Name: Rejestrowanie przestrzennie ograniczonych oscylacji w hipokampie zachowujących się myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Poznaj metodę rejestracji oscylacji hipokampalnych u swobodnie poruszających się myszy przy użyciu sond krzemowych i analizy gęstości prądu źródłowego. Technika ta umożliwia badanie lokalnej aktywności elektrycznej mózgu z wysoką rozdzielczością przestrzenną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni Karin Winterhalter i Kerstin Semmler za pomoc techniczną. Prace te były wspierane przez klaster doskonałości BrainLinks - BrainTools (EXC 1086) Niemieckiej Fundacji Badawczej.

Wszystkie metody z wykorzystaniem żywych zwierząt zostały zatwierdzone przez Regierungspräsidium Freiburg zgodnie z niemiecką ustawą o ochronie zwierząt.
1. Przygotowania
<ol>
	<li>Zaprojektować i zbudować odpowiednie narzędzie do implantacji, które tymczasowo utrzyma sondę krzemową oraz konektor elektrod podczas procesu wszczepiania. Przykład customowego narzędzia do implantacji przedstawiono na Rysunku 1.</li>
	<li>Ostrożnie wyjąć sondę krzemową i konektor elektrod z opakowania, używając pincety z ceramicznymi końcówkami.</li>
	<li>Podnieść płytkę konektora i bezpiecznie przymocować ją za pomocą zacisku typu krokodyl zamocowanego do statywu.</li>
	<li>Używając stereomikroskopu, wyrównać sondę względem narzędzia do implantacji za pomocą pincety z ceramicznymi końcówkami. Nałożyć warstwę parafiny o grubości ~2 mm, roztopioną wypalarką, aby przykleić sondę do narzędzia. Należy uważać, aby podczas tej procedury nie dotknąć trzonów sondy.</li>
	<li>Przymocować konektor elektrod do trzpienia narzędzia do implantacji za pomocą standardowej taśmy klejącej. Należy pamiętać, że w zależności od producenta, przed implantacją może być konieczne przylutowanie przewodów uziemiających do płytki konektora elektrod. Usunąć izolację z dwóch krótkich odcinków miedzianego drutu izolowanego lakierem, używając cyny naniesionej lutownicą (40 °C). Przylutować przewody uziemiające do odpowiednich slotów w płytce konektora elektrod.</li>
	<li>Usunąć izolację z dwóch dodatkowych odcinków drutu miedzianego. Każdy goły drut miedziany owinąć trzykrotnie wokół śruby ze stali nierdzewnej (średnica 1 mm, długość 2 mm). Nałożyć topnik odpowiedni do lutowania stali i przylutować drut miedziany do spodu łebka śruby. Upewnić się, że dolna połowa gwintu śruby pozostaje wolna od cyny.</li>
	<li>Użyć standardowego multimetru, aby sprawdzić kontakt elektryczny między drutem a śrubą.</li>
	<li>Zdezynfekować trzony sondy krzemowej oraz śruby uziemiające poprzez zanurzenie w 70% etanolu (10 s).</li>
	<li>Przygotować osłonę ochronną dla implantowanej sondy, przecinając na pół główkę plastikowej pipety Pasteura.</li>
</ol>
2. Operacja implantacji
<ol>
	<li>Sterylizuj narzędzia chirurgiczne (nożyczki, pęsety precyzyjne, kleszczyki chirurgiczne) za pomocą sterylizatora perłowego. Przetrzyj wszystkie powierzchnie 70% etanolem.</li>
	<li>Wprowadzić w stan znieczulenia przy użyciu 3% izofluranu w tlenie podawanym z przepływem ok. 1 l/min.
	<ol>
		<li>Do podtrzymania znieczulenia należy stosować izofluran w stężeniu 1–1,5%. Należy pamiętać, że stężenie izofluranu wymagane do uzyskania tolerancji chirurgicznej może różnić się w zależności od osobnika.</li>
		<li>Stabilną tolerancję chirurgiczną osiągnięto, gdy zwierzę nie reaguje na uciśnięcie palca. Należy monitorować częstotliwość oddechów myszy i w razie potrzeby dostosować stężenie izofluranu.</li>
		<li>Nanieś maść do oczu zwierzęcia, aby zapobiec ich wysychaniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zamocuj mysz w aparacie stereotaksycznym, delikatnie wprowadzając pręty uszne do kanału słuchowego. Po ustabilizowaniu głowy myszy za pomocą prętów usznych, załóż na pysk maskę do ciągłego podawania izofluranu. Umieść mysz na ręczniku lub podkładce na podgrzewaczu i wstrzyknij buprenorfinę podskórnie (0,05–0,1 mg/kg masy ciała), aby zapewnić przeciwbólowcze działanie pooperacyjne.</li>
	<li>Ogolić głowę standardową golarką i zdezynfekować skórę 70-procentowym etanolem. Za pomocą nożyczek chirurgicznych wykonać nacięcie skóry wzdłuż linii środkowej czaszki, a następnie rozchylić skórę przy użyciu kleszczyków chirurgicznych.</li>
	<li>Ustaw głowę zwierzęcia przy użyciu narzędzia do wyrównywania stereotaksycyjnego, tak aby wyrównać bregmę i lambdę. Różnica powinna wynosić mniej niż 50 µm odchylenia wysokości między bregma a lambda. Ponadto należy wypoziomować głowę wzdłuż osi śr. bocznej, mierząc głębokość od bregma na powierzchni czaszki w określonych odległościach po lewej i prawej stronie (np. 1 mm na lewo i prawo od bregmy). W razie potrzeby skorygować nachylenie głowy.</li>
	<li>Oczyścić główkę 3% nadtlenkiem wodoru i wytrzeć do sucha sterylnymi gazikami bawełnianymi.</li>
	<li>Wyznaczyć lokalizację kraniotomii względem bregma, korzystając z odpowiedniego atlasu stereotaksycznego12.</li>
	<li>Za pomocą wiertła o średnicy 0,9 mm należy wywiercić w kości nad móżdżkiem dwa otwory na śruby uziemiające i referencyjne. Dodatkowo zaleca się wykonanie od 1 do 3 otworów na śruby mocujące w celu stabilizacji implantu. Lokalizacja śrub mocujących zależy od miejsca wykonania kraniotomii. W przypadku implantacji do hipokampa śruby mocujące należy umieścić nad przeciwległą korą ciemieniową oraz jednostronną korą czołową. Śruby należy wprowadzić do kości za pomocą odpowiedniego śrubokręta. Należy uważać, aby nie doprowadzić do penetracji tkanki mózgowej.</li>
	<li>Wykonaj kraniotomię, powoli ścieńczając czaszkę za pomocą wiertła w obszarze prostokąta wokół miejsca implantacji. Kostkę należy często nawilżać sterylizowanym buforem fosforanowym (PB). Pozostałą cienką warstwę czaszki można delikatnie przebić i usunąć przy użyciu cienkiej igły wstrzyknięciowej (27G) oraz pęsety.</li>
	<li>Ostrożnie przebij oponę twardą cienką igłą wstrzyknięciową (27G). Wygnij końcówkę igły za pomocą pęsety, tworząc mały haczyk, a następnie pociągnij oponę twardą, aby ją usunąć. Nałóż PB, aby zapobiec wysychaniu powierzchni mózgu.</li>
	<li>Zamocuj narzędzie do wprowadzania elektrod w uchwycie stereotaktycznym, wyzeruj sondę względem punktu bregma, a następnie przesuń sondę do współrzędnych stereotaktycznych nad otworem trepanacyjnym. Powoli przebij powierzchnię mózgu. Upewnij się, że trzpienie sond nie wyginają się. Unikaj implantowania przez naczynia krwionośne.</li>
	<li>Powoli opuszczaj sondę, aż do momentu, gdy ~200 µm powyżej pożądanej głębokości. Przykryć otwór trepanacyjny oraz trzpienie sondy krzemowej sterylną wazeliną w celu ochrony. Nałożyć cement dentystyczny, aby przymocować podstawę sondy do śruby mocującej w czaszce.</li>
	<li>Bezpośrednio po nałożeniu cementu powoli przesuń sondę do docelowej głębokości. Przesuwanie ostatnich ~200 µm po aplikacji cementu zmniejsza to ruch boczny sondy i zapewnia minimalne uszkodzenie tkanek w obszarze docelowym. Należy pamiętać, że czas utwardzania zastosowanego cementu może wpływać na ten etap protokołu. W przypadku stosowania cementu szybko utwardzalnego należy pominąć ten krok i bezpośrednio zaimplantować sondę na docelową głębokość, aby uniknąć uszkodzenia krzemowej sondy.</li>
	<li>Po utwardzeniu cementu należy zwolnić sondę z narzędzia wprowadzającego, roztopiąc wosk za pomocą kauteryzatora.</li>
	<li>Uwolnij płytkę złącza z urządzenia do implantacji i umieść ją w odpowiednim miejscu na czaszce, używając zacisku typu krokodylk przymocowanego do uchwytu implantacyjnego. W przypadku implantacji sondy do hipokampa, umieść płytkę złącza na przeciwległej kości ciemieniowej. Przymocuj płytkę złącza do czaszki za pomocą cementu dentystycznego.</li>
	<li>Przylutuj przewody masy i referencyjne płytki złącza do przewodów przymocowanych do dwóch śrub nad móżdżkiem.</li>
	<li>Przytnij osłonę ochronną do odpowiedniej wysokości i nałóż ją na sondę krzemową. Przymocuj osłonę do płytki złączy oraz czaszki za pomocą cementu stomatologicznego, unikając kontaktu z skórą wokół odsłoniętej czaszki. Szycie skóry wokół miejsca implantacji zazwyczaj nie jest wymagane.</li>
</ol>
3. Rekonwalescencja po operacji
<ol>
	<li>Zastosuj odpowiednie leczenie przeciwbólowe przez co najmniej 2 dni (np. podskórne iniekcje buprenorfiny co 6 h w ciągu dnia oraz w wodzie pitnej w nocy, w połączeniu z karprofenem (4 - 5 mg/kg masy ciała) podawanym podskórnie co 24 h). Zaleca się kwaterowanie pojedyncze, aby zapobiec uszkodzeniu implantu.</li>
	<li>Zapewnij co najmniej jeden tydzień na rekonwalescencję. Skonsultuj się z lokalnymi wytycznymi dotyczącymi dobrostanu zwierząt.</li>
</ol>
4. Pozyskiwanie danych
<ol>
	<li>Rejestruj LFP od myszy poruszających się swobodnie, używając odpowiedniego systemu akwizycji danych połączonego za pomocą komutatora. Do rejestracji LFP zastosuj częstotliwość próbkowania od 1 do 5 kHz. Wyższa częstotliwość próbkowania (20 - 30 kHz) jest wymagana w przypadku chęci rejestracji wyładowań pojedynczych jednostek wraz z LFP.</li>
	<li>Przechowuj surowe pliki z zapisami poszczególnych kanałów do analizy offline.</li>
</ol>
5. Histologia
<ol>
	<li>Po zakończeniu rejestracji głęboko zanurz zwierzę w narkozie (np. 2 g/kg masy ciała uretanu wstrzykniętego domięśniowo). Potwierdź stan znieczulenia brakiem reakcji na uciśnięcie palca u nogi.</li>
	<li>Przeprowadź perfuzję transkardialną myszy przy użyciu lodowatego soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (~1 min), a następnie 4% paraformaldehydu (~10 min), stosując standardowe metody perfuzji wewnątrzsercowej13. Przed perfuzją można wykonać elektrolityczne uszkodzenie miejsc rejestracji (np. poprzez przyłożenie stałego napięcia 10 - 20 V przez maksymalnie 1 s). Alternatywnie, do identyfikacji można wykorzystać barwniki fluorescencyjne naniesione na końcówki trzpieni przed implantacją. Zaleca się przetestowanie różnych metod identyfikacji pozycji elektrod w celu uzyskania optymalnych wyników dla różnych typów sond krzemowych.</li>
	<li>Wykonaj przekroje mózgu (~10 µm) i zabarw plastry 4'-6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI, 1 µg/mL), a następnie przeprowadź trzy etapy płukania w PB (po 10 min każdy w temperaturze pokojowej).</li>
	<li>Umieść przekroje na szkiełku mikroskopowym, nałóż kroplę medium do zatapiania i przykryj przekrój szkiełkiem nakrywkowym. Pozostaw medium do wyschnięcia przez noc w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przy użyciu mikroskopu epifluorescencyjnego lub konfokalnego skanującego mikroskopu laserowego zidentyfikuj lokalizację miejsc rejestracji.</li>
	<li>W celu próby odzyskania sondy krzemowej do dalszego użytku, przytrzymaj sondę zaciskiem typu krokodyl i uwolnij ją z czaszki, ostrożnie topiąc cement dentystyczny lutownicą (40 °C). Uważaj, aby nie dotknąć trzpieni sondy podczas tej procedury!</li>
	<li>Umyj sondę w gorącej wodzie destylowanej (~80 °C, 15 min), a następnie w roztworze enzymatycznym (1% Tergazyme w wodzie destylowanej, 30 min w temperaturze pokojowej) i wykonaj kolejny etap płukania w wodzie destylowanej (15 min). Należy pamiętać, że skuteczność odzyskiwania sond jest niska.</li>
</ol>
6. Analiza CSD
<ol>
	<li>Korzystając z odpowiedniego środowiska analitycznego (np. (Python), przekształć dane LFP z pojedynczego trzpienia na CSD poprzez przybliżenie drugiej pochodnej przestrzennej wzdłuż trzpienia jako 
	<img alt="Wzór obliczeniowy CSD dla analizy danych neuronowych, przedstawiający pochodne przestrzenne sygnałów LFP." src="/files/ftp_upload/57714/57714eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie"> 
	gdzie LFPn,t czy sygnał LFP znajduje się na nth elektroda w czasie t oraz ΔTo jest błędne zapytanie. Proszę dostarczyć tekst źródłowy do tłumaczenia. jest odstępem międzyelektrodowym. Należy zauważyć, że ze względu na n-1 i nW operacjach +1 nie można oszacować CSD pierwszej i ostatniej elektrody trzpienia, co należy wziąć pod uwagę podczas rozmieszczania sondy. Zaimplementuj wzór aproksymacyjny, korzystając z krótkiego fragmentu kodu, który oblicza sygnał CSD dla każdej elektrody podczas iteracji po czasie (patrz: Supplemental Code File).</li>
	<li>Wykorzystaj uzyskany sygnał CSD do dalszej analizy (np. badanie specyficznych pasm częstotliwości oscylacji mózgu poprzez zastosowanie filtrów pasmowoprzepustowych).</li>
</ol>

<ol><li>Buzsáki, G., Draguhn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+oscillations+in+cortical+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neuronal oscillations in cortical networks.</a> Science. 304 (5679), 1926-1929 (2004).</li>
<li>Keefe, J., Recce, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+relationship+between+hippocampal+place+units+and+the+EEG+theta+rhythm%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Phase relationship between hippocampal place units and the EEG theta rhythm.</a> Hippocampus. 3 (3), 317-330 (1993).</li>
<li>Benchenane, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coherent+theta+oscillations+and+reorganization+of+spike+timing+in+the+hippocampal-prefrontal+network+upon+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Coherent theta oscillations and reorganization of spike timing in the hippocampal-prefrontal network upon learning.</a> Neuron. 66 (6), 921-936 (2010).</li>
<li>Jadhav, S. P., Kemere, C., German, P. W., Frank, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Awake+hippocampal+sharp-wave+ripples+support+spatial+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Awake hippocampal sharp-wave ripples support spatial memory.</a> Science. 336 (6087), 1454-1458 (2012).</li>
<li>Yamamoto, J., Suh, J., Takeuchi, D., Tonegawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+execution+of+working+memory+linked+to+synchronized+high-frequency+gamma+oscillations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Successful execution of working memory linked to synchronized high-frequency gamma oscillations.</a> Cell. 157 (4), 845-857 (2014).</li>
<li>Karalis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4-Hz+oscillations+synchronize+prefrontal-amygdala+circuits+during+fear+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">4-Hz oscillations synchronize prefrontal-amygdala circuits during fear behavior.</a> Nature Neuroscience. 19 (4), 605-612 (2016).</li>
<li>Khodagholy, D., Gelinas, J. N., Buzsáki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning-enhanced+coupling+between+ripple+oscillations+in+association+cortices+and+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Learning-enhanced coupling between ripple oscillations in association cortices and hippocampus.</a> Science. 358 (6361), 369-372 (2017).</li>
<li>Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+extracellular+fields+and+currents--EEG%2C+ECoG%2C+LFP+and+spikes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The origin of extracellular fields and currents--EEG, ECoG, LFP and spikes.</a> Nature Reviews Neuroscience. 13 (6), 407-420 (2012).</li>
<li>Mitzdorf, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+source-density+method+and+application+in+cat+cerebral+cortex%3A+investigation+of+evoked+potentials+and+EEG+phenomena%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Current source-density method and application in cat cerebral cortex: investigation of evoked potentials and EEG phenomena.</a> Physiological Reviews. 65 (1), 37-100 (1985).</li>
<li>Lasztóczi, B., Klausberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layer-specific+GABAergic+control+of+distinct+gamma+oscillations+in+the+CA1+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Layer-specific GABAergic control of distinct gamma oscillations in the CA1 hippocampus.</a> Neuron. 81 (5), 1126-1139 (2014).</li>
<li>Strüber, M., Sauer, J. -F., Jonas, P., Bartos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distance-dependent+inhibition+facilitates+focality+of+gamma+oscillations+in+the+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Distance-dependent inhibition facilitates focality of gamma oscillations in the dentate gyrus.</a> Nature Communications. 8 (1), 758(2017).</li>
<li>Franklin, K. B. J., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFranklin%2C+KBJ+%22The+mouse+brain+in+stereotaxic+coordinates%22">The mouse brain in stereotaxic coordinates</a>. , Academic Press, Elsevier. (2007).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).</li>
<li>Kajikawa, Y., Schroeder, C. E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22153379">How local is the local field potential?</a> Neuron. 72 (5), 847-858 (2011).</li>
<li>Berens, P., Keliris, G. A., Ecker, A. S., Logothetis, N. K., Tolias, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feature+selectivity+of+the+gamma-band+of+the+local+field+potential+in+primate+primary+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Feature selectivity of the gamma-band of the local field potential in primate primary visual cortex.</a> Frontiers in Neuroscience. 2 (2), 199-207 (2008).</li>
<li>Lastóczi, B., Klausberger, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28391402">Distinct gamma oscillations in the distal dendritic field of the dentate gyrus and the CA1 area of mouse hippocampus.</a> Brain Structure and Function. 222 (7), 3355-3365 (2017).</li>
<li>Nguyen Chi, V., Müller, C., Wolfenstetter, T., Yanovsky, Y., Draguhn, A., Tort, A. B. L., Brankačk, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+respiration-driven+rhythm+distinct+from+theta+oscillations+in+awake+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Hippocampal respiration-driven rhythm distinct from theta oscillations in awake mice.</a> Journal of Neuroscience. 36 (1), 162-177 (2016).</li>
<li>Chung, J., Sharif, F., Jung, D., Kim, S., Royer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-drive+and+headgear+for+chronic+implant+and+recovery+of+optoelectronic+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Micro-drive and headgear for chronic implant and recovery of optoelectronic probes.</a> Scientific Reports. 7 (1), 2773(2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Coraz więcej dowodów wskazuje na to, że oscylacje mózgu w obwodach neuronalnych hipokampa występują w dyskretnych domenach przestrzennych 10,11,16. Analiza CSD drastycznie zmniejsza wpływ przewodzenia objętościowego, co jest kluczowym warunkiem wstępnym do badania lokalnych zdarzeń oscylacyjnych. W tym filmie przedstawiamy przewodnik po wszczepianiu sond krzemowych do hipokampa myszy w celu analizy danych CSD. Pokazujemy repreze...

Oscylacje w LFP są krytycznie zaangażowane w przetwarzanie informacji przez obwody neuronalne. Obejmują one szerokie spektrum częstotliwości, od fal wolnych (~1 Hz) do szybkich oscylacji tętnień (~200 Hz)1. Odrębne pasma częstotliwości są związane z funkcjami poznawczymi, w tym pamięcią, przetwarzaniem emocjonalnym i nawigacją2,3,4,5,6,7. Przepływ prądu przez błony neuronalne stanowi największą część sygnału LFP8. Kationy dostające się do komórki (np. poprzez aktywację glutaminergicznego synaps pobudzających) stanowią aktywny pochłaniacz prądu (gdy ładunek opuszcza ośrodek zewnątrzkomórkowy). W przeciwieństwie do tego, przepływ netto ładunku dodatniego do ośrodka zewnątrzkomórkowego, na przykład poprzez aktywację synaps hamujących GABA-ergicznych, obrazuje aktywne źródło prądu w tym miejscu. W dipolach neuronalnych pochłaniacze prądu są sparowane ze źródłami pasywnymi i odwrotnie ze względu na prądy kompensacyjne wpływające na ładunek błony w odległych miejscach.
Pole elektryczne wytwarzane przez odległe procesy neuronowe może również powodować znaczne odchylenia napięcia na elektrodzie rejestrującej i dlatego może być błędnie uważane za zdarzenie lokalne. Takie przewodzenie objętości stanowi poważne wyzwanie dla interpretacji sygnałów LFP. Analiza CSD dostarcza informacji o lokalnych ujściach prądu i źródłach leżących u podstaw sygnałów LFP, a zatem stanowi sposób na zmniejszenie wpływu przewodzenia objętościowego8. W strukturach laminowanych, takich jak hipokamp, jednowymiarowe sygnały CSD mogą być uzyskiwane przez drugą przestrzenną pochodną LFP rejestrowaną z równoodległych elektrod ustawionych prostopadle do płaszczyzn laminarnych9. Pojawienie się komercyjnie dostępnych liniowych sond krzemowych umożliwiło naukowcom wykorzystanie metody CSD do badania lokalnej aktywności oscylacyjnej w hipokampie. Wykazano na przykład, że wyraźne oscylacje gamma pojawiają się w sposób specyficzny dla warstwy w obszarze CA110. Co więcej, analiza CSD zidentyfikowała niezależne gorące punkty aktywności gamma w głównej warstwie komórkowej zakrętu zębatego11. Co ważne, wyniki te były widoczne tylko w lokalnych CSD, ale nie w sygnałach LFP. Analiza CSD stanowi zatem potężne narzędzie do uzyskania wglądu w operacje mikroobwodów hipokampa.
W tym protokole udostępniamy obszerny przewodnik do uzyskiwania jednowymiarowych sygnałów CSD za pomocą sond krzemowych. Metody te umożliwią użytkownikom badanie zlokalizowanych zdarzeń oscylacyjnych w hipokampie zachowujących się myszy.

<table><tbody><tr><td>Zacisk krokodylkowy ze stojakiem</td><td>Reichelt</td><td>Elektronik HALTER ZD-10D</td><td></td></tr><tr><td>Sonda silikonowa</td><td>Cambridge Neurotech</td><td>P-series 32</td><td></td></tr><tr><td>Stereoskop</td><td>Olympus</td><td>SZ51</td><td></td></tr><tr><td>Drut miedziany izolowany lakierem</td><td>B&uuml; rklin Elektronik</td><td>89 F 232</td><td></td></tr><tr><td>uziemiające</td><td>& Więcej GmbH (screwsandmore.de)</td><td>DIN 84 A2 M1x2</td><td></td></tr><tr><td>Flux</td><td>Stannol</td><td>114018</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze z ceramiczną końcówką</td><td>Fine Science Tools</td><td>11210-60</td><td></td></tr><tr><td>Wosk paraffine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>327204</td><td></td></tr><tr><td>Kauteryzator</td><td>Fine Science Tools</td><td>18010-00</td><td></td></tr><tr><td>Lutownica</td><td>Kurtz Ersa</td><td>OIC1300</td><td></td></tr><tr><td>Multimetr</td><td>Uni-T</td><td>UT61C</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Carl Roth</td><td>9065.1</td><td></td></tr><tr><td>Pipety Pasteura</td><td>Carl Roth</td><td>EA65.1</td><td></td></tr><tr><td>Sterylizator ciepła</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-45</td><td></td></tr><tr><td>Ramka stereotaktyczna</td><td>David Kopf</td><td>Model 1900</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaktyczny uchwyt elektrody</td><td>David Kopf</td><td>Model 1900</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Abbvie</td><td>B506</td><td></td></tr><tr><td>Koncentrator tlenu</td><td>Respironix</td><td>1020007</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine</td><td>Indivior UK Limited</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Golarka elektryczna</td><td>Tondeo</td><td>Eco-XS Poduszka</td><td></td></tr><tr><td>grzewcza</td><td>Thermolux</td><td>463265/-67</td><td></td></tr><tr><td>Zaciski chirurgiczne</td><td>Fine Science Tools</td><td>18050-28</td><td></td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne chusteczki bawełniane</td><td>Carl Roth</td><td>EH12.1</td><td></td></tr><tr><td>Wiertarka</td><td>Proxxon</td><td>Micromot 230/E</td><td></td></tr><tr><td>21G igła iniekcyjna</td><td>B. Braun</td><td>4657527</td><td></td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy/sól fizjologiczna</td><td></td><td></td><td></td>buforowana fosforanem</tr><tr><td>Atlas stereotaktyczny</td><td>Elsevier</td><td>9.78012E+12</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne</td><td>Fine Science Tools</td><td>14094-11</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze chirurgiczne</td><td>Fine Science Tools</td><td>11272-40</td><td></td></tr><tr><td>Igły iniekcyjne 27G</td><td>B. Braun</td><td>4657705</td><td></td></tr><tr><td>Wazelina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cement dentystyczny</td><td>Sun Medical</td><td>SuperBond T& M</td><td></td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>Zoetis</td><td>Rimadyl 50mg/ml</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz nagrywający</td><td>Intan Technologies</td><td>C3323</td><td></td></tr><tr><td>Płytka akwizycyjna USB</td><td>Intan Technologies</td><td>C3004</td><td></td></tr><tr><td>do nagrywania</td><td>Intan Technologies</td><td>C3216</td><td></td></tr><tr><td>Komutator elektryczny</td><td>Soczewki Doric</td><td>HRJ-OE_FC_12_HARW</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do akwizycji</td><td>OpenEphys (www.open-ephys.org)</td><td>GUI</td><td>umożliwia akwizycję danych niezależną od platformy</td></tr><tr><td>Komputer do akwizycji</td><td></td><td></td><td></td>danych</tr><tr><td>Środowisko analityczne</td><td>Python (www.python.org)</td><td></td> <td>umożliwia analizę danych niezależną od platformy</td></tr><tr><td>Uretan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>Carl Roth</td><td>H868.1</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>Carl Roth</td><td>H878.2</td><td></td></tr><tr><td>Medium do zatapiania</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81381-50G</td><td></td></tr><tr><td>Woda destylowana</td><td>Millipore</td><td>Milli Q</td><td>Maszyna stołowa do produkcji wody destylowanej</td></tr><tr><td>Tergazyme</td><td>Alconox</td><td>Tergazyme</td><td></td></tr></tbody></table>

rejestrowanie przestrzennie ograniczonych oscylacji w hipokampie zachowujących się myszy

Recording Spatially Restricted Oscillations in the Hippocampus of Behaving Mice

Potencjał pola lokalnego (LFP) powstaje w wyniku ruchów jonów przez błony nerwowe. Ponieważ napięcie rejestrowane przez elektrody LFP odbija zsumowane pole elektryczne dużej objętości tkanki mózgowej, wydobycie informacji o lokalnej aktywności jest trudne. Badanie mikroobwodów neuronalnych wymaga jednak wiarygodnego rozróżnienia między zdarzeniami prawdziwie lokalnymi a sygnałami przewodzonymi objętościowo pochodzącymi z odległych obszarów mózgu. Analiza gęstości źródła prądu (CSD) oferuje rozwiązanie tego problemu, dostarczając informacji o pochłaniaczach prądu i źródłach w pobliżu elektrod. W obszarach mózgu o cytoarchitekturze laminarnej, takich jak hipokamp, jednowymiarowy CSD można uzyskać, szacując drugą pochodną przestrzenną LFP. W tym miejscu opisujemy metodę rejestrowania wielolaminarnych LFP za pomocą liniowych sond krzemowych wszczepionych do grzbietowego hipokampa. Ślady CSD są obliczane wzdłuż poszczególnych trzpieni sondy. Protokół ten opisuje zatem procedurę rozwiązywania przestrzennie ograniczonych oscylacji sieci neuronalnych w hipokampie swobodnie poruszających się myszy.

Rysunek 1 przedstawia narzędzie do insercji stosowane podczas implantacji sond krzemowych. Rejestracje z chronicznie implantowanych sond krzemowych celowanych w obszar CA1 oraz warstwę ziarnistą zakrętu zębatego pokazano na Rysunku 2. Rejestrowaliśmy LFP z trzpieni sondy podczas swobodnego poruszania się w klatce domowej. Aby zminimalizować efekt przewodzenia objętościowego, uzyskane sygnały przekształcono na CSD wzdłuż każdego t...

Ten protokół opisuje rejestrację lokalnych potencjałów pola za pomocą wielozębowych liniowych sond krzemowych. Konwersja sygnałów za pomocą analizy gęstości źródła prądu pozwala na rekonstrukcję lokalnej aktywności elektrycznej w hipokampie myszy. Dzięki tej technice można badać ograniczone przestrzennie oscylacje mózgu u swobodnie poruszających się myszy.

Rejestrowanie przestrzennie ograniczonych oscylacji w hipokampie zachowujących się myszy

The local field potential (LFP) emerges from ion movements across neural membranes. Since the voltage recorded by LFP electrodes reflects the summed ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neurobiologii, takie jak to, w jaki sposób działania sieci neuronalnych są zorganizowane w precyzyjnych skalach czasowych i przestrzennych. Główną zaletą tej techniki jest to, że za pomocą liniowych sond krzemowych analiza bieżących danych pozwala na rekonstrukcję lokalnych oscylacji, które nie mogą być łatwo wykryte w konwencjonalnych zapisach potencjału pola. Aby rozpocząć tę procedurę, wysterylizuj narzędzia chirurgiczne za pomocą sterylizatora z gorącymi kulkami, a następnie przetrzyj wszystkie powierzchnie robocze 70% etanolem.Następnie zamontuj znieczulone zwierzę w stereotaktycznej ramie, delikatnie wkładając nauszniki do kanału słuchowego. Gdy głowa myszy zostanie ustabilizowana przez nauszniki, umieść ustnik na pysku, aby zapewnić ciągłe dostarczanie izofluranu, a następnie nałóż maść na oczy, aby zapobiec wysuszeniu. Następnie umieść poduszkę grzewczą pod myszą i wstrzyknij podskórnie buprenorfinę, aby zapewnić pooperacyjne zniebólenie.Następnie ogol głowę i zdezynfekuj skórę 70% etanolem. Za pomocą nożyczek chirurgicznych wykonaj nacięcie na skórze wzdłuż linii środkowej czaszki i otwórz skórę za pomocą zacisków chirurgicznych. Wyrównaj głowę zwierzęcia za pomocą narzędzia do wyrównywania stereotaktycznego, aby wypoziomować bregmę i lambdę.Przesunięcie wysokości między bregmą a lambdą powinno być mniejsze niż 50 mikrometrów. Ponadto wypoziomuj głowę wzdłuż osi przyśrodkowo-bocznej, mierząc głębokość w określonej odległości od bregmy po lewej i prawej stronie. Wyreguluj głowicę, jeśli jest przechylona.Oczyść głowę 3% wodą utlenioną i osusz ją sterylnymi bawełnianymi chusteczkami. Określ położenie kraniotomii względem bregmy za pomocą odpowiedniego atlasu stereotaktycznego. Za pomocą głowicy wiertarskiej o średnicy 0,9 milimetra wywierć dwa otwory w kości nad móżdżkiem, aby umieścić uziemiające i referencyjne.Dodatkowo wywierć od jednego do trzech otworów na kotwiące, aby ustabilizować implant. Lokalizacja kotwiących będzie zależeć od lokalizacji kraniotomii. Wkręć w kość za pomocą odpowiedniego śrubokręta.Uważaj, aby nie przeniknąć do mózgu. Teraz wykonaj kraniotomię, powoli rozrzedzając czaszkę wiertłem w prostokątnym obszarze po stronie implantacji. Często zwilżaj kość wysterylizowanym buforem fosforanowym.Delikatnie przekłuć pozostałą przerzedzoną czaszkę igłą iniekcyjną o rozmiarze 27 i usunąć ją pęsetą. Następnie ostrożnie przekłuj oponę twardą igłą do wstrzykiwań o rozmiarze 27. Za pomocą pęsety uformuj mały haczyk, zginając końcówkę igły i użyj tego haczyka, aby usunąć oponę twardą.Następnie zastosuj bufor fosforanowy, aby zapobiec wysychaniu powierzchni mózgu. Następnie zamontuj narzędzie do wprowadzania elektrod na uchwycie stereotaktycznym i wyzeruj sondę na bregmie. Przesuń sondę do współrzędnych stereotaktycznych nad kraniotomią i powoli penetruj powierzchnię mózgu.Upewnij się, że trzonki sondy nie wyginają się i unikaj implantacji przez naczynia krwionośne. Następnie powoli opuść sondę do około 200 mikrometrów powyżej żądanej głębokości. Następnie przykryj kraniotomię i trzonki sondy silikonowej wysterylizowaną wazeliną w celu ochrony.Następnie nałóż cement dentystyczny, aby przymocować podstawę sondy do kotwiącej w czaszce. Zaraz po nałożeniu cementu powoli przesuń sondę na docelową głębokość. Przesuń ostatnie 200 mikrometrów po nałożeniu cementu, aby zmniejszyć boczny ruch sondy i zapewnić minimalne uszkodzenie tkanki w obszarze docelowym.Po utwardzeniu cementu zwolnij sondę z narzędzia do wkładania, topiąc wosk za pomocą kauteryzatora. Następnie zwolnij płytkę łączącą z urządzenia wprowadzającego i umieść ją w odpowiednim miejscu na czaszce za pomocą zacisku krokodylkowego. Przymocuj płytkę łączącą do czaszki za pomocą cementu dentystycznego.W przypadku implantacji sondy w hipokampie, należy umieścić płytkę łączącą na przeciwległej kości ciemieniowej. Następnie przewody uziemiające i odniesienia płytki złącza do przewodów przymocowanych do dwóch nad móżdżkiem. Przytnij osłonę ochronną do odpowiedniej wysokości i umieść ją na sondzie silikonowej.Następnie przymocuj pokrywę płytki łączącej i czaszkę za pomocą cementu dentystycznego, omijając skórę wokół odsłoniętej czaszki. Po zabiegu należy zastosować odpowiednie leczenie przeciwbólowe u myszy przez co najmniej dwa dni. Umieść mysz pojedynczo, aby zapobiec uszkodzeniu implantu.Nagrania z przewlekle wszczepionych sond krzemowych celujących w obszar CA1 są pokazane tutaj. Analiza gęstości źródła prądu jest stosowana wzdłuż poszczególnych trzpieni sondy. W tym przykładzie pojedyncze zdarzenie tętnienia ostrej fali prowadzi do wyraźnego ujścia prądu w warstwie promienistej CA1, a w drugim przykładzie zarejestrowano dwa odrębne miejsca w warstwie komórek ziarnistych zakrętu zębatego.Wysokie pasmo gamma zostało wyizolowane przez zastosowanie filtra pasmowego od 60 do 80 Hz, ujawniając lokalne rozbłyski gamma w jednym z dwóch miejsc rejestracji znajdujących się w warstwie komórek ziarnistych. Należy pamiętać, że lokalna aktywność oscylacji gamma może być wykryta dopiero po konwersji zarejestrowanych sygnałów na CSD. CSD, ale nie sygnały LFP, identyfikują okresy asynchronizacji faz i amplitudy między oboma miejscami zapisu.Ten segment pokazuje krótką epokę zsynchronizowanej aktywności gamma. Ślady tutaj ilustrują różnicę faz i wskaźnik różnicy amplitudy dla śladów LFP i CSD. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wszczepić silikonowe sondy do hipokampa.

recording-spatially-restricted-oscillations-hippocampus-behaving

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film przedstawia protokół wszczepienia wielozębowej liniowej sondy krzemowej do mózgu myszy w celu pomiaru lokalnych potencjałów pola. Procedura polega na przymocowaniu sondy do jednostki stereotaktycznej, ustawieniu jej dokładnie nad docelowym obszarem mózgu, wprowadzeniu jej do mózgu i zabezpieczeniu cementem dentystycznym. Po implantacji zespół zabezpieczany jest obudową. Po powrocie do zdrowia konfiguracja pozwala na rejestrowanie lokalnych potencjałów pola, zapewniając wgląd w...

Rejestrowanie aktywności elektrycznej mózgu u zachowujących się myszy za pomocą liniowych sond krzemowych z wieloma zębami

Film demonstruje procedurę rejestrowania potencjału pola lokalnego (LFP) w wycinkach kory hipokampowo-śródwęchowej myszy. Stymulacja elektryczna jest zapewniona w warstwie promieniowej CA3 hipokampa, co powoduje zmiany potencjału postsynaptycznego w warstwie piramidalnej CA1. Rejestrowana jest łączna zmiana potencjału błonowego neuronów CA1, zwana potencjałem pola lokalnego.

Rejestracja potencjału pola lokalnego w wycinkach kory hipokampowo-śródwęchowej myszy

Ten film demonstruje protokół modulacji oscylacji theta w genetycznie zmodyfikowanym modelu myszy z światłoczułymi kanałami jonowymi w neuronach przegrody przyśrodkowej GABA-ergiczne. Dostarczając impulsy świetlne do hipokampa, protokół ma na celu synchronizację aktywności neuronalnej i generowanie oscylacji theta, które są rejestrowane jako lokalne potencjały pola.

Selektywna manipulacja oscylacjami theta w modelu mysim

Ten film demonstruje stereotaktyczne wszczepienie drutu elektrodowego i światłowodu w hipokampie modelu myszy.

Wszczepianie układu elektrod i światłowodu do hipokampa myszy

Ten film pokazuje rejestrację rytmicznej aktywności sieci neuronalnej, znanej również jako oscylacje theta, w izolowanym hipokampie. Elektrody są umieszczane w różnych warstwach i pozycjach przestrzennych w celu wykrywania i analizowania oscylacji theta. Pokazuje to unikalny skład neuronalny i łączność sieci neuronalnej w różnych warstwach hipokampa.

Zapis in vitro oscylacji theta w hipokampie myszy

Tutaj prezentujemy protokół rejestrowania rytmicznych oscylacji sieci neuronalnej theta i gamma z izolowanego całego preparatu hipokampa. Opisujemy etapy eksperymentalne od ekstrakcji hipokampa do szczegółów nagrań klamry polowej, unitarnej i całokomórkowej, a także optogenetycznej stymulacji rytmu theta.

Dostrajanie w paśmie theta hipokampa in vitro: metodologie nagrywania z izolowanego obwodu septohipokampa gryzoni

Opisujemy użycie optogenetyki i zapisów elektrofizjologicznych do selektywnych manipulacji oscylacjami theta hipokampa (5-10 Hz) u zachowujących się myszy. Skuteczność porywania rytmu jest monitorowana za pomocą lokalnego potencjału pola. Połączenie inhibicji opto- i farmakogenetycznej rozwiązuje eferentny odczyt synchronizacji hipokampa.

Optogenetyczne porywanie oscylacji theta hipokampa u zachowujących się myszy

Ten protokół opisuje przygotowanie poziomych wycinków kory hipokampowo-śródwęchowej (HEC) od myszy wykazujących spontaniczną aktywność fal ostrych. Plastry są inkubowane w uproszczonej komorze przechowawczej, a nagrania są wykonywane w warunkach zanurzonych z szybko płynącym sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym, aby promować dotlenienie tkanek i spontaniczne pojawienie się aktywności na poziomie sieci.

Ostre krojenie mózgu myszy w celu zbadania spontanicznej aktywności sieci hipokampa

Ten artykuł demonstruje przygotowanie specjalnego okna obrazowania uzupełnionego o kaniulę infuzyjną i jej implantację w regionie CA1 hipokampa u myszy.

Procedura kraniotomii do wizualizacji aktywności neuronalnej w hipokampie zachowujących się myszy

Ten protokół opisuje użycie specjalnie zaprojektowanego urządzenia rejestrującego i elektrod do rejestrowania lokalnych potencjałów pola i badania przepływu informacji w hipokampie myszy i korze przedczołowej.

Podwójne nagrania zewnątrzkomórkowe w hipokampie myszy i korze przedczołowej myszy

Ten protokół bada zależność między mózgiem a zachowaniem w hipokampie CA1 u myszy poruszających się po smugach zapachu. Zapewniamy protokół krok po kroku, w tym operację w celu uzyskania dostępu do obrazowania hipokampa, trening behawioralny, rejestrację i przetwarzanie mózgu w miniskopie GCaMP6f oraz dane behawioralne w celu dekodowania pozycji myszy na podstawie aktywności neuronalnej ROI.

Miniskop rejestrujący sygnały wapnia w hipokampie myszy poruszających się po pióropuszu zapachowym

Poznaj metodę rejestracji oscylacji hipokampalnych u swobodnie poruszających się myszy przy użyciu sond krzemowych i analizy gęstości prądu źródłowego. Technika ta umożliwia badanie lokalnej aktywności elektrycznej mózgu z wysoką rozdzielczością przestrzenną.

Rejestrowanie przestrzennie ograniczonych oscylacji w hipokampie zachowujących się myszy

Przeglądaj więcej filmów