Name: Test neurosfery do oceny endogennej aktywacji nerwowych komórek macierzystych w mysim modelu minimalnego uszkodzenia rdzenia kręgowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Poznaj test neurosfery do oceny aktywacji endogennych komórek macierzystych w mysim modelu minimalnego uszkodzenia rdzenia kręgowego. Ta metoda pozwala badać dynamikę komórek nerwowych po urazie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest finansowana przez Fundację Krembil (grant operacyjny CMM). WX został laureatem nagrody studenckiej Carlton Marguerite Smith. Holandia otrzymała stypendium dla absolwentów Ontario.

Ten protokół został zatwierdzony przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami na Uniwersytecie w Toronto i jest zgodny z "Przewodnikiem po opiece i użytkowaniu zwierząt doświadczalnych" (2. edycja, Kanadyjska Rada ds. Opieki nad Zwierzętami, 2017).
1. Minimalna operacja uszkodzenia rdzenia kręgowego
UWAGA: Przed operacją upewnij się, że wszystkie narzędzia i materiały chirurgiczne są sterylizowane odpowiednimi metodami (Rysunek 1A).
<ol>
	<li>Zbuduj łuk podparcia klatki piersiowej, zwijając 4–5 kwadratów gazy i sklejając je ze sobą na środku, aby uzyskać stałą rolkę gazy.</li>
	<li>Umieść mysz w komorze indukcyjnej i rozpocznij znieczulenie 5% izofluranem. Potwierdź brak odruchu szczypania palców u nóg przed kontynuowaniem, a także przez cały zabieg. Ponieważ operacja może trwać do 30 minut, zoptymalizuj ją pod kątem minimalnej ekspozycji na izofluran (5 minut przy 5%, a pozostały czas przy 2-3%).</li>
	<li>Przenieść mysz do stożka nosowego podłączonego do aparatu znieczulającego w dawce podtrzymującej 2-3% izofluranu. Użyj maszynki do strzyżenia włosów, aby usunąć sierść z grzbietu zwierzęcia od połowy pleców do szyi/uszu, aby odsłonić szeroki prostokątny obszar skóry do operacji.</li>
	<li>Przenieś mysz do instrumentu stereotaktycznego, umieszczając jej nos w dołączonym stożku nosowym i stabilizując czaszkę za pomocą pasków na uszy. Utrzymuj izofluran na poziomie 5% podczas zakładania pasków dousznych i w dolnej części pleców do 2–3%, gdy mysz jest zamocowana w urządzeniu stereotaktycznym.</li>
	<li>Przedoperacyjne leki przeciwbólowe podawać dootrzewnowo — Meloksykam (2,0 mg/kg). Obficie nałóż smarowanie oczu na otwarte oczy myszy, aby zapobiec wysuszeniu rogówki w znieczuleniu.</li>
	<li>Umieść łuk podtrzymujący klatkę piersiową pod brzuchem myszy, jednocześnie prostując ciało i kręgosłup myszy, lekko pociągając za podstawę ogona. Użyj laboratoryjnej taśmy do etykietowania, aby zabezpieczyć ogon i wszystkie wyprostowane kończyny w pozycji przypominającej gwiazdę. Po zabezpieczeniu popchnij podparcie klatki piersiowej w łuk rostralny, od brzucha myszy w kierunku górnej części klatki piersiowej - w celu podparcia kręgosłupa piersiowego (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B).</li>
	<li>Przygotować sterylne pole operacyjne, dezynfekując obszar skóry strzyżony sierścią przygotowany w kroku 1.3 70% etanolem, a następnie jodowidonem. Powtórz dwa razy. Zastosuj sterylną serwetę chirurgiczną, aby utrzymać szerokie sterylne pole.</li>
	<li>Za pomocą ostrza skalpela #10 wykonaj pionowe nacięcie równoległe do osi podłużnej zwierzęcia od środkowego punktu obu łopatek do krzywizny kręgosłupa piersiowego. Cofnij skórę, aby odsłonić tkankę miękką i kontur kręgosłupa (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C).</li>
	<li>Zidentyfikuj dolną granicę poduszeczki tłuszczowej nadłopatkowej (wyznacza ona poziom kręgów T4/5). Tym samym ostrzem #10, ostrożnie, ale z siłą, przetnij wzdłuż obu stron kości kręgowej T5–T8/9, aby odłączyć ścięgna mięśni pleców od kolumny.</li>
	<li>Włóż zęby retraktorów w miejsca nacięć po obu stronach kręgosłupa. Dostosuj ekspozycję, rozszerzając zwijacze, aby wystarczająco unieść kręgosłup bez zbytniego obciążania cofniętych warstw mięśniowych (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D).</li>
	<li>Pod mikroskopem chirurgicznym ostrożnie oczyść resztki mięśni i inne tkanki miękkie pokrywające kręgosłup, aby odsłonić kość kręgową (<silna klasa="xfig">Rysunek 1E). Zidentyfikuj kręgi, które zostaną usunięte, obejmując wyrostek kolczysty kręgów kleszczami zębatymi i przesuwając go lekko w górę iw dół. 
	UWAGA: Powinno to umożliwić identyfikację stawów międzykręgowych i odsłonić małe otwory (otwory międzykręgowe) pod kręgami będącymi przedmiotem zainteresowania.</li>
	<li>Włóż jedną główkę zakrzywionych, nożyczek po obu stronach odsłoniętego otworu międzykręgowego, doogonowo do blaszki kręgowej, która ma zostać wycięta, i obustronnie przetnij łączące stawy międzykręgowe.</li>
	<li>Podnieś blaszkę do góry i odetnij górne przyczepienie blaszki, aby wyizolować i usunąć kość. 
	UWAGA: Spowoduje to odsłonięcie nienaruszonego worka opony twardej zawierającego rdzeń kręgowy (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1F). Może wystąpić nadmierne krwawienie, które można opanować, umieszczając wstępnie przyciętą gazę o wymiarach 1 cm x 1 cm na dotkniętych obszarach i/lub umycie sterylnym PBS.</li>
	<li>Mając żyłę grzbietową linii środkowej służącą jako punkt orientacyjny, włóż zgięty pod kątem 45° trzon końcówki igły 30 G (ze skosem igły skierowanym do góry) w grzbietowo-boczną powierzchnię rdzenia kręgowego (o głębokości około 1 mm) w odległości około 0,5 mm z boku po obu stronach linii środkowej.</li>
	<li>Przesunąć igłę o ~2 mm od ogona do rostralu (równolegle do linii środkowej) tak, aby cała długość skosu igły została włożona w sznurek. Usuń igłę, przesuwając ją ponownie ścieżką wejścia (<silna klasa="xfig">Rysunek 1G). 
	UWAGA: Krwawienie nie powinno wystąpić, ale na tym etapie może być widoczny obrzęk tkanki rdzeniowej.</li>
	<li>Aby zamknąć ranę, zdejmij retraktor i zszyj mięśnie pleców po obu stronach urazu razem w linii środkowej za pomocą szwu wchłanialnego 6-0. Użyj sterylnego jedwabnego szwu 4-0, aby następnie zamknąć leżącą na powierzchni skórę.</li>
	<li>Nałóż maść z antybiotykiem na wierzch powierzchownie zszytej skóry, aby zapobiec infekcji pooperacyjnej za pomocą końcówki bawełnianego wacika. Pooperacyjny lek przeciwbólowy w postaci 0,1 mg/kg buprenorfiny należy podawać podskórnie wraz z płynami (1 ml roztworu Ringera w okresie laktowanym).</li>
	<li>Wyłącz parownik izofluranu i tlen. Wyjmij mysz z urządzenia stereotaktycznego i umieść ją w czystej klatce bez ściółki.</li>
	<li>Umieść mysz w klatce w odległości około 30 cm od lampy grzewczej w celu odzyskania sił po znieczuleniu i monitoruj zachowanie po przebudzeniu. Mysz powinna obudzić się w ciągu 5–10 minut i mieć funkcję kończyn tylnych z możliwym niedowładem i/lub osłabieniem ogona po przebudzeniu.</li>
	<li>Monitoruj zachowanie myszy w ciągu najbliższych kilku dni i zapewnij odpowiednią opiekę pooperacyjną i leki przeciwbólowe (tj. zacier, płyn z mleczanami Ringera podawany podskórnie, 0,1 mg/kg buprenorfiny 2 razy dziennie podskórnie przez 2-3 dni oraz prawidłowe monitorowanie masy ciała) zgodnie z lokalnymi przepisami dotyczącymi zwierząt i indywidualnie, ponieważ powrót do zdrowia może się różnić.</li>
</ol>
2. Analiza testu neurosfery
UWAGA: Postępuj zgodnie z procedurami hodowli tkanek sterylnych przez cały czas.
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworu enzymatycznego
	<ol>
		<li>Dodaj 32 ml Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) do albuminy zawierającej szklaną butelkę inhibitora ovomukoidów i delikatnie wiruj, aż do rozpuszczenia.</li>
		<li>Dodać 5 ml EBSS do porcjowanej szklanej fiolki z papainą i umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C do rozpuszczenia. Rozwiązanie stanie się jasne (Rozwiązanie 1).</li>
		<li>Pobrać 500 μl EBSS i dodać do wstępnie porcjowanej szklanej fiolki z DNazą I, aby uzyskać stężenie 1 mg/ml (roztwór 2). Wymieszać bardzo delikatnie, przechylając fiolkę do przodu i do tyłu, a następnie dodać 250 μl tej mieszaniny do roztworu 1, 
		UWAGA: Wszystkie wykonane roztwory (roztwór 1 i 2) wystarczą do przetworzenia dwóch kawałków tkanki. Jeśli przetwarzasz więcej kawałków tkanki, dostosuj się do bardziej przygotowanego roztworu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie i rozwarstwienie tkanek
	<ol>
		<li>Umieść chusteczkę laboratoryjną nasączoną izofluranem w klatce dla myszy i odczekaj 2-3 minuty, aby opary całkowicie znieczuliły mysz. Po znokautowaniu wyjmij mysz z klatki i potwierdź, że nie ma odruchu szczypania palców.</li>
		<li>Wykonaj zwichnięcie szyjki macicy metalowym przedmiotem (np. metalową kartą klatkową), aby poddać zwierzę eutanazji. Spryskaj uśpione zwierzę od szyi do połowy pleców obficie 70% etanolem.</li>
		<li>U podstawy czaszki użyj nożyczek, aby odciąć głowę i wyrzucić do torby biologicznej. Wykonaj nacięcie w linii środkowej skóry na całej długości pleców, aby odsłonić kontur mięśni i kości kręgów (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A).</li>
		<li>Podnieś przyśrodkową część każdej łopatki (tj. łopatkę - identyfikowaną przez nałożoną poduszeczkę tłuszczową) i użyj nożyczek, aby odciąć tkankę miękką (między łopatkami a kręgami). Całkowicie oddziel, aby odsłonić znajdujący się pod spodem kręgosłup.</li>
		<li>Podążając za krzywizną kręgosłupa, włóż tę samą parę nożyczek do górnego otworu klatki piersiowej i odizoluj kręgosłup, odcinając przyczepione żebra, mięśnie i narządy wewnętrzne (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2B).</li>
		<li>Włóż nożyczki w otwór/otwór kręgów ogonowych i przetnij stawy międzykręgowe po obu stronach blaszek (powierzchnia grzbietowa). Zachowaj szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić nienaruszonego przewodu. Kontynuuj ten proces, aż żądany poziom i/lub długość przewodu zostanie odsłonięty.</li>
		<li>Ostrożnie przeciąć nerw rdzeniowy (nerwy) wystające bocznie z rdzenia kręgowego przed przeniesieniem tkanki rdzenia kręgowego na szalkę Petriego ze zwykłym sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym. Trzymaj próbkę na lodzie (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C).</li>
		<li>Pod mikroskopem preparacyjnym przeciąć tkankę rdzenia kręgowego tak, aby obejmowała ~2 mm rostral i ogon do miejsca urazu. Użyj dwóch par kleszczyków, aby delikatnie rozdzielić sznur na 2 połówki wzdłuż szczelin grzbietowych i brzusznych (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C').</li>
		<li>Za pomocą mikronożyczek wytnij uszkodzoną grzbietowo-boczną istotę białą. Umieść kawałek w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Przytrzymując jedną połowę rdzenia kręgowego kleszczami, drażnij i usuwaj istotę białą za pomocą kolejnej pary cienkich kleszczy wzdłuż rostrocaudalnego zasięgu rdzenia kręgowego, aby wyizolować pożądany obszar okołokomorowy. Powtórz dla drugiej połowy rdzenia kręgowego.</li>
		<li>Umieść kawałki tkanki okołokomorowej w oddzielnych stożkowych probówkach o pojemności 15 ml. Użyj mikronożyczek i delikatnie zmiel tkankę o ścianki stożkowych rurek. 
		UWAGA: Modyfikacje dysocjacji tkanek pochodzą z Protokołu Systemu Dysocjacji Papainy23 i wcześniej opisanych procedur przygotowania tkanek24.</li>
		<li>Dodać 2,5 ml nowego roztworu 1 (krok 2.1.3) do próbki tkanki i umieścić na kołysce w temperaturze 37 °C na 30 minut.</li>
		<li>Delikatnie rozetrzyj tkankę w roztworze za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 000 μl. Odwirować mętną zawiesinę komórkową o sile 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przygotować roztwór 3 z 2,7 ml zbilansowanego roztworu soli Earle'a, 300 μl roztworu inhibitora owomukoidów (krok 2.1.1) i 150 μl roztworu DNazy I (krok 2.1.3).</li>
		<li>Odrzucić supernatant z etapu (etap 2.2.13) i ponownie zawiesić w 1,5 ml roztworu 3 z poprzedniego etapu (etap 2.2.14).</li>
		<li>Nałożyć tę nową zawiesinę komórek (krok 2.2.15) na 5 ml roztworu inhibitora ovoimucoid (krok 2.1.1) w nowej stożkowej probówce o pojemności 15 ml, aby utworzyć nieciągły gradient gęstości. Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić w 2 ml podłoża nerwowo-podstawowego. Wirować przy 300 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić w 1 ml podłoża neurobazalnego. Przefiltrować zawiesinę za pomocą sitka o wielkości 20 μm, a następnie dodać 4 ml pożywki, aby uzyskać całkowitą objętość 5 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Poszycia
	<ol>
		<li>Przygotować pożywkę hodowlaną do wzrostu neurosfery poprzez uzupełnienie pożywki neuropodstawowej o naskórkowy czynnik wzrostu (20 ng/ml) / czynnik wzrostu fibroblastów (20 ng/ml)/ heparynę (2 μg/ml) [dla ostatecznych NSC] lub czynnik hamujący białaczkę (10 ng/ml) [dla pierwotnych NSC]. Dodać 10 ml dowolnej pożywki do kolby do hodowli tkankowych o pojemności 25 ml.</li>
		<li>Użyj hemocytometru i niebieskiego barwnika trypanowego, aby obliczyć liczbę komórek w zawiesinie od (krok 2.2.18)25. Po obliczeniach dodać komórki do kolb do hodowli tkankowych przygotowanych w (krok 2.3.1) do gęstości klonalnej 10 komórek/μl i umieścić kolbę do hodowli tkankowej z dodanymi komórkami w inkubatorze na 24 godziny (37 °C, 95% wilgotności, 5% CO2). 
		UWAGA: Przykładowa technika liczenia jest następująca: Weź 10 μl zawiesiny komórek i wymieszaj z 10 μl barwnika błękitu trypanowego. Dodać 10 μl tej mieszaniny do hemocytometru. Pod mikroskopem świetlnym 10X policz liczbę żywych komórek i zsumuj wszystkie komórki zliczone w 4 z 4 kwadrantów 4 x 4. Użyj wzoru: 100 000/[(X komórek/4) x 2 x 10 x 1,000], aby podać objętość zawiesiny komórek, która ma być posiewana w każdej kolbie do hodowli tkankowej o pojemności 25 ml, aby zapewnić gęstość klonalną (10 komórek/μl).</li>
		<li>Po upływie 24 godzin delikatnie zamieszać kolbę i przelać jej zawartość do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1–2 ml świeżego podłoża neurobazalnego.</li>
		<li>Powtórzyć krok 2.3.2, aby policzyć liczbę komórek w zawiesinie i komórkach płytki o gęstości klonalnej na 24-dołkowej płytce do hodowli tkankowej zawierającej 500 μl każdej z odpowiednich pożywek uzupełnionych mitogenem (EFH dla ostatecznego wzrostu NSC i LIF dla pierwotnego wzrostu NSC). 
		UWAGA: Użyj dostosowanego wzoru (5,000/[X komórek/4) x 2 x 10 x 1,000), aby obliczyć objętość zawiesiny komórek, która ma być posiewana w każdym dołku zawierającym 500 μl pożywki.</li>
		<li>Umieść płytki zawierające komórki w inkubatorze (37 °C, 95% wilgotności, 5% CO2 ) do wzrostu przez 7 dni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Liczenie
	<ol>
		<li>Po 7 dniach w hodowli usuń płytki i obejrzyj pod mikroskopem świetlnym. Określ ilościowo neurosfery, licząc kuliste kolonie o średnicy >80 μm w przypadku kultur dNSC i >50 μm w przypadku kultur pNSCs. 
		UWAGA: W razie potrzeby neurosfery mogą być dalej pasażowane26 lub różnicowane. Jeśli komórki nie są już potrzebne, należy je usunąć, dodając przyspieszony nadtlenek wodoru do studzienek (ok. 1 ml) na 20 minut, aby kolor pożywki zmienił kolor na żółty. Następnie wyrzuć.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Johansson, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+neural+stem+cell+in+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of a neural stem cell in the adult mammalian central nervous system.</a> Cell. 96 (1), 25-34 (1999).</li>
<li>McKay, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+in+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stem cells in the central nervous system.</a> Science. 276 (5309), 66-71 (1997).</li>
<li>Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mammalian neural stem cells.</a> Science. 287 (5457), 1433-1438 (2000).</li>
<li>Temple, S., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+in+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurology%22%5BJournal%5D)">Stem cells in the adult mammalian central nervous system.</a> Current Opinion in Neurology. 9 (1), 135-141 (1999).</li>
<li>Zhang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+neural+stem+cells+contribute+to+stroke-induced+neurogenesis+and+neuroblast+migration+toward+the+infarct+boundary+in+adult+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Cerebral+Blood+Flow+And+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Activated neural stem cells contribute to stroke-induced neurogenesis and neuroblast migration toward the infarct boundary in adult rats.</a> Journal Of Cerebral Blood Flow And Metabolism. 24 (4), 441-448 (2004).</li>
<li>Komitova, M., Mattsson, B., Johansson, B. B., Eriksson, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enriched+environment+increases+neural+stem%2Fprogenitor+cell+proliferation+and+neurogenesis+in+the+subventricular+zone+of+stroke-lesioned+adult+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Enriched environment increases neural stem/progenitor cell proliferation and neurogenesis in the subventricular zone of stroke-lesioned adult rats.</a> Stroke. 36 (6), 1278-1282 (2005).</li>
<li>Faiz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neural+stem+cells+from+the+subventricular+zone+give+rise+to+reactive+astrocytes+in+the+cortex+after+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Adult neural stem cells from the subventricular zone give rise to reactive astrocytes in the cortex after stroke.</a> Cell Stem Cell. 17 (5), 624-634 (2015).</li>
<li>Ren, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ependymal+cell+contribution+to+scar+formation+after+spinal+cord+injury+is+minimal%2C+local+and+dependent+on+direct+ependymal+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports+-+UK%22%5BJournal%5D)">Ependymal cell contribution to scar formation after spinal cord injury is minimal, local and dependent on direct ependymal injury.</a> Science Reports - UK. 7, (2017).</li>
<li>Mothe, A. J., Tator, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation%2C+migration%2C+and+differentiation+of+endogenous+ependymal+region+stem%2Fprogenitor+cells+following+minimal+spinal+cord+injury+in+the+adult+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Proliferation, migration, and differentiation of endogenous ependymal region stem/progenitor cells following minimal spinal cord injury in the adult rat.</a> Neuroscience. 131 (1), 177-187 (2005).</li>
<li>Thuret, S., Moon, L. D., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+interventions+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Therapeutic interventions after spinal cord injury.</a> Nature Reviews Neuroscience. 7 (8), 628-643 (2006).</li>
<li>Bethea, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemically+administered+interleukin-10+reduces+tumor+necrosis+factor-alpha+production+and+significantly+improves+functional+recovery+following+traumatic+spinal+cord+injury+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Systemically administered interleukin-10 reduces tumor necrosis factor-alpha production and significantly improves functional recovery following traumatic spinal cord injury in rats.</a> Journal of Neurotrauma. 16 (10), 851-863 (1999).</li>
<li>Donnelly, D. J., Popovich, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+its+role+in+neuroprotection%2C+axonal+regeneration+and+functional+recovery+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Inflammation and its role in neuroprotection, axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury.</a> Experimental Neurology. 209 (2), 378-388 (2008).</li>
<li>Cummings, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+neural+stem+cells+differentiate+and+promote+locomotor+recovery+in+spinal+cord-injured+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Human neural stem cells differentiate and promote locomotor recovery in spinal cord-injured mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102 (39), 14069-14074 (2005).</li>
<li>Beattie, M. S., Hermann, G. E., Rogers, R. C., Bresnahan, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+in+models+of+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Cell death in models of spinal cord injury.</a> Progress in Brain Research. 137, 37-47 (2002).</li>
<li>Metz, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+the+weight-drop+contusion+model+in+rats%3A+a+comparative+study+of+human+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Validation of the weight-drop contusion model in rats: a comparative study of human spinal cord injury.</a> Journal of Neurotrauma. 17 (1), 1-17 (2000).</li>
<li>Faulkner, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+astrocytes+protect+tissue+and+preserve+function+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Reactive astrocytes protect tissue and preserve function after spinal cord injury.</a> Journal of Neuroscience. 24 (9), 2143-2155 (2004).</li>
<li>Cheriyan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+injury+models%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Spinal+Cord%22%5BJournal%5D)">Spinal cord injury models: a review.</a> Spinal Cord. 52 (8), 588-595 (2014).</li>
<li>Deleyrolle, L. P., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+expansion%2C+and+differentiation+of+adult+Mammalian+neural+stem+and+progenitor+cells+using+the+neurosphere+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Cell+Transplantation%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation, expansion, and differentiation of adult Mammalian neural stem and progenitor cells using the neurosphere assay.</a> Neural Cell Transplantation: Methods and Protocols. , 91-101 (2009).</li>
<li>Singec, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+actual+sensitivity+and+specificity+of+the+neurosphere+assay+in+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology.</a> Nature Methods. 3 (10), (2006).</li>
<li>Mignone, J. L., Kukekov, V., Chiang, A. S., Steindler, D., Enikolopov, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+and+progenitor+cells+in+nestin-GFP+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Neural stem and progenitor cells in nestin-GFP transgenic mice.</a> The Journal of Comparative Neurology. 469 (3), 311-324 (2004).</li>
<li>Xu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+basic+protein+regulates+primitive+and+definitive+neural+stem+cell+proliferation+from+the+adult+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Myelin basic protein regulates primitive and definitive neural stem cell proliferation from the adult spinal cord.</a> Stem Cells. 35 (2), 485-496 (2017).</li>
<li>Sachewsky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primitive+neural+stem+cells+in+the+adult+mammalian+brain+give+rise+to+GFAP-expressing+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Primitive neural stem cells in the adult mammalian brain give rise to GFAP-expressing neural stem cells.</a> Stem Cell Reports. 2 (6), 810-824 (2014).</li>
<li>Worthington Biochemical Corporation. Papain Dissociation System. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.worthington-biochem.com/PDS/default.html">http://www.worthington-biochem.com/PDS/default.html</a> (2018).</li>
<li>Mothe, A., Tator, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+neural+stem%2Fprogenitor+cells+from+the+periventricular+region+of+the+adult+rat+and+human+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of neural stem/progenitor cells from the periventricular region of the adult rat and human spinal cord.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), (2015).</li>
<li>Absher, M. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B978012427150050098X">Hemocytometer counting.</a> Tissue Culture. , 395-397 (1973).</li>
<li>Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+expansion+of+the+adult+mouse+neural+stem+cells+using+the+neurosphere+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (45), (2010).</li>
<li>Xiong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preconditioning+with+isoflurane+produces+dose-dependent+neuroprotection+via+activation+of+adenosine+triphosphate-regulated+potassium+channels+after+focal+cerebral+ischemia+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesia+and+Analgesia%22%5BJournal%5D)">Preconditioning with isoflurane produces dose-dependent neuroprotection via activation of adenosine triphosphate-regulated potassium channels after focal cerebral ischemia in rats.</a> Anesthesia and Analgesia. 96 (1), 233-237 (2003).</li>
<li>Metz, G. A., Merkler, D., Dietz, V., Schwab, M. E., Fouad, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+testing+of+motor+function+in+spinal+cord+injured+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Efficient testing of motor function in spinal cord injured rats.</a> Brain Research. 883 (2), 165-177 (2000).</li>
<li>Hamers, F. P., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CatWalk-assisted+gait+analysis+in+the+assessment+of+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury.</a> Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podczas zabiegu chirurgicznego istnieje kilka krytycznych etapów, na które badacz powinien zwrócić szczególną uwagę, aby uzyskać optymalne wyniki i zminimalizować zmienność między zwierzętami. Podczas zabiegu należy zachować ostrożność przy stosowaniu znieczulenia wziewnego (izofluranu), ponieważ wykazano, że środek znieczulający ma działanie neuroprotekcyjne przy długotrwałym narażeniu27. W związku z tym, badając zdolność regeneracyjną rdzenia kręgowego po urazie, postaraj się wykonać operację ta...

Centralny układ nerwowy zawiera subpopulację samoodnawiających się, multipotencjalnych komórek macierzystych, które mają zdolność do tworzenia różnych typów dojrzałych komórek nerwowych1,2,3,4. Te nerwowe komórki macierzyste (NSC) znajdują się w wyspecjalizowanych niszach w mózgu i rdzeniu kręgowym i mogą być aktywowane po urazie, aby namnażać się, migrować i różnicować w dojrzałe komórki nerwowe. Wykazano, że NSC i ich potomstwo migrują do miejsca urazu w modelach uszkodzeń korowych5,6. Wykazano, że w mózgu NSC migrują z komór bocznych do miejsca urazu, gdzie różnicują się w astrocyty, które przyczyniają się do powstawania blizn glejowych7. Jednak w rdzeniu kręgowym przeprowadzono niewiele badań, aby zapytać, czy te same endogenne NSC można wykorzystać do wspomagania powrotu do zdrowia po urazie rdzenia kręgowego. Rzeczywiście, obecnie toczy się debata na temat tego, czy aktywacja puli komórek macierzystych w rdzeniu kręgowym wymaga bezpośredniego fizycznego uszkodzenia niszy okołokomorowej wyściełającej kanał centralny8, czy też uszkodzenie miąższu rdzenia kręgowego (pozostawienie nienaruszonej niszy komórek macierzystych) jest wystarczające do aktywacji endogennych NSCs9.
Do badania patofizjologii ostrych i przewlekłych urazów wykorzystano wiele modeli urazów rdzenia kręgowego (SCI). Modele te zostały również wykorzystane do przetestowania potencjalnych terapii w leczeniu SCI poprzez neuroprotekcję, immunomodulację i opracowywanie strategii przeszczepu/wymiany komórek10,11,13. Obecne modele obejmują urazy kompresyjne i/lub stłuczone, które powodują deficyty funkcjonalne na dużą skalę, a także rozległe zmiany i kawitacje w cord14,15. Powstałe blizny glejowe mogą obejmować kilka segmentów kręgosłupa wraz z większością szerokości/obwodu rdzenia kręgowego16. W związku z tym, chociaż modele te są istotne klinicznie, stanowią poważne wyzwanie dla badania odpowiedzi endogennych NSC po urazie. Istnieją chemiczne modele urazów, które można dostosować do powodowania łagodniejszych form urazu, które mogą oszczędzić kanał centralny17. Jednak te rodzaje urazów koncentrują się na demielinizacji związanej z SCI i nie są klinicznie istotnymi modelami dla fizycznych i/lub mechanicznych uszkodzeń związanych z urazowym SCI.
Aby rozwiązać problemy obecnych modeli urazów, dostosowaliśmy model SCI minimalnego śladu igły, pierwotnie opracowany w klasie rat<sup="xref">9, do zastosowania w modelu dorosłej myszy. Nasz dostosowany model urazu może stworzyć spójne uszkodzenie grzbietowo-bocznego odcinka rdzenia kręgowego myszy i oszczędzić kanał centralny na poziomie (poziomach) urazu. Zaletą tego modelu jest to, że pozwala on na badanie kinetyki NSC po urazie i ich potencjalnej migracji promieniowej do miejsca urazu. Zastosowanie modelu mysiego pozwala również na wykorzystanie myszy transgenicznych, które umożliwiają śledzenie linii endogennych NSC i ich potomstwa po urazie. Właściwości NSC można dalej oceniać za pomocą zmodyfikowanej formy testu neurosfery in vitro, która została wprowadzona w tym protokole.
Test neurosfery to test in vitro tworzący kolonie, który pozwala na izolację NSC w obecności mitogenów. Przy gęstości posiewu klonalnego poszczególne NSC namnażają się, dając początek swobodnie unoszącym się sferycznym koloniom komórek, które składają się z niewielkiej subpopulacji NSC i zdecydowanej większości przodków18,19. W naszym protokole demonstrujemy izolację dwóch odrębnych, liniowo powiązanych NSC z obszaru okołokomorowego rdzenia kręgowego - w warunkach wyjściowych i zgodnie z naszym minimalnym modelem SCI. Ostateczne nerwowe komórki macierzyste (dNSC) wyrażają gniazdynę i kwaśne białko fibrylarne gleju (GFAP) i są hodowane w obecności naskórkowego czynnika wzrostu (EGF), czynnika wzrostu fibroblastów (FGF) i heparyny (razem określanych jako EFH)20. Te dNSC są rzadkie w naiwnym rdzeniu kręgowym, powodując powstanie bardzo niewielu neurosfer in vitro. Pokazujemy jednak, że dNSC są aktywowane po minimalnym SCI, zwiększając liczbę neurosfer izolowanych z obszaru okołokomorowego21. Prymitywne nerwowe komórki macierzyste (pNSC) znajdują się przed dNSC w linii nerwowych komórek macierzystych. pNSC występują niezwykle rzadko, wykazują niski poziom markera pluripotencji Oct4 i reagują na czynnik hamujący białaczkę (LiF)22. pNSC nie tworzą neurosfer po wyizolowaniu z rdzenia kręgowego dorosłej myszy ze względu na obecność zasadowego białka mielinowego (MBP) w hodowlach pierwotnych; jednak neurosfery pNSC można wyizolować od myszy z niedoborem MBP, a ich liczba zwiększa się po urazie — podobnie jak w przypadku dNSCs21. Wreszcie pokazujemy, że neurosfery pochodzące z dNSC można wyizolować z miejsca urazu we wczesnym okresie po minimalnym SCI. Wyniki te pokazują, że nasz model urazu i testy mogą ocenić charakterystykę aktywacji okołokomorowych NSC, taką jak ich zdolność do proliferacji i migracji w odpowiedzi na uraz.

<table><tbody><tr><td>Retraktor Agricola</td><td>Fine Science Tools</td><td>17005-04</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe Moria Vannas-Wolff (zakrzywione)</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>15370-50</td><td>Dostosuj przy zamówieniu, aby uzyskać końcówki</td></tr><tr><td>Kleszcze Graefe (proste, 1 x 2 zęby)</td><td>Narzędzia do nauki o wysokiej</td> jakości <td>11053-10</td><td></td></tr><tr><td>Bardzo cienkie kleszcze Graefe (zakrzywione, ząbkowane)</td><td>Narzędzia do nauki o naukach</td><td>11152-10</td><td>Lub jakiekolwiek inne kleszcze do szycia</td></tr><tr><td>Hymotaty Hartmana (proste)</td><td>Fine Science Tools</td><td>13002-10</td><td>Lub inne odpowiednie do szycia</td></tr><tr><td>Rękojeść skalpela #3</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td>Lub inne odpowiednie</td></tr><tr><td>maszynki do strzyżenia włosów</td><td></td><td>amazon.ca https://www.amazon.ca/Wahl-Professional-8685-Classic-Clipper/dp/B00011K2BA</td><td>lub inne odpowiednie</td></tr><tr><td>stereotaktyczne instrument</td><td>Stoeling</td><td>51500</td><td>lub inna odpowiednia</td></tr><tr><td>buprenorfina</td><td></td><td></td><td>lub jakikolwiek odpowiedni sankcjonowany przez moją placówkę opieki nad zwierzętami</td></tr><tr><td>Meloxicam</td><td></td><td></td><td>lub jakikolwiek odpowiedni sankcjonowany przez placówkę opieki nad zwierzętami</td></tr><tr><td>Tears Naturale P.M.</td><td>Alcon</td><td>https://www.amazon.ca/Alcon-Tear-Gel-Liquid-Eye-Gel/dp/B00HHXGUXE</td><td>lub inny odpowiedni</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter International Inc</td><td>DIN 02225875</td><td>lub inny odpowiedni do znieczulenia:</td></tr><tr><td>Q-tips, waciki Cottom</td><td>amazon.ca</td><td></td><td></td>https://www.amazon.ca/Q-Tips-Cotton-Swabs-500-Count/dp/B003M5UO6U/ref=pd_lpo_vtph_194_bs_tr_img_1/140-7113119-8364127?_encoding=UTF8&psc=1&refRID=JC16N542KVRF2N62N3DS</tr><tr><td>Gaza bawełniana</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-761-52</td><td></td></tr><tr><td>Igły 30 G</td><td>Becton Dickinson</td><td>305106</td><td>Na kontuzje</td></tr><tr><td>Igły 25 G</td><td>Becton Dickinson</td><td>305122</td><td>do wstrzykiwań leków</td></tr><tr><td>1 ml Strzykawki</td><td>Becton Dickinson</td><td>3090659</td><td>do wstrzykiwań z lekami</td></tr><tr><td>3 ml Strzykawki</td><td>Becton Dickinson</td><td>309657</td><td>do wstrzykiwań płynów</td></tr><tr><td>4-0 Szew</td><td>uoftmedstore.com</td><td>2297-VS881</td><td>do szycia skóry</td></tr><tr><td>6-0 Szew</td><td>uoftmedstore.com</td><td>VS889</td><td>do szycia mięśni</td></tr><tr><td>Maść Polysporin</td><td>amazon.ca</td><td>102051</td><td></td></tr><tr><td>Waporyzator Isoflurane</td><td>VetEquip</td><td>901806</td><td></td></tr><tr><td>15 ml probówki stożkowe</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>Dowolne odpowiednie</td></tr><tr><td>szalki Petriego</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>dowolna odpowiednia</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>Dowolna</td></tr><tr><td>hemocytometr</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>Dowolna</td></tr><tr><td>odpowiednia</td> <td>wirówkaThermoFisher</td><td></td><td>Wszelkie odpowiednie</td></tr><tr><td>standardowe narzędzia preparacyjne</td><td>Narzędzia do nauki precyzyjnej Mikroskop</td><td></td><td></td></tr><tr><td>preparacyjny</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop zliczający</td><td>Olympus</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>Neural Basal-A Medium</td><td>Invitrogen</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17404-044</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina- Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15070</td><td></td></tr><tr><td>L- Glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>12100046</td><td></td></tr><tr><td>F12</td><td>Invitrogen</td><td>12700075</td><td></td></tr><tr><td>30% Glukoza</td><td>Sigma</td><td>G6152</td><td>1 M, 9,01 g w 100 ml dH2O</td></tr><tr><td>1 M Glukoza</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>7,5% NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>155 mM, 1,30 g w 100 ml dH2O</td></tr><tr><td>155 mM NaHCO3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>23,83 g w 100 ml dH2O</td></tr><tr><td>Apo-Transferrin</td><td>R& D Systems</td><td>3188-AT</td><td></td></tr><tr><td>Putrescyna&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P7505</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma</td><td>I5500</td><td></td></tr><tr><td>Selen</td><td>Sigma</td><td>S9133</td><td></td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>Sigma</td><td>P6149</td><td></td></tr><tr><td>System dysocjacji papainy&nbsp;</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>PDS</td><td>1 fiolka papainy może być użyta do 2 próbek</td></tr><tr><td>Naskórkowy czynnik wzrostu</td><td>Invitrogen</td><td>PMG8041</td><td>w proszku rozpuszczony w 1 ml mieszanki hormonalnej i podzielony na fiolki 20 μl do przechowywania w zamrażarce</td></tr><tr><td>Czynnik wzrostu fibroblastów</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0226</td><td>w proszku rozpuszczony w 0,5 ml mieszanki hormonów i podzielony na 20 &mu; Fiolki L do przechowywania w zamrażarce</td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>Sigma</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>Czynnik hamujący białaczkę</td><td>W domu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>trypanowy niebieski</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowe płytki</td><td>NUNC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 M NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td>11,69 g w 100 ml dH2O</td></tr><tr><td>1 M KCL</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td>7,46 g w 100 ml dH2O</td></tr><tr><td>1 M MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M2393</td><td>20,33 g w 100 ml dH2O</td></tr><tr><td>108 mM CaCl2</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>C7902</td><td>1,59 g w 100 ml dH2O</td></tr></tbody></table>

test neurosfery do oceny endogennej aktywacji nerwowych komórek macierzystych w mysim modelu minimalnego uszkodzenia rdzenia kręgowego

A Neurosphere Assay to Evaluate Endogenous Neural Stem Cell Activation in a Mouse Model of Minimal Spinal Cord Injury

Nerwowe komórki macierzyste (NSC) w rdzeniu kręgowym dorosłego ssaka to względnie mitotycznie spokojna populacja komórek okołokomorowych, które mogą być badane in vitro za pomocą testu neurosfery. Ten test tworzenia kolonii jest potężnym narzędziem do badania odpowiedzi NSC na czynniki egzogenne w naczyniu; Można to jednak również wykorzystać do badania wpływu manipulacji in vivo z właściwym zrozumieniem mocnych stron i ograniczeń testu. Jedną z manipulacji o znaczeniu klinicznym jest wpływ urazu na endogenną aktywację NSC. Obecne modele uszkodzenia rdzenia kręgowego stanowią wyzwanie do zbadania tego, ponieważ nasilenie powszechnych modeli stłuczenia, ucisku i przecięcia powoduje zniszczenie niszy NSC w miejscu urazu, w którym znajdują się komórki macierzyste. W tym miejscu opisujemy model minimalnego urazu, który powoduje miejscowe uszkodzenie na powierzchownej grzbietowo-bocznej powierzchni dolnego poziomu klatki piersiowej (T7/8) rdzenia kręgowego dorosłej myszy. Ten model urazu oszczędza kanał centralny na poziomie urazu i umożliwia analizę NSC, które znajdują się na poziomie zmiany w różnych punktach czasowych po urazie. Tutaj pokazujemy, w jaki sposób test neurosfery można wykorzystać do badania aktywacji dwóch odrębnych, powiązanych liniowo populacji NSC, które znajdują się w regionie okołokomorowym rdzenia kręgowego - prymitywnych i ostatecznych NSC (odpowiednio pNSC i dNSC). Pokazujemy, jak izolować i hodować te NSC z obszaru okołokomorowego na poziomie urazu i miejsca uszkodzenia istoty białej. Nasze pooperacyjne rozwarstwienia rdzenia kręgowego wykazują zwiększoną liczbę neurosfer pNSC i neurosfer pochodzących z dNSC z obszaru okołokomorowego uszkodzonych rdzeni w porównaniu z grupą kontrolną, co świadczy o ich aktywacji poprzez uraz. Co więcej, po urazie neurosfery pochodzące z dNSC mogą zostać odizolowane od miejsca urazu – co pokazuje zdolność NSC do migracji z niszy okołokomorowej do miejsc urazu.

Po operacji u myszy powinny wystąpić minimalne deficyty motoryczne, które mogą obejmować niedowład ogona i ewentualnie kończyn tylnych przez maksymalnie 24 h. Po tym czasie u myszy nie powinno występować porażenia i/lub niedowładu kończyn tylnych oraz powinny być widoczne minimalne zmiany w chodzie.
Rysunek 3 przedstawia reprezentatywne wyniki testu neurosfer przeprowadzonego 5 dni po minimalnym usz...

Tutaj demonstrujemy działanie modelu minimalnego uszkodzenia rdzenia kręgowego u dorosłej myszy, która oszczędza centralną niszę kanałową, w której znajdują się endogenne nerwowe komórki macierzyste (NSC). Pokazujemy, w jaki sposób test neurosfery można wykorzystać do ilościowego określenia aktywacji i migracji ostatecznych i pierwotnych NSC po urazie.

Test neurosfery do oceny endogennej aktywacji nerwowych komórek macierzystych w mysim modelu minimalnego uszkodzenia rdzenia kręgowego

Neural stem cells (NSCs) in the adult mammalian spinal cord are a relatively mitotically quiescent population of periventricular cells that can be studied ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na pytania związane z rolą neuronalnych komórek prekursorowych w medycynie regeneracyjnej. W szczególności możemy zapytać, w jaki sposób uraz wpływa na zachowanie nerwowych komórek prekursorowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona podejście do badania wpływu uszkodzenia rdzenia kręgowego na endogenną kinetykę nerwowych komórek prekursorowych.Wizualna demonstracja tych technik ma kluczowe znaczenie. Ponieważ etapy chirurgiczne i preparacyjne wymagają precyzji i mogą być trudne do nauczenia, chociaż można je doskonalić w praktyce. Przed rozpoczęciem zabiegu użyj maszynki do strzyżenia włosów, aby usunąć sierść z grzbietu znieczulonej myszy od połowy pleców do szyi i uszu.Po zabezpieczeniu myszy w urządzeniu stereotaktycznym umieść cztery do pięciu kawałków zwiniętej gazy pod brzuchem, lekko pociągając za podstawę ogona, aby wyprostować ciało i kręgosłup. Popchnij gazę piersiową z brzucha myszy w kierunku górnej części klatki piersiowej, aby podeprzeć kręgosłup piersiowy. I użyj taśmy laboratoryjnej, aby zabezpieczyć ogon i kończyny w orientacji przypominającej gwiazdę.Po zdezynfekowaniu odsłoniętej skóry sekwencyjnymi wacikami z 70% etanolu i jodu powidonu, za pomocą ostrza skalpela numer 10 wykonaj pionowe nacięcie równoległe do osi podłużnej zwierzęcia, od środka obu łopatek, do krzywizny kręgosłupa piersiowego. Cofnij skórę, aby odsłonić tkankę miękką i kontur kręgosłupa. I zidentyfikuj dolną granicę super łopatki tłuszczowej.Następnie użyj skalpela, aby ostrożnie, ale mocno przeciąć wzdłuż obu stron kręgu od T5 do T8 i dziewięciu kości, aby odłączyć ścięgna mięśni pleców od kręgosłupa. Zmień położenie retraktorów tak, aby zęby retraktorów zostały włożone w miejsce nacięcia po obu stronach kręgosłupa. I rozwiń każdy zwijacz, aby dostosować ekspozycję, aż kręgosłup będzie wystarczająco uniesiony, nie obciążając zbytnio cofniętych warstw mięśni.Pod mikroskopem chirurgicznym dokładnie oczyść resztki mięśni i inne tkanki miękkie pokrywające kręgosłup, aby odsłonić kość kręgową. Zaciskanie wyrostka kolczystego kręgów za pomocą ząbkowanych kleszczy i przesuwanie kleszczy lekko w górę iw dół, aby zidentyfikować kręgi, które zostaną usunięte. Następnie włóż jedną końcówkę pary zakrzywionych, nożyczek po obu stronach odsłoniętego otworu międzykręgowego, doogonowego do blaszki kręgowej, która ma zostać wycięta.I przeciąć łączące stawy międzykręgowe obustronnie. Następnie podnieś blaszkę do góry i odetnij górne przyczepienie blaszki, aby wyizolować i usunąć kość. Podczas odcinania i usuwania blaszki kręgowej należy zawsze uważać, aby zawsze kierować nożyczki do góry, aby nie uszkodzić leżącego pod spodem rdzenia kręgowego.Z żyłami grzbietowej linii środkowej służącymi jako punkt orientacyjny, włóż zgięty pod kątem 45 stopni trzon końcówki igły o grubości 30 stopni, ukośną stroną do góry, na głębokość jednego milimetra w grzbietową boczną powierzchnię rdzenia kręgowego. I około 0,5 milimetra w bok po obu stronach linii środkowej. Przesuń igłę o około dwa milimetry od kierunku ogonowego do rostralnego, tak aby cała długość skosu była włożona w sznurek.Następnie odtwórz ścieżkę wejścia, aby usunąć igłę. Aby zamknąć ranę, zdejmij retraktor i użyj szwu wchłanialnego 6-0, aby połączyć mięśnie pleców po obu stronach urazu wzdłuż linii środkowej. I jedwabny szew 4-0, aby zamknąć leżącą na nim skórę.Aby wyizolować neurosfery, wykonaj nacięcie w linii środkowej skóry na całej długości pleców, aby odsłonić kontur mięśni i kości kręgów. Podnieś przyśrodkową część każdej łopatki i użyj nożyczek, aby odciąć tkankę miękką między łopatką a kręgami. Kiedy leżący pod spodem kręgosłup został odsłonięty, włóż nożyczki do górnego otworu klatki piersiowej, podążając za krzywizną kręgosłupa, i odetnij przyczepione żebra, mięśnie i narządy wewnętrzne, aby odizolować kręgosłup.Włóż nożyczki do otworu kręgowego ogona i przetnij stawy międzykręgowe po obu stronach blaszek, uważając, aby nie uszkodzić nienaruszonego rdzenia. Gdy odsłonięta jest odpowiednia długość rdzenia kręgowego, ostrożnie odetnij wszystkie nerwy rdzeniowe wystające bocznie z rdzenia, zanim przeniesiesz tkankę rdzenia kręgowego na szalkę Petriego ze zwykłym, sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym na lodzie. Pod mikroskopem preparacyjnym przeciąć tkankę rdzenia kręgowego tak, aby zawierała około dwóch milimetrów tkanki rostralnej i ogonowej do miejsca urazu, a następnie użyj dwóch par cienkich kleszczy, aby delikatnie rozdzielić pępowinę na dwie podłużne połówki, wzdłuż szczelin grzbietowych i brzusznych.Użyj mikronożyczek, aby wyciąć uszkodzoną grzbietową boczną istotę białą. I umieść zranioną tkankę w stożkowej rurce o pojemności 15 mililitrów. Trzymając jedną połowę rdzenia kręgowego kleszczami, drażnij i usuwaj nieuszkodzoną istotę białą za pomocą dwóch par kleszczy wzdłuż rostralnego ogonowego zasięgu rdzenia kręgowego, aby wyizolować odpowiedni obszar okołokomorowy.Po wyizolowaniu uszkodzonej istoty białej i związanych z nią obszarów okołokomorowych od drugiej połowy rdzenia kręgowego w ten sam sposób, umieść kawałki tkanki okołokomorowej w pojedynczych stożkowych rurkach o średnicy 15 mililitrów. I użyj mikronożyczek, aby delikatnie zmielić tkankę o ścianki rurek. Po zakończeniu procedury trawienia tkanek i uzyskaniu zawiesiny pojedynczej komórki, należy skonfigurować hodowlę neurosfery, dodając 10 mililitrów odpowiedniej pożywki do jednej 25-milimetrowej kolby do hodowli tkankowej na stan komórki.I dodać izolowane nerwowe komórki macierzyste do gęstości klonalnej 10 komórek na mikrolitr w celu ich hodowli w inkubatorze do hodowli komórkowych. Po 24 godzinach delikatnie zamieszaj kolby i zdekantuj zawartość do pojedynczych 15-mililitrowych stożkowych probówek do odwirowania. Ponownie zawiesić granulki w jednym do dwóch mililitrów świeżej podstawowej pożywki neuronowej w celu policzenia.I poszczepić komórki w gęstości klonalnej na jednej 24-dołkowej płytce do hodowli tkankowej na warunek, zawierającej 500 mikrolitrów odpowiedniej, odpowiedniej pożywki uzupełnionej mitogenem na dołek. Następnie hoduj neurosfery w inkubatorze hodowli komórkowych przez siedem dni. Pięć dni po minimalnym uszkodzeniu rdzenia kręgowego, bezwzględna liczba ostatecznych neurosfer pochodzących z nerwowych komórek macierzystych jest większa niż liczba prymitywnych neurosfer pochodzących z nerwowych komórek macierzystych.Definitywne neurosfery wykazują większą średnicę i duży ciemny środek. Podczas gdy prymitywne neurosfery są mniejsze i ciaśniej upakowane. Minimalne uszkodzenie rdzenia kręgowego powoduje znaczny wzrost neurosfer wyrosłych z kanału centralnego na poziomie urazu, w porównaniu ze stosunkowo niewielkim wzrostem w kanale centralnym, rostralnym do poziomu urazu.Ostateczne neurosfery mogą być również generowane z uszkodzonej istoty białej na poziomie urazu. Region, który nie zawiera komórek tworzących neurosferę u samych zwierząt z laminektomią. Podobny wzrost liczby pierwotnych nerwowych komórek macierzystych obserwuje się po urazie, z wyjątkiem prymitywnych neurosfer przy istocie białej na poziomie miejsca uszkodzenia.Po opanowaniu techniki chirurgicznej można ją wykonać w mniej niż 40 minut. A wycięcie i izolację tkanek można wykonać w ciągu 30 minut, jeśli zostanie wykonane prawidłowo. Po zabiegu chirurgicznym, w zależności od szczepu zwierzęcego, można zastosować dodatkowe metodologie, takie jak immunohistochemia i szokowanie linii, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak kinetyka proliferacji i własny los nerwowych komórek prekursorowych po urazie.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykorzystać test neurosfery do oceny aktywacji nerwowych komórek macierzystych po urazie rdzenia kręgowego.

a-neurosphere-assay-to-evaluate-endogenous-neural-stem-cell

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Niniejszy protokół wideo demonstruje metodę testu neurosfer w celu generowania i namnażania neuralnych komórek macierzystych z obszaru okołokomorowego dorosłej myszy oraz dostarcza wskazówek technicznych pozwalających na uzyskanie powtarzalnych kultur neurosfer.

Izolacja i ekspansja dorosłych komórek macierzystych układu nerwowego myszy z wykorzystaniem testu neurosferowego

Niniejszy protokół wideo demonstruje zastosowanie testu neurosfer do izolacji i ekspansji komórek macierzystych mózgu z eminencji zwojowych mózgu myszy w 14. dniu embrionalnym.

Ustanowienie hodowli embrionalnych neuralnych komórek macierzystych myszy z wykorzystaniem testu neurosferowego

Ten film demonstruje test migracji neurosfery komórek prekursorowych neuronów - test in vitro do badania odpowiedzi migracyjnej neuronalnych komórek prekursorowych z neurosfery - za pomocą analizy mikroskopowej.

Test neurosfery NPC: Test in vitro do oceny odpowiedzi migracyjnej neuronalnych komórek prekursorowych z neurosfery

Źródło: Lakshman, N., et al. Test neurosfery do oceny endogennej aktywacji nerwowych komórek macierzystych w mysim modelu minimalnego uszkodzenia rdzenia kręgowego. J. Vis. Exp. (2018). Ten film pokazuje aktywację i migrację nerwowych komórek macierzystych (NSC) w mysim modelu uszkodzenia rdzenia kręgowego. Aby odsłonić rdzeń kręgowy, z znieczulonej myszy usuwa się kręg z klatki piersiowej kręgosłupa. Następnie za pomocą wygiętej igły tworzy się powierzchowny uraz w istocie białej rdzenia...

 Model minimalnego uszkodzenia rdzenia kręgowego do badania aktywacji i migracji nerwowych komórek macierzystych

Matryce fibrynowe zawierające czynniki wzrostu zostały użyte do zatrzymania przeszczepionych nerwowych komórek macierzystych w miejscach całkowitego przecięcia rdzenia kręgowego. Przeszczepione komórki całkowicie wypełniły jamę chorobową i zróżnicowały się w wiele typów komórek nerwowych, w tym neurony, które rozciągały aksony do rdzenia kręgowego gospodarza na duże odległości.

Promowanie przeżycia i różnicowania nerwowych komórek macierzystych z koktajlami fibryny i czynnika wzrostu po ciężkim urazie rdzenia kręgowego

Uraz rdzenia kręgowego to traumatyczny stan, który powoduje ciężką zachorowalność i wysoką śmiertelność. W niniejszej pracy szczegółowo opisano model kontuzji rdzenia kręgowego u myszy, po którym następuje przeszczepienie nerwowych komórek macierzystych.

Przeszczepienie nerwowych komórek macierzystych w eksperymentalnym modelu kontuzyjnym uszkodzenia rdzenia kręgowego

Rdzeń kręgowy dorosłego ssaka zawiera nerwowe komórki macierzyste/progenitorowe (NSPC), które mogą być izolowane i rozwijane w hodowli. Protokół ten opisuje pobieranie, izolację, hodowlę i pasażowanie NSPC generowanych z obszaru okołokomorowego dorosłego rdzenia kręgowego od szczura i od dawców narządów po przeszczepie.

Izolacja nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych z obszaru okołokomorowego dorosłego szczura i ludzkiego rdzenia kręgowego

Ten artykuł opisuje metodę generowania powtarzalnego uszkodzenia kompresyjnego rdzenia kręgowego (SCI) u noworodka myszy. Model ten stanowi korzystną platformę do badania mechanizmów plastyczności adaptacyjnej, które leżą u podstaw spontanicznej odbudowy funkcjonalnej.

Model urazu kompresyjnego rdzenia kręgowego u noworodków myszy

Tutaj wprowadzamy nowatorską technikę mikrochirurgiczną do izolacji nerwowych komórek macierzystych z wyniosłości zwojowej zarodka myszy E13.

Izolacja i hodowla embrionalnych mysich nerwowych komórek macierzystych

W tym artykule szczegółowo opisujemy protokół generowania kultur neurosfery z pourodzeniowych mysich nerwowych komórek macierzystych pochodzących z głównych nisz neurogennych myszy. Neurosfery służą do identyfikacji nerwowych komórek macierzystych z tkanki mózgowej, co pozwala na oszacowanie liczby komórek prekursorowych. Co więcej, te struktury 3D mogą być powlekane w warunkach różnicowania, dając początek neuronom, oligodendrocytom i astrocytom, umożliwiając badanie losu komórek.

Izolacja i ekspansja neurosfer z postnatalnych (P1−3) mysich nisz neurogennych

Tutaj opisujemy system nukleofekcji zaprojektowany w celu zwiększenia efektywności dostarczania genów w rozszerzonych nerwowych komórkach macierzystych (NSC) wyizolowanych z dorosłej mysiej strefy podkomorowej. Wyniki pokazują, że metoda ta znacznie poprawia perturbację genów w NSC, przewyższając skuteczność tradycyjnych protokołów transfekcji i zwiększając wskaźnik przeżywalności komórek.

Izolacja, ekspansja i nukleofekcja nerwowych komórek macierzystych z dorosłej mysiej strefy podkomorowej

Poznaj test neurosfery do oceny aktywacji endogennych komórek macierzystych w mysim modelu minimalnego uszkodzenia rdzenia kręgowego. Ta metoda pozwala badać dynamikę komórek nerwowych po urazie.

Test neurosfery do oceny endogennej aktywacji nerwowych komórek macierzystych w mysim modelu minimalnego uszkodzenia rdzenia kręgowego (Wideo) | JoVE Journal

Test neurosfery do oceny endogennej aktywacji nerwowych komórek macierzystych w mysim modelu minimalnego uszkodzenia rdzenia kręgowego

Przeglądaj więcej filmów