Kalorespirometria: potężne, nieinwazyjne podejście do badania metabolizmu energii komórkowej
31 maja 2018
Ten protokół opisuje kalorespirometrię, bezpośredni i jednoczesny pomiar zarówno rozpraszania ciepła, jak i oddychania, co zapewnia nieinwazyjne podejście do oceny metabolizmu energetycznego. Technika ta służy do oceny udziału ścieżek tlenowych i beztlenowych w wykorzystaniu energii poprzez monitorowanie całkowitego przepływu energii komórkowej.
Ogólnym celem tej procedury jest analiza aktywności metabolicznej próbki biologicznej i określenie zakresu, w jakim szlaki beztlenowe przyczyniają się do produkcji energii komórkowej w próbce. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie farmacji dotyczące zakresu toksyczności mitochondrialnej podczas opracowywania leków. Główną zaletą tej techniki jest to, że ułatwia ona jednoczesny pomiar zużycia tlenu i produkcji ciepła w badanej próbce ogniwa.
Tak więc metoda ta może zapewnić wgląd w planowanie leczenia podczas opracowywania farmaceutyków. Można go również zastosować w innych dziedzinach, takich jak cyrobiologia, w której można ocenić wpływ wstępnego kondycjonowania metabolicznego na kriokonserwację. Aby przygotować respirometr, najpierw dodaj dwa mililitry DMEM do każdej komory respirometru i całkowicie włóż korki.
Wyreguluj korki za pomocą narzędzia do przekładki korka, aby umożliwić optymalną dyfuzję tlenu do pożywki, i ustaw komory tak, aby w sposób ciągły mieszały próbki z prędkością 750 obr./min w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż stężenie tlenu i strumień tlenu ustabilizują się. Upewnij się, że oprogramowanie respirometru jest zaprogramowane tak, aby uwzględniało rozpuszczalność tlenu w pożywce użytej w doświadczeniu. Następnie wybierz stabilną porcję śladu stężenia tlenu i skalibruj tę porcję, aby uzyskać 100% nasycenie powietrzem.
Teraz zamknij korki, uważając, aby w komorach nie było pęcherzyków. Po około 10 minutach należy zaobserwować stabilny strumień tlenu. Aby przygotować się do kalorymetrii, najpierw dodaj dwa i pięć mililitrów wody dejonizowanej do ampułki referencyjnej, a następnie dokręć nakrętkę.
Za pomocą pompy powietrza usuń zewnętrzne zanieczyszczenia z ampułki, a następnie powoli opuść ampułkę, aby umieścić ją w kanale odniesienia kalorymetru. Ampułka pozostanie w pozycji pierwszej, dopóki ampułka z próbką komórkową nie zostanie przygotowana. DMEM, używany do kalorymetrii, powinien być zrównoważony w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza z nawilżoną atmosferą i 5% CO2.
Rozpocznij eksperyment od dodania trzech mililitrów DMEM do 100-mililitrowej płytki dla każdej ampułki kalorymetrycznej, która zostanie użyta, i umieść płytkę w inkubatorze, aż próbka będzie gotowa do kalorymetrii. Podczas gdy podłoże się równoważy, użyj odwróconego mikroskopu, aby wybrać płytkę z komórkami HepG2, które są od 60 do 80% zlewające się i są jednorodnie rozmieszczone. Najpierw usuń pożywkę do hodowli komórkowej i umyj komórki dwa razy 10 mililitrami PBS.
Dodaj trzy mililitry wstępnie podgrzanej trypsyny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po siedmiu do 10 minutach inkubacji zneutralizuj reakcję enzymatyczną za pomocą trzech mililitrów DMEM o temperaturze 37 stopni Celsjusza i użyj pięciomililitrowej pipety, aby delikatnie zdysocjować komórki w zawiesinę jednokomórkową. Przenieś komórki do sterylnej 15-mililitrowej stożkowej probówki w celu odwirowania i ponownie zawiesić paletę w około pięciu mililitrach świeżego DMEM.
Dokładnie pipetować komórki, aby zdezagregować wszelkie skupiska komórek, a po zliczeniu skoncentrować komórki do około dwóch milionów komórek na 50 mikrolitrów pożywki. Odtwarzalność tej metody zależy od spójnej i dokładnej liczby komórek. Bardzo ważne jest, aby upewnić się, że próbka jest jednorodna i że komórki nie są zbite w żadnym momencie analizy.
Następnie przechowuj komórki na lodzie, aż będą gotowe do wykonania pomiarów respirometrycznych i kalorymetrycznych. Przed pomiarem kalorymetrycznym upewnij się, że kalorymetr jest podłączony do komputera i że sygnał kalorymetryczny jest stabilny i w mikrowatach. Rozcieńczyć komórki do 100 000 komórek na mililitr w zrównoważonym podłożu, które umieszczono w inkubatorze przed przygotowaniem próbki.
Następnie dodaj dwa razy po pięć mililitrów roztworu komórkowego do każdej ampułki, potwierdzając, że między pokrywkami ampułek a pożywką utrzymywana jest wystarczająca ilość powietrza, aby umożliwić dyfuzję gazu. Natychmiast dokręć nakrętki i wyczyść zamknięte ampułki powietrzem, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia zewnętrzne. Następnie powoli opuść szczelnie zamkniętą ampułkę z próbką komórki, aby ustawić jedną z kalorymetrów.
Dokładnie wymieszać próbkę, aby uzyskać jednorodny roztwór, i wstrzyknąć dwa miliony komórek do każdej zamkniętej komory respirometru pod ciągłym mieszaniem. Po 15 minutach w pozycji pierwszej w kalorymetrze powoli opuść zarówno ampułkę referencyjną, jak i ampułkę z komórkami do pozycji drugiej i zapisz czas opuszczania. Po 10 do 15 minutach od wstrzyknięcia komórek do respirometru należy zaobserwować stabilizację strumienia tlenu i stały spadek stężenia tlenu.
Aby określić oddychanie nieszczelne, wstrzyknąć jeden mikrolitr czterech miligramów oligomycyny na mililitr do każdej komory i pozwolić, aby strumień tlenu ustabilizował się przez około 10 minut, rejestrując stabilną szybkość oddychania nieszczelnego, jak właśnie pokazano. Następnie, aby określić maksymalny strumień, wstrzyknąć do komory dwa mikrolitry dwumilimolowego FCCP w punkcie zerowym, pozwalając na ustabilizowanie się strumienia tlenu po każdym wstrzyknięciu i kontynuując miareczkowanie, aż do osiągnięcia maksymalnego strumienia. Zapisuj stabilną częstość oddechów podczas maksymalnego strumienia.
Gdy komora respirometru pracuje przed pomiarem próbki, zarówno stężenie tlenu, jak i ślady strumienia tlenu powinny być stabilne. Po opuszczeniu ampułki do pozycji drugiej można określić okres, w którym moc cieplna jest stabilna, oraz odpowiadający mu czas, w którym strumień tlenu jest stabilny, aby umożliwić obliczenie stosunku kalorespirometrycznego. Jeśli komórki HepG2 są hodowane pod nieobecność glukozy, a galaktoza jest uzupełniana w celu zwiększenia zaangażowania mitochondriów, komórki nie namnażają się wewnątrz kalorymetru, ale zamiast tego zmniejszają swoją aktywność metaboliczną po około 30 minutach w ampułce, ograniczając obliczenia kalorespirometryczne do najwcześniejszego punktu czasowego, w którym zmierzono rozpraszanie ciepła.
Bardzo ważne jest, aby rejestrować czas, w którym komórki są pipetowane do ampułki, tak aby pomiary produkcji ciepła i zużycia tlenu były zbierane w identycznych punktach czasowych, ponieważ potrzeba około 15 minut, aby strumień tlenu ustabilizował się, a stężenie tlenu stale spadało. Ponieważ ustabilizowany strumień tlenu w komórkach służy jako substytut zużycia tlenu przy obliczaniu stosunku kalorespirometrycznego, można wykonać dodatkowe miareczkowanie w celu oceny oddychania nieszczelnego, na co wskazuje spadek strumienia tlenu i maksymalne oddychanie niesprzężone, co wskazuje na brak zwiększenia oddychania przy kolejnych miareczkowaniach FCCP. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w mniej niż cztery godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.
Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że inne linie komórkowe mogą mieć różne właściwości metaboliczne. Dlatego każda nowa linia komórkowa musi być zoptymalizowana zarówno pod kątem pomiarów kalorymetrycznych, jak i respirometrycznych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować komórki HepG2 do kalorespirometrii, aby zapewnić prawidłową kalibrację instrumentalną i prawidłowo przeprowadzić eksperyment kalorespirometryczny.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje kalorespirometrię, nieinwazyjną technikę oceny metabolizmu energetycznego poprzez jednoczesny pomiar rozpraszania ciepła i oddychania. Metoda ta pozwala ocenić wkład szlaków tlenowych i beztlenowych w przepływ energii komórkowej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- neuronauka
- biologia
- rozwój farmaceutyków
Wstęp
- Kalorespirometria umożliwia bezpośredni pomiar aktywności metabolicznej.
- Technika ta pomaga w zrozumieniu toksyczności mitochondrialnej podczas opracowywania leków.
- Można ją również zastosować w krio-biologii w celu oceny efektów prekondycjonowania metabolicznego.
- Kluczową zaletą jest jednoczesny pomiar zużycia tlenu i wydzielania ciepła.
Cel badania
- Analiza aktywności metabolicznej w próbkach biologicznych.
- Określenie roli szlaków beztlenowych w produkcji energii komórkowej.
- Dostarczenie informacji przydatnych do planowania leczenia w rozwoju farmaceutycznym.
Zastosowane metody
- Przygotowanie komór respirometru z DMEM.
- Pomiar zużycia tlenu.
- Pomiar wydzielania ciepła.
- Ocena szlaków metabolizmu energetycznego.
Główne wyniki
- Wgląd w wkład metabolizmu tlenowego i beztlenowego.
- Dane dotyczące toksyczności mitochondrialnej istotne dla opracowywania leków.
- Zrozumienie efektów prekondycjonowania metabolicznego w kriobiologii.
- Ułatwienie planowania leczenia w oparciu o aktywność metaboliczną.
Wnioski
- Kalorespirometria jest cennym narzędziem w analizie metabolicznej.
- Dostarcza ona kluczowych informacji na temat wykorzystania energii w komórkach.
- Metoda ta może usprawnić procesy opracowywania leków.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Kalorespirometria umożliwia jednoczesny pomiar zużycia tlenu i wydzielania ciepła w celu określenia udziału procesów tlenowych i beztlenowych w komórkowej produkcji ATP. To nieinwazyjne podejście wspiera walidację celu poprzez ujawnianie zależności metabolicznych, które mogą zakłócać wyniki przesiewowe leków, szczególnie w warunkach hodowli z wysoką zawartością glukozy. Zapewnia ono pewność predykcyjną w ocenie toksyczności mitochondrialnej i obciążeń metabolicznych na wczesnym etapie procesu odkrywania leków.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikacja hipotez terapeutycznych poprzez określenie stopnia kompensacji beztlenowej w metabolizmie energetycznym podczas leczenia farmakologicznego.
- Wartość operacyjna: Wykrywanie toksyczności mitochondrialnej, która może być maskowana w przekształconych komórkach hodowanych w obecności nasycających stężeń glukozy, co pozwala ograniczyć liczbę wyników fałszywie ujemnych w badaniach przesiewowych związków.
- Wartość prognostyczna: Obliczanie współczynnika kalorespirometrycznego w celu oceny równowagi metabolicznej oraz wsparcia decyzji o kontynuowaniu lub przerwaniu badań (go/no-go) w oparciu o zależność od szlaków energetycznych.
Przesiew i opracowanie testu
- Gotowość testu: Przygotować zwalidowane systemy biologiczne ze stabilnym strumieniem tlenu i sygnałami wydzielania ciepła w celu wiarygodnej oceny związków.
- Wynik ilościowy: Pomiar zużycia tlenu i rozpraszania ciepła jednocześnie w celu wyznaczenia współczynnika kalorespirometrycznego jako funkcjonalnego odczytu wkładu szlaków metabolicznych.
- Powtarzalność: Zapewnić homogeniczne zawiesiny komórkowe i spójną liczbę komórek, aby zachować dokładność pomiarów w powtórzeniach.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie w badaniach nad chorobami: Zastosowanie kalorespirometrii w warunkach normoksji i hipoksji do modelowania metabolizmu nowotworowego oraz oddziaływań ze zrąbem.
- Ciągłość translacyjna: Wykorzystanie tej metody do oceny efektów prekondycjonowania metabolicznego, łącząc odkrycia podstawowe z krio-biologią i strategiami konserwacji.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Wczesna identyfikacja związków o potencjale mitotoksycznym poprzez wykrywanie przejścia na metabolizm beztlenowy jako mechanizmu kompensacyjnego.
Integracja potoku i przepływu pracy
Kalorespirometria wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków – od walidacji celu, przez identyfikację związku wiodącego, aż po ocenę przedkliniczną – dostarczając funkcjonalnych odczytów metabolicznych, które pomagają w wyborze związku oraz określeniu mechanizmu jego działania.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących zależności metabolicznych i inhibicji szlaków w modelach komórkowych.
- Przesiewanie: Umożliwia standaryzację testów poprzez jednoczesną respirometrię i kalorymetrię, co poprawia jakość danych w profilowaniu metabolicznym.
- Analityka: Generuje stosunek kalorespirometryczny, czyli ilościową metrykę porównującą eksperymentalne stosunki ciepła do tlenu z teoretycznymi ekwiwalentami oksykalorycznymi w celu oszacowania udziału procesów beztlenowych.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez ocenę adaptacji metabolicznej w systemach istotnych dla danej jednostki chorobowej w zmiennych warunkach odżywczych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako platforma wielokrotnego użytku do oceny obciążeń metabolicznych w różnych obszarach terapeutycznych i klasach związków.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną poprzez rozróżnienie tlenowej i beztlenowej produkcji ATP w żywych komórkach.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację dzięki pomiarowi dwóch parametrów, co minimalizuje zmienność w fenotypowaniu metabolicznym.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową poprzez identyfikację niedostatków mitochondrialnych przed kosztownym rozwojem na dalszych etapach.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez wskazywanie związków indukujących reorganizację metaboliczną w szlakach energetycznych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w hodowli komórkowej, obsłudze respirometru oraz interpretacji sygnałów kalorymetrycznych.
- Zależność od skalibrowanej aparatury do pomiaru rozpuszczalności tlenu i strumienia ciepła w mediach biologicznych.
- Konieczność standaryzacji przygotowania komórek, czasów równoważenia oraz protokołów wstrzykiwania pomiędzy zespołami.
- Należy uwzględnić specyficzne właściwości metaboliczne danej linii komórkowej, co wymaga optymalizacji dla każdego systemu modelowego.
- Ograniczenie wynikające z potrzeby uzyskania stabilnych sygnałów bazowych przed wstrzyknięciem, co może wydłużyć czas trwania eksperymentu w przypadku powolnego równoważenia.
