Izolacja, charakterystyka i wysokoprzepustowa analiza strumienia zewnątrzkomórkowego pierwotnych komórek nabłonka kanalików nerkowych myszy
20 czerwca 2018
Ten protokół zapewnia efektywne kosztowo podejście do izolowania i charakteryzowania pierwotnych komórek kanalików nerkowych myszy, które następnie mogą być subhodowane w celu oceny funkcji biologicznych nerek ex vivo, w tym bioenergetyki mitochondrialnej.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące metabolizmu nerek, takie jak utlenianie kwasów tłuszczowych, które jest ściśle związane z rozwojem zwłóknienia nerek i różnych innych nefropatii. Główną zaletą tej techniki jest wykorzystanie wysokoprzepustowej platformy do badań przesiewowych pod kątem związków regulujących bioenergetykę mitochondriów w komórkach nabłonka kanalików nerkowych. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię chorób metabolicznych nerek, ponieważ pozwala ona na dokładne badania przesiewowe związków, które regulują metabolizm mitochondrialny w komórkach nabłonka nerkowego.
Aby przygotować pokryte kolagenem 60-milimetrowe szalki Petriego, dodaj dwa mililitry wstępnie przefiltrowanego 20-milimolowego kwasu octowego, a następnie 35 mikrolitrów roztworu kolagenu I do każdej potrawy. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez godzinę, wysusz ją na powietrzu i wystaw na działanie promieniowania UV. Następnie spłucz pozostałości kwasu octowego za pomocą PBS. Wykonaj trzy płukania.
Następnie przechowuj naczynie w inkubatorze do hodowli komórkowych o temperaturze 37 stopni Celsjusza bez dwutlenku węgla. Po przygotowaniu myszy do zabiegu usuń sierść z klatki piersiowej i brzucha za pomocą kremu do depilacji. Następnie zdezynfekuj skórę jodem i zetrzyj pozostałości jodu.
Następnie wykonaj nacięcie, aby otworzyć jamę brzuszną i odsłonić serce i nerki. Teraz ustaw pompę perfuzyjną na 32 mililitry na minutę i usuń wszelkie pęcherzyki z rurki przed rozpoczęciem perfuzji. Użyj igły o rozmiarze 27 na końcu linii.
Aby kontynuować, włóż igłę do lewej komory przez wierzchołek serca. Gdy tylko bufor wypełni serce, zrób otwór w prawym przedsionku, aby utworzyć wyjście dla bufora perfuzyjnego. Następnie przełącz się na bufor wytrawiający i nieznacznie zmniejsz prędkość pompy do 30 mililitrów na minutę w celu roztwarzania.
Po perfuzji 20 mililitrów buforu trawiennego należy usunąć obie nerki w celu izolacji komórek kanalików. Aby przetworzyć pobrane nerki, najpierw usuń torebki nerkowe i rdzeń. Następnie zmiel obie nerki na drobne kawałki i inkubuj je w 10 mililitrach buforu wytrawiającego w piekarniku o temperaturze 37 stopni Celsjusza z delikatnymi obrotami przez pięć minut.
Po strawieniu usuń wszelkie niestrawione tkanki, przepuszczając bufor przez filtr o średnicy 70 mikronów. Po zebraniu strawionej tkanki dodaj 10 mililitrów pożywki hodowlanej, aby zatrzymać trawienie. Następnie odwirować przefiltrowaną zawiesinę tkankową o masie 50 g przez pięć minut, aby osadzać komórki rurkowe.
Następnie przenieś supernatant do nowej probówki, dodaj pięć mililitrów pożywki hodowlanej i powtórz wirowanie, aby zebrać pozostałe komórki rurkowe. Teraz ponownie zawieś pierwszą osadkę w 20 mililitrach pożywki hodowlanej i odwiruj ją przy 50 g przez pięć minut, aby dalej oczyścić zebrane komórki. Usunąć supernatant.
Następnie ponownie zawieś oba osady w 10 mililitrach pożywki hodowlanej. Następnie policz żywe komórki za pomocą barwienia błękitem trypanowym. Następnie umieść do 10 milionów komórek na 60-milimetrowym naczyniu pokrytym kolagenem i pozwól komórkom rurkowym przyczepić się przez noc.
Na początek wysiew komórki rurkowe P1 w 40 000 komórek do studzienek świeżo przygotowanej 96-dołkowej mikropłytki pokrytej kolagenem. Użyj 100 mikrolitrów pożywki hodowlanej na studzienkę. Optymalizacja gęstości komórek i stężenia związków w teście strumienia zewnątrzkomórkowego jest kluczem do udanego eksperymentu.
Zalecamy przeprowadzenie pilotażowego eksperymentu miareczkowania w celu określenia optymalnej gęstości komórek i stężenia związków. Następnie nawodnij wkład czujnika. Najpierw podnieś wkład czujnika i napełnij każdą studzienkę płytki 200 mikrolitrami roztworu kalibracyjnego.
Następnie zmień położenie wkładu, aby zanurzyć czujniki i inkubuj zespół przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia odessaj starą pożywkę i zastąp ją 175 mikrolitrami pożywki do oznaczania glukozy lub kwasów tłuszczowych. Następnie kontynuuj inkubację przez godzinę bez dwutlenku węgla.
Podczas inkubacji komórek załaduj port A wkładu 25 mikrolitrami oligomycyny, załaduj port B FCCP, załaduj port C rotenonem/antymycyną A, a port D i wszystkie inne porty załaduj wodą. Teraz należy przechowywać wkład w inkubatorze niezawierającym dwutlenku węgla, aż zestaw będzie gotowy do kalibracji. Kontynuuj, włączając analizator strumienia zewnątrzkomórkowego i sterownik.
Następnie otwórz oprogramowanie analizatora, wybierz standardowy test i naciśnij opcję Kreator testu. Następnie w zakładce Związki przypisz związki do odpowiednich portów. Na karcie Korekcja tła wybierz źródła, które nie zawierają żadnych komórek.
Następnie użyj karty Grupy i etykiety, aby oznaczyć etykiety grup eksperymentalnych. Następnie w zakładce Protokół ustaw odpowiednie cykle mieszania i mierzenia za pomocą dostępnych komend. Ustawienia te są wskazane w protokole tekstowym, a po ich wprowadzeniu zapisz szablon do wykorzystania w przyszłości.
Teraz naciśnij Zakończ kreatora, aby kontynuować. Teraz naciśnij Start, aby rozpocząć kalibrację. Następnie analizator wysuwa uchwyt płytki i prosi o włożenie płytki naboju.
Ten proces kalibracji trwa od 20 do 25 minut. Po skalibrowaniu systemu naciśnij polecenie zachęty, aby wymienić płytkę kalibracyjną na płytkę ogniwa i kontynuuj pracę. Po zakończeniu przebiegu zapisz dane OCR i wyjmij płytkę z analizatora.
Teraz dodaj Hoechst do każdego z dołków testowych i inkubuj płytkę przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie policz komórki za pomocą wzbudzenia 355 nm i emisji 460 nm i znormalizuj dane OCR do liczby komórek. W tym protokole heterogeniczna populacja komórek nerkowych, niecałkowicie strawionych kanalików i innych szczątków tkanek została wyhodowana na płytkach pokrytych kolagenem.
Dzień po izolacji pożywkę hodowlaną odwirowano w celu usunięcia zanieczyszczeń, a komórki rurkowe ponownie platerowano. Następnie komórki łatwiej się przyczepiały, a do piątego dnia w hodowli osiągnęły 80 do 90% zbieżności. TEC nerek zostały następnie poddane subhodowli i osiągnęły zlew w ciągu jednego tygodnia.
Podobny wzrost nastąpił w ciągu następnych dwóch okresów. Monowarstwa komórek uformowała się w kopułę, unosząc się od płyty i pozostając połączoną za pomocą ciasnych połączeń. Oddychanie mitochondrialne izolowanych pierwotnych TEC mierzono za pomocą opisanej analizy strumienia zewnątrzkomórkowego OCR przy różnych gęstościach posiewu, jak opisano.
Komórki posiane o większej gęstości miały proporcjonalny wzrost OCR. 40 000 komórek na studzienkę pokrywało powierzchnię płytki lepiej niż jakiekolwiek inne gęstości posiewu, co czyni ją optymalnym stężeniem do testowania interakcji między komórkami i związkami. Na przykład pożywki zawierające substrat kwasów tłuszczowych zastosowano do TEC wraz z 2DG, inhibitorem glikolizy, w celu bezpośredniej oceny utleniania kwasów tłuszczowych w TEC w pasażach pierwszym i drugim.
Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby zawsze zapisywać dokładne objętości i stężenia w każdym dołku. Zmiany w końcowych stężeniach składników mogą spowodować, że cały eksperyment zakończy się niepowodzeniem. Po jej opracowaniu, technika ta utoruje drogę naukowcom z dziedziny nefrologii do zbadania roli metabolizmu kwasów tłuszczowych w kanalikach tłuszczowych w patogenezie różnych nefropatii.
Przegląd
Ten protokół zapewnia opłacalne podejście do izolacji i charakteryzacji pierwotnych komórek cewek nerkowych myszy, które następnie mogą być poddać ponownej hodowli w celu oceny funkcji biologicznych nerek ex vivo, w tym bioenergii mitochondrialnej.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Nefologia
- Biologia komórki
- Badania metaboliczne
Tło
- Ta metoda odpowiada na kluczowe pytania dotyczące metabolizmu nerek.
- Koncentruje się na utlenianiu kwasów tłuszczowych związanym z zwłóknieniem nerek i nefropatią.
- Technika ta pozwala na wysokowydajne przesiewowe badania związków.
- Ma znaczenie dla terapii chorób metabolicznych nerek.
Cel badania
- Izolacja i charakteryzacja komórek cewek nerkowych.
- Ocena bioenergii mitochondrialnej w tych komórkach.
- Umożliwienie wysokowydajnego przesiewu związków wpływających na metabolizm nerek.
Stosowane metody
- Przygotowanie naczyń pokrytych kolagem do hodowli komórkowej.
- Chirurgiczne izolowanie nerek myszy w celu wyciągnięcia komórek cewek.
- Użycie buforów do trawienia i wirowania do oczyszczania komórek.
- Analiza przepływu pozakomórkowego w celu oceny funkcji mitochondrialnej.
Główne wyniki
- Udana izolacja i hodowla komórek cewek nerkowych.
- Komórki osiągnęły 80-90% konfluencji w ciągu pięciu dni.
- Wysokowydajne przesiewowe badania związków metabolicznych mitochondrialnych zostało umożliwione.
- Protokół pozwala na powtarzalne wyniki w badaniach komórek nerkowych.
Wnioski
- Protokół jest skuteczny w badaniu funkcji komórek cewek nerkowych.
- Dostarcza wglądu w metabolizm nerek i potencjalne terapie.
- Wysokowydajne możliwości zwiększają efektywność badań.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
High-throughput extracellular flux analysis of primary mouse renal tubular epithelial cells enables robust interrogation of mitochondrial bioenergetics, a critical determinant in renal disease pathogenesis. This workflow supports early-stage target validation and mechanistic de-risking for metabolic pathways implicated in chronic kidney disease. The protocol's scalability and reproducibility position it as a foundational capability for renal metabolism-focused drug discovery portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct assessment of mitochondrial function in disease-relevant renal cell populations.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying fatty acid oxidation and metabolic flux.
- Facilitates functional target validation for pathways linked to renal fibrosis and nephropathies.
- Provides predictive confidence for advancing metabolic targets in renal disease pipelines.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, high-throughput screening of compounds affecting mitochondrial bioenergetics.
- Optimizes assay conditions for cell density and compound concentration, ensuring reproducibility.
- Generates quantitative outputs (OCR) for reliable compound evaluation and comparison.
- Enables platform reuse for iterative screening and lead optimization cycles.
Translational & Preclinical Research
- Aligns ex vivo metabolic readouts with disease-relevant renal cell models.
- Supports translational biomarker development by linking mitochondrial function to renal pathology.
- Provides continuity from early discovery through preclinical validation of metabolic interventions.
- Reduces biological risk by enabling functional assessment prior to in vivo studies.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates from early discovery through lead identification, supporting both target validation and compound screening in renal metabolism research.
- Discovery Biology: Quantifies mitochondrial respiration and fatty acid oxidation to clarify metabolic pathway involvement in renal disease.
- Screening: Provides high-throughput, reproducible assay conditions for compound evaluation in primary renal cells.
- Analytics: Delivers normalized OCR measurements for robust statistical comparison across experimental groups.
- Translational Research: Bridges ex vivo metabolic findings to preclinical models of chronic kidney disease.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, standardized workflow for ongoing renal metabolism research and screening campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in metabolic target selection and validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and throughput in renal cell-based assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and reduces late-stage biological risk in renal drug discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of metabolic targets and compounds for renal indications.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell isolation and mitochondrial functional assays.
- Needs access to high-throughput extracellular flux analyzers and compatible software.
- Demands rigorous standardization of cell density and compound concentrations for reproducibility.
- Adaptation may be needed for other species or renal cell subtypes.
- Careful tracking of assay variables is essential to avoid experimental failure.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:50
Preparing Collagen I Plates
1:31
Perfusion, Digestion and Harvesting Kidneys from Mice
2:36
Tissue Processing and Primary Tubular Cells Isolation
4:11
Mitochondria Bioenergetics Assay
7:26
Results: Renal Tubular Epithelial Cell (TEC) Morphology and Metabolism
9:04
Conclusion
