Name: Homochroniczne przeszczepianie prekursorów interneuronów do wczesnych postnatalnych mózgów myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-08T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Poznaj metodę przeszczepiania prekursorów interneuronów do mózgów myszy w celu badania wpływu środowiska na dojrzewanie komórek nerwowych. Technika ta umożliwia analizę losu neuronów w nowym kontekście.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez National Institutes of Health (K99MH104595) oraz wewnętrzny program badawczy NICHD dla T.J.P. Dziękujemy Gordowi Fishellowi, w którego laboratorium to podejście zostało pierwotnie opracowane.

<ol><li>Bozzi, Y., Casarosa, S., Caleo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epilepsy+as+a+neurodevelopmental+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Epilepsy as a neurodevelopmental disorder.</a> Front Psychiatry. 3 (19), (2012).</li>
<li>Takano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interneuron+Dysfunction+in+Syndromic+Autism%3A+Recent+Advances%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Interneuron Dysfunction in Syndromic Autism: Recent Advances.</a> Dev Neurosci. , (2015).</li>
<li>Inan, M., Petros, T. J., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Losing+your+inhibition%3A+linking+cortical+GABAergic+interneurons+to+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Losing your inhibition: linking cortical GABAergic interneurons to schizophrenia.</a> Neurobiol Dis. 53, 36-48 (2013).</li>
<li>Batista-Brito, R., Machold, R., Klein, C., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+in+cortical+interneuron+precursors+is+prescient+of+their+mature+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Gene expression in cortical interneuron precursors is prescient of their mature function.</a> Cereb Cortex. 18 (10), 2306-2317 (2008).</li>
<li>Flames, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delineation+of+multiple+subpallial+progenitor+domains+by+the+combinatorial+expression+of+transcriptional+codes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Delineation of multiple subpallial progenitor domains by the combinatorial expression of transcriptional codes.</a> J Neurosci. 27 (36), 9682-9695 (2007).</li>
<li>Wonders, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spatial+bias+for+the+origins+of+interneuron+subgroups+within+the+medial+ganglionic+eminence%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">A spatial bias for the origins of interneuron subgroups within the medial ganglionic eminence.</a> Dev Biol. 314 (1), 127-136 (2008).</li>
<li>Inan, M., Welagen, J., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+bias+in+the+mitotic+origins+of+somatostatin-+and+parvalbumin-expressing+interneuron+subgroups+and+the+chandelier+subtype+in+the+medial+ganglionic+eminence%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal bias in the mitotic origins of somatostatin- and parvalbumin-expressing interneuron subgroups and the chandelier subtype in the medial ganglionic eminence.</a> Cereb Cortex. 22 (4), 820-827 (2012).</li>
<li>Petros, T. J., Bultje, R. S., Ross, M. E., Fishell, G., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apical+versus+Basal+Neurogenesis+Directs+Cortical+Interneuron+Subclass+Fate%5BTitle%5D)+AND+%22+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Apical versus Basal Neurogenesis Directs Cortical Interneuron Subclass Fate.</a> Cell Rep. 13 (6), 1090-1095 (2015).</li>
<li>Taniguchi, H., Lu, J., Huang, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spatial+and+temporal+origin+of+chandelier+cells+in+mouse+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The spatial and temporal origin of chandelier cells in mouse neocortex.</a> Science. 339 (6115), 70-74 (2013).</li>
<li>Bandler, R. C., Mayer, C., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+interneuron+specification%3A+the+juncture+of+genes%2C+time+and+geometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Cortical interneuron specification: the juncture of genes, time and geometry.</a> Curr Opin Neurobiol. 42, 17-24 (2017).</li>
<li>Kepecs, A., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interneuron+cell+types+are+fit+to+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interneuron cell types are fit to function.</a> Nature. 505 (7483), 318-326 (2014).</li>
<li>Mayer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+diversification+of+cortical+inhibitory+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Developmental diversification of cortical inhibitory interneurons.</a> Nature. 555 (7697), 457-462 (2018).</li>
<li>Mi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+emergence+of+cortical+interneuron+diversity+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Early emergence of cortical interneuron diversity in the mouse embryo.</a> Science. 360 (6384), 81-85 (2018).</li>
<li>Alvarez-Dolado, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+inhibition+modified+by+embryonic+neural+precursors+grafted+into+the+postnatal+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cortical inhibition modified by embryonic neural precursors grafted into the postnatal brain.</a> J Neurosci. 26 (28), 7380-7389 (2006).</li>
<li>Baraban, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+seizures+by+transplantation+of+cortical+GABAergic+interneuron+precursors+into+Kv1.1+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Reduction of seizures by transplantation of cortical GABAergic interneuron precursors into Kv1.1 mutant mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (36), 15472-15477 (2009).</li>
<li>De la Cruz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interneuron+progenitors+attenuate+the+power+of+acute+focal+ictal+discharges%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Interneuron progenitors attenuate the power of acute focal ictal discharges.</a> Neurotherapeutics. 8 (4), 763-773 (2011).</li>
<li>Gilani, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interneuron+precursor+transplants+in+adult+hippocampus+reverse+psychosis-relevant+features+in+a+mouse+model+of+hippocampal+disinhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Interneuron precursor transplants in adult hippocampus reverse psychosis-relevant features in a mouse model of hippocampal disinhibition.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (20), 7450-7455 (2014).</li>
<li>Larimer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caudal+Ganglionic+Eminence+Precursor+Transplants+Disperse+and+Integrate+as+Lineage-Specific+Interneurons+but+Do+Not+Induce+Cortical+Plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Caudal Ganglionic Eminence Precursor Transplants Disperse and Integrate as Lineage-Specific Interneurons but Do Not Induce Cortical Plasticity.</a> Cell Rep. 16 (5), 1391-1404 (2016).</li>
<li>Martinez-Cerdeno, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+MGE+precursor+cells+grafted+into+adult+rat+striatum+integrate+and+ameliorate+motor+symptoms+in+6-OHDA-lesioned+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Embryonic MGE precursor cells grafted into adult rat striatum integrate and ameliorate motor symptoms in 6-OHDA-lesioned rats.</a> Cell Stem Cell. 6 (3), 238-250 (2010).</li>
<li>Quattrocolo, G., Fishell, G., Petros, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotopic+Transplantations+Reveal+Environmental+Influences+on+Interneuron+Diversity+and+Maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Heterotopic Transplantations Reveal Environmental Influences on Interneuron Diversity and Maturation.</a> Cell Rep. 21 (3), 721-731 (2017).</li>
<li>Xu, Q., Tam, M., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+mapping+Nkx2.1-lineage+cells+in+the+mouse+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Fate mapping Nkx2.1-lineage cells in the mouse telencephalon.</a> J Comp Neurol. 506 (1), 16-29 (2008).</li>
<li>Thompson, L., Bjorklund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival%2C+differentiation%2C+and+connectivity+of+ventral+mesencephalic+dopamine+neurons+following+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Survival, differentiation, and connectivity of ventral mesencephalic dopamine neurons following transplantation.</a> Prog Brain Res. 200, 61-95 (2012).</li>
<li>Liang, Y., Agren, L., Lyczek, A., Walczak, P., Bulte, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+progenitor+cell+survival+in+mouse+brain+can+be+improved+by+co-transplantation+of+helper+cells+expressing+bFGF+under+doxycycline+control%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neural progenitor cell survival in mouse brain can be improved by co-transplantation of helper cells expressing bFGF under doxycycline control.</a> Exp Neurol. 247, 73-79 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Jednym z krytycznych aspektów tego protokołu jest maksymalizacja przeżywalności komórek. Zapewnienie, że tkanka i komórki są zawsze w lodowatym karbotlenowym sACSF, jest niezbędne do przetrwania komórek. Wymaga to skutecznej strategii rozwarstwiania i dysocjacji, aby zminimalizować czas, jaki komórki spędzają w różnych roztworach i poza środowiskiem mózgu. W zależności od liczby obszarów mózgu poddawanych sekcji i przeszczepiania, korzystne może być posiadanie partnera pomagającego w etapach sekcji i/lub przeszczepu w ce...

Prawidłowe funkcjonowanie kory mózgowej wymaga równowagi między pobudzającymi neuronami projekcyjnymi a hamującymi interneuronami GABA-ergicznymi, niezwykle niejednorodną populacją o odrębnych morfologiach, właściwościach elektrofizjologicznych, łączności i markerach neurochemicznych. Nieprawidłowy rozwój i funkcja interneuronów (i określonych podgrup interneuronów) została powiązana z patobiologią zaburzeń psychicznych, takich jak schizofrenia, autyzm i padaczka1,2,3. Co więcej, wiele genów związanych z tymi zaburzeniami mózgu jest silnie wzbogaconych w młodych interneuronach4. W związku z tym potrzebne jest lepsze zrozumienie mechanizmów regulujących determinację i dojrzewanie losu interneuronów, aby zrozumieć prawidłowy rozwój i potencjalną etiologię wielu chorób mózgu.
Interneurony przodomózgowia rodzą się głównie z dwóch przejściowych struktur embrionalnych, przyśrodkowych i ogonowych wyniesień zwojowych (odpowiednio MGE i CGE). Te postmitotyczne komórki (prekursory interneuronów) przechodzą następnie przedłużoną fazę migracji sttycznej, aby rozproszyć się w całym kresomózgowiu, gdzie integrują się z szeroką gamą obwodów. Interneurony pochodzące od MGE składają się z trzech w dużej mierze nienakładających się na siebie, neurochemicznie zdefiniowanych podgrup: interneuronów szybko wystrzeliwujących parwalbuminy (PV+), interneuronów somatostatyny o nieszybkim wystrzeliwaniu (SST+) i późno wybijających neuronalnej syntazy tlenku azotu (nNOS+), które tworzą komórki neurogleju hipokampa i bluszczu. Liczne laboratoria zidentyfikowały kilka mechanizmów w MGE, które regulują początkowe decyzje dotyczące losu interneuronów PV+ lub SST+, w tym przestrzenne gradienty morfogenów, datę urodzenia prekursorów interneuronów i tryb podziału neurogennego5,6,7,8,9,10. Zaproponowano, że interneurony początkowo różnicują się w "klasy kardynalne", a następnie stopniowo dojrzewają do "klas ostatecznych" w miarę interakcji z otoczeniem11. Ostatnie dowody wskazują, że niektóre dojrzałe podtypy interneuronów mogą być genetycznie okablowane, ponieważ komórki te stają się postmitotyczne w wypukłościach zwojowych, co wskazuje, że wcześnie zdefiniowane wewnętrzne programy genetyczne mogą odgrywać większą rolę niż wcześniej sądzono12,13. Jednak kluczowe pytanie, w jaki sposób wewnętrzne programy genetyczne oddziałują na sygnały środowiskowe, aby napędzać różnicowanie w odrębne podtypy interneuronów, pozostaje w dużej mierze niezbadane.
Liczne badania przeszczepiły embrionalne komórki MGE bezpośrednio do różnych regionów mózgu, z konsensusem, że przeszczepione komórki dojrzewają i uwalniają GABA, aby ogólnie hamować lokalne obwody endogenne14,15,16,17,18,19. Te obiecujące obserwacje wzbudziły znaczne zainteresowanie wykorzystaniem interneuronów pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hIPSC) w leczeniu różnych chorób mózgu. Jednak bardzo niewiele z tych badań ocenia, czy te przeszczepione komórki dojrzewają do oczekiwanych typów dojrzałych interneuronów, co jest krytycznym elementem, gdy myśli się o podejściach translacyjnych.
Aby dowiedzieć się, jak środowisko wpływa na różnicowanie i dojrzewanie interneuronów, opracowano strategię przeszczepiania niedojrzałych prekursorów interneuronów do nowych środowisk mózgu w celu zbadania, czy przeszczepione interneurony przyjmują cechy środowiska gospodarza, czy zachowują cechy środowiska dawcy20. Przeszczepy MGE nie są odpowiednie do odpowiedzi na to pytanie, ponieważ MGE zawiera mieszaną populację komórek interneuronowych i projekcyjnych GABA-ergicznych, które rozpraszają się w wielu regionach mózgu21. Nie wiedząc, dokąd migrowałyby te komórki MGE, nie można w pełni ocenić, w jaki sposób środowisko mózgu wpływa na te przeszczepy. Zbierając prekursory interneuronów we wczesnych punktach pourodzeniowych, problem ten można obejść poprzez uzyskanie niedojrzałych komórek, które zakończyły migrację i dotarły do docelowego regionu mózgu, ale mają minimalną interakcję ze środowiskiem. Koncentrując się na specyficznych cechach interneuronów, które są różnie wyrażane między różnymi regionami mózgu, można następnie określić, w jaki sposób środowisko gospodarza zmienia właściwości interneuronów. Ogólne podejście przedstawione w tym protokole powinno mieć zastosowanie do każdego badacza, który chce zbadać, jak zachowują się młode neurony, gdy są zagrożone w nowym środowisku.

<table><tbody><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma</td><td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu jednozasadowy</td><td>Sigma</td><td>S0751</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Sigma</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td></td><td>Sigma S7903</td><td></td></tr><tr><td>Matryce mózgu</td><td>Roboz</td><td>SA-2165</td><td>Potrzebne tylko do zbioru prążkowia</td></tr><tr><td>Szczypce Dumont z drobnym punktem</td><td>Roboz</td><td>RS-4978</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do mikropreparacji</td><td>Roboz</td><td>RS-5940</td><td></td></tr><tr><td>Żyletki</td><td>ThermoFisher</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>Pipety Pasteura</td><td>ThermoFisher</td><td>1367820C</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject III</td><td>Drummond</td><td>3-000-207</td><td></td></tr><tr><td>Manipulator ręczny ze stojakiem</td><td>World Precision Instruments&nbsp;</td><td>M3301R/M10</td><td></td></tr> 5 <tr><td>ml plastikowe rurki z okrągłym dnem</td><td>ThermoFisher</td><td>149591A</td><td></td></tr><tr><td>Szalki Petriego 60 mm</td><td>ThermoFisher</td><td>12556001</td><td></td></tr><tr><td>100 mm szalki Petriego</td><td>ThermoFisher</td><td>12565100</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Sigma</td><td>10165921001</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>16140063</td><td></td></tr><tr><td>Filtry DNase I</td><td>Sigma</td><td>4716728001</td><td></td></tr><tr><td>Celltrics 50um</td><td>Sysmex</td><td>04-0042327</td><td></td></tr><tr><td>Błękit trypanowy</td><td>ThermoFisher</td><td>15-250-061</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>ThermoFisher</td><td>02-671-6</td><td></td></tr></tbody></table>

homochroniczne przeszczepianie prekursorów interneuronów do wczesnych postnatalnych mózgów myszy

Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

Determinacja i dojrzewanie neuronów wymaga skomplikowanej interakcji między programami genetycznymi a sygnałami środowiskowymi. Jednak rozplątanie ról wewnętrznych i zewnętrznych mechanizmów, które regulują ten proces różnicowania, jest zagadką dla wszystkich neurobiologów rozwojowych. Problem ten jest spotęgowany w przypadku interneuronów GABA-ergicznych, niezwykle niejednorodnej populacji komórek, która rodzi się z przejściowych struktur embrionalnych i przechodzi przedłużoną fazę migracji, aby rozproszyć się w całym kresomózgowiu. Aby zbadać, w jaki sposób różne środowiska mózgu wpływają na los i dojrzewanie interneuronów, opracowaliśmy protokół zbierania znakowanych fluorescencyjnie niedojrzałych prekursorów interneuronów z określonych regionów mózgu u nowonarodzonych myszy (P0-P2). W tym wieku migracja interneuronów jest prawie zakończona, a komórki te znajdują się w swoich końcowych środowiskach spoczynku ze stosunkowo niewielką integracją synaptyczną. Po zebraniu roztworów pojedynczych komórek za pomocą cytometrii przepływowej, te prekursory interneuronów są przeszczepiane do pourodzeniowych szczeniąt P0-P2 typu dzikiego. Wykonując zarówno przeszczepy homotopowe (np. kora do kory), jak i heterotopowe (np. kora do hipokampa), można ocenić, jak trudne niedojrzałe interneurony w nowym środowisku mózgu wpływa na ich los, dojrzewanie i integrację obwodów. Mózgi mogą być pobierane od dorosłych myszy i oznaczane za pomocą szerokiej gamy analiz post hoc na przeszczepionych komórkach, w tym profilowania immunohistochemicznego, elektrofizjologicznego i transkrypcyjnego. To ogólne podejście zapewnia badaczom strategię do zbadania, w jaki sposób różne środowiska mózgu mogą wpływać na wiele aspektów rozwoju neuronów i określenia, czy określone cechy neuronów są przede wszystkim napędzane przez przewodowe programy genetyczne, czy sygnały środowiskowe.

Niniejszy protokół demonstruje sposób izolacji konkretnych obszarów mózgu z mózgów we wczesnym okresie postnatalnym (Rysunek 1-2), pozyskiwania dysocjacji pojedynczych komórek prekursorów interneuronów oraz transplantacji tych komórek do różnych obszarów mózgu u naiwnych młodych szczurów WT (Rysunek 3). Do analizy post hoc pobrano mózgi, które otrzymały przeszczepy prekursorów interneuronów, pomiędzy P30-35, aby ...

Wyzwanie dla młodych neuronów w nowych regionach mózgu może ujawnić ważne informacje na temat tego, jak środowisko kształtuje los i dojrzewanie neuronów. Protokół ten opisuje procedurę zbierania prekursorów interneuronów z określonych regionów mózgu i przeszczepiania ich homotopowo lub heterotopowo do mózgu młodych po urodzeniu.

Homochroniczne przeszczepianie prekursorów interneuronów do wczesnych postnatalnych mózgów myszy

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the ...

Ogólnym celem tej procedury jest zebranie prekursorów interneuronów z różnych regionów mózgu u pourodzeniowych młodych myszy i przeszczepienie tych komórek do biorców w tym samym wieku, aby ocenić, jak zmiany środowiskowe wpływają na los i dojrzewanie interneuronów. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neuronauki rozwojowej dotyczące tego, w jaki sposób wewnętrzne programy genetyczne i sygnały środowiskowe oddziałują na siebie, aby kształtować los komórek nerwowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że zmiany w losie i dojrzewaniu prekursorów interneuronów mogą być analizowane po ich adoptywnym przeniesieniu do nowego środowiska mózgu.Wizualna demonstracja etapów pobierania i szczepienia komórek ma kluczowe znaczenie, ponieważ drobne błędy w technice mogą prowadzić do nieefektywnych i nieudanych eksperymentów transplantacyjnych. Na początek umieść jedną żyletkę w przednim płacie czołowym mózgu szczeniaka w pierwszym dniu po urodzeniu, a dodatkowe żyletki w szczelinach tuż za pierwszą żyletką, aby wygenerować dwie plastry o średnicy 0,5 milimetra. Przenieś plastry prążkowia na szalkę Petriego ze sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym z bąbelkami sacharozy lub sACSF i umieść pozostałą tkankę mózgową na szalce Petriego z sACSF na lodzie.Umieść plastry pod mikroskopem preparacyjnym i użyj kleszczy, aby uszczypnąć prążkowie z obu półkul, umieszczając kawałki prążkowia w 50-mililitrowej probówce sACSF na lodzie podczas zbierania. Jeśli mózg został pobrany od fluorescencyjnej myszy reporterowej, użyj mikroskopii fluorescencyjnej, aby odróżnić sygnał pomidora td prążkowia od silniejszego sygnału fluorescencyjnego gałki bladej. Aby usunąć hipokamp, użyj kleszczy, aby wyciąć mózg wzdłuż linii środkowej i umieść jedną półkulę pod mikroskopem preparacyjnym przyśrodkowa powierzchnia do góry.Użyj kleszczy, aby usunąć brzuszną tkankę mózgową i zidentyfikować hipokamp w kształcie kiełbasy obejmujący dostęp przednio-tylny wzdłuż grzbietowej i komorowej strony kory. Włóż końcówki kleszczy przed przednim hipokampem i przesuń kleszcze do tyłu, jednocześnie ściskając wzdłuż granicy kory hipokampa, aby delikatnie oddzielić hipokamp od kory. Umieść izolowaną tkankę w 50-mililitrowej probówce sACSF na lodzie i powtórz pobieranie hipokampa dla przeciwległej półkuli.Następnie umieść półwyciętą korę przyśrodkową do dołu i użyj kleszczy, aby usunąć najbardziej grzbietową, brzuszną, przednią i tylną część kory. Przenieś pozostały kwadrat kory przyśrodkowej do 50-mililitrowej probówki sACSF na lodzie. Po usunięciu mózgu przypnij mózg brzuszną stroną do dołu przez móżdżek i korę przednią lub opuszki węchowe.Za pomocą zakrzywionych kleszczy delikatnie oddziel tylną korę od leżącego poniżej hipokampa i innych tkanek w każdej półkuli. I oderwij korę grzbietową do przodu, aby odsłonić leżące poniżej struktury. Użyj kleszczy, aby uszczypnąć hipokamp w jednej półkuli w linii środkowej i usuń hipokamp, odrywając go bocznie od mózgu.Umieść hipokamp w 50-mililitrowej tubce sACSF na lodzie i zbierz przeciwległy hipokamp w ten sam sposób. Następnie delikatnie zeskrob krawędzie prążkowia, aby poluzować je z otaczającej tkanki. Delikatnie uszczypnij poniżej prążkowia, aby pobrać tkankę prążkowia.Po pobraniu kory z obu półkul, jak wykazano wcześniej, przenieś prążkowie pod fluorescencyjną lunetą preparacyjną. Użyj kleszczy, aby usunąć jaskrawoczerwoną tkankę gałki bladej z pomidorem td-dodatnim z każdego prążkowia. Po pobraniu wszystkich tkanek przenieś tkankę do pięciomilimetrowej probówki z okrągłym dnem i zastąp sACSF w każdej probówce zbiorczej dwoma mililitrami świeżo przygotowanego roztworu pronazy-sACSF na 20-minutową inkubację w temperaturze pokojowej z okazjonalnym trześnieniem.Pod koniec inkubacji ostrożnie zastąpić pronazę-sACSF jednym do dwóch mililitrów roztworu do rozpuszczenia i mechanicznie oddzielić tkanki za pomocą wypolerowanych ogniowo rurek Pasteura. Gdy tkanka jest mętna i nie widać żadnych fragmentów tkanki, przecedź roztwór komórkowy przez filtr 50 mikronów do nowych pięciomililitrowych probówek z okrągłym dnem, aby usunąć wszelkie grudki komórek przed sortowaniem komórek aktywowanym fluorescencją. Po otrzymaniu komórek z cytometrii przepływowej przenieś zawiesiny komórek do 1,5-mililitrowych stożkowych probówek w celu odwirowania.Po odwirowaniu odessać wszystkie oprócz ostatnich 20 mikrolitrów supernatantu z każdej probówki i rozpuścić granulki do liczenia. W razie potrzeby rozcieńczyć roztwór komórek sACSF do stężenia od jednego do trzech razy od 10 do 5 komórek na mikrolitr. Napełnij mikropipetę z cienką końcówką olejem mineralnym.Podłącz mikropipetę do nanolitrowego wtryskiwacza i przymocuj nanolitrowy aparat do wstrzykiwania do manipulatora przymocowanego do podstawy magnetycznej. Podczas gdy pierwsze szczenię jest znieczulane na lodzie, należy kilkakrotnie odpipetować roztwór komórkowy, aby zapewnić jednorodne rozmieszczenie komórek. Wysunąć olej mineralny i całkowicie napełnić pipetę zawiesiną jednokomórkową.Po potwierdzeniu braku reakcji na uszczypnięcie palca u nogi, umieść szczenię na pokrywie szalki Petriego z głową spoczywającą na klejącej szpachli, tak aby czubek głowy był stosunkowo płaski. Przykryj głowę kawałkiem taśmy laboratoryjnej z diamentowym otworem, ciągnąc za nauczoną taśmę, aż skóra zostanie rozciągnięta tak, aby głowa była mocno zabezpieczona i lambda była widoczna przez otwór. Przesuń zabezpieczoną końcówkę pod wtryskiwacz o pojemności nanolitrów i opuść mikropipetę tak, aby końcówka znajdowała się bezpośrednio nad lambdą.Obserwuj współrzędne X, Y na manipulatorze i wyreguluj pokrętła manipulatora, aż mikropipeta znajdzie się w odpowiednich współrzędnych wzdłuż osi środkowej, bocznej i przednio-tylnej głowicy. Opuścić mikropipetę, aż końcówka utworzy niewielkie wklęsłości na skórze, a następnie mocno, ale delikatnie przekręć pokrętło manipulatora osi z, aby wprowadzić mikropipetę przez skórę i czaszkę do mózgu. Lekko cofnij mikropipetę, aż końcówka zostanie otoczona stożkiem skóry w kształcie namiotu.I wyświetl współrzędne wzdłuż osi z. Następnie opuścić mikropipetę na odpowiednią głębokość doświadczalną i wstrzyknąć komórki. Odczekać 15 sekund po dostarczeniu komórek przed wycofaniem mikropipety i w razie potrzeby powtórzyć wstrzyknięcie w drugim miejscu.Umieść szczeniaka na poduszce grzewczej i monitoruj, aż zostanie osiągnięte pełne wyzdrowienie przed przeniesieniem z powrotem do klatki domowej. Przeszczepione komórki migrują przez docelowe obszary mózgu ze zmiennymi wskaźnikami przeżycia komórek od kilkudziesięciu do kilku tysięcy. Przeszczepione komórki lokalizują się w odpowiednich regionach, przy czym wiele komórek wykazuje morfologię interneuronów i dobrze scharakteryzowane markery neurochemiczne interneuronów.Komórki dawcy przeżywają i dojrzewają nawet wtedy, gdy są przeszczepiane do nowych środowisk za pomocą przeszczepów heterotopowych. Analiza elektrofizjologiczna przeszczepionych komórek ujawnia właściwości fizjologiczne podobne do dorosłych i wyraźne wzorce wypalania, reprezentatywne dla dobrze zdefiniowanych podtypów interneuronów, co sugeruje, że przeszczepione interneurony są w stanie prawidłowo dojrzeć w środowisku gospodarza. Przeszczepione komórki wykazują również spontaniczne pobudzające prądy postsynaptyczne.Zapis z komórek piramidowych sąsiadujących z przeszczepionymi interneuronami eksprymującymi rodopsynę kanałową-2 ujawnia postsynaptyczne prądy GABA-ergiczne, które są wywoływane przez niebieskie światło w tych endogennych komórkach piramidowych. Podczas próby tej procedury ważne jest, aby trzymać komórki na lodzie i delikatnie rozcierać je pipetą Pasteura, aby zminimalizować śmierć komórek. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak sekwencjonowanie pojedynczych komórek, na przeszczepionych komórkach, aby pełniej określić, w jaki sposób zmiany środowiskowe wpływają na transkryptom komórki.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś być w stanie wyizolować prekursory interneuronów z różnych regionów mózgu nowonarodzonych szczeniąt i przeszczepić te komórki do różnych regionów mózgu młodych postnatalnych w tym samym wieku.

homochronic-transplantation-interneuron-precursors-into-early

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Źródło: Weber, R. Z., et al. Przeszczep domózgowy i śledzenie bioluminescencji in vivo ludzkich nerwowych komórek progenitorowych w mózgu myszy. J. Vis. Exp. (2022)Ten film demonstruje stereotaktyczny przeszczep genetycznie zmodyfikowanych ludzkich nerwowych komórek progenitorowych (NPC) do mózgu myszy. Naukowcy wstrzykują NPC eksprymujące lucyferazy i białka fluorescencyjne, umożliwiając obrazowanie bioluminescencyjne in vivo i pośmiertną mikroskopię fluorescencyjną w celu zbadania przeżycia,...

Przeszczep ludzkich nerwowych komórek progenitorowych w mózgu myszy

Ten film przedstawia metodę generowania prekursorów interneuronów korowych z embrionalnych komórek macierzystych myszy. Protokół zakłada hodowlę komórek macierzystych w pożywkach zawierających specyficzne inhibitory małocząsteczkowe, które ułatwiają proliferację i agregację komórek macierzystych w ciała zarodkowe (EB). Następnie EB są dysocjowane z enzymami i siane na płytkach hodowlanych pokrytych białkami adhezyjnymi, aby promować ich różnicowanie w prekursory interneuronów korowych.

Generowanie prekursorów interneuronów korowych z embrionalnych komórek macierzystych myszy

Źródło: Quattrocolo, G., et al. Homochroniczne przeszczepianie prekursorów interneuronów do wczesnych postnatalnych mózgów myszy. J. Vis. Exp. (2018)Ten film pokazuje przeszczep komórek prekursorowych interneuronów do mózgu nowonarodzonego myszy przy użyciu podejścia homotopowego lub heterotopowego. Procedura polega na zabezpieczeniu znieczulonego szczeniaka biorcy, zidentyfikowaniu docelowego obszaru mózgu i wstrzyknięciu zawiesiny komórek prekursorowych pochodzących od szczeniaka dawcy na tym...

Przeszczep komórek prekursorowych interneuronów do mózgu szczeniaka myszy

Źródło: Gonzalez-Ramos, A., et al., Transplantation of Human Stem Cell-Derived GABAergic Neurons into the Early Postnatal Mouse Hippocampus to Mitigate Disorders. J. Vis. Exp. (2022)Ten film pokazuje stereotaktyczne wstrzyknięcie komórek prekursorowych interneuronów pochodzenia ludzkiego do hipokampa genetycznie zmodyfikowanego szczeniaka myszy ze zmniejszonymi interneuronami hamującymi, mające na celu przywrócenie równowagi pobudzająco-hamującej.

Przeszczep komórek prekursorowych interneuronów pochodzenia ludzkiego do hipokampa szczeniaka myszy

Źródło: Denaxa, M., el al., Transplantation of Chemogenetically Engineerical Interneuron Pregenitors into Early Postnatal Mouse Brains. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film przedstawia procedurę wstrzykiwania wektora plazmidowego przenoszącego interesujący nas gen do progenitorów interneuronów w embrionalnym wycinku mózgu, a następnie elektroporacji w celu wejścia plazmidu i ekspresji genu. Te zmodyfikowane komórki progenitorowe mogą być później wykorzystane do leczenia zaburzeń mózgu.

Transfer genów wspomagany elektroporacją osadzony w agarozie w progenitorach interneuronów kory myszy

Ten protokół opisuje metodę generowania prekursorów interneuronów korowych i prekursorów interneuronów postmitotycznych z embrionalnych komórek macierzystych myszy przy użyciu zmodyfikowanej metody embrionalnej ciała do monowarstwy. Te progenitory/prekursory mogą być używane in vitro lub sortowane fluorescencyjnie i przeszczepiane do kory nowej noworodka w celu badania determinacji losu lub wykorzystywane w zastosowaniach terapeutycznych.

Różnicowanie embrionalnych komórek macierzystych myszy w prekursory interneuronów korowych

Oparta na inżynierii lentiwirusowej in vitro prekursorów neuronów, ich kotransplantacji do mózgów dzikich typów i sparowanej ocenie morfometrycznej pochodnych "testowych" i "kontrolnych", metoda ta pozwala na dokładne modelowanie in vivo kontroli genów morfologii neuronów kory nowej w prosty i niedrogi sposób.

Dokomorowy przeszczep zmodyfikowanych prekursorów neuronalnych do badań neuroarchitektury in vivo

Tutaj prezentujemy protokół, zaprojektowany do wykorzystania narzędzi chemogenetycznych do manipulowania aktywnością komórek progenitorowych interneuronów korowych przeszczepionych do kory mózgowej myszy po urodzeniu.

Przeszczepienie chemogenetycznie zmodyfikowanych progenitorów interneuronów korowych do wczesnych postnatalnych mózgów myszy

Przeszczepienie ludzkich pluripotencjalnych neuronów GABA-ergicznych pochodzących z komórek macierzystych, generowanych przez programowanie neuronalne, może być potencjalnym podejściem do leczenia zaburzeń neurorozwojowych. Protokół ten opisuje wytwarzanie i przeszczepianie prekursorów neuronów GABA-ergicznych pochodzących z ludzkich komórek macierzystych do mózgów nowonarodzonych myszy, umożliwiając długoterminowe badanie przeszczepionych neuronów i ocenę ich potencjału terapeutycznego.

Przeszczep ludzkich neuronów GABA-ergicznych pochodzących z ludzkich komórek macierzystych do wczesnopourodzeniowego hipokampa myszy w celu złagodzenia zaburzeń neurorozwojowych

Opisano metodę in vivo służącą do badania funkcji genów w mózgu po urodzeniu. Rekombinowane AAV wykazujące ekspresję Cre i/lub białka fluorescencyjnego są wstrzykiwane do mózgu noworodka myszy. Uzyskano mozaikową inaktywację genów oraz rzadkie znakowanie neuronów, co umożliwia szybką analizę funkcji genów w procesach kluczowych dla rozwoju obwodów neuronalnych.

Mozaikowa analiza funkcji genów w postnatalnym rozwoju mózgu myszy z wykorzystaniem rekombinacji Cre opartej na wirusach

Poznaj metodę przeszczepiania prekursorów interneuronów do mózgów myszy w celu badania wpływu środowiska na dojrzewanie komórek nerwowych. Technika ta umożliwia analizę losu neuronów w nowym kontekście.

Homochroniczne przeszczepianie prekursorów interneuronów do wczesnych postnatalnych mózgów myszy

Przeglądaj więcej filmów