w trybie sterowania laserem.</li>
	<li>Wybierz soczewkę obiektywu w sterowaniu mikroskopem.</li>
	<li>Wybierz żądany filtr dla Cy3 i kanału w kontrolce konfiguracji.</li>
	<li>Rozpocznij eksperyment i obserwuj próbkę. Ustawienia mikroskopu konfokalnego podsumowano w Tabeli 7.</li>
</ol>

<ol><li>Smith, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+exonuclease+III+for+preparing+single+stranded+DNA+for+use+as+a+template+in+the+chain+terminator+sequencing+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The use of exonuclease III for preparing single stranded DNA for use as a template in the chain terminator sequencing method.</a> Nucleic Acids Research. 6 (3), 831-848 (1979).</li>
<li>Sekhon, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptabody-aptatope+interactions+in+aptablotting+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Aptabody-aptatope interactions in aptablotting assays.</a> Nanoscale. 9 (22), 7464-7475 (2017).</li>
<li>Ng, J. K., Ajikumar, P. K., Stephanopoulos, G., Too, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+RNA+polymerase-promoter+interaction+by+using+ssDNA-dsDNA+probe+on+a+surface+addressable+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">Profiling RNA polymerase-promoter interaction by using ssDNA-dsDNA probe on a surface addressable microarray.</a> Chembiochem. 8 (14), 1667-1670 (2007).</li>
<li>Sekhon, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+copper+binding+aptamotif+and+aptamer+integrated+recovery+platform+%28AIRP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Defining the copper binding aptamotif and aptamer integrated recovery platform (AIRP).</a> Nanoscale. 9 (8), 2883-2894 (2017).</li>
<li>Mikhailov, V. S., Bogenhagen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Xenopus+laevis+mitochondrial+single-stranded+DNA-binding+protein+on+primer-template+binding+and+3%27--%3E5%27+exonuclease+activity+of+DNA+polymerase+gamma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Effects of Xenopus laevis mitochondrial single-stranded DNA-binding protein on primer-template binding and 3'-->5' exonuclease activity of DNA polymerase gamma.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (31), 18939-18946 (1996).</li>
<li>Yu, X., Cheng, G., Zhou, M. D., Zheng, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-demand+one-step+synthesis+of+monodisperse+functional+polymeric+microspheres+with+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">On-demand one-step synthesis of monodisperse functional polymeric microspheres with droplet microfluidics.</a> Langmuir. 31 (13), 3982-3992 (2015).</li>
<li>Akamatsu, K., Kanasugi, S., Nakao, S., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-Integrated+Glass+Capillary+Device+for+Preparing+Small-Sized+Water-in-Oil-in-Water+Emulsion+Droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Membrane-Integrated Glass Capillary Device for Preparing Small-Sized Water-in-Oil-in-Water Emulsion Droplets.</a> Langmuir. 31 (25), 7166-7172 (2015).</li>
<li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-Flow+Synthesis+of+Co-Polymerizable+Oligo-Microspheres+and+Application+in+ssDNA+Amplification%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">On-Flow Synthesis of Co-Polymerizable Oligo-Microspheres and Application in ssDNA Amplification.</a> PLoS One. 11 (7), e0159777(2016).</li>
<li>Anna, S. L., Bontoux, N. B., Stone, H. A. <a target="_blank" href="https://aip.scitation.org/doi/abs/10.1063/1.1537519">Formation of dispersions using &#34;flow focusing&#34; in microchannels.</a> Applied Physics Letters. 82 (3), 364-366 (2003).</li>
<li>Gupta, A., Matharoo, H. S., Makkar, D., Kumar, R. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0045793014002217">Droplet formation via squeezing mechanism in a microfluidic flow-focusing device.</a> Computers & Fluids. 100, 218-226 (2014).</li>
<li>McDonald, J. C., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28dimethylsiloxane%29+as+a+material+for+fabricating+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Poly(dimethylsiloxane) as a material for fabricating microfluidic devices.</a> Accounts of Chemical Research. 35 (7), 491-499 (2002).</li>
<li>Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDMS+bonding+by+means+of+a+portable%2C+low-cost+corona+system%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system.</a> Lab on a Chip. 6 (12), 1548-1549 (2006).</li>
<li>Olsen, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+Microfluidic+Selex+Using+Free+Solution+Electrokinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Electrochemical+Society%22%5BJournal%5D)">Integrated Microfluidic Selex Using Free Solution Electrokinetics.</a> Journal of the Electrochemical Society. 164 (5), B3122-B3129 (2017).</li>
<li>Dorris, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodeoxyribonucleotide+probe+accessibility+on+a+three-dimensional+DNA+microarray+surface+and+the+effect+of+hybridization+time+on+the+accuracy+of+expression+ratios%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Oligodeoxyribonucleotide probe accessibility on a three-dimensional DNA microarray surface and the effect of hybridization time on the accuracy of expression ratios.</a> BMC Biotechnology. 3, 6(2003).</li>
<li>Heiat, M., Ranjbar, R., Latifi, A. M., Rasaee, M. J., Farnoosh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+strategies+to+optimize+asymmetric+PCR+conditions+as+a+reliable+method+to+generate+large+amount+of+ssDNA+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Applied+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Essential strategies to optimize asymmetric PCR conditions as a reliable method to generate large amount of ssDNA aptamers.</a> Biotechnology and Applied Biochemistry. 64 (4), 541-548 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Zanieczyszczenia dsDNA są głównym problemem w amplifikacji ssDNA. Minimalizacja amplifikacji dsDNA w konwencjonalnej asymetrycznej amplifikacji PCR pozostaje trudna15. Ponadto, chociaż ulepszenia techniczne w zakresie generowania ssDNA umożliwiły nam zwiększenie wydajności przepływu próbek, izolacja ssDNA jest nadal problematyczna ze względu na wysokie koszty i niepełną wydajność oczyszczania.
Asymetryczny PCR jest jedną z najtrudniejszych metod stosowanych podczas prac...

Jednoniciowe DNA (ssDNA) było szeroko rozważane jako molekularny element rozpoznający (MRE) ze względu na jego wewnętrzne właściwości do hybrydyzacji DNA-DNA1,2. Rozwój systemów syntetycznych ssDNA może prowadzić do zastosowań biologicznych, takich jak mikromacierze DNA3, oligoterapie, diagnostyka i zintegrowane wykrywanie molekularne oparte na interakcjach uzupełniających4,5.
Do tej pory, mikrometrowe cząstki polimeru zostały z powodzeniem zademonstrowane za pomocą urządzeń mikroprzepływowych. Udowodniono, że kilka technik mikroprzepływowych jest skutecznych w wytwarzaniu wysoce jednorodnych mikrosfer przy ciągłym przepływie w środowisku mikrokanałowym6,7.
W badaniu Lee et al.8, zgłoszono opartą na kropelkach platformę mikroprzepływową do mikroprzepływowej syntezy kopolimeryzowalnych oligo-mikrosfer i amplifikacji ssDNA. Platforma mikroprzepływowa składa się z dwóch warstw PDMS (polidimetylosiloksan): górnej części z siecią kanałów mikroprzepływowych do generowania mikrosfery i dolnej płaskiej części. Składają się one z trzech rodzajów kanałów fluidycznych PDMS: 1) kanału skupiającego przepływ do generowania kropel, 2) kanału serpentynowego do mieszania dwóch roztworów oraz 3) kanału polimeryzacji sekwencyjnej do krzepnięcia mikrosfery. Po wprowadzeniu dwóch niemieszających się przepływów do jednego kanału przepływowego PDMS, przepływy te mogą być wymuszone przez strukturę wąskiego otworu. Zachowania przepływu, takie jak geometria kanału, natężenie przepływu i lepkość, wpływają na rozmiar i morfologię mikrosfery. W związku z tym główny strumień cieczy można podzielić na monosfery w mikroskali9,10.
Tutaj dostępny jest szczegółowy protokół mikrosferycznego PCR do amplifikacji ssDNA. W pierwszej kolejności opisano proces projektowania urządzeń mikroprzepływowych opartych na kropelkach. Następnie wyjaśniono sposób, w jaki mikrosfery poliakrylamidu mogą być funkcjonalizowane za pomocą losowej matrycy DNA w sposób komplementarny. Na koniec pokazano protokół mikrosferycznego PCR do amplifikacji ssDNA.

<table><tbody><tr><td>ciekły polidimetylosiloksan, PDMS</td><td>Dow Corning Inc.</td><td>Sylgard 184</td><td>Składniki chipa</td></tr><tr><td>40% Akrylamid:bis roztwór (19:1)</td><td>Bio-rad</td><td>1610140</td><td>Składniki kopolimeryzowalnej oligomikrosfery</td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu, APS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3678</td><td>Utwardzacz akryloamidu:bis roztwór</td></tr><tr><td>N,N,N&prime;,N&prime;-tetrametyloetylenodiamina, TEMED</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9281</td><td>Katalizator nadsiarczanu amonu</td></tr><tr><td>Olej mineralny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M5904</td><td>Tabela 1. Rozwiązanie III. Składnik odczynników mikrosferycznych</td></tr><tr><td>Cy3 komplementarnych sond oligonukleotydowych</td><td>zsyntetyzowanych</td><td>przez Bioneer</td><td>Tabela 3. Informacje o sekwencji&nbsp;</td></tr><tr><td>Sonda znakowana akrydytem ssDNA</td><td>Zsyntetyzowana</td><td>przez Bioneer</td><td>Tabela 1. Roztwór I. Składnik odczynników</td></tr><tr><td>mikrosferycznych Tris</td><td>Biosesang</td><td>&nbsp; T1016</td><td>Składniki buforu TE, roztwór buforowy pH</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EDS</td><td>Składniki buforu TE, usuwanie jonów (Ca2+)</td></tr><tr><td>Ex taq</td><td>Takara</td><td>RR001A</td><td>amplifikacja ssDNA</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny&nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM 510</td><td>Identyfikacja oligonukleotydów na powierzchni mikrosfery</td></tr><tr><td>Mikroskop świetlny</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>eclipse 80i</td><td>Obliczanie liczby mikrosfer</td></tr><tr><td>T100 Thermal Cycler</td><td>Bio-rad</td><td>1861096</td><td>amplifikacja ssDNA</td></tr><tr><td>Ręczna obróbka koronowa</td><td>Electro-Technic</td><td>BD-20AC Laboratoryjna obróbka koronowa</td><td>Hydrofilowa obróbka powierzchni</td></tr><tr><td>Płyta grzejna</td><td>Jako jedna</td> płyta grzewcza <td>HI-1000</td><td>do utwardzania cieczy PDMS</td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa</td><td>kd Scientific</td><td>78-1100</td><td>Równomierny przepływ roztworu I i roztworu II Sprężarka</td></tr><tr><td></td><td>Kohands</td><td>KC-250A</td><td>Kontrola przepływu roztworu III</td></tr><tr><td>Bright-Line Hemacytometr</td><td>Sigma</td><td>Aldrich Z359629</td><td>Obliczanie liczby mikrosfer</td></tr></tbody></table>

podejście mikroprzepływowe oparte na kropelkach i amplifikacja mikrosferyczno-pcr dla jednoniciowych amplikonów dna

A Droplet-Based Microfluidic Approach and Microsphere-PCR Amplification for Single-Stranded DNA Amplicons

Mikrofluidyka oparta na kropelkach umożliwia niezawodną produkcję jednorodnych mikrosfer w kanale mikroprzepływowym, zapewniając kontrolowaną wielkość i morfologię uzyskanej mikrosfery. Udało się wytworzyć mikrosferę skopolimeryzowaną za pomocą sondy akrylowo-DNA. Do syntezy jednoniciowego DNA (ssDNA) można zastosować różne metody, takie jak asymetryczny PCR, trawienie egzonukleazą i izolacja na kulkach magnetycznych pokrytych streptawidyną. Jednak metody te nie mogą efektywnie wykorzystywać dużych ilości wysoko oczyszczonego ssDNA. W tym miejscu opisujemy protokół mikrosferycznego PCR, szczegółowo opisujący, w jaki sposób ssDNA może być skutecznie amplifikowane i oddzielane od dsDNA po prostu przez pipetowanie z probówki reakcyjnej PCR. Amplifikacja ssDNA może być stosowana jako potencjalne odczynniki dla procesów mikromacierzy DNA i DNA-SELEX (Systematyczna ewolucja ligandów przez wykładnicze wzbogacanie).

Opracowana polimerowa mikrofluidyczna platforma oparta na kroplach składa się z dwóch warstw PDMS (Rysunek 1a). Do generowania mikrosfer wykorzystano trzy rodzaje sieci kanałów mikrofluidycznych: 1) geometrię skupiania przepływu (flow-focusing), jak pokazano na Rysunku 1b, 2) kanał serpentynowy do mieszania roztworu I i roztworu II oraz 3) kanał polimeryzacji do utwardzania mikrosfer. Wysokość wszystkich kanałów wynosiła 60 μm. D...

Ta praca dostarcza metody wytwarzania platform mikroprzepływowych opartych na kropelkach oraz zastosowania mikrosfer poliakrylamidowych do amplifikacji mikrosferycznej PCR. Metoda microsphere-PCR umożliwia otrzymanie jednoniciowych amplikonów DNA bez rozdzielania dwuniciowego DNA.

Podejście mikroprzepływowe oparte na kropelkach i amplifikacja mikrosferyczno-PCR dla jednoniciowych amplikonów DNA

Droplet-based microfluidics enable the reliable production of homogeneous microspheres in the microfluidic channel, providing controlled size and ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w technice kombinatorycznej systemu mikroprzepływowego i dziedzinie biotechnologii molekularnej, takiej jak urządzenia mikroprzepływowe i metoda asymetrii PCR. Głównymi zaletami tej techniki jest wydajne wytwarzanie wysoce zhomogenizowanych mikrosfer oraz produkcja jednoniciowego DNA bez dodatkowych etapów separacji. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku diagnozy lub terapii różnych chorób.Ponieważ generowanie jednoniciowego DNA ma kluczowe znaczenie dla testów ap-ta-mo-sis, można je wykorzystać do wykrywania i leczenia. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w trójwymiarowy system mikroprzepływowy w MEMS, może być również stosowana do innych systemów stosowanych do wykrywania i leczenia chorób. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności z prawidłowym kontrolowaniem płynów płynących w odwrotnym kierunku.Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie dla obserwacji powstawania mikrosfer w geometrii skupiającej przepływ i krzepnięcia generowanych mikrosfer. Najpierw przygotuj 20 mililitrów płynnego prepolimeru PDMS, mieszając polimer bazowy i katalizator w stosunku 10 do jednego. Wlej 10 mililitrów płynnego PDMS na przygotowaną formę SU-8 na płytce krzemowej dla górnej części sieci mikroprzepływowej.W przypadku dolnej płaskiej części wlej tę samą objętość płynnego PDMS na płytkę krzemową bez struktury formy. Umieść dwie płytki krzemowe pokryte ciekłym prepolimerem PDMS na rozgrzanej płycie grzejnej i utwardzaj w temperaturze 75 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie ręcznie oderwij utwardzoną warstwę PDMS od formy SU-8.Dopasuj okrągłe narzędzie do dziurkowania o średnicy 1,5 milimetra do portu oleju w replikowanej sieci mikroprzepływowej, aby połączyć kanały przepływu w skali mikronowej z próbkami makropłynów. Następnie ręcznie wybij otwór przelotowy. Po trzykrotnym powtórzeniu procesu wykrawania należy wykonać hydrofilową obróbkę powierzchni zarówno na górnej, jak i dolnej warstwie PDMS za pomocą ręcznej obróbki koronowej przez kilka sekund na próbkę.Ułóż dwie warstwy PDMS poddane obróbce plazmowej i podgrzewaj w temperaturze 90 stopni Celsjusza przez 30 minut na płycie grzejnej w procesie łączenia PDMS z PDMS. Wirować i krótko odwirować standardową jednoniciową sondę DNA znakowaną akrydytem i roztwór podstawowy akryloamidu w proporcji 19 do jednego. Przygotuj pierwszy roztwór, mieszając 25 mikrolitrów 40% roztworu akryloamidu, 10 mikrolitrów jednoniciowego DNA, 10 mikrolitrów buforu 5X TBE i pięć mikrolitrów wody.Przygotuj roztwór drugi z 50 mikrolitrami 20% nadsiarczanu amonu. Przygotować dwie strzykawki wypełnione pojedynczo roztworem pierwszym i roztworem drugim, a następnie zamontować je na pompie strzykawkowej, aby wprowadzić przepływy roztworu do platformy mikroprzepływowej. Przygotować olej mineralny zmieszany z 0,4% TEMED do zestalenia powierzchni mikrosfery.Po napełnieniu szklanej butelki olejem mineralnym włóż dwie rurki do portów pneumatycznych i płynów w nakrętce szklanej butelki jako zbiornik mikroprzepływowy. Podłącz rurki między szklaną butelką a portem oleju w urządzeniu mikroprzepływowym. Podłącz rurki do dwóch portów roztworu w urządzeniu mikroprzepływowym, aby dostarczyć dwa roztwory z pomp strzykawkowych.Następnie włóż rurki do portu wylotowego w celu przeniesienia wytworzonej mikrosfery do zlewki. Następnie ustaw natężenie przepływu pompy strzykawkowej na 0,4 do 0,7 mililitra na godzinę. Wyreguluj ciśnienie sprężonego powietrza w sprężarce za pomocą regulatora.Umieść szklaną zlewkę z mieszadłem magnetycznym na płycie grzejnej i ustaw prędkość obrotową. Uruchomić pompę strzykawkową i dostarczyć sprężone powietrze wytwarzane przez zewnętrzną sprężarkę do szklanej butelki za pomocą przełącznika on-off zaworu elektromagnetycznego. Za pomocą mikroskopu cyfrowego obserwuj powstawanie mikrosfer w geometrii ogniskowania przepływu i krzepnięcie generowanych mikrosfer w szklanej zlewce.Obserwacja powstawania mikrosfer jest jednym z najbardziej krytycznych etapów, ponieważ jest to główny proces w tym badaniu mający na celu wytworzenie mikrosfer i układu mikroprzepływowego. Następnie przenieś 100 mikrolitrów mikrosfer do 1,5 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej. Następnie usunąć supernatant przez delikatne odwirowanie i pipetowanie.Ponownie zawiesić komplementarną cyjaninę-3 zmodyfikowaną sondą, używając 100 mikrolitrów buforu 1X TE, aby osiągnąć końcowe stężenie 100 mikromolowych. Następnie dodaj 100 mikromoli komplementarnej cyjaniny-3 modyfikowanej sondą do sterylnej 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówkowej zawierającej kopolimeryzowane mikrosfery AP. Postukaj kilka razy w probówkę, aby wymieszać i inkubować w temperaturze pokojowej w ciemności przez godzinę.Po inkubacji odrzucić supernatant i usunąć pozostały bufor poprzez pipetowanie. Następnie spłucz trzykrotnie 500 mikrolitrami buforu TE. Umieść mikrosfery na szkiełku podstawowym o wymiarach 75 na 50 milimetrów i przykryj folią aluminiową przed obrazowaniem.Uzyskaj około 25 mikrosfer poprzez zliczanie mikroskopowe za pomocą mikroskopu świetlnego o 40-krotnym powiększeniu. Następnie połącz wszystkie odczynniki zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Umieść próbki w termocyklerze i rozpocznij asymetryczny PCR w odpowiednich warunkach.Pobranie supernatantu po asymetrycznym PCR jest jednym z najbardziej krytycznych kroków, ponieważ jest to główny proces generowania jednoniciowego DNA z mikrosferą. Po amplifikacji dodaj osiem mikrolitrów bufora ładującego 6X do każdej próbki. Załaduj 15 mikrolitrów każdej próbki do 2% żelu agarozowego.Następnie wykonuj elektroforezę przy napięciu 100 woltów przez 35 minut w buforze 1X TAE. Umieść zhybrydyzowane mikrosfery w uchwycie i przymocuj uchwyt do stolika mikroskopu konfokalnego. Wybierz laser i włącz go w sterowniku lasera.Wybierz soczewkę obiektywu w sterowaniu mikroskopu. Następnie wybierz żądany filtr dla cyjaniny-3 i kanału w kontrolce konfiguracji. Na koniec rozpocznij eksperyment i obserwuj próbkę.Wytworzona polimerowa platforma mikroprzepływowa oparta na kropelkach składa się z dwóch warstw PDMS. Do generowania mikrosfer wykorzystuje się trzy rodzaje sieci kanałów mikroprzepływowych, którymi są geometria skupiająca przepływ, kanał serpentynowy do mieszania roztworów pierwszego i drugiego oraz kanał polimeryzacyjny do krzepnięcia mikrosfery. Laboratoryjny pneumatyczny system sterowania ciągłym przepływem oleju mineralnego oraz dwie pompy strzykawkowe do przepływu roztworu zostały wykorzystane do generowania mikrosfer w platformie mikroprzepływowej.Jeśli mikrosfery są prawidłowo funkcjonalizowane za pomocą pięciokrotnej sondy DNA akrylowego, powinny one skutkować pokryciem aktywności fluorescencyjnej na powierzchni podczas eksperymentu hybrydyzacji, jak pokazano na tych obrazach fluorescencyjnych. Jeśli kopolimeryzacja nie zachodzi prawidłowo, obraz mikrosfery optycznej będzie wykazywał wewnętrzne zanieczyszczenie wewnątrz mikrosfer. Manipulowanie powierzchnią 3D mikrosfer za pomocą oligosondy DNA jest znacznie szybszym procesem, a platforma syntezy mikrosfer w przepływie może zapewnić narzędzie do amplifikacji i oczyszczania jednoniciowego DNA.Początkowo skopolimeryzowany pięciokrotny AP zapewnia trzypierwszorzędny koniec hydroksylowy do polimeryzacji DNA po wyżarzaniu do jego komplementarnej matrycy. W eksperymencie asymetrycznej PCR zaobserwowano dwuniciowe zanieczyszczenia DNA. Otrzymany jednoniciowy DNA zgromadzony w wyniku mikrosferycznego PCR wykazano przez porównanie z syntetycznymi markerami wielkości za pomocą analizy elektroforezy żelowej.Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że wcześniejsza wiedza na temat protokołów i regulacji, które są powszechnie niezbędne do optymalizacji eksperymentów PCR, jest wymagana do uzyskania cyklu amplifikacji, temperatury wyżarzania i sekwencji sondy w tej metodzie. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się diagnostyką i terapią do połączenia dwóch regionów w biotechnologii molekularnej i biomedycynie. Nie zapominaj, że praca z roztworem akrylamidu może być niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek i fartuchów laboratoryjnych.

a-droplet-based-microfluidic-approach-microsphere-pcr-amplification

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Mikrofluidyczne platformy kropelkowe są obiecującymi narzędziami do eksperymentów wysokoprzepustowych, ponieważ umożliwiają one niskokosztowe generowanie piko-litrowych, samoczynnie odseparowanych komór z częstotliwością rzędu kHz. Dzięki integracji z szybkimi, czułymi i wysokorozdzielczymi metodami spektroskopii fluorescencyjnej, duże ilości informacji generowanych w tych systemach mogą być efektywnie wydobywane, przetwarzane i wykorzystywane.

Metody detekcji fluorescencyjnej dla mikroprzepływowych platform kroplkowych

W tym filmie prezentujemy krok po kroku procedurę generowania emulgowanych nanokropelek do wykrywania docelowych kwasów nukleinowych za pomocą cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy lub dPCR.

Kropelkowa cyfrowa reakcja łańcuchowa polimerazy: metoda generowania reakcji PCR nanokropelkowych w celu wykrywania rzadkich mutacji nowotworowych

Ten film pokazuje rolę cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej w identyfikacji mutacji indel w próbce DNA. Wysoka precyzja i czułość ddPCR umożliwiają dokładne i spójne wykrywanie rzadkich mutacji obecnych w próbce, nawet przy niskich poziomach. Może identyfikować i określać ilościowo mutacje indel w różnych regionach genomu, dostarczając cennych informacji na temat mechanizmów mutacji i funkcjonalnych konsekwencji tych mutacji.

Cyfrowa reakcja łańcuchowa polimerazy kropelkowej do wykrywania mutacji indel w genach docelowych

Ten film opisuje technikę amplifikacji jednoniciowego DNA za pomocą mikrosfer polimerowych pokrytych oligonukleotydami w reakcji jednoprobówkowej. W wyniku tego procesu uzyskuje się czyste jednoniciowe DNA, które można dalej wykorzystać do sekwencjonowania DNA i analizy mikromacierzy.

Reakcja łańcuchowa polimerazy mikrosferycznej w celu amplifikacji jednoniciowego DNA

Ten film demonstruje technikę reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej multipleksowej do jednoczesnej kwantyfikacji regionów metylowanego DNA w różnych populacjach białych krwinek jako wczesnego biomarkera dla diagnozy klinicznej i prognozowania.

Reakcja łańcuchowa polimerazy kropelkowej Multiplex w celu wykrycia metylacji DNA w leukocytach

Ten film pokazuje użyteczność cyfrowego PCR w formacie chip-in-a-tube do wykrywania zmian pojedynczych nukleotydów w próbkach DNA. Pojedyncza reakcja PCR jest dzielona na komory, które działają jako niezależne reakcje PCR, a wykrywanie sygnałów fluorescencyjnych ze amplifikowanych celów w komorach służy do obliczenia częstotliwości wariantu allelu w próbce.

Cyfrowy PCR oparty na chip-in-a-tube do ilościowego oznaczania wariantów pojedynczych nukleotydów

Opisujemy cyfrowy test końcowy do ilościowego oznaczania kwasów nukleinowych za pomocą uproszczonego (analogowego) odczytu. Mierzymy fluorescencję masową kropelkowych testów cyfrowych za pomocą standardowej maszyny qPCR, a nie specjalistycznego oprzyrządowania, i potwierdzamy nasze wyniki za pomocą mikroskopii.

Prosty masowy odczyt cyfrowych testów ilościowych kwasów nukleinowych

Sekwencjonowanie pojedynczych komórek ujawnia niejednorodność genotypową w systemach biologicznych, ale obecnym technologiom brakuje przepustowości niezbędnej do głębokiego profilowania składu i funkcji społeczności. W tym miejscu opisujemy mikroprzepływowy przepływ pracy do sekwencjonowania &gt;50 000 genomów jednokomórkowych z różnych populacji komórek.

Ultraprzepustowa platforma mikroprzepływowa do sekwencjonowania genomu pojedynczej komórki

Tutaj prezentujemy protokół do dokładnego ilościowego oznaczania wielu zmian genetycznych regionu docelowego w jednej reakcji za pomocą drop-off ddPCR i unikalnej pary sond hydrolizy.

Cyfrowa reakcja łańcuchowa polimerazy z pojedynczą kroplą do kompleksowego i jednoczesnego wykrywania mutacji w obszarach hotspotów

Markery epigenetyczne są używane do podtypowania białych krwinek (WBC) poprzez kwantyfikację wzorców metylacji DNA. Protokół ten przedstawia metodę reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej (mdPCR) przy użyciu urządzenia mikroprzepływowego na bazie elastomeru termoplastycznego (TPE) do generowania kropel, co pozwala na precyzyjną i specyficzną dla metylacji multipleksową docelową kwantyfikację różnic WBC.

Specyficzny dla metylacji multipleksowy PCR kropelkowy przy użyciu generatora kropel polimerowych do diagnostyki hematologicznej

Testy kropelek wody w oleju są przydatne do chemii analitycznej, ewolucji enzymów i analizy pojedynczych komórek, ale zazwyczaj wymagają mikrofluidyki do formowania kropel. W tym miejscu opisujemy emulgację z szablonami cząstek, bezprzepływowe podejście do wykonywania testów kropelkowych.

Emulgacja szablonowa cząstek umożliwia oznaczanie kropel bez mikroprzepływowości

Poznaj metodę mikroprzepływową opartą na kropelkach i amplifikację mikrosferyczno-PCR do produkcji jednoniciowych amplikonów DNA bez dodatkowej separacji. Technika ta znajduje zastosowanie w diagnostyce i terapii chorób.

Podejście mikroprzepływowe oparte na kropelkach i amplifikacja mikrosferyczno-PCR dla jednoniciowych amplikonów DNA

Przeglądaj więcej filmów