Izolacja, charakterystyka i wysokoprzepustowa analiza strumienia zewnątrzkomórkowego pierwotnych komórek nabłonka kanalików nerkowych myszy
20 czerwca 2018
Ten protokół zapewnia efektywne kosztowo podejście do izolowania i charakteryzowania pierwotnych komórek kanalików nerkowych myszy, które następnie mogą być subhodowane w celu oceny funkcji biologicznych nerek ex vivo, w tym bioenergetyki mitochondrialnej.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące metabolizmu nerek, takie jak utlenianie kwasów tłuszczowych, które jest ściśle związane z rozwojem zwłóknienia nerek i różnych innych nefropatii. Główną zaletą tej techniki jest wykorzystanie wysokoprzepustowej platformy do badań przesiewowych pod kątem związków regulujących bioenergetykę mitochondriów w komórkach nabłonka kanalików nerkowych. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię chorób metabolicznych nerek, ponieważ pozwala ona na dokładne badania przesiewowe związków, które regulują metabolizm mitochondrialny w komórkach nabłonka nerkowego.
Aby przygotować pokryte kolagenem 60-milimetrowe szalki Petriego, dodaj dwa mililitry wstępnie przefiltrowanego 20-milimolowego kwasu octowego, a następnie 35 mikrolitrów roztworu kolagenu I do każdej potrawy. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez godzinę, wysusz ją na powietrzu i wystaw na działanie promieniowania UV. Następnie spłucz pozostałości kwasu octowego za pomocą PBS. Wykonaj trzy płukania.
Następnie przechowuj naczynie w inkubatorze do hodowli komórkowych o temperaturze 37 stopni Celsjusza bez dwutlenku węgla. Po przygotowaniu myszy do zabiegu usuń sierść z klatki piersiowej i brzucha za pomocą kremu do depilacji. Następnie zdezynfekuj skórę jodem i zetrzyj pozostałości jodu.
Następnie wykonaj nacięcie, aby otworzyć jamę brzuszną i odsłonić serce i nerki. Teraz ustaw pompę perfuzyjną na 32 mililitry na minutę i usuń wszelkie pęcherzyki z rurki przed rozpoczęciem perfuzji. Użyj igły o rozmiarze 27 na końcu linii.
Aby kontynuować, włóż igłę do lewej komory przez wierzchołek serca. Gdy tylko bufor wypełni serce, zrób otwór w prawym przedsionku, aby utworzyć wyjście dla bufora perfuzyjnego. Następnie przełącz się na bufor wytrawiający i nieznacznie zmniejsz prędkość pompy do 30 mililitrów na minutę w celu roztwarzania.
Po perfuzji 20 mililitrów buforu trawiennego należy usunąć obie nerki w celu izolacji komórek kanalików. Aby przetworzyć pobrane nerki, najpierw usuń torebki nerkowe i rdzeń. Następnie zmiel obie nerki na drobne kawałki i inkubuj je w 10 mililitrach buforu wytrawiającego w piekarniku o temperaturze 37 stopni Celsjusza z delikatnymi obrotami przez pięć minut.
Po strawieniu usuń wszelkie niestrawione tkanki, przepuszczając bufor przez filtr o średnicy 70 mikronów. Po zebraniu strawionej tkanki dodaj 10 mililitrów pożywki hodowlanej, aby zatrzymać trawienie. Następnie odwirować przefiltrowaną zawiesinę tkankową o masie 50 g przez pięć minut, aby osadzać komórki rurkowe.
Następnie przenieś supernatant do nowej probówki, dodaj pięć mililitrów pożywki hodowlanej i powtórz wirowanie, aby zebrać pozostałe komórki rurkowe. Teraz ponownie zawieś pierwszą osadkę w 20 mililitrach pożywki hodowlanej i odwiruj ją przy 50 g przez pięć minut, aby dalej oczyścić zebrane komórki. Usunąć supernatant.
Następnie ponownie zawieś oba osady w 10 mililitrach pożywki hodowlanej. Następnie policz żywe komórki za pomocą barwienia błękitem trypanowym. Następnie umieść do 10 milionów komórek na 60-milimetrowym naczyniu pokrytym kolagenem i pozwól komórkom rurkowym przyczepić się przez noc.
Na początek wysiew komórki rurkowe P1 w 40 000 komórek do studzienek świeżo przygotowanej 96-dołkowej mikropłytki pokrytej kolagenem. Użyj 100 mikrolitrów pożywki hodowlanej na studzienkę. Optymalizacja gęstości komórek i stężenia związków w teście strumienia zewnątrzkomórkowego jest kluczem do udanego eksperymentu.
Zalecamy przeprowadzenie pilotażowego eksperymentu miareczkowania w celu określenia optymalnej gęstości komórek i stężenia związków. Następnie nawodnij wkład czujnika. Najpierw podnieś wkład czujnika i napełnij każdą studzienkę płytki 200 mikrolitrami roztworu kalibracyjnego.
Następnie zmień położenie wkładu, aby zanurzyć czujniki i inkubuj zespół przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia odessaj starą pożywkę i zastąp ją 175 mikrolitrami pożywki do oznaczania glukozy lub kwasów tłuszczowych. Następnie kontynuuj inkubację przez godzinę bez dwutlenku węgla.
Podczas inkubacji komórek załaduj port A wkładu 25 mikrolitrami oligomycyny, załaduj port B FCCP, załaduj port C rotenonem/antymycyną A, a port D i wszystkie inne porty załaduj wodą. Teraz należy przechowywać wkład w inkubatorze niezawierającym dwutlenku węgla, aż zestaw będzie gotowy do kalibracji. Kontynuuj, włączając analizator strumienia zewnątrzkomórkowego i sterownik.
Następnie otwórz oprogramowanie analizatora, wybierz standardowy test i naciśnij opcję Kreator testu. Następnie w zakładce Związki przypisz związki do odpowiednich portów. Na karcie Korekcja tła wybierz źródła, które nie zawierają żadnych komórek.
Następnie użyj karty Grupy i etykiety, aby oznaczyć etykiety grup eksperymentalnych. Następnie w zakładce Protokół ustaw odpowiednie cykle mieszania i mierzenia za pomocą dostępnych komend. Ustawienia te są wskazane w protokole tekstowym, a po ich wprowadzeniu zapisz szablon do wykorzystania w przyszłości.
Teraz naciśnij Zakończ kreatora, aby kontynuować. Teraz naciśnij Start, aby rozpocząć kalibrację. Następnie analizator wysuwa uchwyt płytki i prosi o włożenie płytki naboju.
Ten proces kalibracji trwa od 20 do 25 minut. Po skalibrowaniu systemu naciśnij polecenie zachęty, aby wymienić płytkę kalibracyjną na płytkę ogniwa i kontynuuj pracę. Po zakończeniu przebiegu zapisz dane OCR i wyjmij płytkę z analizatora.
Teraz dodaj Hoechst do każdego z dołków testowych i inkubuj płytkę przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie policz komórki za pomocą wzbudzenia 355 nm i emisji 460 nm i znormalizuj dane OCR do liczby komórek. W tym protokole heterogeniczna populacja komórek nerkowych, niecałkowicie strawionych kanalików i innych szczątków tkanek została wyhodowana na płytkach pokrytych kolagenem.
Dzień po izolacji pożywkę hodowlaną odwirowano w celu usunięcia zanieczyszczeń, a komórki rurkowe ponownie platerowano. Następnie komórki łatwiej się przyczepiały, a do piątego dnia w hodowli osiągnęły 80 do 90% zbieżności. TEC nerek zostały następnie poddane subhodowli i osiągnęły zlew w ciągu jednego tygodnia.
Podobny wzrost nastąpił w ciągu następnych dwóch okresów. Monowarstwa komórek uformowała się w kopułę, unosząc się od płyty i pozostając połączoną za pomocą ciasnych połączeń. Oddychanie mitochondrialne izolowanych pierwotnych TEC mierzono za pomocą opisanej analizy strumienia zewnątrzkomórkowego OCR przy różnych gęstościach posiewu, jak opisano.
Komórki posiane o większej gęstości miały proporcjonalny wzrost OCR. 40 000 komórek na studzienkę pokrywało powierzchnię płytki lepiej niż jakiekolwiek inne gęstości posiewu, co czyni ją optymalnym stężeniem do testowania interakcji między komórkami i związkami. Na przykład pożywki zawierające substrat kwasów tłuszczowych zastosowano do TEC wraz z 2DG, inhibitorem glikolizy, w celu bezpośredniej oceny utleniania kwasów tłuszczowych w TEC w pasażach pierwszym i drugim.
Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby zawsze zapisywać dokładne objętości i stężenia w każdym dołku. Zmiany w końcowych stężeniach składników mogą spowodować, że cały eksperyment zakończy się niepowodzeniem. Po jej opracowaniu, technika ta utoruje drogę naukowcom z dziedziny nefrologii do zbadania roli metabolizmu kwasów tłuszczowych w kanalikach tłuszczowych w patogenezie różnych nefropatii.
Przegląd
Niniejszy protokół przedstawia kosztowo efektywne podejście do izolacji i charakterystyki pierwotnych komórek kanalików nerkowych myszy, które mogą być następnie poddawane subkultywacji w celu oceny biologicznych funkcji nerek ex vivo, w tym bioenergetyki mitochondriów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Nefrologia
- Biologia komórki
- Badania nad metabolizmem
Wstęp
- Metoda ta odpowiada na kluczowe pytania dotyczące metabolizmu nerkowego.
- Koncentruje się ona na utlenianiu kwasów tłuszczowych w związku z włóknieniem nerek i nefropatiami.
- Technika ta umożliwia wysokoprzepustowy screening związków.
- Ma ona istotne znaczenie dla terapii metabolicznych chorób nerek.
Cel badania
- Izolacja i charakterystyka komórek kanalików nerkowych.
- Ocena bioenergetyki mitochondrialnej w tych komórkach.
- Umożliwienie wysokoprzepustowego przesiewu związków wpływających na metabolizm nerek.
Zastosowane metody
- Przygotowanie naczyń pokrytych kolagenem do hodowli komórkowej.
- Chirurgiczna izolacja nerek myszy w celu wyekstrahowania komórek kanalikowych.
- Zastosowanie buforów trawiennych i wirowania do oczyszczania komórek.
- Analiza przepływu zewnątrzkomórkowego w celu oceny funkcji mitochondriów.
Główne wyniki
- Pomyślna izolacja i hodowla komórek kanalików nerkowych.
- Komórki osiągnęły 80-90% konfluencji w ciągu pięciu dni.
- Umożliwienie wysokoprzepustowego przesiewu związków wpływających na metabolizm mitochondrialny.
- Protokół pozwala na uzyskanie powtarzalnych wyników w badaniach nad komórkami nerkowymi.
Wnioski
- Protokół ten jest skuteczny w badaniu funkcji komórek kanalików nerkowych.
- Umożliwia on uzyskanie wiedzy na temat metabolizmu nerek oraz potencjalnych metod terapeutycznych.
- Możliwości wysokoprzepustowego przetwarzania zwiększają efektywność badań.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Wysokoprzepustowa analiza strumienia zewnątrzkomórkowego w pierwotnych komórkach nabłonkowych kanalików nerkowych myszy umożliwia rzetelną ocenę bioenergetyki mitochondrialnej, która jest krytycznym determinantem patogenezy chorób nerek. Niniejszy schemat postępowania wspiera wczesną walidację celów terapeutycznych oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego w odniesieniu do szlaków metabolicznych zaangażowanych w przewlekłą chorobę nerek. Skalowalność i powtarzalność tego protokołu sprawiają, że stanowi on fundamentalną metodę dla portfeli badań nad lekami koncentrujących się na metabolizmie nerek.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią ocenę funkcji mitochondriów w populacjach komórek nerkowych istotnych dla przebiegu choroby.
- Wspiera redukcję ryzyka mechanistycznego poprzez kwantyfikację utleniania kwasów tłuszczowych i strumienia metabolicznego.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów dla szlaków związanych z włóknieniem nerek i nefropatiami.
- Zapewnia pewność prognostyczną przy rozwijaniu celów metabolicznych w ramach programów badawczych nad chorobami nerek.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zestandaryzowane, wysokoprzepustowe badanie przesiewowe związków wpływających na bioenergetykę mitochondriów.
- Optymalizuje warunki testu pod kątem gęstości komórek i stężenia związków, zapewniając powtarzalność.
- Generuje dane ilościowe (OCR) umożliwiające rzetelną ocenę i porównanie związków.
- Umożliwia ponowne wykorzystanie platformy w iteracyjnych cyklach badań przesiewowych i optymalizacji związków wiodących.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zestawia wyniki pomiarów metabolicznych ex vivo z modelami komórek nerkowych istotnymi dla przebiegu choroby.
- Wspiera rozwój translacyjnych biomarkerów poprzez powiązanie funkcji mitochondriów z patologią nerek.
- Zapewnia ciągłość od wczesnej fazy odkryć po przedkliniczną walidację interwencji metabolicznych.
- Zmniejsza ryzyko biologiczne, umożliwiając ocenę funkcjonalną przed badaniami in vivo.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół integruje etapy od wczesnych odkryć po identyfikację związku wiodącego, wspierając zarówno walidację celu, jak i screening związków w badaniach nad metabolizmem nerek.
- Biologia odkrywcza: Ilościowe określenie oddychania mitochondrialnego i utleniania kwasów tłuszczowych w celu wyjaśnienia zaangażowania szlaków metabolicznych w choroby nerek.
- Przesiewanie: Zapewnienie wysokoprzepustowych, powtarzalnych warunków analizy do oceny związków w pierwotnych komórkach nerek.
- Analityka: Dostarczenie znormalizowanych pomiarów OCR w celu przeprowadzenia rzetelnego porównania statystycznego między grupami eksperymentalnymi.
- Badania translacyjne: Powiązanie wyników metabolicznych ex vivo z przedklinicznymi modelami przewlekłej choroby nerek.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanowienie skalowalnego, zestandaryzowanego schematu postępowania dla bieżących badań nad metabolizmem nerek i kampanii przesiewowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w wyborze i walidacji celów metabolicznych.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i wydajność w testach opartych na komórkach nerkowych.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji typu go/no-go i zmniejsza ryzyko biologiczne na późnych etapach odkrywania leków na choroby nerek.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów metabolicznych i związków w wskazaniach nerkowych z uwzględnieniem poziomu ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu izolacji pierwotnych komórek oraz testów funkcjonalnych mitochondriów.
- Wymagany jest dostęp do wysokoprzepustowych analizatorów przepływu zewnątrzkomórkowego oraz kompatybilnego oprogramowania.
- W celu zapewnienia powtarzalności konieczna jest rygorystyczna standaryzacja gęstości komórek i stężeń związków.
- Możliżna jest konieczność adaptacji metody dla innych gatunków lub podtypów komórek nerkowych.
- Staranne monitorowanie zmiennych testowych jest niezbędne, aby uniknąć niepowodzenia eksperymentu.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Title
0:50
Preparing Collagen I Plates
1:31
Perfusion, Digestion and Harvesting Kidneys from Mice
2:36
Tissue Processing and Primary Tubular Cells Isolation
4:11
Mitochondria Bioenergetics Assay
7:26
Results: Renal Tubular Epithelial Cell (TEC) Morphology and Metabolism
9:04
Conclusion
