Wytwarzanie indukowanych przez koniugację fluorescencyjnych pegylowanych cząstek wirusopodobnych za pomocą chemii dibromomaleimidowo-dwusiarczkowej

Tutaj prezentujemy procedurę fluorescencyjnej funkcjonalizacji dwusiarczków na Qβ VLP za pomocą dibromomaleimidu. Opisujemy ekspresję i oczyszczanie Qβ, syntezę cząsteczek funkcjonalizowanych dibromomaleimidem oraz reakcję koniugacji między dibromomaleimidem a Qβ. Powstała w ten sposób żółta fluorescencyjna sprzężona cząstka może być używana jako sonda fluorescencyjna wewnątrz komórek.

Ogólnym celem tej metody biokoniugacji jest fluorescencyjna funkcjonalizacja cząstek wirusopodobnych zawierających dwusiarczek. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w reakcji biokoniugacji dla cząstek wirusopodobnych, które mają ograniczoną liczbę reszt aminokwasowych, które można funkcjonalizować. Główną zaletą tej techniki jest to, że za pomocą jednej reakcji można wprowadzić nowe grupy funkcyjne i jednocześnie powstać fluorofory indukowane koniugacją.

Oprócz QBeta uważamy, że tę reakcję można zastosować do dowolnych cząstek wirusopodobnych, które posiadają wiązania dwusiarczkowe. Przed rozpoczęciem procedury odciągania bakteriofaga QBeta należy przetrzeć obszar stołu roztworem wybielacza i etanolu w stosunku 1:1. W środowisku aseptycznym wykonaj dwie trzymililitrowe kultury starterowe, dodając pojedyncze kolonie E.coli BL21 do pożywki SOB.

Hoduj kultury w pomieszczeniu o temperaturze 37 stopni Celsjusza i wilgotności względnej 0%, wytrząsając z prędkością 250 obr./min przez noc. Następnego dnia wyjmij obie trzymililitrowe kultury starterowe z wytrząsarki i w aseptycznym środowisku wlej każdą kulturę starterową do dwulitrowej kolby Erlenmeyera z jednym litrem świeżej pożywki SOB. Umieścić dwie kolby z zaszczepionymi pożywkami na wytrząsarce z prędkością 250 obr./min w pomieszczeniu o temperaturze 37 stopni Celsjusza i wilgotności względnej 0%.

Hoduj bakterie, aż osiągną gęstość optyczną przy 600 nanometrach lub OD 600 od 0,9 do 1,0. Zwykle trwa to około pięciu godzin. Gdy kultury osiągną pożądaną średnicę zewnętrzną 600, użyj pipety P1000, aby dodać jeden mililitr jednomolowego IPTG do każdej kolby w celu wywołania ekspresji białka.

Pozostawić na noc kolby na wytrząsarce w ciepłym pomieszczeniu. Następnego ranka wyjmij kolby z shakera, przenieś zawartość każdej kolby do jednolitrowej butelki i odwiruj przy 20 621 razy grawitacji w czterech stopniach Celsjusza przez jedną godzinę w celu zebrania komórek. Po zakończeniu wirowania wyrzuć supernatant, wlewając go do kolby z około pięcioma mililitrami wybielacza, aby zabić bakterie.

Aby zebrać osad komórkowy, użyj szpatułki, aby zeskrobać osad komórkowy z dna butelki wirówki i przenieś osad do 50-mililitrowej probówki wirówkowej. Aby rozpocząć procedurę oczyszczania QBeta, ponownie zawiesić każdą komórkę za pomocą 20 do 30 mililitrów 0,1-molowego buforu fosforanu potasu o pH 7. Upewnij się, że ponowne zawieszenie nie ma żadnych kawałków.

Lizuj komórki za pomocą procesora mikrofluidyzatora zgodnie z protokołem producenta. Poddaj komórki lizie co najmniej dwa razy, aby zwiększyć wydajność cząstek. Przenieś lizaty do 250-mililitrowych butelek wirówkowych i wiruj przy 20, 621 razy grawitacji w czterech stopniach Celsjusza przez jedną godzinę.

Zmierz objętość supernatantu w mililitrach. Pomnóż tę wartość przez 0,265, a następnie dodaj do supernatantu tę ilość w gramach siarczanu amonu. Dodaj mieszadło i mieszaj na talerzu mieszającym z prędkością 200 obr./min w czterech stopniach Celsjusza przez co najmniej godzinę, aby wytrącić białko.

Wirować w 250-mililitrowych butelkach przy 20, 621 razy grawitacji w czterech stopniach Celsjusza przez godzinę. Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad z około 40 mililitrami 0,1-molowego buforu fosforanu potasu o pH 7. Dodać do próbki surowej równe objętości chloroformu:n-butanolu w stosunku 1:1 i mieszać przez wirowanie przez kilka sekund.

Przenieś mieszaninę do 38-mililitrowej tuby. Wirować przy 20, 621 razy grawitacji w czterech stopniach Celsjusza przez 30 minut. Użyj pipety, aby odzyskać górną warstwę wodną.

Należy uważać, aby nie pobrać żadnej warstwy żelowej, która utworzyła się między warstwą wodną i organiczną. Następnie rozmrozić sześć gotowych gradientów sacharozy od 5 do 40%. Załaduj około dwóch mililitrów ekstraktu na każdy gradient

Ultra-wirowanie przy 99, 582 razy grawitacji w czterech stopniach Celsjusza przez 16 godzin ze swobodnym zwalnianiem. Po zakończeniu ultrawirowania zapal diodę elektroluminescencyjną pod każdą probówką, aby potwierdzić, że widoczny jest niebieski pasek. Użyj strzykawki z długą igłą, aby odzyskać te cząstki.

Ultra-granuluj cząstki w temperaturze 370, 541 razy grawitacji w czterech stopniach Celsjusza przez 2,5 godziny. Powstała osadka oczyszczonych cząstek powinna być przezroczysta. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad z 0,1-molowym buforem fosforanu potasu o pH 7.

Ten schemat pokazuje koniugację, która zostanie zademonstrowana. 10 odpowiedników tris(2-karboksyetylo)fosfiny lub TCEP w stosunku do dwusiarczków w jednym miligramie QBeta stosuje się do redukcji wszystkich dwusiarczków w celu wytworzenia zredukowanych kapsydów QBeta w temperaturze pokojowej w ciągu jednej godziny. Tuż przed redukcją dwusiarczków na QBeta przygotuj świeży roztwór TCEP.

Rozpuść 0,002 grama TCEP i jeden mililitr ultraczystej wody, aby uzyskać 100-krotny roztwór podstawowy. Dodaj 200 mikrolitrów po pięć miligramów na mililitr QBeta do probówki mikrowirówkowej. Następnie dodaj 20 mikrolitrów roztworu podstawowego 100X TCEP do probówki mikrowirówki.

Inkubować w temperaturze pokojowej przez godzinę. W międzyczasie należy przygotować glikol polietylenowy dibromomaleimidu lub roztwór DB-PEG do późniejszej reakcji ponownego mostkowania zredukowanych dwusiarczków. Rozpuść 0,0017 grama DB-PEG w 100 mikrolitrach dimetyloformamidu.

Dodać 680 mikrolitrów 10-milimolowego roztworu fosforanu sodu o pH 5. Następnie dodaj zredukowaną QBeta do roztworu DB-PEG i obserwuj proces mieszania pod ręczną lampą UV 365 nm. Po wymieszaniu powinna być natychmiast widoczna jasnożółta fluorescencja.

Pozwól reakcji postępować w temperaturze pokojowej na rożnie przez noc. Następnego ranka oczyść mieszaninę reakcyjną za pomocą filtra odśrodkowego przy użyciu 1X PBS przy 3, 283 razy grawitacji w czterech stopniach Celsjusza przez 20 minut. Na koniec monitoruj koniugację za pomocą nieredukującej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym SDS i natywnej elektroforezy w żelu agarozowym.

Koniugacja DB-PEG na QBeta została potwierdzona przez nieredukującą elektroforezę w żelu poliakrylamidowym SDS pod wpływem UV i barwienie niebieskim Coomassie. Wszystkie pasma fluorescencyjne umiejscowiły się z niebieskim zabarwieniem Coomassie, co stanowi udaną koniugację. Integralność koniugatów QBeta-PEG potwierdzono za pomocą natywnej elektroforezy w żelu agarozowym i transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Górna mikrofotografia przedstawia QBeta-maleimid lub QBeta-M, a dolna mikrofotografia pokazuje QBeta-PEG. Spektroskopia fluorescencyjna QBeta-M i QBeta-PEG w 0,1 molowym buforze fosforanu potasu wykazała maksimum wzbudzenia około 400 nanometrów i maksimum emisji około 540 do 550 nanometrów. Gdy QBeta-PEG inkubowano z mysimi komórkami makrofagów w pożywce DMEM bez surowicy, a następnie nukleostainizowano, obrazy kolokalizacyjne pokazują, że żółte fluorescencyjne cząstki zostały wchłonięte przez komórki i można je śledzić po czterech godzinach inkubacji.

Natomiast niefunkcjonalizowane cząstki podobne do wirusa QBeta wykazują znikomą fluorescencję. Protokół ten może pomóc naukowcom oczyścić QBeta w ciągu czterech dni i przeprowadzić nocną reakcję koniugacji mostkowej. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że reakcja koniugacji działa najlepiej w warunkach kwaśnych, takich jak pH 5.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak oczyścić QBeta VLP i ponownie zmostkować wiązania dwusiarczkowe ze związkami dibromomaleimidowymi, aby uzyskać znakowany fluorescencyjnie VLP. Po opracowaniu, technika ta zapewniła naukowcom dodatkowy funkcjonalny uchwyt, który może być wykorzystany do podwójnej funkcjonalizacji zewnętrznej powierzchni bakteriofaga QBeta.