Rejestrowanie przestrzennie ograniczonych oscylacji w hipokampie zachowujących się myszy
1 lipca 2018
Ten protokół opisuje rejestrację lokalnych potencjałów pola za pomocą wielozębowych liniowych sond krzemowych. Konwersja sygnałów za pomocą analizy gęstości źródła prądu pozwala na rekonstrukcję lokalnej aktywności elektrycznej w hipokampie myszy. Dzięki tej technice można badać ograniczone przestrzennie oscylacje mózgu u swobodnie poruszających się myszy.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neurobiologii, takie jak to, w jaki sposób działania sieci neuronalnych są zorganizowane w precyzyjnych skalach czasowych i przestrzennych. Główną zaletą tej techniki jest to, że za pomocą liniowych sond krzemowych analiza bieżących danych pozwala na rekonstrukcję lokalnych oscylacji, które nie mogą być łatwo wykryte w konwencjonalnych zapisach potencjału pola. Aby rozpocząć tę procedurę, wysterylizuj narzędzia chirurgiczne za pomocą sterylizatora z gorącymi kulkami, a następnie przetrzyj wszystkie powierzchnie robocze 70% etanolem.
Następnie zamontuj znieczulone zwierzę w stereotaktycznej ramie, delikatnie wkładając nauszniki do kanału słuchowego. Gdy głowa myszy zostanie ustabilizowana przez nauszniki, umieść ustnik na pysku, aby zapewnić ciągłe dostarczanie izofluranu, a następnie nałóż maść na oczy, aby zapobiec wysuszeniu. Następnie umieść poduszkę grzewczą pod myszą i wstrzyknij podskórnie buprenorfinę, aby zapewnić pooperacyjne zniebólenie.
Następnie ogol głowę i zdezynfekuj skórę 70% etanolem. Za pomocą nożyczek chirurgicznych wykonaj nacięcie na skórze wzdłuż linii środkowej czaszki i otwórz skórę za pomocą zacisków chirurgicznych. Wyrównaj głowę zwierzęcia za pomocą narzędzia do wyrównywania stereotaktycznego, aby wypoziomować bregmę i lambdę.
Przesunięcie wysokości między bregmą a lambdą powinno być mniejsze niż 50 mikrometrów. Ponadto wypoziomuj głowę wzdłuż osi przyśrodkowo-bocznej, mierząc głębokość w określonej odległości od bregmy po lewej i prawej stronie. Wyreguluj głowicę, jeśli jest przechylona.
Oczyść głowę 3% wodą utlenioną i osusz ją sterylnymi bawełnianymi chusteczkami. Określ położenie kraniotomii względem bregmy za pomocą odpowiedniego atlasu stereotaktycznego. Za pomocą głowicy wiertarskiej o średnicy 0,9 milimetra wywierć dwa otwory w kości nad móżdżkiem, aby umieścić uziemiające i referencyjne.
Dodatkowo wywierć od jednego do trzech otworów na kotwiące, aby ustabilizować implant. Lokalizacja kotwiących będzie zależeć od lokalizacji kraniotomii. Wkręć w kość za pomocą odpowiedniego śrubokręta.
Uważaj, aby nie przeniknąć do mózgu. Teraz wykonaj kraniotomię, powoli rozrzedzając czaszkę wiertłem w prostokątnym obszarze po stronie implantacji. Często zwilżaj kość wysterylizowanym buforem fosforanowym.
Delikatnie przekłuć pozostałą przerzedzoną czaszkę igłą iniekcyjną o rozmiarze 27 i usunąć ją pęsetą. Następnie ostrożnie przekłuj oponę twardą igłą do wstrzykiwań o rozmiarze 27. Za pomocą pęsety uformuj mały haczyk, zginając końcówkę igły i użyj tego haczyka, aby usunąć oponę twardą.
Następnie zastosuj bufor fosforanowy, aby zapobiec wysychaniu powierzchni mózgu. Następnie zamontuj narzędzie do wprowadzania elektrod na uchwycie stereotaktycznym i wyzeruj sondę na bregmie. Przesuń sondę do współrzędnych stereotaktycznych nad kraniotomią i powoli penetruj powierzchnię mózgu.
Upewnij się, że trzonki sondy nie wyginają się i unikaj implantacji przez naczynia krwionośne. Następnie powoli opuść sondę do około 200 mikrometrów powyżej żądanej głębokości. Następnie przykryj kraniotomię i trzonki sondy silikonowej wysterylizowaną wazeliną w celu ochrony.
Następnie nałóż cement dentystyczny, aby przymocować podstawę sondy do kotwiącej w czaszce. Zaraz po nałożeniu cementu powoli przesuń sondę na docelową głębokość. Przesuń ostatnie 200 mikrometrów po nałożeniu cementu, aby zmniejszyć boczny ruch sondy i zapewnić minimalne uszkodzenie tkanki w obszarze docelowym.
Po utwardzeniu cementu zwolnij sondę z narzędzia do wkładania, topiąc wosk za pomocą kauteryzatora. Następnie zwolnij płytkę łączącą z urządzenia wprowadzającego i umieść ją w odpowiednim miejscu na czaszce za pomocą zacisku krokodylkowego. Przymocuj płytkę łączącą do czaszki za pomocą cementu dentystycznego.
W przypadku implantacji sondy w hipokampie, należy umieścić płytkę łączącą na przeciwległej kości ciemieniowej. Następnie przewody uziemiające i odniesienia płytki złącza do przewodów przymocowanych do dwóch nad móżdżkiem. Przytnij osłonę ochronną do odpowiedniej wysokości i umieść ją na sondzie silikonowej.
Następnie przymocuj pokrywę płytki łączącej i czaszkę za pomocą cementu dentystycznego, omijając skórę wokół odsłoniętej czaszki. Po zabiegu należy zastosować odpowiednie leczenie przeciwbólowe u myszy przez co najmniej dwa dni. Umieść mysz pojedynczo, aby zapobiec uszkodzeniu implantu.
Nagrania z przewlekle wszczepionych sond krzemowych celujących w obszar CA1 są pokazane tutaj. Analiza gęstości źródła prądu jest stosowana wzdłuż poszczególnych trzpieni sondy. W tym przykładzie pojedyncze zdarzenie tętnienia ostrej fali prowadzi do wyraźnego ujścia prądu w warstwie promienistej CA1, a w drugim przykładzie zarejestrowano dwa odrębne miejsca w warstwie komórek ziarnistych zakrętu zębatego.
Wysokie pasmo gamma zostało wyizolowane przez zastosowanie filtra pasmowego od 60 do 80 Hz, ujawniając lokalne rozbłyski gamma w jednym z dwóch miejsc rejestracji znajdujących się w warstwie komórek ziarnistych. Należy pamiętać, że lokalna aktywność oscylacji gamma może być wykryta dopiero po konwersji zarejestrowanych sygnałów na CSD. CSD, ale nie sygnały LFP, identyfikują okresy asynchronizacji faz i amplitudy między oboma miejscami zapisu.
Ten segment pokazuje krótką epokę zsynchronizowanej aktywności gamma. Ślady tutaj ilustrują różnicę faz i wskaźnik różnicy amplitudy dla śladów LFP i CSD. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wszczepić silikonowe sondy do hipokampa.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół szczegółowo opisuje rejestrację lokalnych potencjałów polowych z wykorzystaniem wielostykowych liniowych sond krzemowych w celu zbadania lokalnej aktywności elektrycznej w hipokampie myszy. Dzięki zastosowaniu analizy gęstości prądu źródłowego metoda ta umożliwia badanie przestrzennie ograniczonych oscylacji mózgu u myszy poruszających się swobodnie.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Elektrofizjologia
- Funkcje hipokampa
Wprowadzenie
- Zrozumienie organizacji sieci neuronalnych w małych skalach.
- Analiza gęstości prądu źródłowego usprawnia wykrywanie oscylacji mózgu.
- Sondy wielokanałowe (multi-shank) umożliwiają precyzyjne mapowanie aktywności elektrycznej.
- Oscylacje hipokampa są kluczowe dla funkcji poznawczych.
Cel badania
- Wyjaśnienie organizacji przestrzennej i czasowej aktywności neuronalnej.
- Udoskonalenie metod rejestracji elektrycznej aktywności mózgu.
- Badanie oscylacji lokalnych z wyższą rozdzielczością niż w metodach konwencjonalnych.
Zastosowane metody
- Wielkanałowe liniowe sondy krzemowe zostały zaimplantowane w hipokampie.
- W celu badania dynamiki mózgu in vivo wykorzystano model swobodnie poruszających się myszy.
- Nie wspomniano o żadnych przepływach pracy multiomicznych.
- Opisano kluczowe techniki chirurgiczne i stereotaktyczne niezbędne do implantacji sondy.
- Po zakończeniu rejestracji zastosowano analizę gęstości źródła prądu w celu interpretacji danych.
Główne wyniki
- Skupiono się na analizie zdarzeń typu sharp wave ripple w rejestracjach z hipokampa.
- Wykazano usprawnioną detekcję zlokalizowanych oscylacji gamma.
- Odnotowano wyraźne różnice w fazie i amplitudzie potencjałów polowych (LFP) po konwersji do CSD.
- Wyniki podkreślają zalety stosowania CSD w porównaniu z konwencjonalnymi analizami LFP.
Wnioski
- Badanie to potwierdza użyteczność sond krzemowych w pogłębionych badaniach nad hipokampem.
- Nie omówiono danych multiomicznych; skupiono się na analizie elektrofizjologicznej.
- Wnioski sugerują, że lepsze zrozumienie dynamiki oscylacji neuronalnych może poszerzyć wiedzę na temat procesów pamięci i uczenia się.
Najczęściej Zadawane Pytania
Znaczenie dla przemysłu
Metoda ta umożliwia detekcję oscylacji neuronalnych o wysokiej rozdzielczości, ograniczonych przestrzennie w hipokampie, rozwiązując kluczowy problem w przedklinicznej neuronauce: odróżnienie rzeczywistej aktywności lokalnej sieci od sygnałów przewodzonych objętościowo. Poprzez zastosowanie analizy gęstości źródła prądu (CSD) do wielowarstwowych zapisów potencjałów polowych (LFP) z sond krzemowych, badacze mogą wyizolować dynamikę na poziomie mikroobwodów istotną dla pamięci i funkcji poznawczych. Wspiera to walidację celu i ograniczanie ryzyka mechanistycznego we wczesnej fazie odkrywania, dostarczając odtwarzalnych i mierzalnych odczytów stanów sieci hipokampa w modelach behawioralnych.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie organizacji mikroobwodów hipokampa leżącej u podstaw oscylacji gamma i szybkich fal typu ripple (sharp wave ripples), które są zaangażowane w konsolidację pamięci.
- Wartość operacyjna: Zapewnia przestrzennie rozdzielcze odczyty elektrofizjologiczne, które pomagają odróżnić efekty celowane od niespecyficznych zaburzeń sieciowych.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Generuje ilościowe profile odpływu/dopływu prądu specyficzne dla poszczególnych warstw, które służą jako wiarygodne biomarkery zaangażowania lokalnych obwodów.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje pomiar aktywności oscylacyjnej pomiędzy poszczególnymi trzpieniami i zwierzętami, wspierając powtarzalność testów w badaniach podłużnych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Łączy wzorce oscylacyjne pochodzące z LFP ze stanami behawioralnymi u swobodnie poruszających się myszy, zwiększając trafność prognostyczną dla punktów końcowych funkcji poznawczych.
- Wartość operacyjna: Umożliwia wykrycie rozsprzężenia fazowo-amplitudowego między miejscami rejestracji widocznego wyłącznie w CSD, oferując czułą miarę dysfunkcji sieci.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum odkryć – od testowania hipotez w biologii podstawowej po optymalizację związków wiodących, gdzie fenotypy sieci oscylacyjnych mogą dostarczać informacji o zaangażowaniu celu i selektywności obwodów.
- Biologia odkrywcza: Wspiera mechanistyczną analizę oscylacji sieci hipokampa w celu wyjaśnienia efektów zapośredniczonych przez cel w odniesieniu do synchronii neuronalnej.
- Screening: Dostarcza zestandaryzowanych, ilościowych odczytów CSD (np. mocy pasma gamma, częstości występowania ripple), odpowiednich do wysokowiernego screeningu modulatorów farmakologicznych.
- Analityka: Umożliwia wyodrębnienie indeksów asymetrii fazy i amplitudy z zapisów CSD, zapewniając obiektywne miary koordynacji sieci.
- Badania translacyjne: Łączy lokalne sygnatury oscylacyjne z zachowaniem, wspierając dopasowanie biomarkerów do domen poznawczych istotnych dla wskazań neuropsychiatrycznych.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy reużywalną platformę elektrofizjologiczną do podłużnego monitorowania stanu sieci w różnych modelach chorób i kohortach leczonych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez oddzielenie rzeczywistych oscylacji lokalnych od zakłócających sygnałów przewodzonych objętościowo w danych LFP.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność dzięki standaryzacji rozmieszczenia sond, obliczeń CSD oraz protokołów filtrowania pasmowo-przepustowego (np. 60–80 Hz dla wysokiej gamma).
- Wartość strategiczna: Zmniejsza niepewność związaną z biologiczną oceną ryzyka, umożliwiając wykrycie subtelnych zmian w sieci (np. desynchronizacji fazowej), które są pomijane w konwencjonalnych badaniach LFP.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia podejmowanie decyzji go/no-go w oparciu o zaangażowanie celu na poziomie sieci, a nie tylko ogólne zmiany aktywności.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej w zakresie chirurgii stereotaktycznej, elektrofizjologii oraz matematycznej transformacji CSD.
- Zależność od instrumentarium w postaci liniowych sond krzemowych, systemów akwizycji umożliwiających wielokanałowy zapis LFP oraz narzędzi do postprocesingu w celu szacowania pochodnych przestrzennych.
- Konieczność standaryzacji głębokości wprowadzenia sondy, orientacji trzpienia oraz parametrów filtrowania w ramach zespołów badawczych w celu zapewnienia porównywalności wyników między badaniami.
- Adaptacja do innych obszarów mózgu wymaga dostosowania współrzędnych stereotaktycznych oraz walidacji struktury laminearnej dla prawidłowej interpretacji CSD.
- Ograniczenia praktyczne obejmują inwazyjność chirurgiczną, dryft sygnału w przypadku implantów chronicznych oraz konieczność eksperckiej walidacji źródeł i odpływów (sinks/sources) CSD względem punktów orientacyjnych w badaniu histologicznym.
