Name: Kalorespirometria: potężne, nieinwazyjne podejście do badania metabolizmu energii komórkowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-31T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Poznaj kalorespirometrię, nieinwazyjną metodę badania metabolizmu komórkowego poprzez jednoczesny pomiar zużycia tlenu i produkcji ciepła. Technika ta umożliwia ocenę toksyczności mitochondrialnej w rozwoju leków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została częściowo sfinansowana przez grant CHE-160944 Narodowej Fundacji Nauki dla Mary E. Konkle i Michaela A. Menze.

1. Hodowla komórkowa
<ol>
	<li>Utrzymuj ludzkie komórki raka wątrobowokomórkowego (HepG2) w zmodyfikowanym pożywce Eagle's Modified Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i dodatkowe substraty (10 mM glukozy, 2 mM glutaminy i 1 mM pirogronianu) w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli komórkowych (5% CO2, 95% powietrza, 100% wilgotności). 
	UWAGA: Użyj powyższego preparatu DMEM, gdy DMEM jest przywoływany w późniejszych krokach do respirometrii i kalorymetrii.</li>
	<li>Płytkie komórki należy umieścić na płytce hodowlanej 1 x 10 6 komórek na 100 mm i subkulturować je co 7 dni lub przed osiągnięciem 90% zbiegu i odnawiać pożywkę co 3 - 4 dni.</li>
	<li>Wykonuj eksperymenty, gdy komórki są w 60 - 80% zlewane.</li>
</ol>
2. Przygotowanie respirometru i kalorymetru
<ol>
	<li>Odpipetować 2,2 ml DMEM do komory respirometru, całkowicie włożyć korek i wyregulować go za pomocą narzędzia do przekładki korka, aby umożliwić optymalną dyfuzję tlenu z powietrza do medium.</li>
	<li>Mieszać w sposób ciągły w temperaturze 37 °C, aż stężenie tlenu (ślad niebieski) i strumień tlenu (ślad czerwony) ustabilizują się. Upewnij się, że oprogramowanie respirometru jest zaprogramowane tak, aby uwzględniało rozpuszczalność tlenu w pożywce użytej w eksperymencie. 
	UWAGA: Różne media mają różne współczynniki rozpuszczalności tlenu (np. DMEM = 0,92).</li>
	<li>Po ustabilizowaniu stężenia tlenu w DMEM przy otwartej komorze należy wybrać stabilną część śladu stężenia tlenu i skalibrować ją pod kątem 100% nasycenia powietrzem.</li>
	<li>Skalibruj dla 0% tlenu, wybierając stabilną część śladu stężenia tlenu, gdy w komorze nie ma tlenu. Wykonaj ten krok po miareczkowaniu 20 μl 230 mM ditionianu sodu lub po całkowitym zużyciu tlenu przez próbkę biologiczną na końcu doświadczenia.</li>
	<li>Po kalibracji respirometru na 100% sprężonego powietrza zamknij korek i upewnij się, że w komorze nie ma pęcherzyków powietrza. 
	UWAGA: w zamkniętej komorze zostanie wykryty niewielki wzrost strumienia tlenu, ponieważ polarograficzny czujnik tlenu (POS) zużywa tlen w celu pomiaru ciśnienia parcjalnego tlenu.</li>
	<li>Po ~10 minutach od zamknięcia korka upewnij się, że respirometr jest gotowy do komórek HepG2, obserwując stabilny strumień tlenu. 
	UWAGA: Zastosowany tutaj kalorymetr wykorzystuje ampułki ze stali nierdzewnej i wymaga użycia jednej ampułki jako odniesienia.</li>
	<li>Dodać 2,5 mlH2O(dH2O) [objętość równą próbkom (krok 4)] do ampułki referencyjnej kalorymetru i dokręcić nakrętkę, w razie potrzeby używając szczypiec. Wyczyść szczelnie zamkniętą ampułkę za pomocą przepływu powietrza i powoli opuść ampułkę do pozycji 1 w kanale odniesienia kalorymetru. Pozostać w pozycji 1 do czasu przygotowania próbki biologicznej.</li>
</ol>
3. Przygotowanie komórek HepG2 do respirometrii i kalorymetrii
<ol>
	<li>Upewnij się, że respirometr i kalorymetr są przygotowane i skalibrowane. Podgrzej DMEM i trypsynę do temperatury 37 °C w łaźni wodnej.</li>
	<li>Dodać DMEM do świeżej płytki o średnicy 100 mm i umieścić w inkubatorze, aby umożliwić zrównoważenie pożywki zarówno dla CO2 , jak i temperatury. 
	UWAGA: To podłoże zostanie użyte do eksperymentu kalorymetrycznego, więc odpowiednia objętość zależy od liczby ampułek, które zostaną użyte.</li>
	<li>Potwierdzić za pomocą mikroskopu światła odwróconego, że komórki są w 60 - 80% zlewne, a następnie umyć płytkę o średnicy 100 mm 2x 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodać 3 ml trypsyny o temperaturze 37 °C do 100-milimetrowej płytki z komórkami i inkubować je przez 7-10 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli komórkowych. Zneutralizuj trypsynę za pomocą 3 ml DMEM o temperaturze 37 °C i zawiesij, delikatnie pipetując ją ~20 razy pipetą o pojemności 5 ml.</li>
	<li>Przenieść 6 ml ponownie zawieszonych komórek w DMEM i trypsyny do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować przez 5 minut przy 175 x g. Usunąć płyn bez naruszania osadu komórkowego.</li>
	<li>Ponownie zawiesić osad komórkowy w ~ 5 ml DMEM i dokładnie go pipetować, aby upewnić się, że komórki są wystarczająco oddzielone od siebie.</li>
	<li>Usuń ~ 100 μL dobrze wymieszanej próbki i przeprowadź dokładne liczenie komórek, wykorzystując wszystkie 8 pól na hemocytometrze, aby określić całkowitą liczbę komórek. Następnie obliczyć objętość do ponownego zawieszenia komórek, aby wytworzyć ~2 x 106 komórek na 50 μL. 
	UWAGA: Zapewni to, że do każdej komory respirometru zostaną dodane 2 x 106 komórek z minimalnym przemieszczeniem medium.</li>
	<li>Odwirować komórki przez 5 minut przy 175 x g. Ponownie zawiesić osad w obliczonej objętości DMEM z kroku 3.7.</li>
	<li>Wykonaj zliczanie komórek, aby określić objętość wymaganą do wstrzyknięcia 2 x 106 komórek na komorę do respirometru (powinno to być ~50 μL). Przechowuj komórki do pomiaru respirometrycznego na lodzie, aż będą gotowe.</li>
	<li>Podczas gdy zagęszczona próbka komórkowa znajduje się na lodzie, należy określić rozcieńczenie wymagane do uzyskania stężenia 1 x 105 komórek/ml do kalorymetrii.</li>
	<li>Dobrze wymieszaj próbkę i przygotuj ~ 3 ml komórek w stężeniu 1 x 105 komórek/ml w DMEM dla każdej ampułki. 
	UWAGA: DMEM użyty do rozcieńczenia próbki powinien być zrównoważonym podłożem przygotowanym w kroku 3.3.</li>
</ol>
4. Kalorymetria
<ol>
	<li>Upewnij się, że kalorymetr jest podłączony do komputera, a sygnał kalorymetryczny w μW jest zauważalny i stabilny.</li>
	<li>Dodaj 2,5 ml komórek w proporcji 1 x 105 komórek/ml (~2,5 x 105 komórek) do każdej ampułki, upewniając się, że między pokrywką ampułki a podłożem znajduje się wystarczająca ilość powietrza, aby umożliwić dyfuzję gazu.</li>
	<li>Natychmiast dokręć nakrętkę, w razie potrzeby używając szczypiec. Wyczyść szczelnie zamkniętą ampułkę, używając przepływu powietrza do usunięcia wszelkich zewnętrznych zanieczyszczeń, i powoli opuść ampułkę do pozycji 1 kalorymetru. Zapisz czas, w którym ampułka jest opuszczona do pozycji 1.</li>
	<li>Pozostawić ampułkę w pozycji 1 na 15 minut. 
	UWAGA: W ciągu tych 15 minut komórki należy wstrzyknąć do respirometru (krok 5). Gwarantuje to, że ten sam przedział czasu jest wykorzystywany zarówno do produkcji ciepła, jak i zużycia tlenu, gdy określany jest współczynnik CR.</li>
	<li>Po 15 minutach w pozycji 1 powoli opuścić zarówno ampułkę referencyjną, jak i amppułkę próbki do pozycji 2. Zapisz czas opuszczania ampułek i mierz przez co najmniej 30 minut.</li>
</ol>
5. Respirometria
<ol>
	<li>W 15-minutowym odstępie, w którym ampułka znajduje się w pozycji 1 w kalorymetrze, należy rozpocząć badania respirometryczne.</li>
	<li>Dokładnie wymieszać próbkę komórkową przez pipetowanie, aby uzyskać jednorodny roztwór, a następnie wstrzyknąć <50 μl próbki komórki do każdej komory respirometru, aby uzyskać końcowe stężenie ~2 x 106 komórek/komorę. Zapisz czas, w którym komórki są wstrzykiwane do respirometru.</li>
	<li>Po wstrzyknięciu komórki HepG2 są ciągle mieszane w temperaturze 37 °C. Należy odczekać co najmniej 20 - 30 minut, aby uzyskać zarówno stabilizację strumienia tlenu, jak i stały spadek stężenia tlenu.</li>
	<li>Wybierz zakładkę StrumieńO2 na V po prawej stronie ekranu i podświetl stabilną porcję strumienia tlenu. Wybierz znaki, a następnie statystyki i zapisz dane dla strumienia O2 na V. Zapis ten zostanie wykorzystany do obliczenia współczynnika CR. 
	UWAGA: Kroki 5.5 i 5.6 są opcjonalne. Oddychanie nieszczelne i maksymalne oddychanie niesprzężone zostaną ujawnione przez miareczkowanie oligomycyny i FCCP.</li>
	<li>Wstrzyknąć 1 μl oligomycyny 4 mg/ml do każdej komory i odczekać ~ 10 minut na stabilizację strumienia tlenu. Zapisać stabilną częstość oddychania przy wycieku, wykonując czynności opisane w ppkt 5.4, podkreślając stabilną część śladu strumienia tlenu po dodaniu oligomycyny.</li>
	<li>Miareczkowanie 2 μl 0,2 mM FCCP do każdej komory, co pozwala na stabilizację strumienia tlenu po każdym wstrzyknięciu. Kontynuuj miareczkowanie aż do osiągnięcia maksymalnego strumienia, na co wskazuje nieznaczny spadek kolejnego miareczkowania FCCP. Zapisuj stabilną częstość oddechów podczas maksymalnego strumienia.</li>
</ol>
6. Obliczanie współczynnika kalorespirometrycznego
<ol>
	<li>Przeprowadzić końcową liczbę komórek w próbkach przygotowanych przy ~ 1 x 105 komórek/ml, wykorzystując wszystkie 8 pól hemocytometru w celu określenia całkowitej liczby komórek dodanych do ampułki (2,5 ml).</li>
	<li>Określ czas rejestrowania pomiarów zarówno z kalorymetru, jak i respirometru, przy którym stabilne sygnały są obecne w identycznych momentach. Należy odnieść się do czasu zarejestrowanego w momencie opuszczenia ampułki do pozycji 2 oraz czasu wstrzyknięcia komórek do respirometru.</li>
	<li>Rejestruj produkcję ciepła, umieszczając kursor na ścieżce wyświetlającej moc cieplną dla danej ampułki w czasie określonym w kroku i wyrażonym jako μW/milion komórek. Zbierz dane dotyczące zużycia tlenu i upewnij się, że jest ono wyrażone jako pmol O2 x s-1 x milion komórek.</li>
	<li>Aby obliczyć stosunek CR, najpierw przelicz μW na kJ/s, a następnie podziel kJ/s na mol O2/s, aby uzyskać stosunek CR wyrażony jako kJ/mol O2 . UWAGA: Współczynnik CR podawany jest w kJ/mol O2, 
	(patrz <a href="/files/ftp_upload/57724/JoVE_Supplemental_File.docx" target="_blank">Plik uzupełniający 1</a>)</li>
</ol>

<ol><li>Gnaiger, E., Kemp, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anaerobic+metabolism+in+aerobic+mammalian+cells%3A+information+from+the+ratio+of+calorimetric+heat+flux+and+respirometric+oxygen+flux%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Anaerobic metabolism in aerobic mammalian cells: information from the ratio of calorimetric heat flux and respirometric oxygen flux.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1016, 328-332 (1990).</li>
<li>Barros, N., Gallego, M., Feijoo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calculation+of+the+specific+rate+of+catabolic+activity+%28Ac%29+from+the+heat+flow+rate+of+soil+microbial+reactions+measured+by+calorimetry%3A+significance+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+Biodiversity%22%5BJournal%5D)">Calculation of the specific rate of catabolic activity (Ac) from the heat flow rate of soil microbial reactions measured by calorimetry: significance and applications.</a> Chemistry & Biodiversity. 1, 1560-1568 (2004).</li>
<li>Cheney, M. A., Fiorillo, R., Criddle, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herbicide+and+estrogen+effects+on+the+metabolic+activity+of+Elliptio+complanata+measured+by+calorespirometry%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology+-+Part+C%3A+Pharmacology%2C+Toxicology+and+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Herbicide and estrogen effects on the metabolic activity of Elliptio complanata measured by calorespirometry.</a> Comparative Biochemistry and Physiology - Part C: Pharmacology, Toxicology and Endocrinology. 118, 159-164 (1997).</li>
<li>Wadso, L., Hansen, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calorespirometry+of+terrestrial+organisms+and+ecosystems%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Calorespirometry of terrestrial organisms and ecosystems.</a> Methods. 76, 11-19 (2015).</li>
<li>Gnaiger, E. Animal energetics at very low oxygen: information from calorimetry and respirometry. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGnaiger%2C+E+%22Strategies+for+Gas+Exchange+and+Metabolism%22">Strategies for Gas Exchange and Metabolism</a>. Woakes, A. J., Grieshaber, M. K., Bridges, C. R. , Cambridge University Press. London. 149-171 (1991).</li>
<li>Barros, N., Hansen, L. D., Pineiro, V., Perez-Cruzado, C., Villanueva, M., Proupin, J., Rodriguez-Anon, J. A. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0038071715003661">Factors influencing the calorespirometric ratios of soil microbial metabolism.</a> Soil Biology and Biochemistry. 92, 221-229 (2016).</li>
<li>Menze, M. A., Chakraborty, N., Clavenna, M., Banerjee, M., Liu, X. H., Toner, M., Hand, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+preconditioning+of+cells+with+AICAR-riboside%3A+improved+cryopreservation+and+cell-type+specific+impacts+on+energetics+and+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Metabolic preconditioning of cells with AICAR-riboside: improved cryopreservation and cell-type specific impacts on energetics and proliferation.</a> Cryobiology. 61, 79-88 (2010).</li>
<li>Webb, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWebb%2C+P+%22Human+Calorimetry%22">Human Calorimetry</a>. , ABC-CLIO, LCC. Santa Barbara, CA. In Volume 7 of Endocrinology and Metabolism Series (1985).</li>
<li>Neven, L. G., Lehrman, N. J., Hansen, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+temperature+and+modified+atmospheres+on+diapausing+5th+instar+codling+moth+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thermal+Biology%22%5BJournal%5D)">Effects of temperature and modified atmospheres on diapausing 5th instar codling moth metabolism.</a> Journal of Thermal Biology. 42, 9-14 (2014).</li>
<li>Brueckner, D., Solokhina, A., Krahenbuhl, S., Braissant, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combined+application+of+tunable+diode+laser+absorption+spectroscopy+and+isothermal+micro-calorimetry+for+calorespirometric+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">A combined application of tunable diode laser absorption spectroscopy and isothermal micro-calorimetry for calorespirometric analysis.</a> Journal of Microbiological Methods. 139, 210-214 (2017).</li>
<li>Hasan, S. M. K., Manzocco, L., Morozova, K., Nicoli, M. C., Scampicchio, M. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0040603117300187">Effects of ascorbic acid and light on reactions in fresh-cut apples by microcalorimetry.</a> Thermochimica Acta. 649, 63-68 (2017).</li>
<li>Criddle, R. S., Fontana, A. J., Rank, D. R., Paige, D., Hansen, L. D., Breidenbach, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+measurement+of+metabolic+heat+rate%2C+CO2+production%2C+and+O2+consumption+by+microcalorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Simultaneous measurement of metabolic heat rate, CO2 production, and O2 consumption by microcalorimetry.</a> Analytical Biochemistry. 194, 413-417 (1991).</li>
<li>Criddle, R. S., Breidenbach, R. W., Rank, D. R., Hopkin, M. S., Hansen, L. D. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/004060319080576K">Simultaneous calorimetric and respirometric measurements on plant-tissues.</a> Thermochimica Acta. 172, 213-221 (1990).</li>
<li>Pesta, D., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+respirometry%3A+OXPHOS+protocols+for+human+cells+and+permeabilized+fibers+from+small+biopsies+of+human+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle.</a> Methods in Molecular Biology. 810, 25-58 (2012).</li>
<li>Grimm, D., Altamirano, L., Paudel, S., Welker, L., Konkle, M. E., Chakraborty, N., Menze, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+cellular+energetics+by+galactose+and+pioglitazone%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Modulation of cellular energetics by galactose and pioglitazone.</a> Cell and Tissue Research. , (2017).</li>
<li>Hansen, L. D., Macfarlane, C., McKinnon, N., Smith, B. N., Criddle, R. S. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0040603104003697">Use of calorespirometric ratios, heat per CO2 and heat per O2, to quantify metabolic paths and energetics of growing cells.</a> Thermochimica Acta. 422, 55-61 (2004).</li>
<li>Chinet, A., Clausen, T., Girardier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcalorimetric+determination+of+energy+expenditure+due+to+active+sodium-potassium+transport+in+the+soleus+muscle+and+brown+adipose+tissue+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Microcalorimetric determination of energy expenditure due to active sodium-potassium transport in the soleus muscle and brown adipose tissue of the rat.</a> The Journal of Physiology. 265, 43-61 (1977).</li>
<li>Paul, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+and+biochemical+energy+balance+during+an+isometric+tetanus+and+steady+state+recovery+in+frog+sartorius+at+0+degree+C%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Physical and biochemical energy balance during an isometric tetanus and steady state recovery in frog sartorius at 0 degree C.</a> Journal of General Physiology. 81, 337-354 (1983).</li>
<li>Warburg, O. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/13298683">On the origin of cancer cells.</a> Science. 123, 309-314 (1956).</li>
<li>Kemp, R. B. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/004060319080559H">Importance of the calorimetric-respirometric ratio in studying intermediary metabolism of cultured mammalian cells.</a> Thermochimica Acta. 172, 61-73 (1990).</li>
<li>Kola, I., Landis, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15286737">Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates?</a> Nature Reviews Drug Discovery. 3, 711-715 (2004).</li>
<li>Kamalian, L., Chadwick, A. E., Bayliss, M., French, N. S., Monshouwer, M., Snoeys, J., Park, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+utility+of+HepG2+cells+to+identify+direct+mitochondrial+dysfunction+in+the+absence+of+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+in+Vitro%22%5BJournal%5D)">The utility of HepG2 cells to identify direct mitochondrial dysfunction in the absence of cell death.</a> Toxicology in Vitro. 29, 732-740 (2015).</li>
<li>Rossignol, R., Gilkerson, R., Aggeler, R., Yamagata, K., Remington, S. J., Capaldi, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+substrate+modulates+mitochondrial+structure+and+oxidative+capacity+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Energy substrate modulates mitochondrial structure and oxidative capacity in cancer cells.</a> Cancer Research. 64, 985-993 (2004).</li>
<li>Fontana, A. J., Hansen, L. D., Breidenbach, R. W., Criddle, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcalorimetric+measurement+of+aerobic+cell-metabolism+in+unstirred+cell-cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Thermochimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Microcalorimetric measurement of aerobic cell-metabolism in unstirred cell-cultures.</a> Thermochimica Acta. 172, 105-113 (1990).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Celem kalorespirometrii jest ilościowa ocena udziału szlaków tlenowych i beztlenowych w aktywności metabolicznej oraz uzyskanie złożonego obrazu strumienia energii komórkowej. Osiąga się to poprzez jednoczesny pomiar rozpraszania ciepła i strumienia tlenu, a następnie porównanie obliczonego stosunku CR z teoretycznym ekwiwalentem tlenkowym. Aby uzyskać powtarzalne i wiarygodne dane, należy wziąć pod uwagę kilka kluczowych etapów. Utrzymanie sterylnej, zdrowej hodowli komórkowej ma kluczowe znaczenie. Zanieczyszczenie bak...

W systemach biologicznych, wydzielanie ciepła lub zmiana entalpii podczas metabolizmu jest zazwyczaj monitorowana bezpośrednio (za pomocą bezpośredniej kalorymetrii) lub pośrednio poprzez zużycieO2 i/lub produkcję CO2 (za pomocą respirometrii). Niestety, gdy techniki te są stosowane w izolacji, tracone są krytyczne informacje, takie jak udział szlaków beztlenowych w metabolizmie komórkowym. Kalorespirometria to potężna technika, która opiera się na jednoczesnym pomiarze zarówno rozpraszania ciepła, jak i oddychania. Pionierskie prace kalorespirometryczne pozwoliły na zbadanie metabolizmu beztlenowego w pełni natlenionych komórkach ssaków i wykazały jednoczesny udział szlaków tlenowych i beztlenowych w homeostazie energetycznej, mimo że transformowane komórki znajdowały się w środowisku w pełni natlenionym1. Od tego czasu kalorespirometria jest stosowana w wielu różnych kwestiach biologicznych. Niektóre przykłady obejmują badanie energetyki zwierzęcej przy niskich poziomach tlenu, wpływ zarówno herbicydu, jak i estrogenu na skrzela małży, metabolizm organizmów lądowych oraz mikrobiologiczny rozkład organicznej materii glebowej 2,3,4,5,6. Co więcej, kalorespirometria ujawniła, w jaki sposób wstępne kondycjonowanie metaboliczne przed zamrożeniem poprawia kriokonserwację komórek ssaków7. Każde podejście, zarówno kalorymetria, jak i respirometria, niezależnie od siebie poszerzyło naszą wiedzę na temat bioenergetyki komórkowej i organizmów. Jednak podstawowe pytania biologiczne, na które można odpowiedzieć za pomocą kalorespirometrii, pozostają stosunkowo niezbadane.
Prawo Hessa mówi, że całkowita zmiana entalpii reakcji jest niezależna od ścieżki między stanem początkowym a końcowym. Na przykład całkowita zmiana entalpii dla szlaku biochemicznego jest sumą zmiany entalpii wszystkich reakcji w szlaku. Kalorymetria oferuje podejście w czasie rzeczywistym do pomiaru produkcji ciepła w komórkach, które bezkrytycznie wykrywa zarówno ścieżki tlenowe, jak i beztlenowe. Opiera się to na założeniu, że w systemie nie jest wymieniana żadna energia, z wyjątkiem ścianek eksperymentalnego ampule8. Zmiana rozpraszania ciepła jest równa zmianie entalpii uwalnianej ze wszystkich reakcji metabolicznych w ampułce. Zatem ujemna entalpia koreluje z utratą ciepła z układu. Wyczerpujące badania przeprowadzone w ciągu ostatnich czterech dekad scharakteryzowały termodynamiczny krajobraz zarówno katabolizmu, jak i anabolizmu. Jest to reprezentowane przez stały wzrost liczby artykułów naukowych znajdujących się pod hasłami "biologiczny" i "kalorymetria", indeksowanych przez Narodową Bibliotekę Medyczną Stanów Zjednoczonych (NLM) w Narodowym Instytucie Zdrowia (PubMed). Z badań wynika, że przed 1970 r. w sumie 27 publikacji odnosiło się do kalorymetrii biologicznej; Tymczasem tylko w 2016 roku technikę tę wykorzystano w 546 publikacjach.
Metody kalorymetryczne są dobrze znane do określania produkcji ciepła. Przyznano jednak większą elastyczność w określaniu wartości respirometrycznej. Pomiar respirometryczny może składać się zO2, CO2 lub zarównoO2, jak i CO2 . Co więcej, pomiarO2 lub CO2 można wykonać za pomocą różnych technik, w tym optrod, elektrod typu Clark i spektroskopii absorpcyjnej przestrajalnego lasera diodowego7,9,10,11. Podczas gdy produkcja CO2 jest cennym wskaźnikiem w wielu badaniach respirometrycznych, pożywka dla hodowanych komórek często wykorzystuje system wodorowęglanowych do kontroli pH12,13. Aby uniknąć komplikacji związanych z pomiarem CO2 w układzie wodorowęglanowym, poniższy protokół kalorespirometrii komórek w hodowli wykorzystuje O2 jako jedyny parametr respirometryczny.
Równolegle z pomiarem strumienia tlenu, niektóre respirometry (patrz Tabela Materiałów) są przeznaczone do szczegółowej oceny funkcji mitochondriów. Protokoły miareczkowania substrat-rozprzęgacz-inhibitor (SUIT) są dobrze znane i są kompatybilne z eksperymentami zaprojektowanymi do pomiaru potencjału błonowego lub tworzenia reaktywnych form tlenu (ROS)14. Przedstawiony protokół kalorespirometrii nienaruszonych komórek jest zgodny z wprowadzeniem chemicznych rozprzęgaczy, takich jak cyjanek karbonylu-p-trifluorometoksyfenylohydrazon (FCCP) i inhibitor syntazy F0F1-ATP oligomycyna. Dzięki dodaniu FCCP zużycie tlenu może być oddzielone od produkcji ATP, co jest przydatne do oceny wpływu potencjalnych terapii na wydajność mitochondriów15. Ponadto dodatek oligomycyny rzuca światło na zakres oddychania nieszczelnego. W związku z tym pomiary respirometryczne wykonywane podczas kalorespirometrii są zgodne z obszernymi protokołami mającymi na celu dalsze wyjaśnienie fizjologii mitochondriów.
Jednoczesny pomiar zarówno rozpraszania ciepła, jak i strumienia tlenu pozwala na obliczenie współczynnika kalorespirometrycznego (CR). Stosunek ten jest następnie porównywany ze stałą Thorntona lub teoretycznym ekwiwalentem tlenokalorycznym, który waha się od -430 do -480 kJ mol-1 w zależności od interesującej linii komórkowej lub tkanki oraz uzupełnionych substratów węglowych1,16. W związku z tym bardziej ujemny współczynnik CR ujawnia zwiększony wkład szlaków beztlenowych w ogólną aktywność metaboliczną. Na przykład współczynnik CR dla rutynowego oddychania tkanki mięśniowej bez aktywnego wykonywania pracy waha się od -448 do -468 kJ mol-1, co mieści się w zakresie teoretycznego ekwiwalentu tlekalorycznego17,18. Tymczasem komórki rakowe ssaków hodowane w pożywce o wysokiej zawartości glukozy wykazują zwiększoną fermentację kwasu mlekowego po glikolizie i stosunkowo niskie zaangażowanie mitochondriów19. Ten fenotyp skutkuje współczynnikami CR w zakresie od -490 do -800 kJ mol-1, wykazując zwiększony udział szlaków beztlenowych w metabolizmie komórkowym, na co wskazuje więcej ujemnych wskaźników CR1,7,16,20.
Zarówno komercyjni, jak i non-profit dystrybutorzy komórek i tkanek oferują obecnie linie komórkowe z ponad 150 gatunków, z czego prawie 4 000 linii komórkowych pochodzi od ludzi. Unieśmiertelnione linie komórkowe są wygodnymi narzędziami do szybkiej oceny toksyczności potencjalnych terapii, z których wiele może bezpośrednio lub pośrednio zakłócać funkcje mitochondriów. Wykorzystanie transformowanych komórek podczas badań przesiewowych leków może mieć ograniczoną wartość predykcyjną, częściowo ze względu na efekt Warburga, który jest cechą charakterystyczną wielu nowotworów. Często nowotwory generują ATP z fosforylacji na poziomie substratu i utrzymują równowagę redoks poprzez produkcję mleczanu bez pełnego angażowania mitochondrium w warunkach tlenowych19. Rozwój farmaceutyczny jest notorycznie kosztowny i nieefektywny, a około 8 z 9 związków testowanych w badaniach klinicznych na ludziach nie uzyskało zatwierdzenia przez rynek21. Podczas gdy potencjalne terapie mogą przejść wstępne badania przesiewowe ze względu na niską cytotoksyczność w liniach komórkowych, możliwe jest, że niektóre z tych związków są mitotoksyczne. Bez odpowiedniej metody wykrywania, w jaki sposób toksyny te mogą upośledzać równowagę energetyczną w komórkach pierwotnych, które nie wykazują efektu Warburga, krytyczne informacje są często pomijane, co utrudnia rozwój terapii we wczesnych stadiach.
Kalorespirometria to praktyczne, nieinwazyjne podejście do analizy aktywności metabolicznej w różnych próbkach biologicznych, w tym w komórkach i tkankach. Rdzeń prezentowanego protokołu jest kompatybilny z szeregiem aplikacji. Zidentyfikowano jednak jedną komplikację. Unieśmiertelnione komórki są często hodowane w pożywce wolnej od glukozy uzupełnionej galaktozą w celu zwiększenia udziału fosforylacji oksydacyjnej (OXPHOS) w produkcji energii, w celu uwrażliwienia komórek na potencjalne mitotoksyny22,23. To metaboliczne przeprogramowanie wydaje się zaciemniać analizę, gdy próbki są umieszczane w ampułkach ze stali nierdzewnej używanych przez kalorymetr15. Komórki hodowane w pożywce glukozowej kontynuują wysoką aktywność metaboliczną przez kilka godzin. Tymczasem komórki hodowane w pożywce galaktozy zmniejszają produkcję ciepła w ciągu 30 minut od umieszczenia w ampułce, co sprawia, że pomiary są ograniczone do wczesnych eksperymentalnych punktów czasowych. Takie zachowanie niestety utrudnia ocenę ich proliferacji komórkowej. Pomimo tego specyficznego ograniczenia, większość aplikacji jest kompatybilna z analizą kalorespirometryczną i dzięki temu podejściu można uzyskać szczegółowe informacje metaboliczne.

<table><tbody><tr><td>Komórki HepG2</td><td>Kolekcja kultur typu amerykańskiego</td><td>HB-8065</td><td>Komórki używane do kalorespirometrii</td></tr><tr><td>O2k-Respirometr</td><td>Oroboros Instruments</td><td>10022-02</td><td>Respirometr</td></tr><tr><td>LKB 2277 monitor aktywności termicznej (TAM)</td><td>Termometryczny AB</td><td></td><td>Thermometric został zakupiony przez TA Instruments</td></tr><tr><td>Pirogronian sodu (100 mM)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11360070</td><td>100x roztwór dodany do pożywki DMEM</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca - Premiuim Select</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td>Dodany do 10% w pożywce DMEM</td></tr><tr><td>Trypsn-EDTA (0,25%)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>25200072</td><td>Odczynnik do dysocjacji komórek</td></tr><tr><td>Oligomycyna z Streptomyces diastatochromogenes</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>O4876</td><td>Inhibitor mitochondriów</td></tr><tr><td>4-(trifluorometoksy)fenylohydrazon cyjanku karbonylu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2920</td><td>Rozsprzęgacz mitochondrialny</td></tr><tr><td>Corning 100 mm Naczynie hodowlane TC</td><td>Corning Corporation</td><td>430167</td><td>Naczynie do hodowli tkankowych</td></tr><tr><td>Glukoza, proszek</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15023021</td><td>Glukoza dla podłoża DMEM</td></tr><tr><td>Galaktoza, proszek</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP656500</td><td>Galaktoza do pożywki DMEM</td></tr><tr><td>L-Glutamina (200 mM)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>25030081</td><td>Glutamina do podłoża</td></tr><tr><td>DMEM DMEM, bez glukozy</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11966025</td><td>Pożywka do hodowli komórkowych</td></tr></tbody></table>

kalorespirometria: potężne, nieinwazyjne podejście do badania metabolizmu energii komórkowej

Calorespirometry: A Powerful, Noninvasive Approach to Investigate Cellular Energy Metabolism

Wiele linii komórkowych wykorzystywanych w podstawowych badaniach biologicznych i biomedycznych utrzymuje homeostazę energetyczną poprzez połączenie oddychania tlenowego i beztlenowego. Jednak stopień, w jakim obie ścieżki przyczyniają się do krajobrazu produkcji energii komórkowej, jest konsekwentnie pomijany. Transformowane komórki hodowane w nasyconych poziomach glukozy często wykazują zmniejszoną zależność od fosforylacji oksydacyjnej w produkcji ATP, która jest kompensowana przez wzrost fosforylacji na poziomie substratu. Ta zmiana w równozie metabolicznej pozwala komórkom na proliferację pomimo obecności toksyn mitochondrialnych. Zaniedbując zmienioną równowagę metaboliczną transformowanych komórek, wyniki farmaceutycznych badań przesiewowych mogą być błędnie interpretowane, ponieważ potencjalnie mitotoksyczne skutki mogą nie być wykryte przy użyciu modelowych linii komórkowych hodowanych w obecności wysokich stężeń glukozy. Protokół ten opisuje połączenie dwóch potężnych technik, respirometrii i kalorymetrii, co pozwala na ilościową i nieinwazyjną ocenę zarówno tlenowego, jak i beztlenowego wkładu w komórkową produkcję ATP. Zarówno oddychanie tlenowe, jak i beztlenowe wytwarza ciepło, które można monitorować za pomocą kalorymetrii. Tymczasem pomiar szybkości zużycia tlenu może ocenić zakres oddychania tlenowego. Gdy zarówno rozpraszanie ciepła, jak i zużycie tlenu są mierzone jednocześnie, można określić stosunek kalorezypirometryczny. Uzyskaną doświadczalnie wartość można następnie porównać z teoretycznym równoważnikiem tlenokalorycznym i ocenić zakres oddychania beztlenowego. W związku z tym kalorespirometria zapewnia unikalną metodę analizy szerokiego zakresu zagadnień biologicznych, w tym opracowywania leków, wzrostu drobnoustrojów i podstawowej bioenergetyki zarówno w warunkach normoksyjnych, jak i niedotlenionych.

Powtarzalność pomiarów kalorespirometrycznych zależy od prawidłowego i spójnego przygotowania próbek. Próbek przygotowanych z hodowli komórkowych nie należy stosować, jeśli płytki są przerośnięte, ponieważ z powodu agregacji komórek odczyty liczby komórek mogą być niedokładne. Ponadto może dojść do zmniejszenia przepływu ciepła w wyniku ograniczonej dyfuzji substratów w skupiskach komórek. Dlatego przy stosowaniu komórek adherentnych kluczowe jest wybranie płytki o stopniu konfluencji między 60 - 80% oraz wymiana medium ...

Ten protokół opisuje kalorespirometrię, bezpośredni i jednoczesny pomiar zarówno rozpraszania ciepła, jak i oddychania, co zapewnia nieinwazyjne podejście do oceny metabolizmu energetycznego. Technika ta służy do oceny udziału ścieżek tlenowych i beztlenowych w wykorzystaniu energii poprzez monitorowanie całkowitego przepływu energii komórkowej.

Kalorespirometria: potężne, nieinwazyjne podejście do badania metabolizmu energii komórkowej

Many cell lines used in basic biological and biomedical research maintain energy homeostasis through a combination of both aerobic and anaerobic ...

Ogólnym celem tej procedury jest analiza aktywności metabolicznej próbki biologicznej i określenie zakresu, w jakim szlaki beztlenowe przyczyniają się do produkcji energii komórkowej w próbce. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie farmacji dotyczące zakresu toksyczności mitochondrialnej podczas opracowywania leków. Główną zaletą tej techniki jest to, że ułatwia ona jednoczesny pomiar zużycia tlenu i produkcji ciepła w badanej próbce ogniwa.Tak więc metoda ta może zapewnić wgląd w planowanie leczenia podczas opracowywania farmaceutyków. Można go również zastosować w innych dziedzinach, takich jak cyrobiologia, w której można ocenić wpływ wstępnego kondycjonowania metabolicznego na kriokonserwację. Aby przygotować respirometr, najpierw dodaj dwa mililitry DMEM do każdej komory respirometru i całkowicie włóż korki.Wyreguluj korki za pomocą narzędzia do przekładki korka, aby umożliwić optymalną dyfuzję tlenu do pożywki, i ustaw komory tak, aby w sposób ciągły mieszały próbki z prędkością 750 obr./min w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż stężenie tlenu i strumień tlenu ustabilizują się. Upewnij się, że oprogramowanie respirometru jest zaprogramowane tak, a

calorespirometry-powerful-noninvasive-approach-to-investigate

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Przedstawiono opis metody profilowania funkcji mitochondriów w komórkach. Wygenerowany profil mitochondrialny dostarcza czterech parametrów funkcji mitochondriów, które można zmierzyć w jednym eksperymentcie: podstawowego tempa oddychania, oddychania związanego z syntezą ATP, przecieku protonów oraz wydolności rezerwowej.

Eksperyment profilu bioenergetycznego z wykorzystaniem komórek mioblastów C2C12

Przedstawione metody dostarczają instrukcji krok po kroku do wykonania zbioru testów respirometrycznych opartych na mikropłytkach przy użyciu izolowanych mitochondriów z minimalnych ilości mięśni szkieletowych myszy. Testy te są w stanie zmierzyć mechanistyczne zmiany/adaptacje w mitochondrialnym zużyciu tlenu w powszechnie używanym modelu zwierzęcym.

Wykorzystanie izolowanych mitochondriów z minimalnych ilości mięśni szkieletowych myszy do wysokoprzepustowych pomiarów oddechowych na mikropłytkach

Wysokiej rozdzielczości respirometria służy do określania zużycia tlenu w mitochondriach. Jest to prosta technika określania częstości oddechów mitochondrialnych kompleksów łańcucha oddechowego (I-IV), maksymalnej pojemności mitochondrialnego systemu transportu elektronów i integralności mitochondrialnej błony zewnętrznej.

Respirometria o wysokiej rozdzielczości do oceny funkcji mitochondriów w przepuszczalnych i nienaruszonych komórkach

Celem tego protokołu jest zmierzenie wpływu zmian w oddychaniu mitochondrialnym za pośrednictwem glukozy w obecności naturalnych związków na nienaruszone komórki beta 832/13 za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości.

Respirometria o wysokiej rozdzielczości do pomiaru funkcji mitochondriów nienaruszonych komórek beta w obecności naturalnych związków

Ocena fosforylacji oksydacyjnej za pomocą respirometrów o wysokiej rozdzielczości stała się integralną częścią analizy funkcjonalnej mitochondriów i metabolizmu energii komórkowej. W tym miejscu przedstawiamy protokoły analizy metabolizmu energii komórkowej za pomocą respirometrów komorowych i mikropłytkowych o wysokiej rozdzielczości oraz omawiamy kluczowe zalety każdego urządzenia.

Respirometria o wysokiej rozdzielczości do oceny bioenergetyki w komórkach i tkankach za pomocą respirometrów komorowych i płytkowych

Status metaboliczny ludzkich komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (H-RPE) odzwierciedla ich zdrowie i funkcję. Przedstawiono zoptymalizowany protokół badania strumienia metabolicznego H-RPE w czasie rzeczywistym za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości.

Analiza bioenergetyki w czasie rzeczywistym w pierwotnych komórkach nabłonka barwnikowego ludzkiej siatkówki przy użyciu respirometrii o wysokiej rozdzielczości

Tutaj opisujemy kompleksową metodę pomiaru mitochondrialnej fosforylacji oksydacyjnej w świeżych, przepuszczalnych włóknach mięśni szkieletowych z mięśni ludzkich lub myszy. Metoda ta pozwala na ilościowe określenie oddychania mitochondriów w czasie rzeczywistym oraz ocenę preferencji paliwowych i elastyczności metabolicznej przy jednoczesnym zachowaniu istniejących sieci mitochondrialnych i integralności błony.

Pomiar oddychania mitochondrialnego we włóknach mięśni szkieletowych ludzi i myszy za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości

Nadużywanie alkoholu osłabia odporność makrofagów pęcherzykowych (AM) z powodu stłumionego oddychania mitochondrialnego i bioenergetyki. Niedawno wykazaliśmy, że ekspozycja na etanol (EtOH) zwiększa zależność od glutaminy w oddychaniu mitochondrialnym u AM. W niniejszym artykule przedstawiono metody określania zastosowania glutaminy do oddychania mitochondrialnego w AM traktowanych EtOH przy użyciu bioanalizatora strumienia zewnątrzkomórkowego.

Ocena glutaminy jako źródła paliwa dla makrofagów pęcherzykowych narażonych na przewlekłe działanie etanolu przy użyciu bioanalizatora strumienia zewnątrzkomórkowego

Prezentujemy nieinwazyjną, czasu rzeczywistego metodę monitorowania zdrowia mitochondriów za pomocą Spektroskopi Rezonansowo-Ramanowskiej (RRS). Wykorzystaliśmy RRS do ilościowego określania stanów redoks mitochondriów i opracowaliśmy wskaźnik zdrowia mitochondriów, Redukowany Rezonansowo-Ramanowski Wskaźnik Mitochondriów (3RMR), który wykazuje szybszą reakcję na zmiany w tlenowania niż tradycyjne analityki gazów we krwi.

W czasie rzeczywistym, nieinwazyjna ocena funkcji mitochondrialnych za pomocą spektroskopii rezonansowego rozpraszania Ramana

W niniejszym raporcie opisujemy trójwymiarowy model rekonstrukcji skóry, który naśladuje architekturę i skład ludzkiej skóry. Wykorzystując model rekonstrukcji skóry, badano fizjologię melanocytów, progresję czerniaka oraz losy dermalnych komórek macierzystych. Model ten jest również przydatny jako narzędzie przedkliniczne do oceny leków.

Trójwymiarowy model rekonstrukcji ludzkiej skóry: narzędzie do badania normalnej skóry i progresji czerniaka

Poznaj kalorespirometrię, nieinwazyjną metodę badania metabolizmu komórkowego poprzez jednoczesny pomiar zużycia tlenu i produkcji ciepła. Technika ta umożliwia ocenę toksyczności mitochondrialnej w rozwoju leków.

Kalorespirometria: potężne, nieinwazyjne podejście do badania metabolizmu energii komórkowej

Przeglądaj więcej filmów