Name: Izolacja, charakterystyka i wysokoprzepustowa analiza strumienia zewnątrzkomórkowego pierwotnych komórek nabłonka kanalików nerkowych myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Poznaj izolację pierwotnych komórek nabłonka kanalików nerkowych myszy i analizę strumienia zewnątrzkomórkowego do badania bioenergetyki mitochondrialnej. Ta metoda umożliwia wysokoprzepustowe przesiewanie związków w nefrologii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca została wsparta następującymi grantami dla Liny A. Shehadeh: National Institute of Health (R56HL132209 i 1R01HL140468) oraz Miami Heart Research Institute.

Wszystkie eksperymenty z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie w Miami, zgodnie z wytycznymi NIH.
1. Powlekanie płytek i przygotowanie odczynników
<ol>
	<li>Przygotuj powłokę kolagenową:
	<ol>
		<li>Dodać 35 μl kolagenu I do 2 ml wstępnie przefiltrowanego 20 mM roztworu kwasu octowego na pojedynczą 60-milimetrową szalkę Petriego. Inkubuj go w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, wysusz na powietrzu i wystaw na działanie promieniowania UV.</li>
		<li>Umyj powłokę 3x PBS, aby usunąć wszelkie pozostałości kwasu i przechowuj ją w inkubatorze do hodowli komórkowych o temperaturze 37 °C bezCO2, aż komórki będą gotowe do wysiewu. Końcowe stężenie powłoki kolagenowej wynosi 5 μg/cm2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować bufor perfuzyjny: dodać 300 μl penicyliny-streptomycyny (P/S) do 30 ml PBS i ogrzać mieszaninę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C aż do rozpoczęcia izolacji.</li>
	<li>Przygotować bufor do wytrawiania: rozpuścić 3,9 mg kolagenazy typu 2 w 30 ml PBS, przefiltrować roztwór przez filtr butelkowy o wielkości 0,2 μm i ogrzać go w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C, aż do rozpoczęcia izolacji.</li>
	<li>Przygotuj pożywkę do hodowli komórkowych:
	<ol>
		<li>Doprowadź suplementy do temperatury pokojowej. Bez filtracji dodać suplement (0,05 ml płodowej surowicy cielęcej, 10 ng/ml naskórkowego czynnika wzrostu, 5 μg/ml insuliny, 0,5 μg/ml epinefryny, 36 ng/ml hydrokortyzonu, 5 μg/ml transferyny i 4 pg/ml trójjodo-L-tyroniny) do 500 ml podłoża podstawowego do wzrostu komórek nabłonka nerkowego 2.</li>
		<li>Podgrzej podłoże w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aż będzie gotowe do użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować związki: przygotować 50 mM FCCP, 10 mM rotenonu, 10 mM oligomycyny, 10 mM roztworów podstawowych antymycyny A, 50 mM L-karnityny i 50 mM roztworów podstawowych etomosypu w DMSO, podzielić je na porcje i przechowywać związki w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Przygotować 2,5 mM palmitynianu sodu w 220 ml 150-mM roztworu NaCl i ogrzać roztwór w łaźni wodnej o temperaturze 75 °C, aż palmitynian całkowicie się rozpuści.</li>
	<li>Przygotować albuminę surowicy bydlęcej (BSA): przygotować 0,34 mM beztłuszczowego BSA w 250 ml 150 mM NaCl. Kontrolny BSA służy jako kontrola ujemna dla roztworu palm-BSA, którą można przygotować, wykonując krok 1.8.</li>
	<li>Sprzężenie palmitynianu z BSA (Palm-BSA):
	<ol>
		<li>Roztwór palmitynianu dodawać stopniowo do roztworu BSA, gdy jest jeszcze gorący. Następnie dostosuj pH do 7,4 i mieszaj je w temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 godzinę, aby zakończyć koniugację.</li>
		<li>Po zakończeniu koniugacji dodać kolejne 150 ml 150 mM NaCl do roztworu, dobrze wymieszać i zachować podwielokrotności w temperaturze -20 °C. Końcowy roztwór zawiera 1 mM palmitynianu sodu i 0,17 mM BSA i będzie stosowany jako substrat kwasów tłuszczowych dla komórek w teście strumienia zewnątrzkomórkowego na bazie kwasów tłuszczowych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować oznaczenie strumienia zewnątrzkomórkowego podłoża podstawowego:
	<ol>
		<li>Dodaj 1 torebkę proszku DMEM i 20 ml 200 mM L-glutaminy (4 mM final) do 1 l autoklawizowanego dH2O i delikatnie wymieszaj.</li>
		<li>W dniu eksperymentu bioenergetycznego dodać 100 μM pirogronianu sodu do przygotowanych pożywek podstawowych w celu późniejszego przygotowania pożywki do oznaczania strumienia zewnątrzkomórkowego, która ma być użyta w teście oddychania opartym na glukozie lub kwasach tłuszczowych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj pożywkę na bazie glukozy:
	<ol>
		<li>Aby zmierzyć zdolność oddychania komórkowego poprzez glikolizę, dodaj 17,5 mM glukozy w proszku, 100 μM kontrolnego BSA (jak opisano w kroku 1.7) i 20 μM etomosiru (w celu zahamowania utleniania kwasów tłuszczowych) do podłoża podstawowego opisanego powyżej w kroku 1.9.</li>
		<li>Rozgrzać podłoże w temperaturze 37 °C, dostosować pH do 7,4 i przechowywać je w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C do czasu użycia w teście przepływu zewnątrzkomórkowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj pożywki na bazie kwasów tłuszczowych:
	<ol>
		<li>Aby zmierzyć zdolność oddychania komórkowego poprzez utlenianie kwasów tłuszczowych, dodaj 10 mM 2D-glukozy w proszku (analog glukozy hamujący glikolizę), 100 μM Palm-BSA (jak opisano w kroku 1.8) i 100 μM L-karnityny do podłoża podstawowego opisanego powyżej w kroku 1.9.</li>
		<li>Rozgrzać pożywkę w temperaturze 37 °C, dostosować pH do 7,4 i przechowywać w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C do czasu użycia w teście strumienia zewnątrzkomórkowego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Perfuzja, trawienie i pobieranie nerek od myszy
<ol>
	<li>Znieczulij mysz przepływem izofluranu i unieruchomij ją w pozycji leżącej. Upewnij się, że izolacja rozpoczyna się dopiero po tym, jak zwierzę straci odruchy prostowania, a głębokość znieczulenia jest monitorowana za pomocą oceny szczypania za pomocą atraumatycznych kleszczy przed i w trakcie zabiegu22.</li>
	<li>Usuń sierść za pomocą kremu do depilacji z klatki piersiowej myszy do jej brzucha, zdezynfekuj ją jodem i wytrzyj pozostałości jodu.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie w klatce piersiowej, przetnij skórę, aby otworzyć cały obszar brzucha i odsłoń serce i nerki.</li>
	<li>Ustaw pompę perfuzyjną na 32 ml/min i usuń wszelkie pęcherzyki z rurki przed rozpoczęciem perfuzji.</li>
	<li>Włóż igłę 27-G do lewej komory przez wierzchołek serca, gdy tylko bufor wypełni serce, i szturchnij prawy przedsionek, aby utworzyć wyjście, aby bufor perfuzyjny krążył podczas pompowania serca i ostatecznie został usunięty z wyjścia prawego przedsionka.</li>
	<li>Po perfuzji zmień prędkość pompy na 30 ml/min w celu roztrawienia.</li>
	<li>Po przeprowadzeniu 20 ml buforu trawiennego przez wierzchołek, usuń obie nerki w celu izolacji komórek kanalików.</li>
</ol>
3. Przetwarzanie tkanek i izolacja pierwotnych komórek kanalików
<ol>
	<li>Wyjąć torebki nerkowe i rdzeń, zmielić obie nerki na drobne kawałki i inkubować je w 10 ml buforu wytrawiającego w suszarce o temperaturze 37 °C, delikatnie obracając przez 5 minut.</li>
	<li>Usuń wszelkie niestrawione tkanki nerkowe, przepuszczając bufor przez filtr 70 μm. Dodaj 10 ml pożywki hodowlanej, aby zatrzymać trawienie.</li>
	<li>Aby zebrać komórki rurkowe, należy odwirować przefiltrowaną zawiesinę komórkową o sile 50 x g przez 5 minut, aby zebrać pierwsze osady. Przenieść supernatant do nowej probówki i dodać 5 ml pożywki hodowlanej, odwirować go przy 50 x g przez 5 minut, aby upewnić się, że wszystkie komórki rurkowe zostały zebrane do drugiej osadki. 
	Wirowanie odbywa się z mniejszą prędkością, aby przede wszystkim granulować ciężkie rurki. Później, po tym, jak komórki odzyskają siły po izolacji, czysta kultura rurkowa jest odwirowywana z większą prędkością podczas subkultur.</li>
	<li>Ponownie zawiesić pierwszy osad w 20 ml pożywki hodowlanej i odwirować go przy 50 x g przez 5 minut, aby zebrać trzeci osad.</li>
	<li>Zawiesić drugie i trzecie osadki w 1 ml pożywki hodowlanej. Zmieszać 10 μl zawiesiny komórek z 10 μl błękitu trypanowego, załadować mieszaninę do komory A na szkiełku liczącym i zapisać żywotność komórek z automatycznego licznika komórek (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Wysiewaj do 107 komórek (niejednorodna populacja) na pojedynczym 60-milimetrowym naczyniu wstępnie pokrytym kolagenem i pozwól komórkom rurkowym przyczepić się przez noc.</li>
</ol>
4. Subkultura i charakterystyka pierwotnych komórek rurkowych
<ol>
	<li>W 1 dniu po izolacji zebrać pożywkę hodowlaną i odwirować ją przy 50 x g przez 5 minut, aby otulić wszelkie pływające kanaliki. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 4 ml świeżej pożywki hodowlanej i umieścić go z powrotem w tym samym naczyniu hodowlanym.</li>
	<li>W 4 dniu po izolacji usuń stare pożywki hodowlane i dodaj nowe podłoża.</li>
	<li>W 7 dniu po izolacji odłączyć komórki, inkubując je w temperaturze 37 °C w 2 ml 0,25% trypsyny-EDTA przez 5 minut. Dodać 3 ml pożywki hodowlanej, aby zatrzymać reakcję i zebrać komórki przez odwirowanie przy 250 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Aby przeprowadzić subkulturę i scharakteryzować komórki od P0 do P1, wysiewaj 5,000 komórek na studzienkę na 24-dołkową płytkę pokrytą kolagenem I, jak opisano powyżej.</li>
	<li>24 godziny po kroku 4.4 utrwal komórki w P1 za pomocą 4% PFA przez 10 minut, przepuszczaj je 0,2% Triton X-100 przez 3 minuty i blokuj je 10% surowicą osła (DS) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Rozcieńczyć w stosunku 1:100 w 10% s.m. każde z następujących białek: proksymalne markery kanalikowe angiotensynogen (AGT) i akwaporyna 1 (AQP1), dystalny marker kanalikowy E-kadheryna, marker mezangialny CD90/Thy1 oraz markery makrofagów EGF-podobny moduł zawierający receptor podobny do hormonu mucynopodobnego 1 (F4/80) i klaster różnicowania 68 (CD68) i inkubować je z komórkami przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Następnego dnia wykryj wszelkie zabarwienia za pomocą 1:200 fluorescencyjnych przeciwciał drugorzędowych przeciwko królikowi, myszy lub szczurowi przez 45 minut. Wykonaj zdjęcia pod mikroskopią konfokalną, aby potwierdzić ekspresję markerów, jak pokazano na rysunku 2A.</li>
	<li>W dniu 3 po subhodowli P1 odłącz komórki do subkultury i charakterystyki w P2 poprzez barwienie markerów rurkowych, mezangialnych i makrofagów opisanych w kroku 4.5. Zobrazuj barwienie pod mikroskopią konfokalną, aby potwierdzić ekspresję markerów, jak pokazano na rysunku 2A.</li>
	<li>W dniu 3 po subkulturze P2 odłącz komórki do subkultury i charakterystyki w P3 poprzez barwienie markerów kanalikowatych, mezangialnych i makrofagów opisanych w kroku 4.5. Zobrazuj barwienie pod mikroskopią konfokalną, aby potwierdzić ekspresję markerów, jak pokazano na rysunku 2A.</li>
	<li>Przygotuj barwienie tkanki:
	<ol>
		<li>Suche na powietrzu mrożone preparaty typu dzikiego i Col4a3-/- nerki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i utrwalać je 4% PFA przez 10 minut. Przepuszczaln je 0,2% Triton X-100 przez 10 minut i blokuj je 10% surowicą osła (DS) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Dodać przeciwciała przeciwko białkom markerowym opisanym w kroku 4.5 w stosunku 1:200 i inkubować je w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
		<li>Następnego dnia wykryj wszelkie zabarwienia fluorescencyjnymi przeciwciałami drugorzędowymi przeciwko królikom, myszom lub szczurom w skali 1:200 przez 45 minut. Wykonaj zdjęcia pod mikroskopem konfokalnym, aby potwierdzić ekspresję markerów, jak pokazano na rysunkach 2B i 2C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Test bioenergetyczny mitochondriów
<ol>
	<li>Wysiewaj komórki rurkowe P1 w 20 000, 30 000 lub 40 000 komórek na studzienkę w 100 μl pożywki hodowlanej na 96-dołkowej mikropłytce wstępnie pokrytej 5 μg /cm2 kolagenu I na dzień przed testami strumienia zewnątrzkomórkowego.</li>
	<li>W celu nawodnienia wkładu czujnika należy podnieść wkład czujnika i napełnić każdą studzienkę płytki 200 μl roztworu kalibracyjnego. Ostrożnie załaduj wkład z powrotem, aby zanurzyć czujniki w roztworze kalibracyjnym. Umieść wkład w piekarniku o temperaturze 37 °C bez CO2 na co najmniej 7 godzin przed użyciem. 
	Aby uzyskać najlepsze rezultaty, zaleca się nawodnienie wkładu przez noc.</li>
	<li>Przygotuj związki: przygotuj 8 μM oligomycyny, 9 μM FCCP i mieszaninę 20 μM rotenonu/antymycyny A zarówno w pożywce do oznaczania strumienia zewnątrzkomórkowego glukozy (opisanej w kroku 1.10), jak i kwasów tłuszczowych (opisanej w kroku 1.11).</li>
	<li>Zmienić pożywkę: odessać pożywkę do hodowli komórkowych, dodać 175 μl pożywki do oznaczania glukozy lub kwasów tłuszczowych (w zależności od związku, w którym się pracuje, patrz krok 5.3) i inkubować je przez 1 godzinę w inkubatorze wolnym odCO2 w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Załaduj porty kartridży 25 μL następujących związków: 8 μM oligomycyny dla portu A, aby osiągnąć końcowe stężenie 1 μM (uwaga: ponieważ każda studzienka będzie zawierać 175 μL pożywki, związek zostanie rozcieńczony 8x), 9 μM FCCP w porcie B, aby osiągnąć końcowe stężenie 1 μM (uwaga: ponieważ każda studzienka będzie zawierała 175 μL pożywki plus 25 μL roztworu wstrzykniętego z portu A, związek zostanie rozcieńczony 9x) i 20 μM rotenonu/antymycyny A w porcie C, aby osiągnąć końcowe stężenie 2 μM dla każdego związku (uwaga: ponieważ każda studzienka będzie zawierać 175 μL pożywki plus 50 μL roztworu wstrzykniętego z portów A i B, Związek zostanie rozcieńczony 10x).</li>
	<li>Dodaj wodę do wszystkich studni w porcie D i wszystkich innych portów studni tła (bez komórek). Inkubować wkład w inkubatorze wolnym od CO2 w temperaturze 37 °C przez 10 minut.</li>
	<li>Włącz analizator strumienia zewnątrzkomórkowego i sterownik.</li>
	<li>Otwórz oprogramowanie Analyzer i wprowadź następujący protokół:
	<ol>
		<li>Wybierz test standardowy. Naciśnij przycisk Kreator testów. Korzystając z karty Związki, przypisz układ złożony i użyj karty Grupy i etykiety, aby oznaczyć etykiety grup eksperymentalnych. Pamiętaj, aby przypisać puste studnie (bez komórek) jako tło.</li>
		<li>W zakładce Protokół ustaw następujące cykle mieszania i mierzenia, korzystając z dostępnych poleceń, jak wskazano w Tabeli 1: kalibrować, mieszać przez 2 min, odczekać 2 minuty i mierzyć przez 3 min (powtórzyć ten cykl 2 - 3x); wstrzyknąć port A, mieszać przez 2 min, odczekać 2 min, mierzyć przez 3 min (powtórzyć ten cykl 2 - 3 razy); wstrzyknąć port B, mieszać przez 2 min, odczekać 2 min, mierzyć przez 3 min (powtórzyć ten cykl 2 - 3x); wstrzyknąć port C, mieszać przez 2 min, odczekać 2 min, mierzyć przez 3 min (powtórzyć ten cykl 2 - 3 razy). Naciśnij przycisk End Wizard (Zakończ kreator). Możliwe jest również zapisanie bieżącego szablonu do wykorzystania w przyszłości.</li>
		<li>Naciśnij Start, aby rozpocząć kalibrację. Następnie analizator automatycznie wysuwa uchwyt płytki i prosi o włożenie płytki kasety.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po zakończeniu etapu kalibracji (zwykle w ciągu 20 - 25 minut) naciśnij polecenie prompt, aby zmienić płytkę wkładu na płytkę ogniwa i kontynuować pracę.</li>
	<li>Po zakończeniu cyklu przenieś dane i wyjmij 96-dołkową płytkę. Dodać Hoechsta (1:1 000) do każdego z dołków testowych i inkubować je przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Znormalizować dane OCR do liczby komórek poprzez pomiar odczytu fluorescencji Hoechsta przy wzbudzeniu 355 nm i emisji 460 nm.</li>
</ol>

<ol><li>Bielesz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+notch+signaling+regulates+interstitial+fibrosis+development+in+the+kidneys+of+mice+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Epithelial notch signaling regulates interstitial fibrosis development in the kidneys of mice and humans.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (11), 4040-4054 (2010).</li>
<li>Fabian, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog-Gli+pathway+activation+during+kidney+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Hedgehog-Gli pathway activation during kidney fibrosis.</a> American Journal of Pathology. 180 (4), 1441-1453 (2012).</li>
<li>Forbes, J. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27215468">Mitochondria-power players in kidney function.</a> Trends in Endocrinology & Metabolism. 27 (7), 441-442 (2016).</li>
<li>Suzuki, T., Furusato, M., Takasaki, S., Ishikawa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+mitochondria+in+the+epithelial+cells+of+the+proximal+convoluted+tubules+of+diseased+human+kidneys%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Giant mitochondria in the epithelial cells of the proximal convoluted tubules of diseased human kidneys.</a> Laboratory Investigation. 33 (6), 578-590 (1975).</li>
<li>Yuan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+accounts+for+aldosterone-induced+epithelial-to-mesenchymal+transition+of+renal+proximal+tubular+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction accounts for aldosterone-induced epithelial-to-mesenchymal transition of renal proximal tubular epithelial cells.</a> Free Radical Biology & Medicine. 53 (1), 30-43 (2012).</li>
<li>Kang, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+fatty+acid+oxidation+in+renal+tubular+epithelial+cells+has+a+key+role+in+kidney+fibrosis+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Defective fatty acid oxidation in renal tubular epithelial cells has a key role in kidney fibrosis development.</a> Nature Medicine. 21 (1), 37-46 (2015).</li>
<li>Al-Awqati, Q., Oliver, J. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11849378">Stem cells in the kidney.</a> Kidney International. 61 (2), 387-395 (2002).</li>
<li>Rocca, C. J., Ur, S. N., Harrison, F., Cherqui, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((rAAV9+combined+with+renal+vein+injection+is+optimal+for+kidney-targeted+gene+delivery%3A+conclusion+of+a+comparative+study%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">rAAV9 combined with renal vein injection is optimal for kidney-targeted gene delivery: conclusion of a comparative study.</a> Gene Therapy. 21 (6), 618-628 (2014).</li>
<li>Kamiyama, M., Garner, M. K., Farragut, K. M., Kobori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+establishment+of+a+primary+culture+system+of+proximal+tubule+segments+using+specific+markers+from+normal+mouse+kidneys%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">The establishment of a primary culture system of proximal tubule segments using specific markers from normal mouse kidneys.</a> International Journal of Molecular Sciences. 13 (4), 5098-5111 (2012).</li>
<li>Terryn, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primary+culture+of+mouse+proximal+tubular+cells%2C+established+on+collagen-coated+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">A primary culture of mouse proximal tubular cells, established on collagen-coated membranes.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 293 (2), F476-F485 (2007).</li>
<li>Tang, M. J., Suresh, K. R., Tannen, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbohydrate+metabolism+by+primary+cultures+of+rabbit+proximal+tubules%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Carbohydrate metabolism by primary cultures of rabbit proximal tubules.</a> American Journal of Physiology. 256, C532-C539 (1989).</li>
<li>Gesek, F. A., Wolff, D. W., Strandhoy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+separation+method+for+rat+proximal+and+distal+renal+tubules%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Improved separation method for rat proximal and distal renal tubules.</a> American Journal of Physiology. 253, F358-F365 (1987).</li>
<li>Vinay, P., Gougoux, A., Lemieux, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+pure+suspension+of+rat+proximal+tubules%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Isolation of a pure suspension of rat proximal tubules.</a> American Journal of Physiology. 241 (4), F403-F411 (1981).</li>
<li>Taub, M., Chuman, L., Saier, M. H., Sato, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+Madin-Darby+canine+kidney+epithelial+cell+%28MDCK%29+line+in+hormone-supplemented%2C+serum-free+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Growth of Madin-Darby canine kidney epithelial cell (MDCK) line in hormone-supplemented, serum-free medium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (7), 3338-3342 (1979).</li>
<li>Chung, S. D., Alavi, N., Livingston, D., Hiller, S., Taub, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+primary+rabbit+kidney+cultures+that+express+proximal+tubule+functions+in+a+hormonally+defined+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Characterization of primary rabbit kidney cultures that express proximal tubule functions in a hormonally defined medium.</a> Journal of Cell Biology. 95 (1), 118-126 (1982).</li>
<li>Rubera, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloride+currents+in+primary+cultures+of+rabbit+proximal+and+distal+convoluted+tubules%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Chloride currents in primary cultures of rabbit proximal and distal convoluted tubules.</a> American Journal of Physiology. 275, F651-F663 (1998).</li>
<li>Inoue, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+cultured+tubular+cells+isolated+from+human+urine+for+investigation+of+renal+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Use of cultured tubular cells isolated from human urine for investigation of renal transporter.</a> Clinical Nephrology. 53 (2), 90-98 (2000).</li>
<li>Van der Hauwaert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+a+primary+proximal+tubular+epithelial+cell+model+from+human+kidney+by+CD10%2FCD13+double+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of a primary proximal tubular epithelial cell model from human kidney by CD10/CD13 double labeling.</a> PLoS One. 8 (6), e66750(2013).</li>
<li>Helbert, M. J., Dauwe, S. E., Van der Biest, I., Nouwen, E. J., De Broe, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunodissection+of+the+human+proximal+nephron%3A+flow+sorting+of+S1S2S3%2C+S1S2+and+S3+proximal+tubular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Immunodissection of the human proximal nephron: flow sorting of S1S2S3, S1S2 and S3 proximal tubular cells.</a> Kidney International. 52 (2), 414-428 (1997).</li>
<li>Wen Ding, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteopontin+deficiency+ameliorates+Alport+pathology+by+preventing+tubular+metabolic+deficits%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Osteopontin deficiency ameliorates Alport pathology by preventing tubular metabolic deficits.</a> JCI Insight. 3 (6), (2018).</li>
<li>Quadri, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluoride-associated+ultrastructural+changes+and+apoptosis+in+human+renal+tubule%3A+a+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Human+%26+Experimental+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Fluoride-associated ultrastructural changes and apoptosis in human renal tubule: a pilot study.</a> Human & Experimental Toxicology. , (2018).</li>
<li>Kawai, S., Takagi, Y., Kaneko, S., Kurosawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+three+types+of+mixed+anesthetic+agents+alternate+to+ketamine+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Animals%22%5BJournal%5D)">Effect of three types of mixed anesthetic agents alternate to ketamine in mice.</a> Experimental Animals. 60 (5), 481-487 (2011).</li>
<li>Condorelli, L., et al. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-3-642-03900-3_15">Effect of fluid shear stress on tubular kidney epithelial cell structure.</a> World Congress on Medical Physics and Biomedical Engineering. 25 (10), 50-52 (2009).</li>
<li>Aschauer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delineation+of+the+key+aspects+in+the+regulation+of+epithelial+monolayer+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Delineation of the key aspects in the regulation of epithelial monolayer formation.</a> Molecular and Cellular Biology. 33 (13), 2535-2550 (2013).</li>
<li>George, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+use+of+autologous+renal+cells+from+diseased+kidneys+for+the+treatment+of+renal+failure%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Potential use of autologous renal cells from diseased kidneys for the treatment of renal failure.</a> PLoS One. 11 (10), e0164997(2016).</li>
<li>Elberg, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MKL1+mediates+TGF-beta1-induced+alpha-smooth+muscle+actin+expression+in+human+renal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">MKL1 mediates TGF-beta1-induced alpha-smooth muscle actin expression in human renal epithelial cells.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 294 (5), F1116-F1128 (2008).</li>
<li>Elberg, G., Guruswamy, S., Logan, C. J., Chen, L., Turman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+epithelial+cells+derived+from+human+normal+and+ADPKD+kidneys+in+primary+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Plasticity of epithelial cells derived from human normal and ADPKD kidneys in primary cultures.</a> Cell and Tissue Research. 331 (2), 495-508 (2008).</li>
<li>Cai, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+of+acetaminophen%2C+salicylic+acid%2C+and+caffeine+for+first-passage+rat+renal+inner+medullary+collecting+duct+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Toxicity of acetaminophen, salicylic acid, and caffeine for first-passage rat renal inner medullary collecting duct cells.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 306 (1), 35-42 (2003).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+epithelial+co-culture+of+mouse+renal+peritubular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and epithelial co-culture of mouse renal peritubular endothelial cells.</a> BMC Cell Biology. 15, 40(2014).</li>
<li>Barros, M. H., Hauck, F., Dreyer, J. H., Kempkes, B., Niedobitek, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+polarisation%3A+An+immunohistochemical+approach+for+identifying+M1+and+M2+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Macrophage polarisation: An immunohistochemical approach for identifying M1 and M2 macrophages.</a> PLoS One. 8 (11), e80908(2013).</li>
<li>Kim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+of+Alport+kidney+disease+in+Col4a3+knock+out+mice+is+independent+of+sex+or+macrophage+depletion+by+clodronate+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Progression of Alport kidney disease in Col4a3 knock out mice is independent of sex or macrophage depletion by clodronate treatment.</a> PLoS One. 10 (11), e0141231(2015).</li>
<li>Linnett, P. E., Beechey, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+of+the+ATP+synthethase+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Inhibitors of the ATP synthethase system.</a> Methods in Enzymology. 55, 472-518 (1979).</li>
<li>Bockenhauer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+phenotype+in+Lowe+Syndrome%3A+a+selective+proximal+tubular+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Renal phenotype in Lowe Syndrome: a selective proximal tubular dysfunction.</a> Clinical Journal of the American Society of Nephrology. 3 (5), 1430-1436 (2008).</li>
<li>Ranawaka, R., Dayasiri, K., Gamage, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+child+with+distal+%28type+1%29+renal+tubular+acidosis+presenting+with+progressive+gross+motor+developmental+regression+and+acute+paralysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">A child with distal (type 1) renal tubular acidosis presenting with progressive gross motor developmental regression and acute paralysis.</a> BMC Research Notes. 10 (1), 618(2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do zadeklarowania.

Zoptymalizowaliśmy protokół, który pozwala na skuteczną izolację mysich komórek nabłonka kanalików nerkowych (TEC) i wykazaliśmy, że komórki mogą być hodowane w celu analizy strumienia zewnątrzkomórkowego w celu oceny oddychania mitochondrialnego w obecności substratów na bazie kwasów tłuszczowych i/lub glukozy. Protokół ten jest przeznaczony do badań koncentrujących się zarówno na proksymalnych, jak i dystalnych komórkach kanalików i służy jako rama, za pomocą której można budować bardziej złożone eksperymenty w celu zrozumienia chorób nerek związanych z patologią TEC. W porównaniu z poprzednio opublikowanymi protokołami 9,10,19, metoda ta nie wymaga separacji gradientowej z długimi czasami wirowania ani dużego użycia przeciwciał do sortowania, a zatem stanowi bardziej wydajny i zoptymalizowany przewodnik dla badaczy zajmujących się polem metabolicznym kanalików nerkowych. W tym protokole znajduje się kilka krytycznych etapów, w tym trawienie, ponowne zbieranie i posiewanie gęstości oraz optymalizacja związków do testu strumienia zewnątrzkomórkowego.
Wybór odpowiedniego rodzaju kolagenazy i optymalnego stężenia jest kluczem do udanego trawienia i dysocjacji komórek kanalików nerkowych od tkanek nerkowych. W porównaniu z innymi typami kolagenaz, kolagenaza typu 2 zawiera stosunkowo wyższy poziom aktywności proteazy, zdolnej do dysocjacji zwartych struktur nerkowych. Aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia w wyniku wydłużonego czasu perfuzji i trawienia, 0,013% kolagenazy typu 2 perfuzjono w tempie 30 ml/min. Torebka nerkowa została usunięta dopiero po pobraniu obu nerek od zwierzęcia i przeniesieniu do wysterylizowanego kaptura do hodowli komórkowych. Nerki zostały zmielone na drobne kawałki i kontynuowały ich inkubację z 10 ml buforu wytrawiającego przez kolejne 5 minut w celu całkowitego trawienia i maksymalnego uwolnienia komórek kanalików.
Chociaż po trawieniu zawiesina tkankowa jest przepuszczana przez filtr o średnicy 70 μm w celu usunięcia bardzo dużych kawałków tkanki, nadal będą istnieć niestrawione kanaliki, które przechodzą przez filtr i pozostają w zawiesinie komórkowej i zostają posiane na szalce hodowlanej. Potrzeba więcej czasu niż normalnie, aby te kanaliki uwolniły komórki rurkowe i mocno przylgnęły do szalki hodowlanej. Dlatego bardzo ważne jest, aby zebrać zawiesinę komórkową i odwirować ją w celu osadzenia nieprzyłączonych kanalików i komórek na drugi dzień po posiewie komórek. Ten etap wirowania z niską prędkością dodatkowo usuwa inne typy komórek, które są lżejsze niż komórki rurkowe i pozwala na osadzanie się nieprzyłączonych kanalików i komórek rurkowych.
Identyfikacja prawidłowej gęstości komórek jest pierwszym i kluczowym krokiem do udanego testu strumienia zewnątrzkomórkowego. Wyniki wykazały, że 40 000 komórek na studzienkę na mikropłytce XF96 jest idealne dla pierwotnych komórek rurkowych zarówno w teście oddychania opartym na kwasie tłuszczowym, jak i glukozie (Figura 3C). W tym protokole wyizolowane komórki rurkowe wykorzystano do testu strumienia zewnątrzkomórkowego w pasażach 1 i 2. Komórki były hodowane do pasażu 3, chociaż zachowały ekspresję markerów rurkowych (ryc. 2) i przyzwoitą wydajność w testach bioenergetycznych (ryc. 3A) i wykazały obniżony poziom oddychania podstawowego w porównaniu z pasażem 2 (pokazane przez porównanie OCR w skrajnych prawych panelach ryciny 3A z figurą 3C). Spadek ten może nie wpływać na zasadniczo zdrowe komórki rurkowe (na przykład te wyizolowane od młodych myszy typu dzikiego). Jednak w przypadku badań na komórkach wyizolowanych z mysich modeli PChN, które mają już zmniejszone oddychanie mitochondrialne, wyższe pasaże komórek mogą powodować dalsze zmniejszenie oddychania podstawowego, co wpłynęłoby na wyniki testu przepływu zewnątrzkomórkowego. W przeprowadzonych tutaj badaniach komórki zarówno z pasażu 1, jak i pasażu 2 wykazywały wysoki poziom oddychania podstawowego. Dlatego, postępując zgodnie z tym protokołem, zalecamy wykorzystanie tych dwóch wczesnych fragmentów do badań oddychania mitochondrialnego z komórkami wyizolowanymi zarówno od zdrowych, jak i chorych zwierząt. Komórki z pasażu 2 powinny być nadal brane pod uwagę, jeżeli subkultura pasażu 1 nie daje wystarczającej liczby komórek do oznaczenia strumienia. Oprócz badań bioenergetycznych, nasze poprzednie badania pokazują, że pierwotne TEC w pasażu 3 mogą być niezwykle przydatne w leczeniu związkami, a następnie w badaniach białek i RNA (dane nie pokazane). Biorąc to pod uwagę, sugerujemy, aby badacze korzystający z tego protokołu do izolowania komórek rurkowych starannie wybrali optymalne przejście dla różnych zastosowań badawczych.
Zasada działania analizy strumienia zewnątrzkomórkowego opiera się na oddziaływaniach między wstrzykiwanymi związkami a kompleksami łańcucha oddechowego oraz na wpływie rozprzęgacza. Oligomycyna jest inhibitorem kompleksu V (syntazy ATP) i służy do rozróżnienia zużycia tlenu związanego z ATP i zużycia tlenu, które jest wymagane do pokonania regularnego wycieku protonów przez wewnętrzną błonę mitochondriów32. FCCP oddziela zużycie tlenu od produkcji ATP poprzez zakłócenie potencjału błony mitochondrialnej. W ten sposób zapewnia pomiar maksymalnej zdolności oddechowej, ponieważ omija ograniczoną zdolność wypływu jonów protonowych przez syntazę ATP, umożliwiając transport protonów przez membranę. Antymycyna-A, inhibitor kompleksu III, i rotenon, bloker kompleksu I, są stosowane w połączeniu do wyłączenia całego oddychania mitochondrialnego, umożliwiając różnicowanie między mitochondrialnym a niemitochondrialnym zużyciem tlenu w komórkach. Związki te powinny być zawsze miareczkowane dla określonego typu komórki przed testem strumienia zewnątrzkomórkowego w celu określenia optymalnych stężeń, które dają optymalne krzywe OCR. W tym przypadku zalecamy 1 μM oligomycyny, 1 μM FCCP i 2 μM rotenonu/antymycyny A do testu strumienia zewnątrzkomórkowego na pierwotnych TEC.
Podsumowując, protokół ten zapewnia prosty i opłacalny sposób izolowania pierwotnych komórek nabłonka kanalików nerkowych proksymalnych i dystalnych, które można wykorzystać do oceny bioenergetyki mitochondriów ex vivo. Chociaż protokół ten może być przydatny w szerokim zakresie badań biologii molekularnej badających biologiczną funkcję komórek nabłonka kanalików nerkowych, zdajemy sobie sprawę z jego ograniczeń, gdy stosujemy go do badań wymagających czystych kanalików proksymalnych lub dystalnych. Na przykład badania nad zespołem Lowe'a, selektywną dysfunkcją kanalików proksymalnych33 lub badania nad kwasicą dystalnych kanalików nerkowych, dysfunkcją dystalnych kanalikównerkowych 34, wymagałyby bardziej wyrafinowanego protokołu izolacji i oczyszczania komórek. Jednak w przypadku większości badań, które porównują kanaliki i kłębuszki nerkowe, a także w przypadku badań przesiewowych potencjalnych regulatorów oddychania mitochondrialnego w komórkach kanalików w ogóle, protokół zapewnia wykonalne podejście o wysokiej przepustowości. W związku z tym protokół ten może mieć szerokie zastosowanie w badaniu dysfunkcji mitochondriów związanych z zaburzeniami nerek w celu odkrycia leku lub walidacji celu.

Funkcja komórek nabłonka kanalików nerkowych (TEC) jest silnie związana z ogólnym stanem zdrowia nerek. Patologiczna sygnalizacja w nerkach powoduje odróżnicowanie TEC, co odgrywa główną rolę w zwłóknieniu nerek i przewlekłej chorobie nerek (PChN)1,2. Jako wysoce energetyczny narząd, nerka jest drugim po sercu pod względem zużycia tlenu, głównie poprzez mitochondrialną fosforylację oksydacyjną3. Badania mikroskopią elektronową wykazały dodatnią korelację mitochondrialnych zmian morfologicznych ze zdarzeniami patologicznymi w kanalikach nerkowych4. Dysfunkcja mitochondriów w TEC powoduje zwłóknienie nerek poprzez przejście nabłonkowe do mezenchymalnego5 i wadliwe utlenianie kwasów tłuszczowych6. Zwłóknienie to postępująca patologia nerek, która prowadzi do PChN. Dlatego zrozumienie statusu energetycznego TEC nerek jest niezbędne do odkrycia patofizjologii PChN.
W dorosłym nerce występuje > 20 typów komórek7. Aby zbadać funkcję TEC, potrzebna jest pierwotna hodowla komórek nabłonka nerkowego jako platforma do zastosowań biologii molekularnej, takich jak leczenie chemiczne i manipulacje genetyczne. Co ważne, manipulacje genetyczne mogą być przeprowadzane in vivo u myszy poprzez transgenezę lub przy użyciu technik dostarczania genów AAV8, tak aby izolowane komórki pierwotne były już genetycznie manipulowane. Izolacja pierwotnych komórek kanalików nerkowych od myszy9,10, rats11,12,13, canines14, rabbits15,16, and people17,18 zgłaszano etapy oczyszczania w celu uzyskania czystych proksymalnych komórek kanalików. W tych wcześniej opublikowanych protokołach, które koncentrują się na izolacji proksymalnych komórek rurkowych, przeprowadzono eksperymenty z wirowaniem gradientowym i sortowaniem w celu oczyszczenia19. Chociaż protokoły te są cenne w badaniu kanalików proksymalnych, nie są wystarczające, gdy do zbadania potrzebne są zarówno kanaliki proksymalne, jak i dystalne. Na przykład nasze badanie zespołu Alporta wykazało, że zarówno proksymalne, jak i dystalne kanaliki nerkowe odgrywają ważną rolę w postępie choroby20, a zatem oba rodzaje kanalików nerkowych powinny być badane w hodowli. Niedawne badanie dotyczące toksyczności fluorku nerek wykazało również, że zmiany patologiczne zaszły zarówno w kanalikach proksymalnych, jak i dystalnych21. Dlatego ten protokół izolacji został zaprojektowany i zoptymalizowany zarówno dla proksymalnych, jak i dystalnych komórek kanalików z nerek myszy przy minimalnych kosztach odczynników i prostych procedurach. Alternatywnie, badacze mogą nadal postępować zgodnie z protokołem do kroku 3.1 i dodać kroki oczyszczania9 od tego momentu do przodu w celu izolacji czystych proksymalnych komórek kanalikowych.
Izolowane komórki prezentują wysoki poziom energii i zachowują cechy nabłonka nerek po subkulturach do 4 pasaży. Korzystając z wysokoprzepustowego analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego, oceniamy oddychanie mitochondrialne bezpośrednio w izolowanych TEC na 96-dołkowej płytce, co prowadzi do dalszych spostrzeżeń nad optymalizacją gęstości komórek. Obserwacje te sugerują, że protokół ten może być stosowany do badań ex vivo kanalików nerkowych ze spójną, dobrze standaryzowaną produkcją TEC nerkowych. Dodatkowym znaczeniem tego protokołu jest jego wykonalne zastosowanie jako wysokoprzepustowego narzędzia do charakterystyki ex vivo bioenergetyki mitochondrialnej w proksymalnych i dystalnych komórkach kanalików nerkowych. W związku z tym może służyć jako platforma do odkrywania leków lub charakterystyki zaburzeń nerek.

<table><tbody><tr><td>Kolagen I Białko szczura, ogon</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1048301</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>J.T.Baker</td><td>9508</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typu II</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,25%)</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do wzrostu komórek nabłonka nerek 2</td><td>PromoCell</td><td>C-26130</td><td></td></tr><tr><td>2-Deoxy glukoza</td><td>Sigma</td><td>D6134</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>L-karnityna</td><td>Sigma</td><td>C0283</td><td></td></tr><tr><td>Etomoxir</td><td>Sigma</td><td>E-1905</td><td></td></tr><tr><td>Oligomycyna</td><td>Sigma</td><td>75351</td><td></td></tr><tr><td>4-(trifluorometoksy)fenylohydrazon karbonylu cyjanku karbonylu (FCCP)</td><td>Sigma</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td>Rotenon</td><td>Sigma</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>Antimycin-A</td><td>Sigma</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Palmitynian sodu</td><td>Sigma</td><td>P9767</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Sigma</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina 200mM roztwór</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>DMEM w proszku</td><td>Sigma</td><td>D5030-1L</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>LifeTechnologies</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Barwienie niebieskim trypanem (0,4%)</td><td>LifeTechnologies</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka zliczające</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0011</td><td></td></tr><tr><td>Mikrokleszcze preparacyjne</td><td>Roboz</td><td>RS-5101</td><td></td></tr><tr><td>Automatyczny licznik komórek TC10</td><td>Bio-Rad</td><td>506BR2119</td><td></td></tr><tr><td>MINIPULS 3 Pompa perystaltyczna</td><td>Gilson Inc.</td><td>GM3P</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 Analyzer</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>S7800A</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 FluxPack (zawiera wkłady z czujnikami, mikropłytki i kaliber)</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>10260-100</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja, charakterystyka i wysokoprzepustowa analiza strumienia zewnątrzkomórkowego pierwotnych komórek nabłonka kanalików nerkowych myszy

Isolation, Characterization, And High Throughput Extracellular Flux Analysis of Mouse Primary Renal Tubular Epithelial Cells

Dysfunkcja mitochondriów w komórkach nabłonka kanalików nerkowych (TEC) może prowadzić do zwłóknienia nerek, głównej przyczyny przewlekłej choroby nerek (PChN). W związku z tym ocena funkcji mitochondriów w pierwotnych TEC może dostarczyć cennych informacji na temat statusu bioenergetycznego komórek, dostarczając informacji na temat patofizjologii PChN. Chociaż dostępnych jest wiele złożonych protokołów izolacji i oczyszczania kanalików proksymalnych u różnych gatunków, w tej dziedzinie brakuje opłacalnej metody zoptymalizowanej pod kątem izolacji komórek rurkowych bez konieczności oczyszczania. W tym miejscu zapewniamy protokół izolacji, który pozwala na badania koncentrujące się zarówno na pierwotnych proksymalnych, jak i dystalnych TEC nerek myszy. Oprócz opłacalnych odczynników i minimalnych procedur na zwierzętach wymaganych w tym protokole, izolowane komórki utrzymują wysoki poziom energii po izolacji i mogą być hodowane do czterech pasaży, co pozwala na ciągłe badania. Ponadto, za pomocą wysokowydajnego analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego, oceniamy oddychanie mitochondrialne bezpośrednio w izolowanych TEC na 96-dołkowej płytce, dla której podajemy zalecenia dotyczące optymalizacji gęstości komórek i stężenia związków. Obserwacje te sugerują, że protokół ten może być stosowany w badaniach ex vivo kanalików nerkowych ze spójną, dobrze standaryzowaną produkcją TEC nerkowych. Protokół ten może mieć szersze zastosowanie w przyszłości do badania dysfunkcji mitochondriów związanych z zaburzeniami nerek w celu odkrywania leków lub ich charakteryzowania.

Perfuzja i trawienie nerek zapewniają wysoką żywotność komórek nabłonka cewek: 
Komórki nabłonka cewek nerkowych myszy zostały wyizolowane zgodnie z krokami opisanymi w sekcjach 1–3 powyższego protokołu.
Po trawieniu, heterogenna populacja komórek nerkowych, niecałkowicie strawione kanaliki oraz inne szczątki tkankowe o rozmiarze mniejszym niż 70 µm zostały wysiane na naczynie hodowlane w dniu izolacji. Przewiduje się, że zmiany od dnia 0 do dnia 1 po izolacji objawiają się zazwyczaj jedynie w stopniu przylegania komórek, a nie w ich wzroście. Po przeanalizowaniu pływającej heterogennej populacji stwierdzono, że w dniu 1 przyległo jedynie kilka komórek cewkowych (Rycina 1A). Ponowne zebranie komórek w dniu 1, wirowanie i ponowne wysianie pomogły usunąć lekkie zanieczyszczenia i osadzić małe fragmenty kanalików w celu uwolnienia komórek cewkowych. Od dnia 1 do dnia 3 oczekiwano nie tylko lepszego przylegania komórek, ale także wyraźnego wzrostu tempa ich namnażania, co zaobserwowano w postaci trzykrotnego zwiększenia gęstości komórek w porównaniu z dniem 1 (Rycina 1A). W początkowej fazie wzrostu komórki tworzyły kilka kolonii i zasiedlały obszary wokół nich. Od tego momentu izolowane komórki w pełni się zregenerowały i wykazywały prawidłową proliferację. Do 5. dnia komórki osiągnęły 80 - 90% konfluencji w szalce Petriego o średnicy 60 mm, pozostawiając pewne wolne przestrzenie między poszczególnymi komórkami oraz koloniami (Rycina 1A).
Subkultywacja i charakterystyka wyizolowanych komórek cewkowych: 
Wyizolowane nabłonkowe komórki cewek nerkowych poddano subkultywacji w celu przeprowadzenia charakterystyki, zgodnie z krokami opisanymi w sekcji 4 powyższego protokołu.
Od 5. dnia komórki całkowicie regenerowały się po izolacji i zaczęły intensywnie proliferować. Tydzień po izolacji komórki osiągnęły konfluencję w szalce Petriego o średnicy 60 mm. Po 1 tygodniu hodowli w pasażu 0 komórki były gotowe do przesiania do pasażu 1, a następnie do kolejnych dwóch pasaży. Podobne wzorce wzrostu zaobserwowano w pasażu 1 i pasażu 2. Zazwyczaj komórki w pasażu 1 i 2 osiągają konfluencję niezbędną do dalszych pasażowań w czasie krótszym niż tydzień (Rycina 1B). Ciągła hodowla konfluentnych komórek od pasażu 0 do pasażu 2 wykazała rozległe tworzenie się kopułek23,24 (Rycina 1B), co sugeruje, że izolowane komórki zachowały prawidłowy stan fizjologiczny i wydzielały płyny w sposób zbliżony do warunków in vivo. Spowodowało to oddzielenie się monowarstwy komórek od płytki, przy jednoczesnym zachowaniu połączeń poprzez połączenia ścisłe.
Aby scharakteryzować komórki w hodowli, przeprowadzono barwienie immunofluorescencyjne w hodowanych komórkach od pasażu 1 do pasażu 4, a także w kontrolnej linii komórkowej – ludzkich komórkach nabłonka proksymalnego cewek nerkowych HK-2. Do badań charakterystyki wykorzystano markery kanalików proksymalnych: akwaporynę 1 (AQP1)25 i angiotensynogen (AGT)9, marker kanalików dystalnych: E-kadherynę25, marker nabłonkowy: aktynę mięśni gładkich (SMA)26,27,28, markery makrofagów: F4/8029 i CD6830 oraz marker kłębuszkowy: antygen różnicowania tymocytów 1 (Thy1/CD90)9. Białka kanalików proksymalnych AQP1 i AGT wykazywały konsekwentnie wysoką ekspresję w izolowanych komórkach kanalikowych od pasażu 1 do pasażu 4, a także w dodatniej kontroli w postaci proksymalnych komórek nabłonkowych HK-2 (Rycina 2A). Białko kanalików dystalnych, E-kadheryna, była wyrażana w izolowanych komórkach kanalikowych do pasażu 4 i była również obserwowana w komórkach HK-2 (Rycina 2A). SMA była obficie wyrażana w izolowanych komórkach kanalikowych oraz w kontrolnych komórkach HK-2, co jest zgodne z opublikowanymi doniesieniami26,27. Z kolei białko kłębuszkowe Thy1 oraz białko makrofagów F4/80 były nieobecne zarówno w izolowanych komórkach kanalikowych, jak i w kontrolnych komórkach HK-2 (Rycina 2A). CD68 wykazywało minimalną ekspresję w komórkach HK-2 oraz w izolowanych komórkach kanalikowych w pasażu 1 i pasażu 2, a następnie jego ekspresja stała się niewykrywalna od pasażu 3 do pasażu 4 (Rycina 2A). Wyniki sugerują, że komórki izolowane zgodnie z tym protokołem stanowią mieszaninę komórek kanalików proksymalnych i dystalnych. Aby porównać ekspresję tych białek markerowych in vivo, przeprowadzono barwienie w zamrożonych tkankach nerek. Markery kanalikowe, w tym AQP1, AGT i E-kadheryna, oraz białko kłębuszkowe Thy1 wykazywały wysoką ekspresję w nerkach pobranych od zdrowej myszy typu dzikiego (Rycina 2B). Niska ekspresja F4/80 i CD68 była obserwowana w nerkach typu dzikiego, natomiast szeroka ekspresja występowała w nerkach pobranych od myszy Col4a3-/-, u której rozwinęła się niewydolność nerek z infiltracją makrofagów20,31 (Rycina 2C).
Analiza bioenergetyki mitochondriów w izolowanych pierwotnych komórkach kanalikowych: 
Kroki analizy oddychania mitochondrialnego opisano w sekcji 5 protokołu przedstawionego powyżej.
Oddychanie mitochondrialne wyizolowanych pierwotnych komórek cewkowych mierzy się za pomocą zewnątrzkomórkowej analizy strumienia szybkości zużycia tlenu (OCR) przy różnych gęstościach wysiewu. Aby dobrać odpowiednią gęstość wysiewu, dzień przed (około 20 h przed) zewnątrzkomórkowym pomiarem strumienia (Ryc. 3A) na 96-dołkową mikropłytkę XF96 wysiano odpowiednio 20 000, 30 000 i 40 000 pierwotnych TEC na dołek. Po przeprowadzeniu zewnątrzkomórkowej analizy strumienia pomiary OCR znormalizowano do liczby komórek poprzez kwantyfikację barwienia Hoechstem. Wysiew TEC w gęstości 20 000, 30 000 lub 40 000 komórek/dołek skutkował średnim podstawowym OCR wynoszącym odpowiednio 25, 45 lub 50 pmol/min (Ryc. 3A). Ponadto obrazy mikroskopowe wysianych komórek wykazały, że gęstość 40 000 komórek/dołek lepiej pokrywała całą powierzchnię dna dołków mikropłytki niż pozostałe gęstości wysiewu (Ryc. 3B). Mimo że maksymalny OCR przy użyciu 40 000 komórek nie wzrósł w porównaniu do gęstości 30 000 komórek, zalecamy gęstość komórek na poziomie około 40 000 komórek/dołek dla optymalnych oddziaływań między komórkami a związkami.
Ponadto w naszych eksperymentach wykazano, że optymalne stężenia związków hamujących/odsprzęgających wynoszą 1 µM oligomycyny, 1 µM FCCP oraz 2 µM rotenonu/antymycyny-A (protokoły analizy przepływu zewnątrzkomórkowego oraz wstrzykiwania przez porty zamieszczono w Tabeli 1; eksperymenty optymalizacyjne nie zostały przedstawione). Zaleca się jednak wszystkim użytkownikom przeprowadzenie wstępnego testu z różnymi stężeniami tych związków, najlepiej niższymi i wyższymi od wartości opublikowanych, aby zapewnić uzyskanie najlepszych wyników.
Analiza przepływu zewnątrzkomórkowego dostarcza szeregu istotnych parametrów do oceny bioenergetyki nerkowych TEC. Przykładowo, ponieważ wykazano, że utlenianie kwasów tłuszczowych jest specyficznie zaburzone w TEC, zastosowanie pożywek zawierających substrat w postaci kwasu tłuszczowego (palmitanu) wraz z inhibitorem glikolizy (2DG) może służyć jako użyteczne narzędzie do bezpośredniej oceny utleniania kwasów tłuszczowych w TEC w pasażach 1 i 2 (Rycina 3C). W przypadku włóknienia nerek oczekuje się, że całkowita wydolność oddechowa komórek będzie niższa niż w zdrowej nerce, nawet jeśli pożywki oparte na glukozie nie wykażą żadnych różnic.
Podsumowując, analiza strumienia zewnątrzkomórkowego, szczególnie w celu oceny zdolności do utleniania kwasów tłuszczowych, może być wykorzystana jako informacyjna metoda oceny stanu energetycznego nerkowych komórek TEC, w których zmiany patologiczne wpływające na profil bioenergetyczny odgrywają kluczową rolę w włóknieniu nerek i progresji do niewydolności nerek.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Kroki</td>
			<td>Czas (min)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kalibrować</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Równoważyć:</td>
			<td>00:12:00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pomiar 1</td>
			<td>3 pętle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wymieszaj</td>
			<td>00:02:00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Czekaj</td>
			<td>00:02:00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pomiar</td>
			<td>00:03:00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wymieszać</td>
			<td>00:02:00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Czekaj</td>
			<td>00:02:00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pomiar</td>
			<td>00:03:00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wymieszaj</td>
			<td>00:02:00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Czekaj</td>
			<td>00:02:00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pomiar</td>
			<td>00:03:00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wstrzyknij do portu A (1 μM Oligomycyna)</td>
			<td>2 pętle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wymieszaj</td>
			<td>00:02:00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Czekaj</td>
			<td>00:02:00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pomiar</td>
			<td>00:03:00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wymieszaj</td>
			<td>00:02:00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Czekaj</td>
			<td>00:02:00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pomiar</td>
			<td>00:03:00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wstrzyknij przez port B (1 μM FCCP)</td>
			<td>2 pętle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wymieszać</td>
			<td>00:02:00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Czekaj</td>
			<td>00:02:00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pomiar</td>
			<td>00:03:00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wymieszać</td>
			<td>00:02:00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Czekaj</td>
			<td>00:02:00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pomiar</td>
			<td>00:03:00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wstrzyknąć do portu C (2 μM Rotenon/Antymycyna)</td>
			<td>2 pętle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wymieszać</td>
			<td>00:02:00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Czekać</td>
			<td>00:02:00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pomiar</td>
			<td>00:03:00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wymieszać</td>
			<td>00:02:00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Czekaj</td>
			<td>00:02:00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pomiar</td>
			<td>00:03:00</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Zstandardyzowany protokół analizy strumienia zewnątrzkomórkowego dla optymalnych pomiarów OCR w pierwotnych komórkach cewkowych.
<img alt="Etapy wzrostu hodowli komórkowej, dni 1-5, pasaż 0-2, obrazy mikroskopowe 10X-40X." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57718/57718fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Hodowla komórkowa izolowanych pierwotnych komórek kanalikowych. (A) Izolowane pierwotne komórki kanalikowe przytwierdzają się wcześnie, w 1 dniu, i intensywnie rosną od 3 do 5 dnia. Obrazy wykonano przy użyciu obiektywów 10X i 20X. (B) Ten panel przedstawia subkulturę izolowanych pierwotnych komórek kanalikowych od pasażu 0 do pasażu 3. Obrazy wykonano przy użyciu obiektywów 10X i 20X w celu obrazowania kopułek komórkowych oraz obiektywu 40X w celu ukazania zmian morfologicznych w kolejnych pasażach. Pasek skali = 100 µm. <a href="/files/ftp_upload/57718/57718fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mikroskopia immunofluorescencyjna komórek nerkowych wykazująca AQP1, AGT, E-kadherynę; lokalizacja białek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57718/57718fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Charakterystyka wyizolowanych pierwotnych komórek cewkowych. (A) Immunobarwienie przeciwciałami przeciwko białkom cewek bliższych (AQP1, AGT), białku czewki dalszej (E-kadheryna), białku nabłonkowemu (SMA), białku mezangialnemu (Thy1) oraz białkom makrofagów (F4/80, CD68) wykazuje, że wyizolowane pierwotne komórki cewkowe i późniejsze subkultury są czystymi komórkami cewek bliższych i dalszych. (B) Ten panel przedstawia barwienie białek cewki bliższej, cewki dalszej i białek mezangialnych w tkankach nerkowych zdrowej myszy typu dzikiego jako kontrolę dodatnią oraz kontrolę ujemną bez przeciwciał pierwszorzędowych. (C) Ten panel przedstawia barwienie białek makrofagów F4/80 i CD68 w tkance nerkowej pobranej od myszy Col4a3-/- jako kontrolę dodatnią. Pasek skali = 20 µm. DAPI pokazano w kolorze niebieskim. Białka markerowe pokazano w kolorze zielonym. <a href="/files/ftp_upload/57718/57718fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres OCR pierwotnych komórek kánicozek oraz zdjęcia komórek. Analiza respiracji metabolicznej z użyciem FCCP i Rot/AA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57718/57718fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Analiza przepływu zewnątrzkomórkowego w wyizolowanych pierwotnych komórkach kánicozek przy różnych gęstościach wysiewu. (A) Zwiększenie gęstości wysiewu komórek podnosi podstawowy poziom respiracji w pierwotnych komórkach kánicozek, badanych w trzecim pasażu. (B>) Ten panel przedstawia obrazy mikroskopowe pierwotnych komórek kánicozek hodowanych na mikropłytce XF96 z wysiewem o gęstości 20 000, 30 000 i 40 000 komórek/studzienkę. Pasek skali = 100 µm. (C>) Ten panel przedstawia analizę przepływu zewnątrzkomórkowego w pierwotnych komórkach kánicozek w pasażach 2 i 1, opartą na kwasach tłuszczowych lub glukozie. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM. <a href="/files/ftp_upload/57718/57718fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Ten protokół zapewnia efektywne kosztowo podejście do izolowania i charakteryzowania pierwotnych komórek kanalików nerkowych myszy, które następnie mogą być subhodowane w celu oceny funkcji biologicznych nerek ex vivo, w tym bioenergetyki mitochondrialnej.

Izolacja, charakterystyka i wysokoprzepustowa analiza strumienia zewnątrzkomórkowego pierwotnych komórek nabłonka kanalików nerkowych myszy

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące metabolizmu nerek, takie jak utlenianie kwasów tłuszczowych, które jest ściśle związane z rozwojem zwłóknienia nerek i różnych innych nefropatii. Główną zaletą tej techniki jest wykorzystanie wysokoprzepustowej platformy do badań przesiewowych pod kątem związków regulujących bioenergetykę mitochondriów w komórkach nabłonka kanalików nerkowych. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię chorób metabolicznych nerek, ponieważ pozwala ona na dokładne badania przesiewowe związków, które regulują metabolizm mitochondrialny w komórkach nabłonka nerkowego.Aby przygotować pokryte kolagenem 60-milimetrowe szalki Petriego, dodaj dwa mililitry wstępnie przefiltrowanego 20-milimolowego kwasu octowego, a następnie 35 mikrolitrów roztworu kolagenu I do każdej potrawy. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez godzinę, wysusz ją na powietrzu i wystaw na działanie promieniowania UV. Następnie spłucz pozostałości kwasu octowego za pomocą PBS. Wykonaj trzy płukania.Następnie przechowuj naczynie w inkubatorze do hodowli komórkowych o temperaturze 37 stopni Celsjusza bez dwutlenku węgla. Po przygotowaniu myszy do zabiegu usuń sierść z klatki piersiowej i brzucha za pomocą kremu do depilacji. Następnie zdezynfekuj skórę jodem i zetrzyj pozostałości jodu.Następnie wykonaj nacięcie, aby otworzyć jamę brzuszną i odsłonić serce i nerki. Teraz ustaw pompę perfuzyjną na 32 mililitry na minutę i usuń wszelkie pęcherzyki z rurki przed rozpoczęciem perfuzji. Użyj igły o rozmiarze 27 na końcu linii.Aby kontynuować, włóż igłę do lewej komory przez wierzchołek serca. Gdy tylko bufor wypełni serce, zrób otwór w prawym przedsionku, aby utworzyć wyjście dla bufora perfuzyjnego. Następnie przełącz się na bufor wytrawiający i nieznacznie zmniejsz prędkość pompy do 30 mililitrów na minutę w celu roztwarzania.Po perfuzji 20 mililitrów buforu trawiennego należy usunąć obie nerki w celu izolacji komórek kanalików. Aby przetworzyć pobrane nerki, najpierw usuń torebki nerkowe i rdzeń. Następnie zmiel obie nerki na drobne kawałki i inkubuj je w 10 mililitrach buforu wytrawiającego w piekarniku o temperaturze 37 stopni Celsjusza z delikatnymi obrotami przez pięć minut.Po strawieniu usuń wszelkie niestrawione tkanki, przepuszczając bufor przez filtr o średnicy 70 mikronów. Po zebraniu strawionej tkanki dodaj 10 mililitrów pożywki hodowlanej, aby zatrzymać trawienie. Następnie odwirować przefiltrowaną zawiesinę tkankową o masie 50 g przez pięć minut, aby osadzać komórki rurkowe.Następnie przenieś supernatant do nowej probówki, dodaj pięć mililitrów pożywki hodowlanej i powtórz wirowanie, aby zebrać pozostałe komórki rurkowe. Teraz ponownie zawieś pierwszą osadkę w 20 mililitrach pożywki hodowlanej i odwiruj ją przy 50 g przez pięć minut, aby dalej oczyścić zebrane komórki. Usunąć supernatant.Następnie ponownie zawieś oba osady w 10 mililitrach pożywki hodowlanej. Następnie policz żywe komórki za pomocą barwienia błękitem trypanowym. Następnie umieść do 10 milionów komórek na 60-milimetrowym naczyniu pokrytym kolagenem i pozwól komórkom rurkowym przyczepić się przez noc.Na początek wysiew komórki rurkowe P1 w 40 000 komórek do studzienek świeżo przygotowanej 96-dołkowej mikropłytki pokrytej kolagenem. Użyj 100 mikrolitrów pożywki hodowlanej na studzienkę. Optymalizacja gęstości komórek i stężenia związków w teście strumienia zewnątrzkomórkowego jest kluczem do udanego eksperymentu.Zalecamy przeprowadzenie pilotażowego eksperymentu miareczkowania w celu określenia optymalnej gęstości komórek i stężenia związków. Następnie nawodnij wkład czujnika. Najpierw podnieś wkład czujnika i napełnij każdą studzienkę płytki 200 mikrolitrami roztworu kalibracyjnego.Następnie zmień położenie wkładu, aby zanurzyć czujniki i inkubuj zespół przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia odessaj starą pożywkę i zastąp ją 175 mikrolitrami pożywki do oznaczania glukozy lub kwasów tłuszczowych. Następnie kontynuuj inkubację przez godzinę bez dwutlenku węgla.Podczas inkubacji komórek załaduj port A wkładu 25 mikrolitrami oligomycyny, załaduj port B FCCP, załaduj port C rotenonem/antymycyną A, a port D i wszystkie inne porty załaduj wodą. Teraz należy przechowywać wkład w inkubatorze niezawierającym dwutlenku węgla, aż zestaw będzie gotowy do kalibracji. Kontynuuj, włączając analizator strumienia zewnątrzkomórkowego i sterownik.Następnie otwórz oprogramowanie analizatora, wybierz standardowy test i naciśnij opcję Kreator testu. Następnie w zakładce Związki przypisz związki do odpowiednich portów. Na karcie Korekcja tła wybierz źródła, które nie zawierają żadnych komórek.Następnie użyj karty Grupy i etykiety, aby oznaczyć etykiety grup eksperymentalnych. Następnie w zakładce Protokół ustaw odpowiednie cykle mieszania i mierzenia za pomocą dostępnych komend. Ustawienia te są wskazane w protokole tekstowym, a po ich wprowadzeniu zapisz szablon do wykorzystania w przyszłości.Teraz naciśnij Zakończ kreatora, aby kontynuować. Teraz naciśnij Start, aby rozpocząć kalibrację. Następnie analizator wysuwa uchwyt płytki i prosi o włożenie płytki naboju.Ten proces kalibracji trwa od 20 do 25 minut. Po skalibrowaniu systemu naciśnij polecenie zachęty, aby wymienić płytkę kalibracyjną na płytkę ogniwa i kontynuuj pracę. Po zakończeniu przebiegu zapisz dane OCR i wyjmij płytkę z analizatora.Teraz dodaj Hoechst do każdego z dołków testowych i inkubuj płytkę przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie policz komórki za pomocą wzbudzenia 355 nm i emisji 460 nm i znormalizuj dane OCR do liczby komórek. W tym protokole heterogeniczna populacja komórek nerkowych, niecałkowicie strawionych kanalików i innych szczątków tkanek została wyhodowana na płytkach pokrytych kolagenem.Dzień po izolacji pożywkę hodowlaną odwirowano w celu usunięcia zanieczyszczeń, a komórki rurkowe ponownie platerowano. Następnie komórki łatwiej się przyczepiały, a do piątego dnia w hodowli osiągnęły 80 do 90% zbieżności. TEC nerek zostały następnie poddane subhodowli i osiągnęły zlew w ciągu jednego tygodnia.Podobny wzrost nastąpił w ciągu następnych dwóch okresów. Monowarstwa komórek uformowała się w kopułę, unosząc się od płyty i pozostając połączoną za pomocą ciasnych połączeń. Oddychanie mitochondrialne izolowanych pierwotnych TEC mierzono za pomocą opisanej analizy strumienia zewnątrzkomórkowego OCR przy różnych gęstościach posiewu, jak opisano.Komórki posiane o większej gęstości miały proporcjonalny wzrost OCR. 40 000 komórek na studzienkę pokrywało powierzchnię płytki lepiej niż jakiekolwiek inne gęstości posiewu, co czyni ją optymalnym stężeniem do testowania interakcji między komórkami i związkami. Na przykład pożywki zawierające substrat kwasów tłuszczowych zastosowano do TEC wraz z 2DG, inhibitorem glikolizy, w celu bezpośredniej oceny utleniania kwasów tłuszczowych w TEC w pasażach pierwszym i drugim.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby zawsze zapisywać dokładne objętości i stężenia w każdym dołku. Zmiany w końcowych stężeniach składników mogą spowodować, że cały eksperyment zakończy się niepowodzeniem. Po jej opracowaniu, technika ta utoruje drogę naukowcom z dziedziny nefrologii do zbadania roli metabolizmu kwasów tłuszczowych w kanalikach tłuszczowych w patogenezie różnych nefropatii.

isolation-characterization-high-throughput-extracellular-flux

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszym raporcie opisujemy metodę izolacji i hodowli niszy komórek progenitorowych z embrionalnej nerki myszy, która może być wykorzystana do badania szlaków sygnalizacyjnych regulujących komórki macierzyste/progenitorowe rozwijającej się nerki. Hodowane komórki są bardzo podatne na traktowanie małymi cząsteczkami i białkami rekombinowanymi, a co istotne, również na transdukcję wirusową, co umożliwia efektywną manipulację badanymi szlakami.

Izolacja i hodowla komórek ze strefy nefrogennej embrionalnej nerki myszy

Opisano wpływ aktywacji izoformy kinazy białkowej C (PKC) na funkcje mitochondrialne związane z oddychaniem i fosforylacją oksydacyjną oraz na żywotność komórek. Podejście to adaptuje technikę adenowirusową w celu selektywnej nadekspresji izoform PKC w pierwotnych hodowlach komórkowych oraz szereg analiz służących do określenia funkcji mitochondriów i stanu energetycznego komórki.

Ocena funkcji mitochondriów i żywotności komórek w komórkach nerkowych z nadekspresją izoform kinazy białkowej C

W tym filmie pokazujemy kroki izolacji i oczyszczania komórek nabłonka kanalików nerkowych dla szerokiego zakresu badań biologii molekularnej i hodowli komórkowych.

Izolacja mysich komórek nerkowych: technika izolowania i generowania pierwotnej kultury komórek nabłonka kanalików nerkowych

Pojedyncze kardiomiocyty od myszy typu dzikiego i zmutowanych mogą być izolowane z serca w celu zbadania ich kurczliwości i przejściowych stanów wapnia. Pozwala to na scharakteryzowanie udziału dysfunkcji komórkowej w dysfunkcji serca z dowolnej przyczyny.

Izolacja i analiza fizjologiczna kardiomiocytów myszy

Kanały jonowe wyrażane w nabłonku kanalików nerkowych odgrywają znaczącą rolę w patologii wielotorbielowatości nerek. W tym miejscu opisujemy protokoły eksperymentalne stosowane do przeprowadzania analizy patch-clamp i wewnątrzkomórkowych pomiarów poziomu wapnia w nabłonku torbielowatym świeżo wyizolowanym z nerek gryzoni.

Wdrożenie patch clampu i mikroskopii fluorescencyjnej na żywo w celu monitorowania właściwości funkcjonalnych świeżo wyizolowanego nabłonka PKD

Ten protokół opisuje decelularyzację nerek szczura Sprague Dawley poprzez wstępną perfuzję detergentów przez układ krwionośny, wytwarzając bezkomórkowe matryce zewnątrzkomórkowe nerek, które służą jako szablony do ponownego zasiedlenia ludzkimi komórkami nabłonka nerkowego. Recelularyzacja i zastosowanie testu perfuzji resazuryny do monitorowania wzrostu odbywa się w specjalnie zaprojektowanych bioreaktorach perfuzyjnych.

Repopulacja komórek nabłonkowych i przygotowanie rusztowań macierzy zewnątrzkomórkowej gryzoni do rozwoju tkanki nerkowej

Po infekcji wirusowej, nerka zawiera stosunkowo dużą liczbę limfocytów T CD8+ i daje możliwość badania nieśluzówkowych komórekT RM. W tym miejscu opisujemy protokół izolacji limfocytów nerkowych myszy do analizy cytometrii przepływowej.

Izolacja mysich limfocytów T CD8 + rezydujących w nerkach do analizy cytometrii przepływowej

Tutaj prezentujemy protokoły, które szczegółowo opisują instrukcje dotyczące wdrażania hodowli komórkowych 3D przy użyciu matryc kolagenowych i kolagenowo-agarozowych w systemie mikrofizjologicznym. Protokoły te wspierają kogenerację kanalików proksymalnych nerek i sferoidów raka nerkowokomórkowego, symulując warunki in vivo i umożliwiając zaawansowane badania interakcji komórek raka nerki.

Kohodowla mikroprzepływowa zdrowych nerek i nabłonka guza w celu modelowania progresji raka nerki

W tym miejscu opisujemy protokoły uzyskiwania pierwotnych kultur ludzkich komórek nabłonka kanalików nerkowych (HRTEC) z kory nerkowej w celu opracowania monowarstwowych i trójwymiarowych kultur na macierzy zewnątrzkomórkowej (3D-HRTEC).

Rozwój hodowli pierwotnych komórek nabłonka ludzkich kanalików nerkowych w warunkach jednowarstwowych i trójwymiarowych

Przedstawiamy zoptymalizowany protokół przetwarzania całych ludzkich nerek w celu izolacji i hodowli pierwotnych komórek nabłonkowych kanałów proksymalnych nerek oraz zastosowanie tych komórek w trójwymiarowej, mikrofluidycznej, mikrofizjologicznej platformie do ponownego odtworzenia kanału proksymalnego nerk.

Izolacja pierwotnych komórek nabłonka nabłonka proksymalnego ludzkiego i ich zastosowanie w tworzeniu mikrofizjologicznego modelu kanału bliższego nerki

Tutaj opisujemy protokół in vitro modelujący niedotlenienie/uszkodzenia reoxygenacji w wysokometabolicznych komórkach nabłonka rurkowo-rurkowego. Model ten został zaprojektowany tak, aby wywołać uszkodzenia wywołane stresem metabolicznym, które można zmierzyć poprzez ekspresję markerów uszkodzenia kanałów bliższych oraz ocenę funkcji oddechowej mitochondriów.

Modelowanie niedotlenienia/uszkodzeń reoxygenacji w bliższych komórkach nabłonka rurkowego

Poznaj izolację pierwotnych komórek nabłonka kanalików nerkowych myszy i analizę strumienia zewnątrzkomórkowego do badania bioenergetyki mitochondrialnej. Ta metoda umożliwia wysokoprzepustowe przesiewanie związków w nefrologii.

Izolacja, charakterystyka i wysokoprzepustowa analiza strumienia zewnątrzkomórkowego pierwotnych komórek nabłonka kanalików nerkowych myszy (Wideo) | JoVE Journal

Izolacja, charakterystyka i wysokoprzepustowa analiza strumienia zewnątrzkomórkowego pierwotnych komórek nabłonka kanalików nerkowych myszy

Przeglądaj więcej filmów