Test oparty na cytometrii przepływowej do pomiaru potencjału błony mitochondrialnej w miocytach serca po niedotlenieniu/reoksygenacji
13 lipca 2018
Tutaj prezentujemy protokół, który wykorzystuje barwnik JC-1 do oceny potencjału błony mitochondrialnej komórek po wystawieniu na hipoksję/reoksygenację z lub bez środka ochronnego.
Metoda ta może pomóc w zmierzeniu wpływu niedotlenienia/reoksygenacji na komórki w potencjale błony mitochondrialnej i może być wykorzystana do oceny, czy środek chroni przed urazem. Główną zaletą tego testu jest to, że wykrywany przez niego MMP jest w przypadku takich czynników jak wielkość mitochondriów. Dodatkowo ma niskie wymagania dotyczące materiałów i blasku.
Zacznij od 70% zlewających się ludzkich miocytów serca na sześciodołkowej płytce. Po umyciu komórek solą fizjologiczną z buforem fosforanowym, dodać lek lub nośnik w dwóch mililitrach surowicy i DMEM bez glukozy. Inkubować w inkubatorze do hodowli komórkowych zawierającym 5% CO2 i 95% powietrza w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut przed hipoksją.
Po 30 minutach umieść naczynie z ludzkimi miocytami serca w 2,5-litrowym, hermetycznym słoiku bezhipoksyjnym. Wyposażony w katalizator do wychwytywania wolnego tlenu oraz wskaźnik beztlenowy do pomiaru ciśnienia tlenu w medium. Umieść słoik w inkubatorze do hodowli tkankowych.
Kolor wskaźnika beztlenowego zmienia się z jasnoniebieskiego w środowisku normoksyjnym na bladobiały w warunkach niedotlenienia. Dotlenij ludzkie miocyty sercowe, wyjmując sześciodołkową płytkę ze słoika i umieszczając ją na półce inkubatora na dwie godziny. Po ponownym natlenieniu przepłucz komórki jednym mililitrem wstępnie podgrzanego PBS i dodaj 0,5 mililitra wstępnie podgrzanej 25% trypsyny wzdłuż ściany studzienki.
Inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez około minutę, aż wszystkie ludzkie miocyty serca zostaną prawie oderwane. Następnie dodaj jeden mililitr kompletnej pożywki DMEM do studzienek, aby zneutralizować trypsynę. Przenieś zawiesinę komórek do 15-mililitrowej probówki wirówkowej i osadź HCM, wirując przy 500 razy G przez trzy minuty w temperaturze pokojowej.
Po odwirowaniu ostrożnie zassać supernatant, nie naruszając osadów. Następnie dodaj 5 mililitrów kompletnej pożywki dla ludzkich miocytów serca i 5 mililitrów roztworu roboczego JC-1 do każdej probówki. Ponownie zawiesić HCM, pipetując w górę i w dół.
Przykryj probówki folią aluminiową, aby zapobiec bieleniu wskaźnika fluorescencyjnego i inkubuj komórki w normalnych warunkach przez 20 minut. Po zagnieżdżeniu ludzkich miocytów sercowych przez wirowanie w temperaturze 500 razy G przez trzy minuty w wirówce wstępnie schłodzonej do czterech stopni Celsjusza, dwukrotnie przepłucz komórki dwoma mililitrami lodowatego buforu barwiącego JC-1. Po drugim płukaniu ponownie zawieś ludzkie miocyty serca w 300 mikrolitrach lodowatego buforu barwiącego.
I przefiltrować próbki do odpowiednich probówek na próbki. Przeanalizuj komórki za pomocą cytometrii przepływowej w ciągu 30 minut. Uruchom cytometr przepływowy i upewnij się, że oprogramowanie jest podłączone.
Wykonaj rozruch hydrauliczny. Rozpocznij transmisję i skonfiguruj przerwę. Otwórz dwa okna wykresu punktowego w oprogramowaniu do cytometrii przepływowej.
Wybierz światło rozproszone do przodu na osi X i światło rozproszone z boku na osi Y na pierwszym wykresie punktowym. Aby przedstawić cechy komórek odpowiednio pod względem ich wielkości i ziarnistości. Wybierz kanał detekcji PE dla osi Y.
I FITC dla osi X, przy użyciu skali logarytmicznej na drugim wykresie punktowym, która służy do pomiaru intensywności kwitnienia barwnika JC-1 w komórkach. Kliknij przycisk rozładuj, aby wypuścić ramię podtrzymujące probówkę i umieść pustą probówkę z próbką zawierającą ludzkie miocyty serca, które nie zostały zabarwione JC-1. Kliknij obciążenie, aby przywrócić ramię podporowe do pozycji roboczej.
Kliknij przycisk nagrywania, aby pobrać cząstki z zawiesiny w probówce z pustą próbką. I dostosuj napięcia kanałów fluorescencyjnych na drugim wykresie punktowym. Bramka populacji komórek do dalszej analizy na pierwszym wykresie kropkowym.
Następnie przeanalizuj ludzkie miocyty serca. Wyświetlić dane statystyczne każdej probówki z próbką i obliczyć MMP każdej próbki, dzieląc stosunek intensywności czerwonej fluorescencji przez intensywność zielonej fluorescencji. Niedotlenienie i reoksygenacja znacząco indukują apoptozę ludzkich miocytów serca w porównaniu z normalnymi komórkami mierzonymi stosunkiem PI aneksyny.
Tradycyjna chińska medycyna o działaniu kardioprotkowym, zapobiegała apoptozie HCM po niedotlenieniu/dotlenieniu. Jak pokazano tutaj, stosunek czerwonego / zielonego JC-1 po leczeniu mitochondrialnym CCP wynosił prawie zero. Zgodne z wynikami testu apoptozy.
Grupa leczona H/R wykazywała znacznie niższy stosunek koloru czerwonego do zielonego w porównaniu z grupą normalną. I odwrócił tę zmianę proporcji. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby uruchomić komórki załadowane JC-1 w lodowatym buforze stojącym, ponieważ temperatura ma znaczący wpływ na stabilność potencjału błony mitochondrialnej.
Zgodnie z tą procedurą można wykonać inne metody, takie jak manipulacja genetyczna, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, czy spadek MMP wynika z otwarcia MPTP.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten protokół wykorzystuje barwnik JC-1 do oceny potencjału błony mitochondrialnej (MMP) komórek poddanych hipoksji/reoksygenacji. Ocenia również efekty ochronne środków przeciwko uszkodzeniu komórkowemu.
Kluczowe komponenty badania
Obszar nauki
- Biologia komórki
- Funkcja mitochondrialna
- Badania nad hipoksją
Tło
- Potencjał błony mitochondrialnej jest kluczowy dla przetrwania komórek.
- Hipoksja/reoksygenacja może prowadzić do uszkodzenia komórkowego.
- Środki ochronne mogą łagodzić te efekty.
- Barwnik JC-1 jest wiarygodnym wskaźnikiem zmian MMP.
Cel badania
- Zmierzyć wpływ hipoksji/reoksygenacji na MMP.
- Ocenić efekty ochronne określonych środków.
- Zapewnienie prostego testu z niewielkimi materiałami do oceny MMP.
Zastosowane metody
- Hodowla ludzkich miocytów sercowych do 70% konfluencji.
- Płukanie komórek buforem fosforanowym.
- Inkubacja z lekiem lub pojazdem w surowicy wolnym DMEM.
- Nawracanie komórek do warunków hipoksji na potrzeby oceny.
Główne wyniki
- Wykazane zmiany w MMP z powodu hipoksji/reoksygenacji.
- Zidentyfikowane efekty ochronne środków na MMP.
- Wykazane niskie wymagania materiałowe dla testu.
- Podkreślenie wpływu wielkości mitochondriów na wykrywanie MMP.
Konkluzje
- Test JC-1 jest skuteczny w ocenie zmian MMP.
- Środki ochronne mogą znacząco wpływać na wyniki MMP.
- Ta metoda jest dostępna i wydajna dla badań komórkowych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Assessing mitochondrial membrane potential (MMP) is critical for evaluating cardioprotective strategies in ischemia-reperfusion injury models. This flow cytometry-based JC-1 assay provides a quantitative, high-throughput readout of mitochondrial depolarization in human cardiac myocytes, enabling mechanistic de-risking of therapeutic candidates targeting reperfusion injury. The method supports target validation by linking MMP changes to mitochondrial permeability transition pore (mPTP) opening, a key event in cardiomyocyte death.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Measures MMP as a functional readout of mitochondrial health and mPTP opening in disease-relevant human cardiac myocytes.
- Operational Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses regarding cytoprotective agents under hypoxia/reoxygenation stress.
- Predictive Value: Supports target confidence by correlating MMP preservation with reduced apoptosis, as demonstrated by Annexin PI ratio.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: JC-1’s red/green fluorescence ratio provides a ratiometric, mitochondria-specific readout independent of cell size or granularity.
- Operational Value: Low material requirements and compatibility with standard flow cytometry platforms support assay scalability and reproducibility.
- Screening Readiness: Enables rapid evaluation of compound libraries for effects on MMP in a physiologically relevant human cell model.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Uses human cardiac myocytes to enhance translational relevance over rodent models in ischemia-reperfusion studies.
- Operational Value: Standardized hypoxia/reoxygenation protocol allows consistent induction of mitochondrial depolarization for compound testing.
- Predictive Value: Facilitates go/no-go decisions by linking MMP protection to functional outcomes like reduced apoptosis.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the early discovery continuum, supporting target validation and lead identification by providing mechanistic insights into mitochondrial dysfunction in cardiovascular disease models.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of MMP as a biomarker of mPTP activation and reperfusion injury severity.
- Screening: Delivers quantitative, normalized fluorescence ratio data suitable for hit selection and dose-response profiling.
- Analytics: Generates red/green intensity ratio metrics that allow statistical comparison across treatment groups.
- Translational Research: Uses human-derived cells to improve predictive confidence for preclinical advancement.
- Enterprise Reuse: Protocol can be adapted across cardiotoxicity and cardioprotection screening campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic insight into mitochondrial depolarization as a convergent point of reperfusion injury pathways.
- Operational Value: Minimizes variability by normalizing MMP readout to mitochondrial content via ratiometric JC-1 detection.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early identification of compounds that preserve MMP and reduce apoptotic commitment.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of candidates demonstrating MMP stabilization in human cardiac myocytes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary human cardiac myocyte culture and hypoxia/reoxygenation modeling.
- Dependent on flow cytometry with FITC and PE detection channels and logarithmic fluorescence scaling.
- Necessitates strict temperature control during JC-1 staining to preserve mitochondrial membrane potential integrity.
- Requires standardization of hypoxia duration and reoxygenation timing across experimental groups.
- Limited to adherent cell types amenable to trypsinization and washing without loss of viability.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:42
Establishment of Hypoxia/Reoxygenation Model
1:57
Preparation of HCMs for Flow Cytometry
3:49
Flow Cytometer Setup
4:43
Flow Cytometry Measurement and Data Analysis
5:40
Results: Validation of the Establishment of Hypoxia/Reoxygenation (H/R) Model by Flow Cytometry
6:34
Conclusion
