Wytwarzanie indukowanych przez koniugację fluorescencyjnych pegylowanych cząstek wirusopodobnych za pomocą chemii dibromomaleimidowo-dwusiarczkowej

Ogólnym celem tej metody biokoniugacji jest funkcjonalizacja fluorescencyjna cząsteczek wirusopodobnych zawierających mostki dwusiarczkowe. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące reakcji biokoniugacji w przypadku cząsteczek wirusopodobnych, które posiadają ograniczoną liczbę reszt aminokwasowych poddających się funkcjonalizacji. Główną zaletą tej techniki jest możliwość jednoczesnego wprowadzenia nowych grup funkcyjnych i utworzenia fluoroforów indukowanych koniugacją w ramach jednej reakcji. Wierzymy, że poza Q-Beta reakcję tę można zastosować do każdych cząsteczek wirusopodobnych posiadających wiązania dwusiarczkowe.

Przed rozpoczęciem procedury ekspresji bakteriofaga Q-Beta należy przetrzeć powierzchnię blatu roztworem wybielacza i etanolu w stosunku 1:1. W warunkach aseptycznych należy przygotować dwie kultury startowe o objętości 3 mL, dodając pojedyncze kolonie E.coli BL21 do pożywki SOB. Kultury należy inkubować w pomieszczeniu o temperaturze 37 °C i 0% wilgotności względnej, przy wytrząsaniu z prędkością 250 rpm przez noc. Następnego dnia należy wyjąć obie kultury startowe o objętości 3 mL z inkubatora i w warunkach aseptycznych przelać każdą z nich do dwulitrowej kolby Erlenmeyera z przegrodami zawierającej jeden litr świeżej pożywki SOB. Obie kolby z zaszczepioną pożywką należy umieścić na wytrząsarce z prędkością 250 rpm w pomieszczeniu o temperaturze 37 °C i 0% wilgotności względnej. Bakterie należy hodować do momentu osiągnięcia gęstości optycznej przy 600 nanometrach (OD 600) w zakresie od 0,9 do 1,0. Zazwyczaj trwa to około pięciu godzin. Gdy kultury osiągną pożądaną wartość OD 600, należy użyć pipety P1000, aby dodać jeden mililitr jednomolarnego IPTG do każdej kolby w celu indukcji ekspresji białka. Kolby należy pozostawić na wytrząsarce w ciepłym pomieszczeniu przez noc.

Następnego dnia rano wyjmij kolby z wytrząsarki, przelej zawartość każdej z nich do butelki o pojemności jednego litra i wiruj przy 20 621 ×g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jedną godzinę, aby zebrać komórki. Po zakończeniu wirowania usuń nadsącz, wlewając go do kolby zawierającej około pięciu mililitrów wybielacza w celu zabicia bakterii.

Aby zebrać osad komórkowy, należy go zeskrobać ze dna butelki do wirówki za pomocą szpatułki, a następnie przenieść do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.

Aby rozpocząć procedurę oczyszczania Q-Beta, resuspender każdy osad komórkowy w 20 do 30 ml 0,1-molarnego buforu fosforanowego potasu, pH 7. Należy upewnić się, że w zawiesinie nie ma grudek. Komórki należy poddać lizie za pomocą mikrofluidyzera zgodnie z protokołem producenta. Lizę komórek należy przeprowadzić co najmniej dwukrotnie, aby zwiększyć wydajność cząstek. Lizaty należy przenieść do butelek wirówkowych o pojemności 250 ml i wirować przy 20 621 ×g w temperaturze 4 °C przez jedną godzinę. Należy zmierzyć objętość supernatantu w ml. Wartość tę należy pomnożyć przez 0,265, a następnie dodać do supernatantu odpowiadającą tej liczbie ilość siarczanu amonu w gramach. Należy dodać mieszadło magnetyczne i mieszać na mieszadle w temperaturze 4 °C przy 200 rpm przez co najmniej jedną godzinę, aby wytrącić białko. Odwiruj w butelkach 250 ml przy 20 621 ×g w temperaturze 4 °C przez godzinę. Należy odrzucić supernatant i resuspender osad w około 40 ml 0,1-molarnego buforu fosforanowego potasu, pH 7. Do surowej próbki należy dodać równą objętość mieszaniny chloroform:n-Butanol w stosunku 1:1 i mieszać w wortexie przez kilka sekund. Mieszaninę należy przenieść do probówki o pojemności 38 ml. Wirować przy 20 621 ×g w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Za pomocą pipety należy odzyskać górną warstwę wodną. Należy uważać, aby nie pobrać żadnej części warstwy żelowej, która utworzyła się między warstwą wodną a organiczną.

Następnie rozmrozić przygotowane wcześniej gradienty sacharozy od 65 do 40%. Nanieść około dwóch mililitrów ekstraktu na każdy gradient.

Wirowanie w ultrawirówce przy 99 582 ×g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 16 godzin z wolnym hamowaniem. Po zakończeniu ultrawirowania należy oświetlić każdą probówkę diodą LED, aby potwierdzić widoczność niebieskiego prążka. Do odzyskania tych cząstek należy użyć strzykawki z długą igłą. Następnie cząstki należy poddać ultrawirowaniu w celu otrzymania osadu przy 370 541 ×g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 2,5 godziny. Otrzymany osad oczyszczonych cząstek powinien być przezroczysty. Należy odlać nadsącz i resuspender osad w 0,1-molarnej buforze fosforanowym potasu o pH 7.

Ten schemat przedstawia konjugację, która zostanie zademonstrowana. Aby zredukować wszystkie mostki disiarczkowe i uzyskać zredukowane kapsydy Q-Beta w temperaturze pokojowej w ciągu jednej godziny, stosuje się 10 równoważników Tris(2-karboksyetylo)fosfiny lub TCEP w stosunku do mostków disiarczkowych w jednym miligramie Q-Beta. Bezpośrednio przed redukcją mostków disiarczkowych w Q-Beta należy przygotować świeży roztwór TCEP.

Rozpuścić 0,002 g TCEP w 1 mL ultra czystej wody, aby przygotować 100-krotny roztwór zapasowy. Do probówki do mikrocentryfugi dodać 200 µL Q-Beta o stężeniu 5 mg/mL. Następnie do probówki dodać 20 µL 100-krotnego roztworu zapasowego TCEP. Inkubować w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę.

W międzyczasie należy przygotować roztwór glikolu polietylenowego z dibromomaleimidem (DB-PEG) do późniejszej reakcji ponownego mostkowania zredukowanych dwusiarczków. Rozpuścić 0,0017 g DB-PEG w 100 µL dimetyloformamidu. Dodać 680 µL 10 mM roztworu fosforanu sodu o pH 5. Następnie dodać zredukowane Q-Beta do roztworu DB-PEG i obserwować proces mieszania za pomocą przenośnej lampy UV o długości fali 365 nm. Po wymieszaniu powinna być natychmiast widoczna jasna żółta fluorescencja. Reakcję należy prowadzić przez noc w temperaturze pokojowej na rotatorze.

Następnego dnia oczyszczamy mieszaninę reakcyjną za pomocą filtra do wirowania, używając 1X PBS przy 3 283 ×g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 minut. Na koniec monitorujemy koniugację za pomocą nieredukującej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym SDS oraz natywnej elektroforezy w żelu agarozowym.

Koniugację DB-PEG z Q-Beta potwierdzono za pomocą nieredukującej elektroforezy żelowej SDS-PAGE w świetle UV oraz barwienia błękitem Coomassie. Wszystkie prążki fluorescencyjne współlokalizowały się z barwieniem błękitem Coomassie, co świadczy o pomyślnym przeprowadzeniu koniugacji. Integralność koniugatów Q-Beta-PEG potwierdzono za pomocą natywnej elektroforezy w żelu agarozowym oraz transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Górna mikrofotografia przedstawia Q-Beta-maleimid (Q-Beta-M), a dolna mikrofotografia przedstawia Q-Beta-PEG. Spektroskopia fluorescencyjna Q-Beta-M oraz Q-Beta-PEG w 0,1 M buforze fosforanowym potasu wykazała maksimum wzbudzenia w okolicach 400 nm oraz maksimum emisji w zakresie od 540 do 550 nm. Po inkubacji Q-Beta-PEG z komórkami makrofagów mysich w bezsurowiczym medium DMEM, a następnie zabarwieniu jąder komórkowych, obrazy ko-lokalizacji wykazują, że żółte fluorescencyjne cząsteczki zostały pobrane przez komórki i mogą być śledzone po czterech godzinach inkubacji.

W przeciwieństwie do nich, niefunkcjonalizowane cząsteczki wirusopodobne Q-Beta wykazują pomijalną fluorescencję.

Niniejszy protokół może pomóc badaczom w oczyszczeniu Q-Beta w ciągu czterech dni oraz przeprowadzeniu nocnej reakcji koniugacji z ponownym tworzeniem mostków. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że reakcja koniugacji przebiega najefektywniej w warunkach kwasowych, np. przy pH 5.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak oczyszczać VLP Q-Beta oraz jak ponownie tworzyć mostki dwusiarczkowe za pomocą związków dibromomaleimidu w celu otrzymania VLP znakowanych fluorescencyjnie. Po opracowaniu technika ta dostarczyła badaczom dodatkowego uchwytu funkcjonalnego, który może być wykorzystany do dwufunkcjonalizacji zewnętrznej powierzchni bakteriofaga Q-Beta.