Name: Wytwarzanie indukowanych przez koniugację fluorescencyjnych pegylowanych cząstek wirusopodobnych za pomocą chemii dibromomaleimidowo-dwusiarczkowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Poznaj metodę bio-koniugacji do fluorescencyjnej funkcjonalizacji cząstek wirusopodobnych Qβ zawierających wiązania dwusiarczkowe. Technika ta umożliwia wprowadzenie nowych grup funkcyjnych i tworzenie fluoroforów w jednej reakcji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

J.J.G. dziękuje National Science Foundation (DMR-1654405) oraz Cancer Prevention Research Institute of Texas (CPRIT) (RP170752s) za ich wsparcie.

1. Przygotowanie
<ol>
	<li>Przygotuj agar z bulionu lizogennego (LB) i wlej talerze12.</li>
	<li>Przekształć BL21(DE3) za pomocą plazmidu pET28 zawierającego sekwencję białka płaszcza wtQβ.
	<ol>
		<li>Rozmrozić kompetentne komórki E. coli BL21(DE3) w łaźni lodowej. Umieść 50 μl komórek w probówce do mikrowirówki.</li>
		<li>Dodaj 2 μl plazmidu do jednej probówki i delikatnie przesuń probówkę. Następnie inkubować na lodzie przez 30 minut.</li>
		<li>Szok termiczny komórek przez 45 s w łaźni wodnej o temperaturze dokładnie 42 °C. Natychmiast po szoku cieplnym umieścić probówkę z powrotem w łaźni lodowej i inkubować przez 5 minut.</li>
		<li>Dodać 950 μl pożywki LB, która nie zawiera żadnego antybiotyku.</li>
		<li>Potrząsać kulturą z prędkością 200 obr./min przez 60 minut w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Umieścić 100 μl kultury na płytkach agarowych LB (z kanamycyną) i inkubować szalkę przez noc w temperaturze 37 °C. W razie potrzeby wybrać białe kolonie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj pożywkę Super Optimal Bulion (SOB).
	<ol>
		<li>Dwie 2-litrowe kolby Erlenmeyera z przegrodami w autoklawie w cyklu superdry.</li>
		<li>W aseptycznym środowisku odważyć i dodać do każdej kolby 20,0 g tryptonu, 5,0 g ekstraktu drożdżowego, 2,469 g bezwodnego siarczanu magnezu, 0,584 g chlorku sodu i 0,186 g chlorku potasu.</li>
		<li>Doprowadzić objętość do 1 l ultraczystą wodą w każdej kolbie i autoklawie w cyklu cieczowym.</li>
		<li>Gdy pożywka SOB osiągnie temperaturę pokojową po autoklawowaniu, dodać 1 ml kanamycyny (100 mg/ml) do każdego litra pożywki i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować 0,1 M bufor fosforanu potasu (pH 7,00).
	<ol>
		<li>Przygotować 1 M jednozasadowy roztwór potasu, rozpuszczając 68,045 g jednozasadowego potasu w 500 ml ultraczystej wody.</li>
		<li>Przygotować 1 M roztwór dwuzasadowy potasu, rozpuszczając 87,09 g dwuzasadowego potasu w 500 ml ultraczystej wody.</li>
		<li>Do butelki o pojemności 1 l dodać 38,5 ml jednozasadowego roztworu potasu i 61,5 ml dwuzasadowego potasu.</li>
		<li>W razie potrzeby dostosuj pH do 7,00 i doprowadź do objętości 1 l.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonać 5–40% gradientów sacharozy w 0,1 M buforze fosforanu potasu (pH 7,00).
	<ol>
		<li>W probówkach wirówkowych o pojemności 50 ml przygotować roztwory zawierające 5–40% (zwiększając się w krokach co 5%) sacharozę rozpuszczoną w 0,1 M buforze fosforanu potasu (pH 7,00).</li>
		<li>Umieść 3,3 ml 5% roztworu sacharozy na dnie 38 ml okrągłodennej probówki z poliwęglanu za pomocą długiej strzykawki igłowej i powtórz to dla pięciu innych probówek.</li>
		<li>Ostrożnie umieść 3,3 ml 10% roztworu sacharozy na dnie probówki i ostrożnie wyjmij igłę, aby nie zakłócić gradientu. Powtórz dla pozostałych pięciu probówek. 
		 </li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kontynuuj osadzanie 3,3 ml warstw roztworów sacharozy, zwiększając od 15% do 40% w każdej probówce, zachowując ostrożność, aby nie zakłócić gradientu.</li>
	<li>Po zakończeniu przykryć wierzchołki gradientów folią i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
2. Wyrażenie Qβ
<ol>
	<li>Przetrzyj powierzchnię stołu wybielaczem/etanolem w stosunku 1:1.</li>
	<li>Wykonaj dwie kultury starterowe o pojemności 3 ml w środowisku aseptycznym poprzez dodanie pojedynczych kolonii E. coli BL21(DE3) do 3 ml pożywki SOB w środowisku aseptycznym .</li>
	<li>Uprawiaj na wytrząsarce z prędkością 250 obr./min w pomieszczeniu o temperaturze 37 °C i wilgotności względnej 0% (rH) przez noc.</li>
	<li>Zaszczepić kulturę starterową w pożywce SOB:
	<ol>
		<li>Wyjąć z wytrząsarki obie kultury starterowe o pojemności 3 ml i w aseptycznym środowisku wlać każdą kulturę starterową do jednej z dwóch 2-litrowych kolb Erlenmeyera z przegrodami o pojemności 2 litrów, z których każda zawiera 1 litr świeżej pożywki SOB.</li>
		<li>Umieścić zaszczepioną pożywkę na wytrząsarce z prędkością 250 obr./min w pomieszczeniu o temperaturze 37 °C i wilgotności względnej 0%.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hoduj bakterie na wytrząsarce z prędkością 250 obr./min w pomieszczeniu o temperaturze 37 °C i wilgotności względnej 0%, aż OD600 osiągnie 0,9–1,0.</li>
	<li>Dodać 1 ml 1 M tiogalaktopiranozydu izopropylu β-D-1 (IPTG) za pomocą pipety P1000 w celu wywołania ekspresji białka.</li>
	<li>Pozostaw media na wytrząsarce z prędkością 250 obr./min w pomieszczeniu o temperaturze 37 °C i wilgotności względnej 0% na noc. </li>
	<li>Następnego ranka wyjąć pożywkę z wytrząsarki i odwirować ją przy użyciu butelek o pojemności 1000 ml o stężeniu 20,621 × g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C w celu zebrania komórek.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i zebrać osad komórkowy.
	<ol>
		<li>Wlej supernatant do kolby z około 5 ml wybielacza, aby zabić bakterie. To jest marnotrawstwo.</li>
		<li>Za pomocą szpatułki zeskrob osad komórkowy z dna butelki wirówki i włóż osad do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Oczyszczanie Qβ
<ol>
	<li>Zawiesić osad komórkowy za pomocą ~20–30 ml 0,1 M buforu fosforanu potasu (pH 7,00).</li>
	<li>Upewnij się, że resuspension nie ma kawałków i poddać komórki lizie za pomocą procesora mikrofluidyzatora zgodnie z protokołem producenta (patrz Tabela materiałów). Poddaj komórki lizie co najmniej dwa razy, aby zwiększyć wydajność cząstek.</li>
	<li>Odwirować lizat w butelkach wirówkowych o pojemności 250 ml przy 20,621 x g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Wyrzucić osad i zmierzyć objętość supernatantu w ml. Pomnóż tę wartość przez 0,265 i dodaj tę ilość g siarczanu amonu do supernatantu.</li>
	<li>Mieszać w temperaturze 4 °C przez co najmniej 1 godzinę na płytce mieszającej z prędkością 200 obr./min, aby wytrącić białko.</li>
	<li>Wirować w butelkach o pojemności 250 ml przy 20,621 x g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad z około 10 ml 0,1 M buforu fosforanu potasu (pH 7,00).</li>
	<li>Dodać równe objętości chloroformu/n-butanolu w stosunku 1:1 do surowej próbki i mieszać przez wirowanie przez kilka sekund.</li>
	<li>Wirować w probówkach o pojemności 38 ml w temperaturze 20,621 × g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odzyskaj górną warstwę wodną za pomocą pipety Pasteura. Należy uważać, aby nie pobrać żadnej warstwy przypominającej żel, która utworzyła się między warstwą wodną a organiczną.</li>
	<li>Rozmrozić sześć gotowych gradientów sacharozy o sacharozie 5–40% i naładować na każdy z nich około 2 ml ekstraktu.</li>
	<li>Ultrawirówka przy 99,582 x g przez 16 godzin w temperaturze 4 °C ze swobodnym opóźnieniem.</li>
	<li>Zapal diodę elektroluminescencyjną (LED) pod każdą rurką, a niebieski pasek powinien stać się widoczny. Odzyskaj te cząstki za pomocą strzykawki z długą igłą.</li>
	<li>Ultragranulować cząstki w temperaturze 370,541 x g przez 2,5 godziny w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić przezroczystą osadkę oczyszczonych cząstek z 0,1 M buforem fosforanu potasu (pH 7,00).</li>
</ol>
4. Kwantyfikacja i potwierdzenie produktu
<ol>
	<li>Użyj testu Bradforda, aby określić ilościowo produkt13.</li>
	<li>Uruchom redukującą i nieredukującą elektroforezę w żelu poliakryloamidowym dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE), aby potwierdzić produkt14. 
	UWAGA: Redukcja SDS-PAGE służy do potwierdzenia masy cząsteczkowej białka płaszcza; nieredukcyjna SDS-PAGE ma na celu potwierdzenie struktury wyższego rzędu.</li>
</ol>
5. Sprzężenie związków DB na Qβ
<ol>
	<li>Zmniejsz dwusiarczki na Qβ.
	<ol>
		<li>Rozpuścić 0,0020 g tris(2-karboksetylo)fosfiny (TCEP) w 1 ml ultraczystej wody, aby uzyskać 100-krotny roztwór podstawowy. 
		UWAGA: Przygotuj świeży TCEP przed redukcją.</li>
		<li>Dodać 200 μl Qβ (5 mg/ml) do probówki mikrowirówkowej.</li>
		<li>Następnie dodaj 20 μl 100x roztworu podstawowego TCEP.</li>
		<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ponowne mostkowanie zredukowanego disiarczku za pomocą glikolu polietylenowego dibromomaleimidu (DB-PEG).
	<ol>
		<li>Rozpuścić 0,0017 g glikolu dibromomaleimidowo-polietylenowego (DB-PEG) w 100 μl DMF.</li>
		<li>Dodać 680 μl 10 mM roztworu fosforanu sodu (pH 5,00).</li>
		<li>Dodać zredukowany Qβ do roztworu DB-PEG i obserwować proces mieszania pod lampą UV 365 nm. Jasnożółtą fluorescencję można natychmiast uwidocznić za pomocą ręcznej lampy UV 365 nm po zmieszaniu.</li>
		<li>Pozwól reakcji postępować przez noc w temperaturze pokojowej (RT) na rożnie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mieszaninę reakcyjną oczyścić za pomocą filtra odśrodkowego (COMW = 10 kDa) trzykrotnie, używając 1x PBS przy 3,283 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Monitoruj koniugację za pomocą nieredukcyjnej SDS-PAGE i natywnej elektroforezy w żelu agarozowym. 
	UWAGA: VLP działają jako nienaruszone cząstki w natywnym żelu agarozowym i są rozdzielane na podstawie ich ładunku, wielkości i kształtu.</li>
</ol>

<ol><li>Pokorski, J., Breitenkamp, K., Liepold, L., Qazi, S., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Virus-Based+Polymer-Protein+Nanoparticles+by+Atom+Transfer+Radical+Polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Functional Virus-Based Polymer-Protein Nanoparticles by Atom Transfer Radical Polymerization.</a> J. Am. Chem. Soc. 133 (24), 9242-9245 (2011).</li>
<li>Capehart, S., Coylet, M., Glasgow, J., Francis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+Integration+of+Gold+Nanoparticles+and+Organic+Fluorophores+Using+Synthetically+Modified+MS2+Viral+Capsids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Controlled Integration of Gold Nanoparticles and Organic Fluorophores Using Synthetically Modified MS2 Viral Capsids.</a> J. Am. Chem. Soc. 135 (8), 3011-3016 (2013).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Template-Directed+Synthesis+of+Porous+and+Protective+Core-Shell+Bionanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Template-Directed Synthesis of Porous and Protective Core-Shell Bionanoparticles.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 55 (36), 10691-10696 (2016).</li>
<li>Chen, Z., Li, N., Li, S., Dharmarwardana, M., Schlimme, A., Gassensmith, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+Chemistry%3A+The+Chemical+Functionalization+of+Viral+Architectures+to+Create+New+Technology%5BTitle%5D)+AND+%22WIREs.+Nanomed.+Nanobiotechnol%22%5BJournal%5D)">Viral Chemistry: The Chemical Functionalization of Viral Architectures to Create New Technology.</a> WIREs. Nanomed. Nanobiotechnol. 8 (4), 512-534 (2015).</li>
<li>Chalker, J. M., Bernardes, G. J. L., Lin, Y. A., Davis, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+modification+of+proteins+at+cysteine%3A+opportunities+in+chemistry+and+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+-+Asian+J%22%5BJournal%5D)">Chemical modification of proteins at cysteine: opportunities in chemistry and biology.</a> Chem. - Asian J. 4 (5), 630-640 (2009).</li>
<li>Le, D. H., Lee, K. L., Shukla, S., Commandeur, U., Steinmetz, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potato+Virus+X%2C+a+Filamentous+Plant+Viral+Nanoparticle+for+Doxorubicin+Delivery+in+Cancer+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Potato Virus X, a Filamentous Plant Viral Nanoparticle for Doxorubicin Delivery in Cancer Therapy.</a> Nanoscale. 9 (6), 2348-2357 (2017).</li>
<li>Chen, L., Wu, Y., Yuan, L., Wang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-templated+FRET+Platform+for+the+Rational+Design+of+Ratiometric+Fluorescent+Nanosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Comm%22%5BJournal%5D)">Virus-templated FRET Platform for the Rational Design of Ratiometric Fluorescent Nanosensors.</a> Chem. Comm. 51 (50), 10190-10193 (2015).</li>
<li>Lee, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer+Structure+and+Conformation+Alter+the+Antigenicity+of+Virus-like+Particle-Polymer+Conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Polymer Structure and Conformation Alter the Antigenicity of Virus-like Particle-Polymer Conjugates.</a> J. Am. Chem. Soc. 139 (9), 3312-3315 (2017).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acsmacrolett.7b00049">Polymer-Protein Core-Shell Nanoparticles for Enhanced Antigen Immunogenicity.</a> ACS Macro Lett. 6 (4), 442-446 (2017).</li>
<li>Brown, S. D., Fielder, J. D., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+Hybrid+Bacteriophage+Qbeta+virus-like+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Assembly of Hybrid Bacteriophage Qbeta virus-like particles.</a> Biochemistry. 48 (47), 11155-11157 (2009).</li>
<li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+Functionalization+across+Quaternary+Structure+in+a+Virus-+like+Particle%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorescent Functionalization across Quaternary Structure in a Virus- like Particle.</a> Bioconjugate Chem. 28 (9), 2277-2283 (2017).</li>
<li>Addgene. Pouring LB Agar Plates. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/pouring-lb-agar-plates/">https://www.addgene.org/protocols/pouring-lb-agar-plates/</a> (2016).</li>
<li>Bio-Rad. Bradford Protein Assay. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/4110065A.pdf">http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/4110065A.pdf</a> (2017).</li>
<li>Bio-Rad. Guide to Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Detection. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6040.pdf">http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6040.pdf</a> (2017).</li>
<li>Smith, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Modification%2C+Bioconjugation%2C+and+Disulfide+Bridging+Using+Bromomaleimides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Protein Modification, Bioconjugation, and Disulfide Bridging Using Bromomaleimides.</a> J. Am. Chem. Soc. 132 (6), 1960-1965 (2010).</li>
<li>Castaneda, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mild+Synthesis+of+N-functionalised+Bromomaleimides%2C+Thiomaleimides+and+Bromopyridazinediones%5BTitle%5D)+AND+%22Tetrahedron+Lett%22%5BJournal%5D)">A Mild Synthesis of N-functionalised Bromomaleimides, Thiomaleimides and Bromopyridazinediones.</a> Tetrahedron Lett. 54 (27), 3493-3495 (2013).</li>
<li>Fiedler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+Mutations+Change+the+Structure+and+Stability+of+a+Virus-+Like+Particle%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Engineered Mutations Change the Structure and Stability of a Virus- Like Particle.</a> Biomacromolecules. 13 (8), 2339-2348 (2012).</li>
<li>Manzenrieder, F., Luxenhofer, R., Retzlaff, M., Jordan, R., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilization+of+Virus-like+Particles+with+Poly%282-oxazoline%29s%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Stabilization of Virus-like Particles with Poly(2-oxazoline)s.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 50 (11), 2601-2605 (2011).</li>
<li>Chen, Z., Li, N., Chen, L., Lee, J., Gassensmith, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+Functionalized+Bacteriophage+Q%CE%B2+as+a+Photocaged+Drug+Carrier%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Dual Functionalized Bacteriophage Qβ as a Photocaged Drug Carrier.</a> Small. 12 (33), 4563-4571 (2016).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W porównaniu z oczyszczaniem mniejszych białek, unikalnym etapem oczyszczania bakteriofaga Qβ jest wirowanie w gradiacji sacharozy. Po etapie ekstrakcji chloroformem/n-butanolem, Qβ jest dalej oczyszczany przy użyciu 5-40% gradientów sacharozy. Podczas wirowania cząstki są oddzielane na podstawie ich rozmiarów. Większe cząstki przemieszczają się do obszaru o wyższej gęstości, podczas gdy mniejsze cząstki pozostają w obszarze o niższej gęstości. Qβ przemieszcza się do dolnej jednej trzeciej gradientu i pozostaje tam, podc...

Wykorzystanie nano-rozmiarowych kapsydów wirusowych stało się ekscytującą dziedziną, która ma na celu poszerzenie zakresu zastosowań w badaniach biomedycznych1,2,3. Rekombinowane cząstki wirusopodobne (VLP) są strukturalnie wywodzące się z wirusów, ale brakuje im oryginalnego materiału genetycznego wirusa, co czyni je niezakaźnymi nanocząstkami białkowymi. Ponieważ cechy powierzchni są programowane genetycznie, a każdy kapsyd ulega ekspresji identycznie jak te przed i po nim, możliwe jest poznanie lokalizacji i liczby reaktywnych łańcuchów bocznych aminokwasów z atomistyczną precyzją. W wielu przypadkach zarówno powierzchnia zewnętrzna, jak i wewnętrzna zawierają wiele rodzajów reszt aminokwasowych wystawionych na działanie rozpuszczalników, które można funkcjonalizować poprzez reakcje biokoniugacji - reakcje, które tworzą wiązania kowalencyjne między biomolekułą a cząsteczką syntetyczną4,5.
Reakcje biokoniugacji pomagają interesującym biomolekułom uzyskać bardziej zróżnicowane funkcje w stosunkowo prosty sposób. Cząsteczki będące przedmiotem zainteresowania, takie jak leki terapeutyczne6, znaczniki fluorescencyjne7 i polimery8,9 mogą być wstępnie zsyntetyzowane i scharakteryzowane, zanim zostaną przyłączone do powierzchni VLP. Szczególnie powszechnym VLP w badaniach biomedycznych i biomateriałowych jest VLP oparty na bakteriofagu Qβ, który, w rekombinacji wyrażony, jest dwudziestościennym kapsydem wirusowym o długości fali 28 nm<klasa sup="xref">10. Najczęstszymi miejscami reakcji na Qβ są lizyny z dużym marginesem, chociaż niedawno poinformowaliśmy o udanej koniugacji związków dibromomaleimidu 11 ze zredukowanymi dwusiarczkami, które wyściełają pory Qβ w reakcji Haddletona-Bakera. Reakcja przebiega z dobrą wydajnością i, co równie ważne, bez utraty stabilności termicznej cząstek. Jednocześnie reakcja ta generuje fluorescencję indukowaną koniugacją, która może być wykorzystana do śledzenia wchłaniania tych cząstek do komórek. W tej pracy demonstrujemy koniugację glikolu polietylenowego (PEG) na powierzchni Qβ w wyniku reakcji Haddletona-Bakera, w wyniku której powstaje jasnożółty fluorofor. Cząstki te mogą być następnie śledzone, gdy są pobierane przez komórki. Niniejszy protokół pomoże naukowcom w generowaniu nowych fluorescencyjnych pegylowanych nanocząstek białkowych opartych na Qβ, chociaż jego zasady mają zastosowanie do jednego z wielu innych VLP zawierających dwusiarczki narażone na działanie rozpuszczalników.

<table><tbody><tr><td>Rosół LB (młynarz)&nbsp;</td><td>EMD Millipore</td><td>1.10285.0500</td><td></td></tr><tr><td>Trypton, Poweder</td><td>Research Products International</td><td>T60060-1000.0</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy, Poweder</td><td>Research Products International</td><td>Y20020-1000.0</td><td></td></tr><tr><td>Bezwodny siarczan magnezu</td><td>P212121</td><td>CI-06808-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu (krystaliczny / certyfikowany ACS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>Elga PURELAB Flex 3 System oczyszczania wody</td><td>Fisher Scientific 4474524</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monobasic Fosforan potasu</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-1</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu dwuzasadowy bezwodny</td><td>Fisher Scientific</td><td>P288-500</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>S25590B</tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818500</td><td></td></tr><tr><td>Izopropyl &beta;-D-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I6758-1G</td><td></td></tr><tr><td>Fiberlite F10-4x1000 Wirnik LEX&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>096-041053</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan amonu</td><td>P212121</td><td>KW-0066-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Alfa Aesar</td><td>32614-M6</td><td></td></tr><tr><td>1-butanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A399-4</td><td></td></tr><tr><td>SW 28 Ti Rotor - łyżka wahadłowa, aluminiowa</td><td>redlica Beckman 342204</td><td>: SW 28 Ti Rotor/ 342217: Zestaw</td><td></td>łyżek</tr><tr><td>Typ 70 Ti Rotor, stały kąt, Tytan, 8 x 39 mL,</td> <td>Beckman Coulter</td><td>337922</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie (Bradford) Test białka</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI23200</td><td></td></tr><tr><td>TRIS Chlorowodorek Produkty</td><td>Badawcze Międzynarodowe</td><td>T60050-1000.0</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametyloetylenodiamina</td><td>Alfa Aesar</td><td>J63734-AC</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek tris(2-karboksyetylo)fosfiny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4706-2G</td><td></td></tr><tr><td>2 3-dibromomaleimid 97%</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>553603-5G</td><td></td></tr><tr><td>Glikol polietylenowy</td><td>Alfa Aesar</td><td>41561-22</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC424375000</td><td></td></tr><tr><td>Akrylamid / bis-akryloamid</td><td>P212121</td><td>RP-A11310-500.0</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3771-100G</td><td></td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP179-100</td><td></td></tr><tr><td>FV3000 konfokalny laserowy mikroskop skaningowy</td><td>Olympus&nbsp;</td><td>FV3000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Rewolwer Labnet Regulowany rotator&nbsp;</td><td>Thomas Naukowy&nbsp;</td><td>Numer katalogowy 1190P25&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Butelka o wysokiej wydajności 1000 ml Sorvall, PC, z aluminiową nakrętką&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>010-1459</td><td></td></tr><tr><td>Butelki wirówkowe Nalgene z nakrętkami, kopolimer polipropylenu</td><td>Thermo Scientific</td><td>3141-0250</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Probówki okrągłodenne; 38 ml; PC</td><td>Thermo Scientific</td><td>3117-0380</td><td></td></tr><tr><td>2 L Kolby Erlenmeyera z wąską szyjką i obrzeżem o dużej wytrzymałości</td><td>Pyrex</td><td>4980-2L</td><td></td></tr><tr><td>Filtry odśrodkowe Amicon Ultra-4</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC801024</td><td></td></tr><tr><td>M-110P Procesor materiałów mikrofluidyzatora</td><td>Microfluidics</td><td>M-110P</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Szybkie probówki wirówkowe z poliwęglanu z okrągłym dnem</td><td>Thermo Scientific</td><td>3117-0380PK</td><td></td></tr><tr><td>Butelka, z zespołem nakrętki, poliwęglan</td><td>Beckman Coulter</td><td>41121703</td><td></td></tr><tr><td>cylinder, z podziałką - polipropylen 250 mL</td><td>PolyLab</td><td>80005</td><td></td></tr><tr><td>533LS-E Series</td><td>Getinge</td><td>533LS-E</td> - TrueLine - Płytka do hodowli <td></td></tr><tr><td>komórkowych, poddana obróbce, PS, 96 Well, z pokrywką</td><td>LabSource</td><td>D36-313-CS</td><td></td></tr><tr><td>Stożkowa probówka wirówkowa Falcon 15 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>Probówka mikrocentyfuga: 1,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka orbitalna VWR Os-500</td><td>VWR Scientifc Products</td><td>14005-830</td><td></td></tr><tr><td>Systemy ręcznego odlewania Tetra</td><td>Bio-Rad</td><td>1658000FC</td><td></td></tr><tr><td>Polipropylen, 250 ml</td><td>Beckman Coulter</td><td>41121703</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofluorometr NanoDrop</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3300</td><td></td></tr><tr><td>z długą igłą&nbsp;</td><td>Hamilton&nbsp;</td><td>7693</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki Exel International o pojemności od 5 do 6 cm³ Luer Lock</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-841-46</td><td></td></tr><tr><td>P1000 Pipetman</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>P200 Pipetman</td><td>Gilson</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>P100 Pipetman</td><td>Gilson</td><td>F123615</td><td></td></tr><tr><td>P20 Pipetman</td><td>Gilson</td><td>F123600</td><td></td></tr><tr><td>P10 Pipetman</td><td>Gilson</td><td></td><td></td>F144802</tr><tr><td>Intel Weighing PM-100 Laboratoryjna klasyczna waga laboratoryjna o wysokiej precyzji</td><td>Inteligentna technologia ważenia</td><td>IWT_PM100</td><td></td></tr><tr><td>Stożkowa probówka wirówkowa Falcon 50 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>4&ndash; 15% Mini-PROTEAN TGX Gel, 10 dołków, 50 i mikro; l</td><td>Bio-Rad</td><td>456-1084</td><td></td></tr></tbody></table>

wytwarzanie indukowanych przez koniugację fluorescencyjnych pegylowanych cząstek wirusopodobnych za pomocą chemii dibromomaleimidowo-dwusiarczkowej

Making Conjugation-induced Fluorescent PEGylated Virus-like Particles by Dibromomaleimide-disulfide Chemistry

Niedawny wzrost liczby wirusopodobnych cząsteczek (VLP) w badaniach biomedycznych i materiałowych można przypisać ich łatwości biosyntezy, dyskretnemu rozmiarowi, programowalności genetycznej i biodegradowalności. Chociaż są one bardzo podatne na reakcje biokoniugacji w celu dodania syntetycznych ligandów do ich powierzchni, zakres metodologii biokoniugacji na tych wodnych kapsydach jest stosunkowo ograniczony. Aby ułatwić kierunek badań nad biomateriałami funkcjonalnymi, należy rozważyć nietradycyjne reakcje biokoniugacji. Reakcja opisana w tym protokole wykorzystuje dibromomaleimidy do wprowadzenia nowej funkcjonalności w wiązaniach dwusiarczkowych wystawionych na działanie rozpuszczalnika VLP na bazie bakteriofaga Qβ. Co więcej, produkt końcowy jest fluorescencyjny, co ma dodatkową zaletę w postaci generowania sondy in vitro do śledzenia przy użyciu dostępnego na rynku zestawu filtrów.

Pochodne dibromomaleimidu mogą być syntetyzowane poprzez reakcję kondensacji między bezwodnikiem dibromomaleimidu a aminami pierwszorzędowymi15. Alternatywnie, zastosowano łagodną metodę syntetyczną16 z wykorzystaniem aktywowanego N-metoksykarbonylo-3,4-dibromomaleimidu, który po reakcji z metoksypolietylenoglikolem (PEG) dał DB-PEG (Rycina 1). Do identyfikacji struktury związku wykorzystano NMR (<strong class="...

Tutaj prezentujemy procedurę fluorescencyjnej funkcjonalizacji dwusiarczków na Qβ VLP za pomocą dibromomaleimidu. Opisujemy ekspresję i oczyszczanie Qβ, syntezę cząsteczek funkcjonalizowanych dibromomaleimidem oraz reakcję koniugacji między dibromomaleimidem a Qβ. Powstała w ten sposób żółta fluorescencyjna sprzężona cząstka może być używana jako sonda fluorescencyjna wewnątrz komórek.

Wytwarzanie indukowanych przez koniugację fluorescencyjnych pegylowanych cząstek wirusopodobnych za pomocą chemii dibromomaleimidowo-dwusiarczkowej

The recent rise in virus-like particles (VLPs) in biomedical and materials research can be attributed to their ease of biosynthesis, discrete size, ...

Ogólnym celem tej metody biokoniugacji jest funkcjonalizacja fluorescencyjna cząsteczek wirusopodobnych zawierających mostki dwusiarczkowe. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące reakcji biokoniugacji w przypadku cząsteczek wirusopodobnych, które posiadają ograniczoną liczbę reszt aminokwasowych poddających się funkcjonalizacji. Główną zaletą tej techniki jest możliwość jednoczesnego wprowadzenia nowych grup funkcyjnych i utworzenia fluoroforów indukowanych koniugacją w ramach jednej reakcji. Wierzymy, że poza Q-Beta reakcję tę można zastosować do każdych cząsteczek wirusopodobnych posiadających wiązania dwusiarczkowe.Przed rozpoczęciem procedury ekspresji bakteriofaga Q-Beta należy przetrzeć powierzchnię blatu roztworem wybielacza i etanolu w stosunku 1:1. W warunkach aseptycznych należy przygotować dwie kultury startowe o objętości 3 mL, dodając pojedyncze kolonie E.coli BL21 do pożywki SOB. Kultury należy inkubować w pomieszczeniu o temperaturze 37 °C i 0% wilgotności względnej, przy wytrząsaniu z prędkością 250 rpm przez noc. Następnego dnia należy wyjąć obie kultury startowe o objętości 3 mL z inkubatora i w warunkach aseptycznych przelać każdą z nich

making-conjugation-induced-fluorescent-pegylated-virus-like-particles

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Wytwarzanie fluorescencyjnych cząstek wirusopodobnych pokrytych PEG przy użyciu chemii dibromomaleimidu i wiązań dwusiarczkowych

Przedstawiamy dwukolorowy test fluorescencyjny in vitro, służący do wizualizacji fuzji pojedynczych cząsteczek wirusa z płynną dwuwarstwą docelową. Poprzez znakowanie cząsteczek wirusowych fluoroforami, które różnicowo barwią błonę wirusa oraz jego wnętrze, jesteśmy w stanie monitorować kinetykę hemifuzji i tworzenia się porów.

Metoda pomiaru kinetyki fuzji wirusowej na poziomie pojedynczych cząsteczek

Wykorzystując postępy w opracowywaniu fluoroforów oraz technologii obrazowania, opracowano prostą metodę znakowania wirusa dengi barwnikami Alexa Fluor w celu wizualizacji wczesnych oddziaływań między wirusem a komórką.

Wizualizacja wirusa dengi za pomocą znakowania Alexa Fluor

Cząsteczki adenowirusów są modyfikowane tak, aby zawierały albo nienaturalny analog aminokwasu azydohomoalaninę, albo azydocukier O-GlcNAz. Grupa azydowa każdego z nich jest chemoselektywnie łączona za pomocą reakcji chemii „click” w celu modyfikacji powierzchni wirusa.

Chemoselektywna modyfikacja powierzchni wirusów za pomocą bioortogonalnej chemii klik

Nanocząstki wirusowe pochodzenia roślinnego (VNPs) stanowią obiecujące platformy do zastosowań w biomedycynie. W niniejszym materiale opisujemy procedury propagacji, oczyszczania, charakteryzacji oraz biokoniugacji roślinnych VNP. Na koniec przedstawiamy zastosowanie VNP w celowanym dostarczaniu do guzów oraz obrazowaniu z wykorzystaniem modelu ksenoprzeszczepu u myszy i obrazowania fluorescencyjnego.

Nanocząsteczki wirusowe do obrazowania guzów in vivo

Source: Olety, B., et. al., Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes. J. Vis. Exp. (2016)This study demonstrates a fluorescence-based assay to observe the membrane-binding behavior of human immunodeficiency virus type-1 structural protein. Using synthetic giant unilamellar vesicles as model membranes, the assay visualizes protein recruitment and assembly, mimicking early steps of viral particle formation.

Visualizing Viral Structural Protein Assembly on Giant Unilamellar Vesicle Membranes

Źródło: Natilla, A.,and Hammond, R. W. Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs. J. Vis. Exp. (2013)W niniejszym filmie zaprezentowano specyficzne dla miejsca znakowanie fluorescencyjne zmutowanych cząsteczek wirusopodobnych (VLP) wytworzonych w Nicotiana benthamiana przy użyciu barwnika reaktywnego wobec grup tiolowych, a następnie ich oczyszczanie i...

Znakowanie reszt cysteiny dostępnych na powierzchni w zmodyfikowanych cząsteczkach wirusopodobnych

Źródło: Chen, Z., et al. Making Conjugation-induced Fluorescent PEGylated Virus-like Particles by Dibromomaleimide-disulfide Chemistry. J. Vis. Exp. (2018)W niniejszym filmie zaprezentowano metodę kontrolowanej ekspresji białka kapsydu bakteriofaga Qβ w zmodyfikowanych szczepach E. coli. Powstałe białka ulegają samoroskładaniu w cząsteczki przypominające wirusy (VLP), które są następnie pozyskiwane do dalszej biokoniugacji.

Produkcja cząsteczek wirusopodobnych w zmodyfikowanych E. coli

Źródło: Chen, Z., et al. Making Conjugation-induced Fluorescent PEGylated Virus-like Particles by Dibromomaleimide-disulfide Chemistry. J. Vis. Exp. (2018)Niniejszy film prezentuje fluorescencyjną funkcjonalizację cząstek wirusopodobnych poprzez ponowne sieciowanie zredukowanych mostków dwusiarczkowych za pomocą łącznika z glikolu polietylenowego (PEG), co pozwala na otrzymanie stabilnych, możliwych do śledzenia koniugatów odpowiednich do obrazowania komórkowego i celowanego dostarczania w...

Funkcjonalizacja fluorescencyjna cząsteczek przypominających wirusy poprzez ponowne tworzenie mostków dwusiarczkowych

Szybki i modułowy protokół generowania rekombinowanych wirusów krowianki wyrażających fluorescencyjnie znakowane białka jednocześnie przy użyciu metody przejściowej selekcji dominującej jest opisany tutaj.

Metodologia wydajnego wytwarzania znakowanych fluorescencyjnie białek wirusa krowianki

Ilustrujemy tutaj test wiązania błon in vitro, w którym interakcje między HIV-1 Gag a błonami lipidowymi są wizualnie analizowane za pomocą znakowanego YFP Gag syntetyzowanego w systemie translacji in vitro opartym na kiełkach pszenicy i GUV przygotowanych techniką elektroformacji.

Wizualizacja wiązania knebla HIV-1 z błonami gigantycznych pęcherzyków jednowarstwowych (GUV)

Zaprojektowaliśmy białko kapsydu wirusa zapalenia wątroby typu E jako nanocząstkę teranostyczną (HEVNP). HEVNP samoorganizuje się w stabilną klatkę dwudziestościenną podczas dostarczania błony śluzowej. W tym miejscu opisujemy modyfikację HEVNP do celowania w guz poprzez mutację reszt wystawionych na powierzchni do cystein, które sprzęgają syntetyczne ligandy, które specyficznie wiążą komórki nowotworowe.

Funkcjonalizacja powierzchni nanocząstek wirusa zapalenia wątroby typu E przy użyciu metod koniugacji chemicznej

Poznaj metodę bio-koniugacji do fluorescencyjnej funkcjonalizacji cząstek wirusopodobnych Qβ zawierających wiązania dwusiarczkowe. Technika ta umożliwia wprowadzenie nowych grup funkcyjnych i tworzenie fluoroforów w jednej reakcji.

Wytwarzanie indukowanych przez koniugację fluorescencyjnych pegylowanych cząstek wirusopodobnych za pomocą chemii dibromomaleimidowo-dwusiarczkowej (Wideo) | JoVE Journal

Wytwarzanie indukowanych przez koniugację fluorescencyjnych pegylowanych cząstek wirusopodobnych za pomocą chemii dibromomaleimidowo-dwusiarczkowej

Przeglądaj więcej filmów