Homochroniczne przeszczepianie prekursorów interneuronów do wczesnych postnatalnych mózgów myszy
June 8th, 2018
Wyzwanie dla młodych neuronów w nowych regionach mózgu może ujawnić ważne informacje na temat tego, jak środowisko kształtuje los i dojrzewanie neuronów. Protokół ten opisuje procedurę zbierania prekursorów interneuronów z określonych regionów mózgu i przeszczepiania ich homotopowo lub heterotopowo do mózgu młodych po urodzeniu.
Ogólnym celem tej procedury jest zebranie prekursorów interneuronów z różnych regionów mózgu u pourodzeniowych młodych myszy i przeszczepienie tych komórek do biorców w tym samym wieku, aby ocenić, jak zmiany środowiskowe wpływają na los i dojrzewanie interneuronów. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neuronauki rozwojowej dotyczące tego, w jaki sposób wewnętrzne programy genetyczne i sygnały środowiskowe oddziałują na siebie, aby kształtować los komórek nerwowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że zmiany w losie i dojrzewaniu prekursorów interneuronów mogą być analizowane po ich adoptywnym przeniesieniu do nowego środowiska mózgu.
Wizualna demonstracja etapów pobierania i szczepienia komórek ma kluczowe znaczenie, ponieważ drobne błędy w technice mogą prowadzić do nieefektywnych i nieudanych eksperymentów transplantacyjnych. Na początek umieść jedną żyletkę w przednim płacie czołowym mózgu szczeniaka w pierwszym dniu po urodzeniu, a dodatkowe żyletki w szczelinach tuż za pierwszą żyletką, aby wygenerować dwie plastry o średnicy 0,5 milimetra. Przenieś plastry prążkowia na szalkę Petriego ze sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym z bąbelkami sacharozy lub sACSF i umieść pozostałą tkankę mózgową na szalce Petriego z sACSF na lodzie.
Umieść plastry pod mikroskopem preparacyjnym i użyj kleszczy, aby uszczypnąć prążkowie z obu półkul, umieszczając kawałki prążkowia w 50-mililitrowej probówce sACSF na lodzie podczas zbierania. Jeśli mózg został pobrany od fluorescencyjnej myszy reporterowej, użyj mikroskopii fluorescencyjnej, aby odróżnić sygnał pomidora td prążkowia od silniejszego sygnału fluorescencyjnego gałki bladej. Aby usunąć hipokamp, użyj kleszczy, aby wyciąć mózg wzdłuż linii środkowej i umieść jedną półkulę pod mikroskopem preparacyjnym przyśrodkowa powierzchnia do góry.
Użyj kleszczy, aby usunąć brzuszną tkankę mózgową i zidentyfikować hipokamp w kształcie kiełbasy obejmujący dostęp przednio-tylny wzdłuż grzbietowej i komorowej strony kory. Włóż końcówki kleszczy przed przednim hipokampem i przesuń kleszcze do tyłu, jednocześnie ściskając wzdłuż granicy kory hipokampa, aby delikatnie oddzielić hipokamp od kory. Umieść izolowaną tkankę w 50-mililitrowej probówce sACSF na lodzie i powtórz pobieranie hipokampa dla przeciwległej półkuli.
Następnie umieść półwyciętą korę przyśrodkową do dołu i użyj kleszczy, aby usunąć najbardziej grzbietową, brzuszną, przednią i tylną część kory. Przenieś pozostały kwadrat kory przyśrodkowej do 50-mililitrowej probówki sACSF na lodzie. Po usunięciu mózgu przypnij mózg brzuszną stroną do dołu przez móżdżek i korę przednią lub opuszki węchowe.
Za pomocą zakrzywionych kleszczy delikatnie oddziel tylną korę od leżącego poniżej hipokampa i innych tkanek w każdej półkuli. I oderwij korę grzbietową do przodu, aby odsłonić leżące poniżej struktury. Użyj kleszczy, aby uszczypnąć hipokamp w jednej półkuli w linii środkowej i usuń hipokamp, odrywając go bocznie od mózgu.
Umieść hipokamp w 50-mililitrowej tubce sACSF na lodzie i zbierz przeciwległy hipokamp w ten sam sposób. Następnie delikatnie zeskrob krawędzie prążkowia, aby poluzować je z otaczającej tkanki. Delikatnie uszczypnij poniżej prążkowia, aby pobrać tkankę prążkowia.
Po pobraniu kory z obu półkul, jak wykazano wcześniej, przenieś prążkowie pod fluorescencyjną lunetą preparacyjną. Użyj kleszczy, aby usunąć jaskrawoczerwoną tkankę gałki bladej z pomidorem td-dodatnim z każdego prążkowia. Po pobraniu wszystkich tkanek przenieś tkankę do pięciomilimetrowej probówki z okrągłym dnem i zastąp sACSF w każdej probówce zbiorczej dwoma mililitrami świeżo przygotowanego roztworu pronazy-sACSF na 20-minutową inkubację w temperaturze pokojowej z okazjonalnym trześnieniem.
Pod koniec inkubacji ostrożnie zastąpić pronazę-sACSF jednym do dwóch mililitrów roztworu do rozpuszczenia i mechanicznie oddzielić tkanki za pomocą wypolerowanych ogniowo rurek Pasteura. Gdy tkanka jest mętna i nie widać żadnych fragmentów tkanki, przecedź roztwór komórkowy przez filtr 50 mikronów do nowych pięciomililitrowych probówek z okrągłym dnem, aby usunąć wszelkie grudki komórek przed sortowaniem komórek aktywowanym fluorescencją. Po otrzymaniu komórek z cytometrii przepływowej przenieś zawiesiny komórek do 1,5-mililitrowych stożkowych probówek w celu odwirowania.
Po odwirowaniu odessać wszystkie oprócz ostatnich 20 mikrolitrów supernatantu z każdej probówki i rozpuścić granulki do liczenia. W razie potrzeby rozcieńczyć roztwór komórek sACSF do stężenia od jednego do trzech razy od 10 do 5 komórek na mikrolitr. Napełnij mikropipetę z cienką końcówką olejem mineralnym.
Podłącz mikropipetę do nanolitrowego wtryskiwacza i przymocuj nanolitrowy aparat do wstrzykiwania do manipulatora przymocowanego do podstawy magnetycznej. Podczas gdy pierwsze szczenię jest znieczulane na lodzie, należy kilkakrotnie odpipetować roztwór komórkowy, aby zapewnić jednorodne rozmieszczenie komórek. Wysunąć olej mineralny i całkowicie napełnić pipetę zawiesiną jednokomórkową.
Po potwierdzeniu braku reakcji na uszczypnięcie palca u nogi, umieść szczenię na pokrywie szalki Petriego z głową spoczywającą na klejącej szpachli, tak aby czubek głowy był stosunkowo płaski. Przykryj głowę kawałkiem taśmy laboratoryjnej z diamentowym otworem, ciągnąc za nauczoną taśmę, aż skóra zostanie rozciągnięta tak, aby głowa była mocno zabezpieczona i lambda była widoczna przez otwór. Przesuń zabezpieczoną końcówkę pod wtryskiwacz o pojemności nanolitrów i opuść mikropipetę tak, aby końcówka znajdowała się bezpośrednio nad lambdą.
Obserwuj współrzędne X, Y na manipulatorze i wyreguluj pokrętła manipulatora, aż mikropipeta znajdzie się w odpowiednich współrzędnych wzdłuż osi środkowej, bocznej i przednio-tylnej głowicy. Opuścić mikropipetę, aż końcówka utworzy niewielkie wklęsłości na skórze, a następnie mocno, ale delikatnie przekręć pokrętło manipulatora osi z, aby wprowadzić mikropipetę przez skórę i czaszkę do mózgu. Lekko cofnij mikropipetę, aż końcówka zostanie otoczona stożkiem skóry w kształcie namiotu.
I wyświetl współrzędne wzdłuż osi z. Następnie opuścić mikropipetę na odpowiednią głębokość doświadczalną i wstrzyknąć komórki. Odczekać 15 sekund po dostarczeniu komórek przed wycofaniem mikropipety i w razie potrzeby powtórzyć wstrzyknięcie w drugim miejscu.
Umieść szczeniaka na poduszce grzewczej i monitoruj, aż zostanie osiągnięte pełne wyzdrowienie przed przeniesieniem z powrotem do klatki domowej. Przeszczepione komórki migrują przez docelowe obszary mózgu ze zmiennymi wskaźnikami przeżycia komórek od kilkudziesięciu do kilku tysięcy. Przeszczepione komórki lokalizują się w odpowiednich regionach, przy czym wiele komórek wykazuje morfologię interneuronów i dobrze scharakteryzowane markery neurochemiczne interneuronów.
Komórki dawcy przeżywają i dojrzewają nawet wtedy, gdy są przeszczepiane do nowych środowisk za pomocą przeszczepów heterotopowych. Analiza elektrofizjologiczna przeszczepionych komórek ujawnia właściwości fizjologiczne podobne do dorosłych i wyraźne wzorce wypalania, reprezentatywne dla dobrze zdefiniowanych podtypów interneuronów, co sugeruje, że przeszczepione interneurony są w stanie prawidłowo dojrzeć w środowisku gospodarza. Przeszczepione komórki wykazują również spontaniczne pobudzające prądy postsynaptyczne.
Zapis z komórek piramidowych sąsiadujących z przeszczepionymi interneuronami eksprymującymi rodopsynę kanałową-2 ujawnia postsynaptyczne prądy GABA-ergiczne, które są wywoływane przez niebieskie światło w tych endogennych komórkach piramidowych. Podczas próby tej procedury ważne jest, aby trzymać komórki na lodzie i delikatnie rozcierać je pipetą Pasteura, aby zminimalizować śmierć komórek. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak sekwencjonowanie pojedynczych komórek, na przeszczepionych komórkach, aby pełniej określić, w jaki sposób zmiany środowiskowe wpływają na transkryptom komórki.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś być w stanie wyizolować prekursory interneuronów z różnych regionów mózgu nowonarodzonych szczeniąt i przeszczepić te komórki do różnych regionów mózgu młodych postnatalnych w tym samym wieku.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie bada, jak zmiany środowiskowe wpływają na los i dojrzewanie prekursorów interneuronów u noworodków myszy. Protokół opisuje metodę pobierania i przeszczepiania tych prekursorów z różnych regionów mózgu w celu oceny rozwoju neuronów.
Główne elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauka rozwojowa
- Wyznaczanie losu neuronów
- Techniki przeszczepiania
Tło
- Rozumienie interakcji programów genetycznych i sygnałów środowiskowych jest kluczowe dla rozwoju neuronów.
- Badanie koncentruje się na interneuronach, które odgrywają kluczową rolę w obwodach mózgowych.
- Protokoły mają na celu wyjaśnienie, jak młode neurony mogą przystosować się do nowych środowisk.
- Procedura podkreśla znaczenie precyzji techniki w udanym przeszczepie.
Cel badania
- Zaproponowanie metody pobierania i przeszczepiania prekursorów interneuronów.
- Ocena, jak te prekursory przystosowują się i dojrzewają w różnych środowiskach mózgu.
- Zbadanie podstawowych pytań dotyczących losu neuronów w różnych warunkach środowiskowych.
Zastosowane metody
- Badanie wykorzystuje protokół pobierania tkanek mózgowych od noworodków myszy.
- Prekursory interneuronów są izolowany z regionów takich jak wzgórze i hipokamp.
- Pobrane tkanki są przeszczepiane do odbiorców o zbliżonym wieku w celu badania.
- Ważne kroki obejmują użycie ostrzaczek do krojenia tkanki i mikroskopii fluorescencyjnej do identyfikacji tkanek.
- Przed przeszczepieniem stosuje się metody dysockacji i sortowania komórek.
Główne wyniki
- Technika pozwala na pomyślne pobieranie i przeszczepianie prekursorów interneuronów.
- Następne oceny ujawniają, jak te komórki dojrzewają w nowych środowiskach.
- Wyniki mogą pogłębić zrozumienie, w jaki sposób czynniki środowiskowe wpływają na rozwój i integrację neuronów.
- Kluczowe wnioski sugerują, że technika umożliwia badanie zachowania komórkowego w różnych kontekstach.
Wnioski
- To badanie demonstruje znaczącą metodę badania zdolności adaptacyjnych i dojrzewania neuronów.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia współzależności wpływów genetycznych i środowiskowych na los neuronów.
- Protokół poprawia zdolność do badania pytań rozwojowych w neuronaukach.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This protocol enables mechanistic de-risking of neuronal development hypotheses by isolating the impact of environmental cues on interneuron fate and maturation. By transplanting precursors into heterotopic brain regions, researchers can distinguish intrinsic genetic programs from extrinsic signals, improving target validation confidence in neurodevelopmental disease models. The approach supports predictive confidence in preclinical models by revealing whether neuronal phenotypes are genetically hardwired or environmentally modulated.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by testing whether interneuron maturation depends on genetic programs or environmental inputs.
- Operational Value: Provides a reproducible system to assess cell-autonomous versus non-cell-autonomous mechanisms in neuronal differentiation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitatively assessable grafted cells with defined neurochemical markers for downstream phenotypic screening.
- Operational Value: Produces standardized, transplant-ready interneuron precursors suitable for assay development in disease-relevant systems.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates disease-relevant system modeling by testing how grafted interneurons integrate and mature in host circuits.
- Operational Value: Enables longitudinal analysis of graft survival, maturation, and electrophysiological properties in adult hosts.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to preclinical modeling by providing a controlled system to assess neuronal maturation under defined environmental conditions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on intrinsic versus extrinsic regulation of neuronal fate through heterotopic transplantation.
- Screening: Delivers standardized cellular inputs with quantifiable maturation readouts for compound or genetic perturbation studies.
- Analytics: Enables electrophysiological, immunohistochemical, and transcriptional profiling of grafted cells to quantify maturation states.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity by assessing circuit integration and functional properties of grafted interneurons.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating neuronal adaptability across multiple brain regions and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in neuronal development by decoupling genetic and environmental contributions.
- Operational Value: Delivers a standardized, scalable workflow for harvesting and transplanting fluorescently labeled interneuron precursors.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in target validation by clarifying whether neuronal phenotypes are environmentally responsive.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted advancement by identifying targets whose modulation is likely to be robust across diverse neural environments.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgical tissue harvesting, fluorescence-activated cell sorting, and stereotactic neonatal injection.
- Dependent on precision dissection tools, fluorescence microscopy, and nanoliter injection systems for viable cell delivery.
- Necessitates standardized cell viability and concentration protocols to ensure reproducible engraftment across experiments.
- Must account for regional heterogeneity in host brain environments when interpreting graft maturation and integration outcomes.
- Limited by variable cell survival rates post-transplantation, requiring adequate sample sizes for statistical power.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:57
Striatum, Hippocampus, and Cortex Harvest: Technique 1
3:15
Striatum, Hippocampus, and Cortex Harvest: Technique 2
4:33
Generation of Single Cell Suspensions
6:01
P0-2 Wild-Type (WT) Pup Transplantation
8:13
Results: Representative Grafted Interneuron Analyses
9:28
Conclusion
